用夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物治疗神经病症的方法

用夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物治疗神经病症的方法
【专利摘要】一种通过施用夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物、或其组分或亚组分治疗神经病症的方法，其中所述提取物、或其组分或亚组分不包含夹竹桃苷和黄夹次苷乙。通过向对象施用治疗有效量的提取物、或其组分或亚组分，治疗阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈症或中风。该提取物可存在于药物组合物中。
【专利说明】用夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物治疗神经病症的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及用夹竹桃属(Nerium)物种或黄花夹竹桃属(Thevetia)物种的提取物、或含有它们的制剂(组合物、配方)治疗神经病症的方法。本发明特别涉及通过将提取物施用给需要其的对象，用于治疗神经疾病或障碍的方法。本发明还包括含有所述提取物组分或亚组分的药物组合物以及它们的使用和制备方法。
【背景技术】
[0002]神经疾病和障碍影响脑部功能。已针对这些疾病和障碍尝试开展了治愈治疗或改善治疗；然而，尽管已证 明有许多药物治疗方法对于许多不同疾病和障碍是有效的，还未形成广泛或普遍的治愈治疗。
[0003]亨廷顿舞蹈症(HD)是一种影响神经系统的脑部遗传疾病。它是由从父母传给孩子的缺陷基因引起的。HD基因干扰称为“亨廷顿(huntington)”的特定蛋白的制造，所述蛋白对于适宜的脑部发育似乎是关键的。HD的典型迹象包括情感、认知和运动障碍。亨廷顿舞蹈症的特征是急速不自主运动(舞蹈症)，但有时引起无异常运动下的僵直，在使用四肢方面的改变(失用症)，身体机能控制的丧失和痴呆，包括记忆力、思考速度、判断的进行性退化以及问题意识和计划意识的缺乏。不存在亨廷顿舞蹈症的已知治愈。尽管许多药物有助于控制HD有关的症状，例如情感和运动问题，没有治疗来停止或逆转该疾病的进程。亨廷顿舞蹈症已被公认为是具有普遍膜异常的疾病。已观察到，与从亨廷顿舞蹈症患者的皮肤获得的正常(Butterfield DA, Oeswein JQ, Prunty ME, Hisle KC, MarkesberyWR., Increased sodium potassium adenosine triphosphatase activity in erythrocytemembrane in Huntington’s disease, Ann Neurology, 4:60-62, 1978)成纤维细胞膜相比，在亨廷顿舞蹈症患者的红细胞和基底神经节的膜中的Na，K-ATP酶显著升高的水平和活性(10 倍的提高)(Schroeder F，Goetz IE, Roberts E, Membrane anomalies in Huntington’sdisease fibroblasts.J.Neurochem.43:526-539，1984)。
[0004]阿尔茨海默病是一种形式的痴呆一损害脑部智力功能(记忆、方位、计算等)但通常保留其运动功能的一种神经退行性疾病。在阿尔茨海默病中，智力逐渐退化，引起记忆力丧失、混乱、定向障碍、受损的判断和可影响个人行使正常日常活动的其他问题。精神变化的类型、严重程度、顺序和进程有很大不同。没有阿尔兹海默病已知的治愈，也没有已知的方法减缓其进程。对于疾病早期或中期的某些人，例如他克林的药物可缓解某些认知症状。安理申(多奈哌齐)和艾斯能(卡巴拉汀)是指定用于治疗轻微至中度痴呆阿尔兹海默病类型的可逆乙酰胆碱酯酶抑制剂。这些药物(称为胆碱酯酶抑制剂)通过提高神经递质乙酰胆碱的脑部水平起作用，帮助恢复脑细胞之间的联系。某些药物可帮助控制例如失目民、躁动、徘徊、焦虑和抑郁的行为症状。这些治疗的目标在于使患者更加舒适。尽管没有药物已知治愈阿尔兹海默病，胆碱酯酶抑制剂可改善日常活动的表现，或减轻行为问题。目前测试的用于治疗阿尔兹海默病的药物包括雌激素、非类固醇抗炎剂、维生素E、司来吉兰(Carbex、咪多吡)和植物药产品银杏。
[0005]欧洲夹竹桃(Nerium oleander)是广泛分布在亚洲亚热带、美国西南部和地中海的观赏性植物。其医药和毒理学性质已得到长久公认。其已用于例如治疗痔疮、溃疡、麻风病、毒蛇咬伤、以及甚至是诱导流产。夹竹桃苷(oleandrin)，夹竹桃提取物的一种重要成分但非唯一成分，是一种强心苷。
[0006]从夹竹桃属植物提取苷类已提供来自欧洲夹竹桃的药理学/治疗学活性成分。其中有夹竹桃苷、黄夹次苷乙(黄花夹竹桃次苷B(nerifolin))和其他强心苷化合物。由欧洲夹竹桃热水提取获得的夹竹桃苷提取物(以商标ANVIRZEL?出售)含有浓缩形式或粉末形式的欧洲夹竹桃热水提取物。已完成热水夹竹桃提取物(即Anvirzel?)的I期试验(Mekhail et al., Am.Soc.Clin.0ncol., vol.20, p.82b, 2001) ? 推测可提供约 57ug 夹竹桃苷/天的夹竹桃提 取物，可以高达1.2ml/m2/d的剂量安全施用。没有发现剂量相关毒性。

【发明内容】

[0007]本发明提供一种治疗神经病症的方法，包括向需要其的对象施用有效量的含有夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物的组合物，以治疗所述神经病症。本发明提供实施方式，其中使用提取物的组分或提取物组分的亚组分代替未分级提取物，并且其中所述提取物的组分或亚组分不包含夹竹桃苷和黄夹次苷乙。
[0008]一方面，本发明提供一种用包含夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物的组合物在需要其的对象中治疗神经疾病或障碍的方法，所述方法包括:
[0009]确定对象患有神经疾病和障碍；以及
[0010]指示向对象施用包含夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物的组合物。
[0011]本发明某些实施方式包括以下那些，其中I)为对象开具并施用治疗相关剂量的组合物；2)使对象按处方给药方案服用组合物；3)提取物包含从夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种提取的一或多种治疗有效剂；4)组合物进一步包含一或多种其他治疗有效剂；5)通过使用热水、冷水、超临界流体、有机溶剂或其组合提取夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种获得提取物；6)提取物不包含强心苷；7)提取物不包含治疗有效量的强心苷；8)提取物不包含夹竹桃苷；9)组合物包含夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物的组分；10)组合物包含夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物的组分，其中所述组分已由提取物的液相色谱分级制备；11)夹竹桃属物种是欧洲夹竹桃，黄花夹竹桃属物种是黄花夹竹桃(Thevetia neriifolia) ；12)提取物不包含黄夹次苷乙；13)组合物包含夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物组分的亚组分，其中所述亚组分已由提取物组分的液相色谱分级制备，并且所述亚组分不包含夹竹桃苷和黄夹次苷乙；14)夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物，如果其含有强心苷，当以一剂型施用给患有神经疾病或障碍的对象时，与以其他方式类似的剂型以相同剂量的强心苷施用给对象的纯强心苷相比，提供改善的临床反应或临床效果；或15)它们的组合。
[0012]本发明还提供一种在需要其的对象中治疗神经病症的方法，所述方法包括:
[0013]确定对象的神经病症是否是阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈症、中风或其他神经病症;
[0014]指示施用夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物；[0015]根据处方的初始给药方案向对象施用初始剂量的提取物一段时间；
[0016]定期测定对象对用提取物治疗的临床反应和/或治疗反应的适当性；以及
[0017]如果对象的临床反应和/或治疗反应适当，根据需要用提取物继续治疗，直至达到期望的临床终点；或
[0018]如果对象的临床反应和/或治疗反应在初始剂量和初始给药方案下不适当，那么逐步提高或逐步减少剂量，直至达到对象中期望的临床反应和/或治疗反应。
[0019]本发明还提供在处于神经病症风险的对象群体中预防或降低神经病症发生率的方法，所述方法包括:
[0020]在经常性的基础上，以延长时间段向对象群体中的一或多个对象施用有效剂量的夹竹桃属物种或黄 花夹竹桃属物种的提取物，所述对象群体处于患神经病症的风险，所述神经病症例如阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈症、中风或其他神经病症，从而预防或降低群体中的神经病症发病率。
[0021]本发明包括实施方式，其中:a)所述方法进一步包括指示施用提取物至一或多个对象；b)所述方法进一步包括根据处方给药方案向对象施用有效剂量的提取物一段时间；
c)所述方法进一步包括定期测定一或多个对象对用提取物治疗的临床反应和/或治疗反应的适当性；d)如果对象的临床反应和/或治疗反应是适当的，那么所述方法进一步包括根据需要用提取物继续治疗，直至达到期望的临床终点；e)如果对象的临床反应和/或治疗反应在初始剂量和初始给药方案下不适当，那么所述方法进一步包括逐步提高或逐步减少剂量，直至达到对象中期望的临床反应和/或治疗反应；f)将提取物施用给群体中的多个对象；g)经常性的基础是每天、每隔一天、每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周、每隔一周、每两周、每三周、每月、每双月、每半月、每隔一月、每两个月、每季、每隔一季、每三个月、每季节(seasonally)、每半年和/或每年；h)延长时期是一或多个周、一或多个月、一或多个季度和/或一或多年；i) 一天内，一或多次施用有效剂量；j)所述方法进一步包括鉴别处于患神经病症风险的对象群体，所述神经病症例如阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈症、中风或其他神经病症；k)处于风险的对象群体的特征是对象增大的年龄、神经病症的家族史、发生神经病症的遗传易感性、对象中ApoE4基因的存在和表达、女性(女性患阿尔茨海默病是男性的两倍)、心血管疾病(例如高血压和高胆固醇水平)、糖尿病(尤其是2型或成人发病型糖尿病)、唐氏综合征、头部伤害、低水平的正规教育、吸烟、过量饮酒和/或药物滥用；1)提取物不包含治疗有效量的强心苷；m)提取物不包含强心苷；或11)它们的组
口 ο
[0022]本发明还提供治疗对象中风的延时(time-delayed)方法,包括:
[0023]在对象已患中风后的延迟时期，根据初始给药方案施用初始剂量的夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物；
[0024]测定对象对用提取物治疗的临床反应和/或治疗反应的适当性；以及
[0025]如果对象的临床反应和/或治疗反应是适当的，那么根据需要用提取物继续治疗，直至达到期望的临床终点；或者
[0026]如果对象的临床反应和/或治疗反应在初始剂量和初始给药方案下不适当，那么逐步提高或逐步减少剂量，直至达到对象中期望的临床反应和/或治疗反应。
[0027]本发明某些实施方案包括以下那些，其中:1)延迟时期是10小时或更短、8小时或更短、6小时或更短、4小时或更短、3小时或更短、2小时或更短、I小时或更短、45分钟或更短、30分钟或更短、20分钟或更短或10分钟或更短；2)通过评估身体一侧脸部、胳膊和/或腿的任何衰弱、身体一侧脸部、胳膊和/或腿的麻痹、不能理解口头语言、不能说话或清楚说话、不能写、眩晕和/或步态不平衡、复视和异常严重的头痛，已完成测定对象临床和/或治疗反应的适当性；或3)它们的组合。
[0028]本发明还提供夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物在制备用于治疗对象神经病症的药物中的用途。在某些实施方式中，此药物的制备包括:提供夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物；将夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物或其组分的剂量包括在药物剂型中；以及包装该药物剂型。本发明还提供包含夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物用于治疗对象神经病症的药物组合物。在某些实施方式中，可如2006年7月26日提交的PCT国际申请PCT/US06/29061、2005年7月28日提交的US7, 402，325和2008年I月24日提交的美国专利申请12/019,435中所描述的进行所述制备，所述专利或专利申请的全部公开内容通过引用结合至本文。所述制备还可包括一或多个额外步骤例如:将包装的剂型递送给供应商(零售商、批发商和/或经销商)；将包装的剂型卖给或以其他方式提供给患有神经病症的对象；在药物内包括标签和包装说明书，其提供关于剂型的使用、给药方案、施用、含量和毒性学性质的说明。在某些实施方案中，神经病症的治疗包括:确定对象患有神经病症或障碍；指示根据给药方案向对象施用提取物或其组分；向对象施用含有提取物的一或多个药物剂型，其中所述一或多个药物剂型是根据给药方案施用的。
[0029]本发明还提供夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物或组合物，即包含夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物的药物配方或剂型，用于治疗神经病症。在某些实施方式中，提取物可如在本文或美国专利7，402，325、PCT国际专利申请PCT/US06/29061、美国专利申请 12/019435 或 Newman 等(`Mo 1.1nterven.(2008), 8, 36-49)中所述，获自夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种，所述专利或专利申请的全部公开内容通过引用结合至本文。
[0030]本发明提供用于制备夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物组分的方法，包括:提取包含夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的物质以形成它们的未分级提取物，所述提取物包含用于治疗神经病症的一或多种药理学活性成分；以及将未分级提取物进行分级以形成它们的两种或更多种组分，其中至少一种组分包含一或多种非强心苷的药理学活性成分。在某些实施方案中，a)至少一种组分不包含强心苷；b)至少一种组分至少包含强心苷；c)用超临界液体、水、有机溶剂或它们的组合进行提取；d)用液相色谱或溶剂提取进行分级；e)所述至少一种组分不包含夹竹桃苷和黄夹次苷乙；或0它们的组合。
[0031]本发明还提供分级夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物，以提供其一或多种治疗有效组分的方法。所述方法包括:a)提供夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物山)分级提取物以提供提取物的两种或更多种组分，包含一或多种药理学活性剂(其不是强心苷)且不包含强心苷(夹竹桃苷和黄夹次苷乙)的第一提取物组分，和包含一或多种强心苷和一或多种药理学活性剂(其不是强心苷)的第二提取物组分。还可如在本文中所述完成分级。在某些实施方案中，对第一提取物组分和第二提取物组分进行进一步分级以提供两种或更多种不同的亚组分，其中第一亚组分包含一或多种类固醇，第二亚组分包含一或多种三職烯(triterpene)。在某些实施方案中，通过具有固定相和流动相的液相色谱完成分级。
[0032]本发明还提供包含获自夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物组分的组合物，由此所述组分已通过分级获自夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物获得。在某些实施方式中，提取物组分包含一或多种类固醇和一或多种三萜烯，并任选地不包含强心苷(夹竹桃苷和黄夹次苷乙)。
[0033]本发明还提供包含获自夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物组分的亚组分的组合物，由此所述亚组分已通过进一步分级获自夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物组分获得。在某些实施方式中，提取物组分的亚组分包含一或多种类固醇、强心苷、强心苷的相关苷元，例如夹竹桃苷元、强心留、或三職类化合物(triterpenoid)、和一或多种三萜烯。在某些实施方式中，提取物组分的亚组分包含一或多种三萜烯，并不包含类固醇。每个亚组分独立地任选地不包含强心苷(夹竹桃苷和黄夹次苷乙)。
[0034]在某些实施方式中:a)提取物进一步包含获自(提取自)夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的至少两种药理学活性剂；b)当向对象施用提取物时，该至少两种药理学活性剂叠加性地或协同性地促进提取物的治疗功效；c)该至少两种药理学活性剂都不是强心苷；和/或d)至少两种药理学活性剂选自强心苷、强心苷的相关苷元，例如夹竹桃苷元、强心甾、三萜类化合物的组。
[0035]在某些实施方式中:1)强心苷选自由夹竹桃苷、奥多诺苷(odoroside)、夹竹 桃它罗苷、G毒毛旋花苷、蟾毒灵(bufalin)、洋地黄毒苷(digitoxin)、华蟾毒它灵(cinobufatalin)、华蟾酥毒基(cinobufagin)和酯蟾毒配基(resibufogenin)组成的组；2)提取物存在于药物配方或组合物中；3)提取物已从夹竹桃(oleander)植物物质或neriifolia植物物质获得；4)该植物物质包括夹竹桃属物种，例如欧洲夹竹桃；或黄花夹竹桃属物种，例如黄花夹竹桃(Thevetia neriifolia)或Thevetia peruviana(另称为黄夹竹桃)；5)任选地在修饰剂存在的情况下，由超临界流体(SCF)提取制备提取物；6)强心苷是夹竹桃苷；7)提取物是由热水提取、冷水提取、有机溶剂提取或水性有机溶剂提取制备的。
[0036]在某些实施方案中，提取物(或其组分或亚组分)包含少于I重量％、少于0.5重量％、少于0.1重量％、少于0.05重量％或少于0.01重量％的多糖。在某些实施方式中，提取物(或其组分或亚组分)包含白桦脂醇(乌索-12-烯-3 β，28-二醇(urs-12-ene-3 β，28-diol)) ；28-去甲乌索-12-烯-3 β -醇；乌索-12-烯 _3 β -醇；3 β，3 β -羟基-12-齐墩果烯-28-酸；3 β，20 α - 二羟基乌索-21-烯-38-酸(3 β，20 α -dihydroxyurs-21-en-38-oic acid) ；3 β , 27- 二轻基-12-乌索烯-38-酸(3 β，27-dihydroxy-12-ursen-38-oic acid) ；3 β , 13 β - 二轻基乌索-11-烯-28-酸；3 β，12 α - 二轻基齐墩果烷-28，13 β -内酯和 3 β，27- 二羟基-12-齐墩果-28-酸(3 β，27_dihydroxy-12-oleanan-28-oic acid)。在某些实施方案中，提取物(或其组分或亚组分)包含选自强心苷的糖基成分的一或多种强心苷前体。在某些实施方案中，糖基选自由葡萄糖苷、果糖苷和葡萄糖苷酸组成的组。在某些实施方案中，提取物(或其组分或亚组分)包含夹竹桃苷元、乌索酸、白桦脂酸、奥多诺苷、夹竹桃它罗苷、齐墩果酸和一或多种三萜烯以及少于0.5%重量的多糖。
[0037]在某些实施方案中，患有神经病症的对象，即需要其的对象，是这种对象群体的一部分。本发明提供了用于改善患有神经病症的对象群体中统计学显著数目的对象的临床状态，所述方法包括:向对象群体施用夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物，或包含夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物的组合物；以及确定对象的临床状态。在某些实施方案中，统计学显著数目是群体的至少5%。
[0038]在某些实施方式中，神经病症是阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈症、中风、滔蛋白病变或其他神经病症，例如本文所描述的。可通过将提取物包含在含有一或多种药学可接受赋形剂的药物剂型中制备药物。
[0039]根据需要用提取物或含有提取物的组合物的对象继续治疗。可如所需要调整剂量或给药方案，直至患者达到期望的临床终点例如与疾病相关的特定神经学症状的降低或减轻。临床反应和/或治疗反应的适当性的测定可由熟悉被治疗的神经病症的临床医生进行。
[0040]在某些实施 方式中，神经病症选自由神经疾病、神经障碍、滔蛋白病变和中风组成的组。在某些实施方式中，神经疾病是神经退行性疾病。在某些实施方式中，神经退行性疾病选自由亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病、帕金森氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、牛海绵状脑病、多发性硬化、糖尿病神经病变、自闭症和青少年型神经元蜡样脂褐质沉积病组成的组。在某些实施方式中，中风是中风引起的缺血性损伤。在某些实施方式中，神经病症是滔蛋白病变，其是具有与对象中Tau3R/Tau4R比率失衡有关的病因学的神经退行性疾病。滔蛋白病变是由人脑中滔蛋白(tau)的病理性聚集引起的一类神经退行性疾病。在某些实施方式中，滔蛋白病变是唐氏综合症、皮克氏病、基底节变性、朊病毒病的某些变体、阿尔茨海默病、进行性核上性麻痹或额颞痴呆。本发明方法的单个步骤可以单独的设施或在相同设施内进行。
[0041]在某些实施方式中，神经元是体外的、离体的或体内的。在某些实施方式中，神经元是CA-1神经元。
[0042]在某些实施方式中，本发明提供夹竹桃属物种或Neriifolia属物种的提取物、或其组分、或其亚组分，它们具有本文所描述的1HNMR谱。在某些实施方式中，本发明提供夹竹桃属物种或Neriifolia属物种的提取物、或其组分、或其亚组分，当施用给对象时，显示本文所描述的治疗活性。在某些实施方式中，本发明提供夹竹桃属物种或Neriifolia属物种的提取物、或其组分、或其亚组分，它们具有本文所描述的HPLC色谱图。在某些实施方式中，本发明方法采用如本文所述的提取物、其组分或其亚组分。在某些实施方式中，本发明组合物包含如本文所述的提取物、其组分或其亚组分。
[0043]本发明包括本文所述的本发明方面、实施方式和亚实施方式的所有组合。除非本文另外指明，术语“提取物”可指未分级提取物或分级提取物(即提取物的组分)或亚分级提取物(即提取物的组分的亚组分)。
【专利附图】

【附图说明】
[0044]以下附图构成本说明书的一部分，并描述了要求保护的发明的示例性实施方式。本领域技术人员根据本文的这些图和说明书，将能够在不进行过度实验情况下，实施本发明。
[0045]图1A描绘在神经保护基于脑部切片的“中风”试验中(实施例8)，从夹竹桃苷相比于无氧或葡萄糖剥夺(OGD)、对照的比较性评估获得的浓度-响应数据，其中在存在或不存在夹竹桃苷的条件下，在氧气和葡萄糖剥夺(OGD=中风)后5-6分钟测定了健康皮层神经元的数目。
[0046]图1B描绘在如本文所述的神经保护基于脑部切片的“中风”试验中(实施例8)，针对欧洲夹竹桃未分级SCF提取物的浓度-响应试验的结果，其中使用无氧或葡萄糖剥夺作为对照。
[0047]图2A-2C描绘在神经保护基于脑部切片的“阿尔茨海默”试验中(实施例9)，夹竹桃苷相比于欧洲夹竹桃未分级SCF提取物的比较性评估的结果，其中在不存在或存在不同量的那些制剂的条件下，在ΑΡΡ/Αβ诱导的退化之后测定了健康皮层神经元的数目。
[0048]图3A-3D描绘在神经保护基于皮质纹状体共培养神经元的“亨廷顿舞蹈症”试验中(实施例10)，来自比较性评估夹竹桃苷(图3Α-3Β)(图3C-3D)的重复试验的结果，其中在不存在或存在不同量的夹竹桃苷的条件下，测定了相对于对照的，皮层神经元相比于转染了突变形式的亨廷顿(htt)蛋白的纹状体神经元的挽救百分比。
[0049]图4A-4E描绘如本文所述的神经保护基于脑部切片的“中风”试验的结果，其中含有夹竹桃苷的SCF提取物已通过液相色谱分级(实施例13)，并且五个不同组分(以下说明)进行了该实验(实施例15):组分0-H(图4A)、组分0-2 (图4B)、组分0_3 (图4C)、组分 0-4 (图 4D)、组分 0-5 (图 4E)。
[0050]图5描绘对于欧洲夹竹桃SCF提取物的组分0-4相比于总(parent)未分级欧洲夹竹桃SCF提取物(PBI或PB1-05204)，浓度-响应基于脑部切片的“中风”试验(实施例15)的结果。
[0051 ] 图6描绘在基于APP的“阿尔茨海默”试验中(实施例11)，欧洲夹竹桃SCF提取物的组分(0-4或0-4A)相比 于未处理(细胞未转染ΑΡΡ/Αβ)的比较性评估的结果，其中在不存在或存在不同量的那些制剂的条件下，在ΑΡΡ/Αβ诱导的退化之后测定了健康皮层神经元的数目。
[0052]图7描绘在基于Tau4R的“阿尔茨海默”试验中(实施例12)，欧洲夹竹桃SCF提取物的组分(0-4)相比于未处理(细胞未转染ΑΡΡ/Αβ)的比较性评估的结果，其中在不存在或存在不同量的那些制剂的条件下，在Tau4R之后测定了健康和受损皮层神经元的数目。
[0053]图8A-8D描绘通过根据实施例13制备的组分的HPLC分析获得的色谱图。
[0054]图9A-9I描绘针对组分0-4欧洲夹竹桃SCF提取物中存在的多种成分的HNMR谱。图9A描绘在根据实施例17亚分级之前，0-4组分的HNMR谱。图9B-9I描绘根据实施例17对0-4组分进行硅胶快速色谱获得的多种亚组分的HNMR谱。
【具体实施方式】
[0055]本发明提供一种通过施用有效剂量的夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物给需要其的对象治疗神经病症的方法。根据最适合对象的给药方案施用所述提取物，根据针对需要治疗的神经病症的传统临床实践和临床治疗终点，临床确定剂量和给药方案的适合性。
[0056]在某些实施方式中，治疗的神经退行性疾病或神经病症具有与对象中tau蛋白过量表达和/或Tau3R/Tau4R比率失衡相关的病因学。这种病症叫做滔蛋白病变。示例性滔蛋白病变包括唐氏综合症、皮克氏病、朊病毒病的某些变体、阿尔茨海默病、进行性核上性麻痹或额颞痴呆、基底节变性、关岛震颤麻痹痴呆综合症、嗜银颗粒性痴呆、C型尼曼匹克病和运动性痴呆(dementia pugilistic)。
[0057]在某些实施方式中，治疗的神经退行性疾病或神经病症具有与以下相关的病因学:β -淀粉样前体蛋白的异常或非典型蛋白水解、神经元突触中β -淀粉样蛋白的积累、神经元突触中淀粉样纤维的形成、或神经元突触中淀粉样斑块的形成。这种疾病或病症的实例是阿尔茨海默病。根据本发明治疗的对象会表现出治疗反应。“治疗反应”意思是患有疾病或病症的对象会由于用提取物治疗而享有至少一种下列临床益处:改善疾病或病症、降低与疾病或病症有关的症状的发生、部分缓解疾病或病症、完全缓解疾病或病症、或发展时间延长。换言之，治疗反应可以是完全的或部分的治疗反应。
[0058]治疗反应还可说明为被神经退行性疾病所累的患者生活治疗改善的治疗反应。生活质量改善可以通过例如与疾病(例如震颤、不自主肌肉运动、丧失或部分丧失神经-肌肉协调、记忆保持等)有关症状的发生、频率或严重性降低发生。
[0059]“在风险 对象群体中防止神经病症的发生”意思是在具有患神经病症风险的人口统计预确定群体中，在预确定时间段内，神经病症不会发生。在预确定时间段内的防止是由于所述群体中的对象已服用根据本发明的提取物。作为实例，当以预确定时间段向具有患中风风险的对象群体中的对象施用提取物或含有提取物的组合物时，在该预确定时间段内在那些对象中不会发生中风。特别是，含有提取物的组合物在一年的时间内长期施用给具有患阿尔茨海默病或任何一种滔蛋白病变(tauopathology)相关疾病的对象群体，且所述群体中的对象在该一年时间内不表现与阿尔茨海默病相关的症状。
[0060]“在风险对象群体中降低神经病症的发生率”在含义上与“防止发生”相关，除了“降低发生率”允许在人口统计预确定对象群体中神经病症的发生，但是与不服用根据本发明的含有提取物的组合物的、另外的类似人口统计预确定的风险对象群体相比，处于降低的发生率或严重水平。
[0061]如本文所用，“发展时间”是诊断(或治疗)疾病后，到疾病开始恶化之前的时间段、时间长度或持续时间。这是保持疾病水平，没有疾病进一步发展的时间段，并且当疾病开始再次发展时，该时间段结束。通过在治疗之前或开始之时，将患有神经病症的对象“分期”来确定疾病发展。例如，在治疗之前或开始之时确定对象的神经健康状况。之后用提取物治疗对象，并且定期监测神经健康状况。在某些随后时间点，神经病症的症状可能恶化，由此标志疾病发展以及“发展时间”的结束。期间疾病没有发展或者期间疾病水平或严重程度没有恶化的时间段是“发展时间”。
[0062]给药方案包括根据给药计划施用的提取物的治疗相关剂量(或有效剂量)。因此治疗相关剂量是观察到针对提取物治疗的疾病或病症的治疗反应的治疗剂量，并且是对象可以在没有过量不期望或有害副作用的情况下服用提取物的治疗剂量。治疗相关剂量对于对象是不致死的，尽管它可能在患者中引起某些副作用。它是对于服用提取物的对象来说，临床益处的水平超过对象由于服用提取物所经历的有害副作用水平的剂量。根据多种已知药理学、药效动力学和药代动力学原理,治疗相关剂量在对象之间不同。然而，治疗相关剂量一般是在0.1至100微克提取物/天的范围内，该提取物是固体、液体或半固体形式。本领域已知在对象中提供目标治疗结果的药理学活性剂的实际量会根据药学基本原理在对象之间不同。
[0063]根据在神经疾病或失调或神经退行性疾病或失调治疗中通常使用的任何给药方案，可施用治疗相关剂量。可一次、两次、三次或更多次的每日给药安排来施用治疗相关剂量。可每隔一天、每三天、每四天、每五天、每半周、每周、每两周、每三周、每四周、每月、每两个月、每半月、每三个月、每四个月、每半年、每年、或根据任何上述的结合来施用，以实现适合的给药安排。例如，可每日一次施用治疗相关剂量一或多个周。
[0064]以下实例包括在神经病症例如神经疾病、神经失调或中风中提取物效力的证据。实施例3详述了一种用夹竹桃属物种的提取物、或其组合物、黄花夹竹桃属物种的提取物、或其组合物、或它们的组合连同一或多种其他治疗剂治疗阿尔茨海默病的方法。实施例4详述了一种用提取物或提取物组合连同一或多种其他治疗剂治疗亨廷顿舞蹈症的方法。实施例5详述了一种用提取物或提取物组合连同一或多种其他治疗剂治疗中风引起的缺血性脑损伤或非中风引起的缺血性脑损伤的方法。
[0065]总体上，以下述治疗患有神经病症的对象。评估表现有神经病症的对象，以确定该神经病症是否是阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈症、中风或其他神经病症。如果对象得到阳性诊断，指示施用提取物或含有提取物的组合物。根据处方给药方案向对象施用起始剂量的提取物或组合物一段时间。定期确定对象的临床反应和治疗反应的水平。如果在一剂量时治疗反应的水平太低，那么根据预确定剂量递增安排将剂量逐步提高，直到对象中达到期望的治疗反应水平。如果对象表现出不期望的副作用或不可接受水平的副作用，那么逐步降低剂量直到对象中达到治疗反应水平相比副作用特征的期望平衡。如所需要，继续用提取物或组合物治疗对象。可如所需要调整剂量或给药方案，直到患者实现期望的临床终点例如疾病本身的中止、疾病有关症状的减少、和/或疾病进程发展的下降。
[0066]提取物，特别是未分级提取物，包含一或多种药理学活性化合物。某些那些化合物还未被确认，某些可以是夹竹桃苷或其他强心苷、欧夹竹桃苷(oleaside)、夹竹桃苷兀、夹竹桃它罗苷、奥多诺苷(Wang X, Plomley JB, Newman RA and CisnerosA.LC/MS/MS analyses of an oleander extract for cancer treatment, AnalyticalChem.72:3547-3552, 20 00)和其他植物材料。来自超临界流体工艺的未分级SCF提取物一般含有重量计0.9%至2.5%理论范围的夹竹桃苷。已经获得含有不同量的夹竹桃苷的SCF提取物。在一个实施方式中，SCF提取物包含重量计约2%的夹竹桃苷。
[0067]夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物的可提取未确认的成分可包含至少一种(非强心苷)药理学活性成分，其有助于SCF提取物或其组分的功效。两种或更多种药理学活性可提取成分可叠加性地或协同性地提供观察到的功效。换言之，本发明夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物含有非强心苷的一或多种药理学活性成分，尽管一或多种强心苷可额外包含在提取物中。提取物可分级为多种不同组分，某些组分含有强心苷、一或多种非强心苷的药理学活性成分、或它们的组合。此外，每种提取物组分可进一步分级为两种或更多种不同的亚组分。
[0068]在SCF提取物存在夹竹桃苷之外的一或多种药理活性成分的证据来自将含有纯夹竹桃苷的溶液的浓度-响应曲线与含有SCF提取物的相比较。图1A描绘了在如实施例8说明的神经保护基于脑部切片的“中风”试验中，对含有纯夹竹桃苷的溶液的浓度-响应试验结果。溶液中的夹竹桃苷浓度从0.0069至230 μ g/ml变化。图1B描绘了在如本文(实施例8)中说明的神经保护基于脑部切片的“中风”试验中，对含有夹竹桃苷SCF夹竹桃属物种的提取物的浓度-响应试验的结果。数据表明提取物比纯的夹竹桃苷更有效，意味着提取物含有提供神经保护的一或多种药理学活性剂。
[0069]实施例8详细说明了用来评估提取物、或其组合物用于治疗中风引起的缺血性神经损伤的功效的体外试验。所述试验是针对氧合葡萄糖剥夺(OGD)的基于脑部切片的试验，所述剥夺用来诱导24小时内健康皮层神经元的> 50%的丧失。使用夹竹桃属物种例如欧洲夹竹桃的总未分级SCF提取物作为阳性对照。之后根据实施例13分级该总提取物，以提供夹竹桃属物种的提取物的组分。根据实施例6、14和17分析组分。
[0070]三職烯的HNMR的特征是高磁场(upfield)的7个甲基信号，约5.3ppm处的烯烃质子和约3.4ppm处的氧化次甲基信号，以及在高磁场(约1.0?2.5ppm)处的许多亚甲基和次甲基质子信号。该HNMR谱(图9B-9I)表明主要成分是类固醇和三萜烯。没有观察到显著量糖苷的信号。没有观察到α，β-不饱和Υ-或δ-内酯的信号，它们是强心苷特征性的，表明在Fr-0-4组分中不存在强心苷或它的苷元。图9C中的HNMR谱对应于含有至少一种类固醇和至少一种 或至少两种不同三萜烯的亚组分。图9B中的HNMR谱对应于含有至少两种不同三萜烯例如两种乌索烷的混合物并不包含类固醇的亚组分。
[0071]相应地，组分0-4含有至少一种三萜烯和至少一种类固醇。在某些实施方式中，组分0-4含有至少两种不同的三萜烯和至少两种不同的类固醇，或者该组分含有多种不同的三萜烯和多种不同的类固醇。在该实施例中评估的0-4组分不包含治疗有效量的强心苷。在某些实施方式中，组分0-4不包含强心苷。在某些实施方式中，组分0-4的第一亚组分含有至少一种类固醇和至少一种三萜烯或至少两种不同的三萜烯，第二亚组分含有至少两种不同的三萜烯，不包含类固醇。在某些实施方式中，第一和第二亚组分的每一个不包含强心苷。
[0072]在OGD处理的脑切片(中风模型)和非OGD处理(即对照)的脑切片(非中风模型)中测试了组分0-4。数据表明当使用100ng/mL至I μ g/mL浓度范围的提取物0-4组分的溶液时，提取物0-4组分提供了实质的神经保护，并且当使用I μ g/mL至lmg/mL浓度范围的提取物0-4组分溶液时，提供了甚至更高的神经保护。因此，含有每mL液体剂型IOOng/mL至lmg/mL提取物组分的液体剂型将在施用其的对象中提供神经保护。
[0073]尽管在提取物的全身剂量之后，没有在人脑中进行直接测定，推测当施用给对象时，提取物组分中的一或多种生理活性成分会穿越血脑屏障。夹竹桃苷，作为纯化合物或者包含在称之为PB1-05204的SCF提取物中，已被表明在啮齿动物(小鼠)模型中有效穿越血脑屏障并进入脑。有理由预期夹竹桃苷对于人的血脑屏障亦会如此。
[0074]相应地，本发明提供一种保护神经元避免由氧剥夺或氧-葡萄糖剥夺引起的活性丧失的方法，其通过将氧剥夺和/或葡萄糖剥夺的神经元暴露给有效量的夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物，以最小化活性丧失、降低活性丧失率、停止活性丧失、减缓活性丧失发生、和/或保护由暴露氧剥夺和/或葡萄糖剥夺的条件引起的神经元的功能。在某些实施方式中，该方法采用有效量的夹竹桃属物种提取物或黄花夹竹桃属物种提取物的组分或亚组分。在某些实施方式中，组分或亚组分已由提取物的液相色谱分级制备。在某些实施方式中，组分不包含强心苷，且在其他实施方式中，组分或亚组分包括一或多种强心苷，特别是本文描述的那些。[0075]实施例9详细说明了用于评估提取物治疗阿尔茨海默病的功效的体外试验。该试验是针对ΑΡΡ/Αβ引起的(ΑΡΡ:β-淀粉样前体蛋白)皮层锥体神经元退化的基于脑切片的试验。被分泌酶分裂后，APP被分解为A β肽，其据信是形成β_淀粉样斑块的致病因素。Αβ蛋白与形成β_淀粉样斑块有关，并且据信是阿尔茨海默病的标志(如果不是病因)。生物射弹转染用于将必要标记例如YFP(标记黄色荧光蛋白)和疾病基因构建体导入到脑切片的相同神经元群体中。YFP与APP同种型共转染，导致在脑切片制备和转染后的三至四天的时期内，皮层锥体神经元的进行性退化。数据(图2A-2C)表明夹竹桃属物种SCF提取物对APP-转染的脑切片提供浓度依赖的神经保护，从而挽救水平几乎至由BACE抑制剂药物，即分泌酶抑制剂药物，所提供的相同水平。分泌酶将APP前体蛋白分裂为毒性Αβ蛋白。含有夹竹桃苷的SCF提取物显示提供比单独的夹竹桃苷更高的神经保护。图2A-2C中的数据的重要性在于，文献中几乎没有化合物或治疗策略在代表阿尔茨海默病的本体外试验中表现出任何显著的神经元保护。
[0076]使用欧洲夹竹桃SCF提取物的组分重复APP-WT基于脑切片的阿尔茨海默病试验(实施例11)。在ΑΡΡ/Αβ引起的退化之后，在不同量的SCF提取物0-4Α组分(0.01至100yg/mL)的存在条件下，确定健康皮层神经元的数目。暴露于氧和葡萄糖剥夺用作内部阳性对照，产生类似中风的引起的神经元损伤。阴性对照仅仅是相对健康的脑切片神经元，无OGD处理或暴露于处理。数据描绘于图6，其中较浅颜色的柱指示相对于APP-WT条件的显著差异，依据ANOVA及随后的0.05置信水平的杜纳法事后比较试验(Dunnett’ s posthoc comparison test)。数据表明0_4A组分在该试验中提供神经保护，即使它不包含强心苷。
[0077]利用tau4R基于脑切片的阿尔茨海默病试验评估黄花夹竹桃SCF提取物的组分0-4(0-4A)(实施例12)。测定健康皮层神经元的数目。本试验中的功效定义为以下或基于以下定义:在不同量的SCF提取物0-4A组分存在的条件下(0.3-100 μ g/ml，浓度已根据提取物的重量得以确定)，健康的相比于不健康数目的相对总数目以及降解神经元的百分比。这些实验中的阴性对照由没有暴露于OGD的脑切片组成，然而暴露于OGD但没有被来源于未分级欧洲夹竹桃提取物 的组分处理的脑切片用作内部阳性对照。数据描绘于图7，其中较浅颜色的柱指示相对于损害神经元的显著差异，依据ANOVA及随后的0.05置信水平的杜纳法事后比较试验。数据表明0-4A组分在该试验中提供神经保护，即使它不包含强心苷。
[0078]相应地，本发明提供一种保护神经元避免阿尔茨海默病引起的活性丧失的方法，该方法包括:将表现出阿尔茨海默病特征的神经元暴露于有效量的夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物，以最小化活性丧失、降低活性丧失率、停止活性丧失、减缓活性丧失发生、和/或由阿尔茨海默病引起的神经元的关键功能。在某些实施方式中，该方法采用有效量的夹竹桃属物种提取物或黄花夹竹桃属物种提取物的组分。在某些实施方式中，组分已通过提取物的液相色谱分级制备。在某些实施方式中，组分不包含强心苷，并且在其他实施方式中，组分包含一或多种强心苷，特别是本文中说明的那些。
[0079]实施例10详细说明了用于评估提取物治疗亨廷顿舞蹈症的功效的试验。通过电穿孔将突变htt蛋白导入皮层神经元、纹状体神经元和神经胶质的高密度的、混合的共培养物。纹状体神经元和皮层神经元由不同颜色荧光蛋白转染，从而有利于单独确认共培养物中不同类型的神经元。颜色荧光蛋白是荧光的，并且在用合适波长的光源激发后“发射”颜色。数据(图3A-3D)表明夹竹桃苷和欧洲夹竹桃的SCF提取物在提供更多数目的存活神经元方面，比KW6002(腺苷2a受体拮抗剂)更加有效。数据还表明SCF提取物比单独的夹竹桃苷更有效，提示提取物进一步包含除夹竹桃苷以外的一或多种治疗有效剂，其能用于治疗亨廷顿舞蹈症。这样其他的剂可随同夹竹桃苷或其他强心苷一起使用，或在无夹竹桃苷或其他强心苷的条件下使用。相应地，本发明提供一种保护神经元避免亨廷顿舞蹈症引起的活性丧失的方法，该方法包括:将表现出亨廷顿舞蹈症特征的神经元暴露于有效量的夹竹桃苷或含有夹竹桃苷的提取物，以最小化活性丧失、降低活性丧失率、停止活性丧失、减缓活性丧失发生、和/或由亨廷顿舞蹈症引起的神经元的正常功能。
[0080]实施例16详述了能用于评估提取物中风后的延迟时期后，在对象中治疗中风的功效的示例性脑切片试验。如本文说明进行利用氧葡萄糖剥夺的脑切片试验；然而，不是用提取物预防性地处理脑切片，在0、1、2、4和6小时的延时时期后用提取物处理它们。数据将证明包含提取物针对中风后长达I小时、长达2小时、长达3小时、长达4小时、长达5小时、长达约6小时的延迟时期，有效提供显著的神经保护。
[0081 ] 相应地，本发明提供了一种在对象中治疗中风的延时方法,其通过在对象患中风之后，向对象施用夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物剂量。在对象患中风后的可接受延迟时期内，根据初始给药方案施用初始剂量的提取物。之后，确定对象对提取物治疗的临床反应和/或治疗反应的适当性。如果对象的临床反应和/或治疗反应是适当的，那么如所需要继续用提取物治疗，直到达到期望的临床终点。或者，如果对象的临床反应和/或治疗反应在初始剂量和初始给药方案下不适当，逐步提高或逐步降低剂量直到达到对象中期望的临床反应和/或治疗反应。可连同给药方案的改变，完成剂量逐步提高或逐步降低，给药方案的改变例如给药频率或剂量施用总周期的改变。
[0082]本文的某些脑切片试验在以下条件下进行:其中OGD之前，脑组织由提取物处理。在那些条件下，数据证实了提取物在预防性地提供神经保护避免中风引起的损害的实用性。
[0083]如果临床医生试图用提取物的组合或它的组合物以及一或多种其他治疗剂治疗具有神经病症的对象，并且已知`对象具有的该特定神经病症至少部分地治疗响应于用所述一或多种其他治疗剂的治疗，那么本方法发明包括:向需要其的对象施用治疗相关剂量的提取物(或它的组分或亚组分)以及治疗相关剂量的所述一或多种其他治疗剂，其中根据第一给药方案施用提取物(或它的组分或亚组分)，且根据第二给药方案施用所述一或多种其他治疗剂。在某些实施方案中，第一和第二给药方案相同。在某些实施方式中，第一和第二给药方案不同。
[0084]如果处于治疗的神经症状是阿尔茨海默病，一或多种其他治疗剂可选自由BACE抑制剂或乙酰胆碱酯酶抑制剂组成的组。在某些实施方案中，一或多种其他治疗剂可选自由盐酸美金刚?(NamendaTM, memantine HCl)、安理申?(多奈哌齐)、加兰他敏?(Razadyne?, galantamine)、艾斯能?(卡巴拉汀)和康耐视?(他克林)组成的组。
[0085]如果治疗的神经病症是亨廷顿舞蹈症，一或多种其他治疗剂可选择由天然产物、抗痉挛药、NMDA (η-甲基d-天冬氨酸)受体拮抗剂和钠离子通道阻断剂组成的组。示例性治疗剂包括维生素E、巴氯芬(CoQlO衍生物)、拉莫三嗪(抗痉挛药)、瑞马酰胺(作为低亲和性NMDA拮抗剂的麻醉剂)和利鲁唑(Na离子通道拮抗剂)。认为这些剂中的每一个的功效就其本身是低的(Mestre T.et al, Chochrane Database Systematic ReviewsJuly8, 2009;8(3):^006455);然而，预期将含有提取物的剂型施用给接受一或多种这些其他试剂的对象，将为患有神经疾病的对象提供与施用这些试剂而不施用所述提取物相比，改善的临床影响。
[0086]如果治疗的神经病症是中风引起的缺血性脑损伤(缺血性中风)，那么除了提取物，可以米用文献(Gutierrez M.et al.“Cerebral protection, brain repair, plasticityand cell therapy in ischemic stroke，，Cerebrovasc.Dis.2009;27Suppll:177-186)中公开的治疗处理，例如静脉溶栓。在某些实施方式中，一或多种治疗剂可选自由药物例如阿替普酶(溶栓剂)组成的组。
[0087]可以剂量且根据临床医生认可为治疗有效的给药方案，或者以临床医生认可为亚治疗有效的剂量施用一或多种其他治疗剂。通过施用提取物和一或多种其他治疗剂的组合提供的临床益处和/或治疗效果可以是叠加性的或协同性的，此益处或效果的水平通过将组合的施用与单独的提取物和一或多种其他治疗剂的施用比较确定。可以剂量并根据如美国食品药品监 督管理局(U.S.F.D.A.)、世界卫生组织(W.H.0)、欧洲药品管理局(E.M.E.A.)、药物管理局(TGA，澳大利亚)、泛美卫生组织(PAHO)、药物和医疗器械安全局(Medsafe,新西兰)或全世界多个卫生部建议或说明的给药方案施用一或多种其他治疗剂。
[0088]如果根据本发明使用强心苷，其可以是已知具有Na，K-ATP酶结合活性的任何强心苷。强心苷应能够穿越血脑屏障，并在施用后以延长的时期保留在脑组织中。就此而言，强心苷应在施用强心苷后在脑中保留至少8小时，归因于组织结合和随之发生的低清除率。
[0089]如果存在，强心苷可以纯的形式或以与一或多种其他化合物的混合物存在。强心苷可以提取物存在。
[0090]提取物可由临界流体(SCF) 二氧化碳(CO2)提取或如此提取物的化学改性形式(例如包括乙醇或使用SCF CO2和乙醇制备的提取物；实施例1)制备。提取物可通过用有机溶剂提取植物材料获得，所述有机溶剂例如乙醇、甲醇、丙醇或其他这样的溶剂。提取物可从植物材料获得。植物材料可以是例如获自夹竹桃属物种例如欧洲夹竹桃植物物质，或黄花夹竹桃属物种例如黄花夹竹桃(另称为黄夹竹桃)的植物物质。提取过程可在欧洲夹竹桃叶的干粉上进行，所述干粉是根据在以下文献中说明的过程制备的:以阿丁顿(Addington)名义在2005年2月15日提交的当前审理的美国临时申请60/653，210、以阿丁顿名义在2006年I月26日提交的美国专利申请11/340，016、以阿丁顿名义在2006年7月28日提交的美国专利申请11/191，650(现在是2008年7月22日授权的美国专利7,402，325)、或2006年7月26日提交的PCT国际专利申请PCT/US06/29061、或Newman等(Mol.1nterven.(2008)，8，36-49),这些的全部公开通过引用结合至此,或是根据本文说明的过程制备的。这些方法还可用于制备夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的未分级提取物。除非另外指明，本文所用术语“提取物”可意指“未分级提取物”或提取物的组分或提取物组分的亚组分。术语“未分级提取物”通常意指通过提取植物材料获得的提取物，其中提取物还未经过分级，例如在提取物初始制备之后，通过色谱法或溶剂萃取分级或分离为单个成分或成分的组。[0091]如本文中使用，术语“夹竹桃苷”意指夹竹桃苷的所有已知形式，除非另外指明。夹竹桃苷可以外消旋形式、光学纯形式或光学富集形式存在。欧洲夹竹桃植物材料可以例如从商业植物供应商Aldridge Nursery (得克萨斯州，亚他斯科)获得。
[0092]未分级提取物可通过含强心苷植物物质的改性(例如乙醇)或未改性超临界流体提取获得，所述植物物质例如含有夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的植物物质。超临界流体提取物可包含从植物物质提取的一或多种药理活性剂，其当施用给对象时，有助于提取物的治疗功效。当存在两种或更多种此活性剂时，它们叠加性地或协同性地有助于提取物的治疗功效。
[0093]可通过多种不同过程制备未分级提取物。可如上或根据由Huseyin Ziya Ozel博士(美国专利5，135，745)开发的过程制备提取物，说明了用于在水中制备植物提取物的热水提取程序。水性提取物据报道含有分子量从2KD至30KD变化的数种多糖、夹竹桃苷、夹竹桃苷元、奥多诺苷和夹竹桃它罗苷。多糖据报道包括酸性高多聚半乳糖醛酸聚糖(homopoIygalacturonans)或阿拉伯半乳糖醒酸聚糖(arabinogalaturonans)。授权给Selvaraj等的美国专利5，869，060公开了夹竹桃属物种的热水提取物及其生产方法，例如实施例2。所得提取物可之后被冻干以产生粉。美国专利6，565，897 (Selvaraj的美国预授权公开20020114852和PCT国际公开W02000/016793)公开了用于制备实质上无菌提取物的热水提取过程。Erdemoglu 等(J.Ethnopharmacol.(2003) Nov.89(1)，123-129)公开了比较植物(包括欧洲夹竹桃)的水性提取物和乙醇提取物的结果，基于它们的抗伤害性活性和抗炎活性。Adome 等(Afr.Health Sc1.(2003) Aug.3 (2), 77-86;乙醇提取物)、el_Shazly等(J.Egypt Soc.Parasitol.(1996), Aug.26 (2), 461-473;乙醇提取物)、Begum 等(Phytochemistry (1999) Feb.50 (3), 435-438;甲醇提取物)、Zia 等(J.EthnoIpharmaco1.(1995)Nov.49(I), 33-39;甲醇提取物)和 Vlasenko 等(Farmatsiia.(1972)Sept.-Oct.21(5),46-47;醇提取物)公开了欧洲夹竹桃的有机溶剂提取物。Singh等的美国预授权专利申请公开20040247660公开了制备用于治疗癌症的夹竹桃苷的蛋白稳定化脂质体配方。Singh等的美国预授权专利申请公开20050026849公开了含有环糊精的夹竹桃苷的水溶性配方。Singh等的美国预授权专利申请公开20040082521公开了制备来自热水提取物的夹竹桃苷的蛋 白稳定化纳米颗粒配方。
[0094]SCF提取可在超临界流体中改性剂的存在下进行，例如醇诸如甲醇，以增强期望化合物从植物物质的提取(2005年7月26日提交的PCT/US06/29061 ；US7, 402，325和2008年 I 月 4 日提交的 USSN12/019435、或 Newman 等(Mol.1nterven.(2008)，8，36-49)，其全部公开通过引用结合至此)。改性剂通常具有超临界流体与被提取化合物之间的挥发性，并且它们必须与超临界流体混溶。在某些实施方式中，改性剂是环境条件下的液体。通过实例并非限制，改性剂可选择由乙醇、甲醇、丙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷等组成的组。
[0095]可能的是，如在本文所包括的试验中通过功效所确定，提取物还在它们的相对性能方面不同。即使如此，如果一或多种药理学活性剂以足够高的量或浓度存在于提取物中，以能够制备治疗相关剂量，那么认为该提取物是本发明的一部分。
[0096]实施例13说明了用于分级SCF提取物为五种不同组分的色谱方法:0-H、0-2、0-3、
0-4和0-5。组分通过以下制备:将未分级提取物负载至用水平衡的ODS-硅胶柱上，接下来通过使甲醇含量不同(30%、55%、80%和100%)的多部分水性流动相顺序流过柱以洗脱提取物的不同组分，收集各自的流出物(组分)，和通过减压溶剂蒸发以移除溶剂来浓缩流出物，从而提供组分0-1 (或0-H)、0-2、0-3、0-4和0_5。根据实施例14分析组分，通过薄层层析使用附着至(因此可用于检测)强心苷的灵敏染料指示剂测定它们在强心苷和其他成分方面的组成。此外，使用液相色谱/串联质谱或DAD-UV检测分析这些组分中强心苷的存在或不存在。
[0097]通过液相色谱采用不同于ODS-硅胶的固定相和/或通过采用不同于水的流动相，可分析提取物的组分或亚组分。本文进一步描述了示例性合适的固定相。
[0098]图8A-8D 描绘了 HPLC 分析实施例 13 的组分 Fr_0_l、Fr_0_2、Fr-03 和 Fr_0_4 之后获得的色谱图。基于比较使用相应外部参照样品获得的保留时间，确定了(Fr-0-2和Fr-0-3)组分含有夹竹桃苷衍生物(强心苷)、夹竹桃苷(Rt=8.3min)和其他未确认的成分。在原始未分级SCF提取物中发现的大部分夹竹桃苷主要在Fr-0-3组分中。Fr_0_4不含有可计量的量的任何强心苷。相应地，组分的组成根据夹竹桃苷含量、强心苷和其他未确认的成分而不同。
[0099]
【权利要求】
1.一种治疗对象中神经病症的方法，包括:向有此需要的对象施用有效量的包含夹竹桃属(Nerium)物种或黄花夹竹桃属(Thevetia)物种的提取物的组合物，以治疗所述神经病症，其中所述提取物不包含夹竹桃苷和黄夹次苷乙。
2.一种在有需要的对象中治疗神经病症的方法，包括: 确定所述对象中的神经病症是否是阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈症、中风、滔蛋白病变、或具有与以下相关的病因学的病症:β_淀粉样前体蛋白的过度蛋白水解、对象之神经元突触中β -淀粉样蛋白的积累、对象之神经元突触中淀粉样纤维的形成、或对象之神经元突触中淀粉样斑块的形成； 指示施用夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的未分级提取物或提取物组分或提取物亚组分，其中所述提取物、其组分或其亚组分不包含夹竹桃苷和黄夹次苷乙； 根据处方的初始给药方案向所述对象施用初始剂量的所述提取物一段时间； 定期测定所述对象对用所述提取物治疗的临床反应和/或治疗反应的适当性；以及 如果所述对象的临床反应和/或治疗反应适当，则根据需要用提取物继续治疗，直至达到期望的临床终点；或 如果所述对象的临床反应和/或治疗反应在初始剂量和初始给药方案下不适当，则逐步提高或逐步减少剂量，直至在所述对象中达到期望的临床反应和/或治疗反应。
3.夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物、或其组分或亚组分，用于治疗对象中的神经病症，其中所述提取物、其组分或其亚组分不包含夹竹桃苷和黄夹次苷乙。
4.用于治疗对象中的神经病症的含有提取物的药物组合物，其中所述药物组合物包含:夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的未分级提取物、夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的未分级提取物的组分、 或夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的未分级提取物的组分的亚组分，其中所述提取物、其组分或其亚组分不包含夹竹桃苷和黄夹次苷乙。
5.一种用于改善患有神经病症的对象群体中统计学显著数目的对象的临床状态的方法，所述方法包括:向所述对象群体施用夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物，其中所述提取物是未分级的、其组分或其组分的亚组分；以及确定所述对象的临床状态，其中所述提取物、其组分或其亚组分不包含夹竹桃苷和黄夹次苷乙。
6.一种在处于风险的对象群体中预防或降低神经病症发生率的方法，所述方法包括: 在经常性的基础上，在延长时间段向所述对象群体中的一或多个对象施用有效剂量的夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物、其组分或其亚组分，所述对象群体处于患神经病症的风险，所述神经病症例如是阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈症、中风或其他神经病症，由此预防或降低该群体中的神经病症发病率，其中所述提取物、其组分或其亚组分不包含夹竹桃苷和黄夹次苷乙。
7.根据权利要求6的方法，其中所述方法进一步包括定期测定一或多个所述对象对用提取物治疗的临床反应和/或治疗反应的适当性；以及如果所述对象的临床反应和/或治疗反应是适当的，则该方法进一步包括根据需要用提取物继续治疗，直至达到期望的临床终点；或者，如果所述对象的临床反应和/或治疗反应在初始剂量和初始给药方案下不适当，则该方法进一步包括逐步提高或逐步减少剂量，直至达到对象中期望的临床反应和/或治疗反应。
8.根据权利要求6或7的方法，其中所述方法进一步包括鉴别处于患神经病症风险的对象群体，所述神经病症例如是阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈症、中风或其他神经病症。
9.根据权利要求8的方法，其中所述处于风险的对象群体的特征是对象年龄增大、神经病症的家族史、发生神经病症的遗传易感性、对象中ApoE4基因的存在和表达、女性、心血管疾病(例如高血压和高胆固醇水平)、糖尿病(尤其是2型或成人发病型糖尿病)、唐氏综合征、头部伤害、低水平的正规教育、吸烟、过量饮酒和/或药物滥用。
10.根据权利要求6、7或8的方法，其中:a)所述方法进一步包括指示施用上述提取物至一或多个对象山)所述方法进一步包括根据处方给药方案向所述对象施用有效剂量的所述提取物一段时间；和/或c)将所述提取物施用给群体中的多个对象。
11.根据权利要求6、7或8的方法，其中:a)所述经常性的基础是每天、每隔一天、每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周、每隔一周、每两周、每三周、每月、每双月、每半月、每隔一月、每两个月、每季、每隔一季、每三个月、每季节、每半年和/或每年山)所述延长时间段是一或多个周、一或多个月、一或多个季度和/或一或多年；和/或c)所述有效剂量一天内一或多次施用。
12.—种治疗对象中风的延时方法，包括: 在对象已患中风后的延迟时期，根据初始给药方案施用初始剂量的夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物、或其组分或其亚组分，其中所述提取物、其组分或其亚组分不包含夹竹桃苷和黄夹次苷乙； 测定该对象对用所述提取物治疗的临床反应和/或治疗反应的适当性；以及 如果该对象的临床反应和/或治疗反应是适当的，则根据需要用所述提取物继续治疗，直至达到期望的临床终点；或者 如果该对象的临床反应和/或治疗反应在初始剂量和初始给药方案下不适当，则逐步提高或逐步减少剂量，直至在所述对象中达到期望的临床反应和/或治疗反应。
13.根据权利要求12的方法，其中所述延迟时期是10小时或更短、8小时或更短、6小时或更短、4小时或更短、3小时或更短、2小时或更短、I小时或更短、45分钟或更短、30分钟或更短、20分钟或更短或10分钟或更短。
14.根据权利要求12或13的方法，其中通过评估身体一侧脸部、胳膊和/或腿的任何衰弱、身体一侧脸部、胳膊和/或腿的麻痹、不能理解口头语言、不能说话或清楚说话、不能写、眩晕和/或步态不平衡、复视和异常严重的头痛来测定对象临床和/或治疗反应的适当性。
15.根据权利要求1-14任一项的发明，其中所述提取物包含提取自夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的一或多种治疗有效剂。
16.根据权利要求1-14任一项的发明，其中所述组合物进一步包含一或多种其他治疗有效剂。
17.根据权利要求1-14任一项的发明，其中所述提取物是通过经热水提取、冷水提取、超临界流体提取、有机溶剂提取或它们的组合对夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种进行提取获得的。
18.根据权利要求1-14任一项的发明，其中所述提取物不包含强心苷，或者不包含治疗有效量的强心苷。
19.根据权利要求1-14任一项的发明，其中所述组合物包含夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物的组分。
20.根据权利要求20的发明，其中所述组分已通过提取物的液相色谱分级制备。
21.根据权利要求1-14任一项的发明，其中夹竹桃属物种是欧洲夹竹桃(Neriumoleander),且黄花夹竹桃属物种是黄花夹竹桃(Thevetia neriifolia)。
22.根据权利要求1-14任一项的发明，其中所述组合物包含夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物的组分的亚组分，其中所述亚组分已通过提取物组分的液相色谱分级制备，且所述亚组分不包含夹竹桃苷和黄夹次苷乙。
23.根据权利要求1-14任一项的发明，其中:1)为对象开具并施用治疗相关剂量的组合物；和/或2)按处方给药方案向对象施用组合物。
24.一种用于制备夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物组分的方法，包括: 提取包含夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的物质以形成它们的提取物，所述提取物包含用于治疗神经病症的一或多种药理学活性成分；以及 将提取物进行分级以形成它们的两种或更多种组分，其中至少一种组分包含一或多种非强心苷的药理学活性成分，其中所述组分不包含夹竹桃苷和黄夹次苷乙。
25.根据权利要求24的方法，其中所述提取已通过热水提取、冷水提取、有机溶剂提取、超临界流体提取或它们的组合进行。
26.根据权利要求24或25的方法，其中所述分级已通过液相色谱进行。
27.根据权利要求24或25的方法，其中:a)所述至少一种组分不包含强心苷；或《所述至少一种组分进一步 包含强心苷。
28.一种分级夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物以提供其一或多种治疗有效组分的方法，所述方法包括: a)提供夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物； b)分级提取物以提供提取物的两种或更多种组分，第一提取物组分包含非强心苷的一或多种药理学活性剂，且不包含夹竹桃苷和黄夹次苷乙，第二提取物组分包含一或多种强心苷以及非强心苷的一或多种药理学活性剂。
29.根据权利要求28的方法，其中对第一提取物组分或第二提取物组分进行进一步分级以提供两种或更多种不同的亚组分，其中第一亚组分包含一或多种类固醇，第二亚组分包含一或多种三萜烯。
30.根据权利要求28的方法，其中所述分级是通过具有固定相和流动相的液相色谱完成的。
31.一种包含获自夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物组分的亚组分的组合物，其中所述亚组分已通过进一步分级获自夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的提取物组分获得。
32.根据权利要求31的组合物，其中:a)所述亚组分包含一或多种类固醇、强心苷、强心苷的相关苷元、夹竹桃苷元、强心留或三萜类化合物，和一或多种三萜烯；b)所述亚组分包含一或多种三萜烯且不包含类固醇；和/或c)每个亚组分独立地不包含夹竹桃苷和黄夹次苷乙。
33.根据以上权利要求任一项的发明，其中所述提取物包含获得(提取)自夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的至少两种药理学活性剂。
34.根据权利要求33的发明，其中:a)当向对象施用所述提取物时，所述至少两种药理学活性剂叠加性地或协同性地作用，促进该提取物的治疗功效山)所述至少两种药理学活性剂都不是强心苷；和/或c)至少两种药理学活性剂选自强心苷、强心苷的相关苷元的组。
35.根据以上权利要求任一项的发明,其中强心苷选自由夹竹桃苷、奥多诺苷、夹竹桃它罗苷、G毒毛旋花苷、蟾毒灵、洋地黄毒苷、华蟾毒它灵、华蟾酥毒基和酯蟾毒配基组成的组。
36.根据以上权利要求任一项的发明，其中所述提取物存在于药物配方或组合物中。
37.根据以上权利要求任一项的发明，其中:a)所述提取物已从夹竹桃植物物质或neriifolia植物物质获得；b)该植物物质包括夹竹桃属物种例如欧洲夹竹桃，或黄花夹竹桃属物种例如黄花夹竹桃(Thevetia neriifolia)或 Thevetia peruviana。
38.根据以上权利要求任一项的发明，其中:a)所述提取物是任选地在修饰剂存在的情况下，由超临界流体(SCF)提取制备的；b)所述提取物是由热水提取制备的；c)所述提取物是由冷水提取制备的；d)所述提取物是由有机溶剂提取制备的；e)所述提取物是由水性有机溶剂提取制备的 ；或0所述提取物是由超临界提取、热水提取、冷水提取或有机溶剂提取的两种或更多种的组合制备的。
39.根据以上权利要求任一项的发明，其中所述夹竹桃属物种或Neriifolia属物种的提取物、或其组分或其亚组分具有如本文所述的1HNMR谱。
40.根据以上权利要求任一项的发明,其中所述夹竹桃属物种或Neriifolia属物种的提取物、或其组分或其亚组分在施用给对象时显示如本文所述的治疗活性。
41.根据以上权利要求任一项的发明，其中所述夹竹桃属物种或Neriifolia属物种的提取物、或其组分或其亚组分具有如本文所述的HPLC色谱。
42.夹竹桃属物种或Neriifolia属物种的提取物、或其组分或其亚组分，具有如本文所述的1HNMR谱。
43.夹竹桃属物种或Neriifolia属物种的提取物、或其组分或其亚组分，具有如本文所述的HPLC色谱。
44.夹竹桃属物种或Neriifolia属物种的提取物、或其组分或其亚组分，当施用给对象时,显示如本文所述的治疗活性。
【文档编号】A61P3/10GK103429251SQ201180065127
【公开日】2013年12月4日 申请日期:2011年11月3日 优先权日:2010年11月22日
【发明者】O·C·阿丁顿, R·A·纽曼 申请人:菲尼克斯生物技术公司