专利名称：含有黄花假杜鹃提取物的药物组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物活性成分的协同组合物及该生物活性成分的分离方法，所述生物活性成分主要由分离自植物源即黄花假杜鹃的环烯醚萜苷、乙酰假杜鹃素和山栀子苷甲酯组成。本发明还涉及利用所述协同性生物活性组合物治疗哺乳动物的肝中毒、应激(stress)和免疫缺陷的用途。
背景技术：
黄花假杜鹃(Barleria prionitis Linn.；科爵床科)是用于印度本土医药体系的一种熟知植物。几乎该植物的各个部分均可入药。其叶是利尿的，用于治疗尿路感染，并可用来治疗瘫痪、风湿性疼痛和胃机能紊乱。该植物具有杀菌作用，其煎剂可用作水肿的洗液。其根可治牙痛和炎症。其皮可治百日咳，并可用作祛痰药[L.V.Asolkar等；Glossary ofIndian Medicinal Plants(印度药用植物名词)(第二次增订)，印度科学和工业研究委员会(CSIR)，新德里，1992，115页；Wealth of IndiaRawMaterials，CSIR，新德里，1988，第IIB卷，47页]。
对该植物最早的化学研究的报道出现在1970年，当时Moritra等人报道了β-谷甾醇的存在[Moritra，S.K.等(Bull.Calcutta Sch.Trop.Med；1970，18，7)]。Harborne等报道了从新鲜的花中分离黄芩配基-7-鼠李糖基糖苷[Harborne，J.B.等，phytochemistry(植物化学)，1971，10，2822]。该化合物的结构后来被修饰为5，6，4’-三羟基-7-O-新橙皮糖基黄酮[Nair，A.G.Ramchandran等，Ind.J.Chem.(印度化学杂志)1982，21B，1135]。叶和茎显示存在5种环烯醚萜苷。其中的四种已被表征，即乙酰基假杜鹃素(acetylbalerin)(6，8-双-O-乙酰基山栀子苷甲酯)、假杜鹃素(barlerin)(8-O-乙酰基山栀子苷甲酯)、山栀子苷甲酯和6-O-乙酰基山栀子苷甲酯[Taneja，S.C.和Tiwari，H.P.，Tetrahedron Lett(四面体快报)，1975，1995；Damtoft，S.等，同上，1982，23，4155；Emary，N.A.等，BullPharm.Sci.Assuit Univ.1990，13(1)，65-72]。
来自胡黄连(Picrorhiza kurroa)的根的环烯醚萜苷(即胡黄连苷，kutkin、picroside和kutkoside)[Ansari，R.A.等，Indian J.Med.Research(印度医药研究杂志)，1988，87，401；Sharma，M.L.博士论文，题为“Evaluation of immunomodulatory activity of some medicinal plants inmammals(一些药用植物对哺乳动物的免疫调节活性的评估)”，1991，University of Jammu(查谟大学)]和来自黄荆(Vitex negundo)的根的环烯醚萜苷(即穗花牡荆苷，agnuside和negundosides)[Suri，J.L.等，印度专利第178389/1997号；Banerjee，S.K.等，印度专利申请号116/DEL/98]具有强的保肝和免疫复原活性。
通过对黄花假杜鹃(地上部分)进行细致的化学和药理学研究，分离出了收率约14％的生物活性成分，这些活性成分具有显著的保肝、免疫复原和抗应激的活性。
发明内容
本发明的主要目的是提供生物活性成分的协同组合物，所述生物活性成分主要由分离自植物源即黄花假杜鹃的环烯醚萜苷、乙酰基假杜鹃素和山栀子苷甲酯组成。
本发明的另一个目的是提供用于分离所述生物活性成分的方法。本发明的另一个目的是提供用所述协同生物活性组合物治疗哺乳动物的肝中毒、应激和免疫缺陷的用途。
本发明涉及生物活性成分的协同组合物，所述生物活性成分主要由分离自植物源即黄花假杜鹃的环烯醚萜苷、乙酰基假杜鹃素和山栀子苷甲酯组成。本发明还提供用所述协同生物活性组合物治疗哺乳动物的肝中毒、应激和免疫缺陷的用途。
具体实施例方式
因此，本发明提供了一种新的协同药物组合物，所述组合物含有得自植物黄花假杜鹃的环烯醚萜苷生物活性成分，所述生物活性成分含有以下组分(a)1.6～6.2％的假杜鹃素；(b)0.015～0.38％的乙酰基假杜鹃素；(c)4.4-8.0％的山栀子苷甲酯；和(d)药用添加剂，而且所述组合物对于受验者具有保肝、抗应激和免疫恢复作用。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物用于治疗由四氯化碳、对乙酰氨基酚和半乳糖胺引起的肝损伤。
在本发明的另一个实施方案中，对于哺乳动物中由CCl4引起的肝中毒，优选剂量为每公斤体重20～200mg。
在本发明的另一个实施方案中，在由CCl4引起肝中毒的哺乳动物中，保肝活性高达88％。
在本发明的另一个实施方案中，对于哺乳动物中由对乙酰氨基酚引起的肝中毒，剂量为每公斤体重50～100mg。
在本发明的另一个实施方案中，在由对乙酰氨基酚引起肝中毒的哺乳动物中，保肝活性高达86％。
在本发明的另一个实施方案中，对于哺乳动物中由半乳糖胺引起的肝中毒，剂量为每公斤体重50～100mg。
在本发明的另一个实施方案中，在由半乳糖胺引起肝中毒的哺乳动物中，保肝活性高达86％。
在本发明的另一个实施方案中，对于哺乳动物的抗疲劳活性的剂量为每公斤体重25～100mg。
在本发明的另一个实施方案中，对于哺乳动物的抗疲劳活性的优选剂量为每公斤体重50～100mg。
在本发明的另一个实施方案中，对于哺乳动物的抗疲劳作用大于80％。
在本发明的另一个实施方案中，对于免疫复原活性的剂量为每公斤体重50～100mg。
在本发明的另一个实施方案中，所述免疫复原活性高达70％。
在本发明的另一个实施方案中，所述组合物使升高的血清谷丙转氨酶(GPT)水平减低约92％。
在本发明的另一个实施方案中，所述组合物使升高的血清谷草转氨酶(GOT)水平减低约74％。
在本发明的另一个实施方案中，所述组合物使升高的血清碱性磷酸酶(ALP)水平减低约88％。
在本发明的另一个实施方案中，所述组合物使升高的血清甘油三酸酯水平减低约88％。
在本发明的另一个实施方案中，对于升高的胆红素水平，所述组合物的保肝活性为约85.96％。
在本发明的另一个实施方案中，所述受验者选自哺乳动物。
在本发明的另一个实施方案中，所述组合物被单独使用或与药用载体结合使用。
在本发明的另一个实施方案中，所述组合物与药用添加剂、载体、稀释剂、溶剂、填料、润滑剂、赋形剂、粘合剂或稳定剂结合而施用给受验者。
在本发明的另一个实施方案中，施用需要的剂量来发挥预防和治疗作用。
在本发明的另一个实施方案中，所述组合物可通过全身、口服或任何临床可接受的/医学可接受的方法施用。
在本发明的另一个实施方案中，所述受验者选自动物和哺乳动物。
本发明还提供了一种制备协同性生物活性成分的方法，所述生物活性成分中含有环烯醚萜苷(a)乙酰基假杜鹃素、(b)假杜鹃素和(c)和山栀子苷甲酯，所述方法包括以下步骤(a)用含水醇对粉末状植物原料进行萃取；(b)在最高达45℃的温度下减压浓缩该萃取物；(c)在水和中等极性的有机溶剂之间分配该浓缩物；和(d)在最高达45℃的温度下对水性成分进行蒸发以使其完全干燥，以便得到所述生物活性成分。
在本发明的另一个实施方案中，所述含水醇中的醇选自由乙醇、甲醇及其混合物组成的组。
本发明的另一个实施方式提供了一种方法，其中含水乙醇和含水甲醇的比例范围均为3∶7～1∶9。
本发明的另一个实施方式提供了一种方法，其中所述分配步骤所用的有机溶剂选自由氯仿、二氯甲烷(dichloromethene)、乙醚、二氯甲烷和/或乙酸乙酯组成的组。
本发明的另一个实施方式提供了一种方法，其中所述植物原料选自由叶、茎、皮及其混合物组成的地上部分。
本发明的另一个实施方式提供了一种方法，其中含有所述生物活性成分的萃取物在冷冻干燥器中蒸发或采用薄膜蒸发器蒸发。
本发明还提供了治疗患有肝中毒、免疫缺陷和应激的受验者的用途，所述用途包括给选定的受验者施用药物有效剂量的生物活性成分的协同组合物，所述生物活性成分含有提取自植物来源黄花假杜鹃的环烯醚萜苷，所述组合物含有(a)1.6～6.2％的假杜鹃素；(b)0.015～0.38％的乙酰基假杜鹃素；和(c)4.4～8.0％的山栀子苷甲酯。
本发明的另一个实施方式提供了一种用途，其中所述组合物用来治疗由四氯化碳、对乙酰氨基酚和半乳糖胺引起的肝损伤。
本发明的另一个实施方案提供了一种用途，其中，对于哺乳动物的中由CCl4引起的肝中毒，其剂量是每公斤体重20～200mg。
本发明的另一个实施方案提供了一种用途，其中，在由CCl4引起肝中毒的哺乳动物中，其保肝活性高达88％。
本发明的另一个实施方案提供了一种用途，其中，对于哺乳动物中由对乙酰氨基酚引起的肝中毒，其剂量是每公斤体重50～100mg。
本发明的另一个实施方案提供了一种用途，其中，在由对乙酰氨基酚引起肝中毒的哺乳动物中，其保肝活性高达86％。
本发明的另一个实施方案提供了一种用途，其中，对于哺乳动物中由半乳糖胺引起的肝中毒，其剂量是每公斤体重50～100mg。
本发明的另一个实施方案提供了一种用途，其中，在由半乳糖胺引起肝中毒的哺乳动物中，其保肝作用高达86％。
本发明的另一个实施方案提供了一种用途，其中，对于哺乳动物的抗疲劳活性的剂量是每公斤体重50～100mg。
本发明的另一个实施方案提供了一种用途，其中，对于哺乳动物的抗疲劳效果大于80％。
本发明的另一个实施方案提供了一种用途，其中，对于免疫复原活性的剂量是每公斤体重50～100mg。
本发明的另一个实施方案提供了一种用途，其中，所述免疫复原活性高达70％。
本发明的另一个实施方案提供了一种用途，其中，所述组合物使升高的血清谷丙转氨酶(GPT)降低了约92％。
本发明的另一个实施方案提供了一种用途，其中，所述组合物使升高的血清谷草转氨酶(GOT)降低了约74％。
本发明的另一个实施方案提供了一种用途，其中，所述组合物使升高的血清碱性磷酸酶(ALP)降低了约88％。
本发明的另一个实施方案提供了一种用途，其中，所述组合物使升高的血清甘油三酸酯降低了约88％。
本发明的另一个实施方案提供了一种用途，其中，所述组合物对升高的胆红素水平的保肝活性为约85.96％。
本发明的另一个实施方案提供了一种用途，其中，病理状态选自胃的或肝的功能紊乱。
本发明的另一个实施方案提供了一种用途，其中，所述受验者选自哺乳动物。
本发明的另一个实施方案提供了一种用途，其中，所述组合物被单独使用或与药用载体结合使用。
本发明的另一个实施方案提供了一种用途，其中，所述组合物与药用添加剂、载体、稀释剂、溶剂、填料、润滑剂、赋形剂、粘合剂或稳定剂结合而施用给受验者。
本发明的另一个实施方案提供了一种用途，其中，施用需要的剂量来发挥预防和治疗作用。
本发明的另一个实施方案提供了一种用途，其中，所述组合物可通过全身、口服或任何临床/医学可接受的方法施用。
本发明的另一个实施方案提供了一种用途，其中，所述受验者选自动物和哺乳动物。
实施例下面将根据以下优选的实施方案和实施例进一步描述本发明。
该生物活性成分表现出显著的保肝、免疫恢复和抗应激活性。与已知的保肝药水飞蓟素(silymarin)多剂量治疗(口服)进行比较显示，在降低扑热息痛引起的升高的血清谷丙转氨酶(GPT)水平、血清谷草转氨酶(GOT)水平和血清碱性磷酸酶(ALP)水平方面，该生物活性成分几乎与水飞蓟素一样有效。
对于CCl4和半乳糖胺引起的肝损伤也观察到了类似效果。除保肝活性外，该生物活性成分还显示出显著的抗应激活性，以100mg/kg/天(口服)的剂量治疗两周后，该抗应激活性使缺氧下的存活时间和游泳存活时间分别增加了47.72％和82％。该生物活性成分还显示出显著的免疫复原活性，它刺激细胞介导的迟发性过敏(DTH)增加了69.5％，并且刺激体液介导的过敏反应(抗体效价)增加了56.87％，而采用已知的免疫抑制化学治疗剂环磷酰胺治疗动物时，免疫复原活性增加了33.3％。
通过下面的实施例来说明本发明的方法，但这些实施例并不应解释为限制本发明的范围。
实施例1将黄花假杜鹃的地上部分(叶和茎)的粉末(1kg)装入渗滤浸出器，用80％的含水乙醇(4升)处理，室温下放置过夜。将该渗滤液排出，通过在室温下静置过夜将浸渍渣萃取3次，每次用3升上述溶剂。在保持水浴温度低于45℃的薄膜蒸发器中，将合并的渗滤液减压浓缩。用乙酸乙酯(4×250ml)抽提该含水的浓缩物(500ml)。用100ml水洗涤合并的乙酸乙酯萃取物，将洗出的液体与上述水层混合，在低于45℃的薄膜蒸发器中减压蒸发，从而使其完全干燥；产物148g。对产物进行HPLC(高效液相色谱)分析发现，它含有0.37％的乙酰基假杜鹃素、6.12％的假杜鹃素和7.9％的山栀子苷甲酯。
实施例2将黄花假杜鹃(地上部分，1kg)粉碎，然后装入渗滤浸出器。在其中加入4升80％的含水甲醇，室温下放置过夜。排出萃取液，通过在室温下静置过夜将浸渍渣再萃取3次，每次用3升上述溶剂。将合并的萃取液在低于45℃下减压浓缩至500ml。用氯仿(4×250ml)萃取含水浓缩物。用100ml水洗涤合并的氯仿萃取物，将水性洗涤液与以上水性浓缩液混合，在低于45℃的薄膜蒸发器中蒸发至完全干燥；产物150g。对产物进行HPLC分析发现，它含有0.3％的乙酰基假杜鹃素、5.8％的假杜鹃素和7.5％的山栀子苷甲酯。
实施例3将磨细的黄花假杜鹃的地上部分(叶和茎)(1kg)装入渗滤浸出器，用5升80％的含水甲醇通过在室温下放置过夜来萃取该物质。该过程重复3次，每次用3升含水甲醇。将合并的渗滤液在45℃减压浓缩(薄膜蒸发器)至500ml。用乙酸乙酯(4×250ml)萃取该水性浓缩物。用100ml水洗涤合并的有机萃取物，将水性洗涤液与以上的水性浓缩物混合，并在冷冻干燥机中蒸发，以使其完全干燥；产物169g。对产物进行HPLC分析发现，它含有0.015％的乙酰基假杜鹃素、3.04％的假杜鹃素和6.22％的山栀子苷甲酯。
用以下公式计算保肝活性(H)H＝[1-(TC-V/VC-V)]×100其中，TC、VC和V分别为用药物+毒素、载体+毒素和载体处理的各组动物。
实施例4
对Wistar白化变种大鼠(150-180g)和Swiss白化变种小鼠(25-30g)进行药理学研究，这些动物不分性别、群体，它们在本学会的动物室饲养。获得之后，将全部动物分成不同的组，放一个星期以便适应实验室环境，并保持处于标准状况(23±2℃，60-70％的相对湿度，12小时光照周期)。无限制地给动物饲喂标准的啮齿动物类丸食和水。除一般行为和急性中毒研究(每组使用10只动物)外，每组有6只动物。
实施例5肝毒素引发急性肝炎的肝毒素在临床表现、生物化学和组织学上与病毒性肝炎十分相似。药物也是引起慢性肝病的原因，所述慢性肝病是例如慢性肝炎、脂肪肝、肝硬化和肝的多种血管病变。在许多情况下，已证实药物引起的肝炎与病毒性肝炎难以区分。用于实验研究的化学物质引起的肝损伤应当足够严重，其严重程度应足以引起细胞死亡或改变肝功能。急性肝损伤的机理依赖于化学物质和所用的动物的品种。许多化学物质产生实质性损伤，阻塞胆汁流动并引起黄疸(胆损伤(cholreticinjury))。申请人研究了对于四氯化碳、对乙酰氨基酚和D-半乳糖胺引起的肝中毒的保肝活性。
四氯化碳(CCl4)它是最强的肝毒素之一(就损伤的严重性而言)。它引起毒性的坏疽，导致具有类似于急性病毒性肝炎临床特征的生化改变(Vogel，1977，Bramanti等，1978，Agarwal 1983，Kumar等，1992)。由服用与液体石蜡混合的四氯化碳而引起肝损伤。在急性单剂量治疗中，给动物施用单剂量的四氯化碳(50μl/kg，口服)，而在用药物进行多次治疗时采用的剂量为0.5ml/kg(口服)。通过胃内插管口服(p.o.)。对照组动物服用等量的液体石蜡。数据记录于表3和表4。
扑热息痛(APAP，对乙酰氨基酚)它是一种广泛用于镇痛解热的治疗药物。大剂量服用时，它会导致肝坏疽，导致具有类似于急性病毒性肝炎临床特征的生化改变(Proudfoot和Wright，1970)。在动物中观察到了类似的结果(Potter等，1973)。如果在吸入麻醉性乙醚数小时后给药，则毒性作用可得到加强(Wells等，1985)。
在密闭的室内吸入麻醉性乙醚(4ml/4分钟/6只动物)6小时后，腹膜内注射含扑热息痛(200mg/kg)的生理盐水(pH9.4)，从而引起肝损伤。对照组动物接受等量的载体。(表2)D-半乳糖胺它是引发大鼠肝内炎症的毒素之一，这种肝炎在临床上与病毒性肝炎类似。有人对氨基半乳糖(GalN)引起的肝损伤的机理进行了深入研究，这个模型现在被认为是肝损伤的权威体系之一。(Bauer等，1974，Al-Tuwaiiiri等，1981；Zimmerman，H.J.1978)。(表1)由皮下注射半乳糖胺(300mg/kg)的生理盐水溶液引起肝损伤。对照组动物接受等量的载体。
实施例6用生物活性化合物和水飞蓟素治疗除在毒性研究中使用10％重量/体积的悬浮液外，在所有其他试验中使用新鲜配制的含0.2％阿拉伯胶的生理盐水悬浮液(1～5％，重量/体积)。采用水飞蓟素(阳性对照)和其他对照药物的含0.2％阿拉伯胶的悬浮液(1～5％，重量/体积)。
研究以下参数GPT和GOT与2，4-二硝基苯肼反应后，用分光光度法检测转氨基反应生成的丙酮酸盐(Reitman和Frankel，1957)。
ALP采用磷酸对硝基苯酯作为底物，用分光光度法检测在碱性介质中形成的对硝基酚(Walter和Schutt，1974)。
胆红素通过与NaNO2的重氮化反应来测定总胆红素(Malloy和Evelyn，1937)。
甘油三酸酯用异丙醇萃取血清中的甘油三酸酯，并用KOH皂化。用高碘酸盐将游离的甘油转化为甲醛，使其与乙酰丙酮反应后，进行测定。采用三油精作为标准物(Neri和Firings，1973)。
实施例7一般行为和急性中毒采用不同剂量(10、30、100、1200、1400、1600、1800和2000mg/kg)的萃取物和TAF，将每个剂量对每组10只小鼠口服给药，用同样数目小鼠的一个组作为对照。对这些动物连续观察1小时，其后的4个小时中每半小时观察一次，观察有无任何集体行为的变化以及一般运动活动、翻腾、痉挛、夹尾反应、咬、立毛、瞳孔尺寸、排便、进食行为等，继续观察达72小时，看有无死亡。采用Miller和Tainter(1944)的方法计算小鼠的LD50值。记录治疗期间用来测定保肝活性的不同模型中所有组的动物死亡率，以此作为亚急性中毒的大概指标。
统计分析采用单因素方差分析(ANOVA)对所得数据进行统计分析，以便比较不同的组(Armitage，1987)，并对对照组和试验组做Dunnett的t检验(Dunnett，1964)。采用双尾配对Student的t检验比较治疗前后的均值，并且采用单尾的非配对Student的t检验来比较对照组和药物治疗组(Ghosh，1984)。以p值小于0.05或比0.05更小的值作为显著性的标准。
实施例8免疫调节活性适应原对健康的受验者具有强的免疫调节作用，而且它被认为是非特异性免疫刺激物。应激会显著降低免疫机能(Solomon等，1985；Harman，D.，1993)。我们的研究显示，在应激时，TAF为免疫系统提供了重要的支持(表14)。它对于治疗角叉藻聚糖对大鼠引起的创伤的作用进一步证实了这一点(Swingle，1974；Bowen和fauci，1984，Sternberg和Licinio，1995.；Otterness和Bliven，1985；)。通过稳定血管膜而稳定血管渗透性并中和化学介质(Kumar等1992)，以及刺激免疫介质反应(体液和细胞介导的免疫反应)(Arrigoni-Martelli和Bramm.1975；Arrigoni-Martelli等，1976；)，可以抑制角叉藻聚糖所引起的创伤。免疫刺激物的活性与初级或次级抗体合成的增强有关，它对于以SRBC作为抗原的DTH模型的作用进一步证实了这一点(Arrigoni-Martelli等，1976)(表，
图14)。
对于正常小鼠的免疫刺激物活性采用8组小鼠(表14)。在药物治疗的当天(0天)，药物治疗1小时后给这些小鼠腹膜内注射浓度为5×109SRBC/ml的新鲜绵羊红细胞(即SRBC，已用大量无热质的无菌生理盐水洗涤)0.2ml，使这些小鼠具有免疫力(Sharma等，1992)，在第7天，从所有动物的眼窝窦内取少量血，分离血清以获得初次抗体效价，然后再经腹膜内注射等量的SRBC以进行激发。在第14天，施用最后一剂后1小时，再次收集所有动物的血液，通过红细胞凝集技术(Nelson和Mildenhall，1967)，在“V”型底96孔微滴定平板中进行连续双倍稀释，以获得次级抗体效价(Sharma等，1992)。显示可见凝集的最高稀释度为该抗体效价。
对于免疫抑制小鼠的免疫刺激物活性采用8组小鼠。除第1组和第3组外，给大鼠口服环磷酰胺(CY)250mg/kg，间隔24小时，给药两天。在第3天，在药物治疗后1小时，所有动物用SRBC(5×109SRBC/ml，0.2ml，腹膜内注射)免疫接种19(Sharma等，1992)。从第3天到第7天，每天给大鼠口服(p.o.)用生理盐水溶解的不同剂量的试验药物和载体(生理盐水)，一日一次，间隔24小时。在第7天，施用最后一剂后1小时，再次收集所有动物的血液，通过红细胞凝集技术(Nelson和Mildenhall，1967)获得次级抗体效价(Sharma等，1992)。显示可见凝集的最高稀释度为该抗体效价。
小鼠的迟发性过敏(DTH)反应在0日通过给小鼠右后脚趾皮下(s.c.)注射5×109/ml的SRBC 20μl，使小鼠致敏，而且在第7日，给其左后脚趾注射相同剂量的SRBC(皮内注射i.d.)以进行激发(Doherry，1981)。激发后24小时，用球状测微计(读数到0.1mm)测量每只小鼠的左后脚垫的厚度，并每组记以平均值±S.E.(表14)。
抗缺氧作用抗缺氧作用与改善或提高大脑对缺氧的耐受力以及降低在急性缺氧时大脑的耗氧量有关(Qu等，1988)。当小鼠暴露于低压环境一定时间后，小鼠心脏和脑细胞的线粒体受到严重损伤，而且，大脑的神经递质即去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)和乙酰胆碱(ACh)会显著减少。我们的结果显示，口服不同等级的剂量为12.5～100mg/kg的TAF可延长缺氧时间，所延长的时间与剂量相关(表2)。这种效果可能与大脑对缺氧的耐受力的提高以及急性缺氧时大脑耗氧量的减少有关。BF对急性缺氧小鼠的保护性作用可归因于BF对垂体-肾上腺轴的作用(Lu等，1988)。
任何原因的应激表现都会引起不利变化和身体正常功能的改变、降低劳动效率、增加疲劳、降低运动活动性和诱发精神抑郁。据猜想，真正的适应原可逆转这种作用(Brekhman，1965，Brekhman，1969)。应激导致中枢神经元损伤(Anisman等，1985)，因为行为的压抑是应激常见的结果(Solomon等，1985)，而且抗疲劳活性很大程度上有赖于神经化学物质即中枢的NE和5-HT。我们的结果显示，用BF做预处理可以增加劳动效率且减轻疲劳(表1)。
实验模型缺氧时间采用6组小鼠。在第15天，给药后1小时，记录所有动物各自的缺氧时间(Caillard等，1975)。将动物放在容积为300ml的与电子表相连的空玻璃罐中，用涂有润滑油的玻璃塞子使玻璃罐保持气密性，并记录直到痉挛出现的时间(表13)。
游泳表现时间采用7组小鼠，在第15天，给药后1小时，测量所有动物各自的游泳时间(Porsolt等，1977)。让动物在perpex玻璃烧杯(高30cm、直径20cm，装有高达25cm水)中游泳，烧杯内保持温度26±1℃，并有持续的空气流自底部吹入。当小鼠停留在底部超过10秒时，记为游泳耐力终点(表1)。
应激改变了身体的正常功能(Brekhman，1965)。在一个特殊方案中，被迫游泳的动物起初用力活动一段时间后，便不动了，似乎变得精神抑郁(Porsolt等1977；Anisman等，1985)，且引起重度疲劳。我们的结果显示，用“TAF”做预处理可以增加劳动效率且减轻疲劳，正如文献所记载，可能是通过维持神经肌肉协调来增加游泳能力和抗疲劳活性(Anisman等，1985)(表13)。
抗疲劳作用训练小鼠停留在转动的杆上。本研究采用在连续5天中，在3次连续的训练中能在20r.p.m.转动的杆(UGO Basile，意大利)上停留超过5分钟的小鼠。在第15天，给药后1小时，除了无应激的对照组外，让所有组的动物都持续游泳2小时，至筋疲力尽。用棉纸把这些动物擦干后，立刻放在转动的杆上，以检测其抗疲劳能力(Dua等，1989)和运动协调效果。停留在转动的杆上达到180秒或更长时间的小鼠被认为是不疲劳的，具有完全的运动协调性。通过可数性反应即组中均有反应或无反应，记数停留在转动的杆上超过180秒的小鼠的数量，以此为基础计算每组有效的百分数。将这些动物从游泳池中取出30分钟后，再次放到转动的杆上，以测定其抗疲劳作用。类似地，将没有游泳的两组动物也放到转动的杆上，测定其抗疲劳作用(表13)。
用以下公式计算抗应激活性A＝[1-(TS-V)/(VS-V)]×100其中V是载体，TS和VS分别是用药物和载体处理的动物组。
优点1、本发明提供了一种生物活性组合物，该组合物具有强的保肝、免疫复原和抗应激性能。
2、本发明公开了一种制备协同组合物的方法，所述协同组合物含有3种作为标志物的化合物。
3、所述的3种标志化合物属于环烯醚萜类化合物，即黄花假杜鹃素、乙酰基假杜鹃素和山栀子苷甲酯。
4、由本发明方法得到的协同性生物活性成分不含任何毒性。
5、本发明的方法从植物中获得了理想收率的协同性成分。
权利要求
1.一种新的协同性药物组合物，该组合物含有来自植物黄花假杜鹃的环烯醚萜苷生物活性成分，所述生物活性成分包含如下组分(a)1.6～6.2％的假杜鹃素；(b)0.015～0.38％的乙酰基假杜鹃素；(c)4.4-8.0％的山栀子苷甲酯；和(d)药用添加剂，而且所述活性成分对于受验者具有保肝、抗应激和免疫复原作用。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物用于治疗由四氯化碳、对乙酰氨基酚和半乳糖胺引起的肝损伤。
3.如权利要求1所述的组合物，其中，对于哺乳动物中由CCl4引起的肝中毒，优选剂量为每公斤体重20～200mg。
4.如权利要求1所述的组合物，其中，在由CCl4引起肝毒的哺乳动物中，保肝活性高达88％。
5.如权利要求1所述的组合物，其中，对于哺乳动物中由对乙酰氨基酚引起的肝中毒，剂量为每公斤体重50～100mg。
6.如权利要求1所述的组合物，其中，在由对乙酰氨基酚引起肝中毒的哺乳动物中，保肝活性达86％。
7.如权利要求1所述的组合物，其中，对于哺乳动物中由半乳糖胺引起的肝中毒，剂量为每公斤体重50～100mg。
8.如权利要求1所述的组合物，其中，在由半乳糖胺引起肝中毒的哺乳动物中，保肝活性高达86％。
9.如权利要求1所述的组合物，其中，对于哺乳动物中的抗疲劳活性的剂量为每公斤体重25～100mg。
10.如权利要求1所述的组合物，其中，对于哺乳动物中的抗疲劳活性的优选剂量为每公斤体重50～100mg。
11.如权利要求1所述的组合物，其中，对于哺乳动物的抗疲劳作用大于80％。
12.如权利要求1所述的组合物，其中，对于免疫复原活性的剂量为每公斤体重50～100mg。
13.如权利要求1所述的组合物，其中，所述免疫复原活性高达70％。
14.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物使升高的血清谷丙转氨酶(GPT)水平减低约92％。
15.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物使升高的血清谷草转氨酶(GOT)水平减低约74％。
16.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物使升高的血清碱性磷酸酶(ALP)水平减低约88％。
17.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物使升高的血清甘油三酸酯水平减低约88％。
18.如权利要求1所述的组合物，其中，对于升高的胆红素水平，所述组合物的保肝活性为约85.96％。
19.如权利要求1所述的组合物，其中，所述受验者选自哺乳动物。
20.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物被单独使用或与药用载体结合使用。
21.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物与药用添加剂、载体、稀释剂、溶剂、填料、润滑剂、赋形剂、粘合剂或稳定剂结合而施用给受验者。
22.如权利要求1所述的组合物，其中，施用需要的剂量来发挥预防和治疗作用。
23.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物通过全身性、口服或任何的临床可接受的/医学可接受的方法施用。
24.如权利要求1所述的组合物，其中，所述受验者选自动物和哺乳动物。
25.一种制备协同性生物活性成分的方法，所述生物活性成分中含有环烯醚萜苷(a)乙酰基假杜鹃素、(b)假杜鹃素和(c)和山栀子苷甲酯，所述方法包括以下步骤(a)用含水醇对粉末状植物原料进行萃取；(b)在最高达45℃的温度下减压浓缩该萃取物；(c)在水和中等极性的有机溶剂之间分配该浓缩物；并且(d)在最高达45℃的温度下对水性成分进行蒸发以使其完全干燥，以便得到所述生物活性成分。
27.如权利要求25所述的方法，其中，所述含水醇中的醇选自由乙醇、甲醇及其混合物组成的组。
28.如权利要求25所述的方法，其中，所述含水甲醇和含水乙醇的范围均为3∶7～1∶9。
29.如权利要求25所述的方法，其中，所述分配步骤所用的有机溶剂选自由氯仿、二氯甲烷、乙醚、二氯甲烷和/或乙酸乙酯组成的组。
30.如权利要求25所述的方法，其中，所述植物原料选自由叶、茎、皮及其混合物组成的地上部分。
31.如权利要求25所述的方法，其中，含有所述生物活性成分的萃取物在冷冻干燥机中蒸发或采用薄膜蒸发器蒸发。
32.治疗患有肝中毒、免疫缺陷和应激的受验者的用途，所述用途包括将含药物有效剂量的生物活性成分的协同组合物施用于选定的受验者，所述生物活性成分含有提取自黄花假杜鹃的植物源性的环烯醚萜苷，所述组合物含有(a)1.6～6.2％的假杜鹃素；(b)0.015～0.38％的乙酰基假杜鹃素；和(c)4.4-8.0％的山栀子苷甲酯。
33.如权利要求32所述的用途，其中，所述组合物用来治疗由四氯化碳、对乙酰氨基酚和半乳糖胺引起的肝损伤。
34.如权利要求32所述的用途，其中，对于哺乳动物中由CCl4引起的肝中毒，所述剂量是每公斤体重20～200mg。
35.如权利要求32所述的用途，其中，在由CCl4引起肝中毒的哺乳动物中，所述组合物的保肝活性高达88％。
36.如权利要求32所述的用途，其中，对于哺乳动物中由对乙酰氨基酚引起的肝中毒，所述剂量是每公斤体重50～100mg。
37.如权利要求32所述的用途，其中，在由对乙酰氨基酚引起肝中毒的哺乳动物中，所述组合物的保肝活性高达86％。
38.如权利要求32所述的用途，其中，对于哺乳动物中由半乳糖胺引起的肝中毒，所述剂量是每公斤体重50～100mg。
39.如权利要求32所述的用途，其中，在由半乳糖胺引起肝中毒的哺乳动物中，所述组合物的保肝活性高达86％。
40.如权利要求32所述的用途，其中，用于哺乳动物中的抗疲劳活性的所述剂量是每公斤体重50～100mg。
41.如权利要求32所述的用途，其中，所述组合物对于哺乳动物的抗疲劳效果大于80％。
42.如权利要求32所述的用途，其中，对于免疫复原活性，所述剂量是每公斤体重50～100mg。
43.如权利要求32所述的用途，其中，所述免疫复原活性高达70％。
44.如权利要求32所述的用途，其中，所述组合物使升高的血清谷丙转氨酶(GPT)降低了约92％。
45.如权利要求32所述的用途，其中，所述组合物使升高的血清谷草转氨酶(GOT)降低了约74％。
46.如权利要求32所述的用途，其中，所述组合物使升高的血清碱性磷酸酶(ALP)降低了约88％。
47.如权利要求32所述的用途，其中，所述组合物使升高的血清甘油三酸酯降低了约88％。
48.如权利要求32所述的用途，其中，所述组合物对升高的胆红素水平的保肝活性为约85.96％。
49.如权利要求32所述的用途，其中的病理状态选自胃的或肝的功能紊乱。
50.如权利要求32所述的用途，其中，所述受验者选自哺乳动物。
51.如权利要求32所述的用途，其中，所述组合物被单独使用或与药用载体结合使用。
52.如权利要求32所述的用途，其中，所述组合物与药用添加剂、载体、稀释剂、溶剂、填料、润滑剂、赋形剂、粘合剂或稳定剂结合而施用给受验者。
53.如权利要求32所述的用途，其中，所施用的剂量是发挥预防和治疗作用所需的剂量。
54.如权利要求32所述的用途，其中，所述组合物通过全身性、口服或任何临床可接受的/医疗可接受的方法施用。
55.如权利要求32所述的用途，其中，所述受验者选自动物和哺乳动物。
全文摘要
本发明提供了生物活性成分的协同组合物及该生物活性成分的分离方法，所述生物活性成分主要由分离自植物黄花假杜鹃的环烯醚萜苷假杜鹃素和山栀子苷甲酯组成。本发明还涉及利用所述协同性生物活性组合物治疗哺乳动物的肝中毒、应激和免疫缺陷的用途。
文档编号A61P37/04GK1627954SQ02829021
公开日2005年6月15日 申请日期2002年3月25日 优先权日2002年3月19日
发明者J·L·苏里, S·K·班纳吉, 苏巴实·昌卓·塔尼加, A·S·阿南德, 阿尼尔·普哈卡, 布品德·辛格·贾格, 阿吉特·库马尔·萨克塞纳, 巴尔·克里尚·昌丹, 苏克德夫·斯瓦米·汉达 申请人:科学和工业研究委员会