专利名称：依达拉奉的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体涉及依达拉奉预防氧惊厥的用途。
背景技术：
氧惊厥又名惊厥型氧中毒或急性氧中毒，是人体吸入高分压氧气(高于200kPa) 一定时间后，神经细胞兴奋性增加导致的临床表现类似癫痫大发作的一种疾病。氧惊厥多发生在潜水活动中，发作时潜水员可出现全身强直性收缩以及阵发性痉挛，意识丧失，并伴有尿便失禁，潜水员往往失去控制而引起溺水或放漂等潜水事故，严重影响潜水员安全，极大地限制了使用氧气轻潜水装具执行水下军事作战任务、水下商业性潜水作业和科学考察等活动。此外，临床高压氧已经广泛应用于治疗减压病、一氧化碳中毒、组织坏死和神经损伤等疾病，但也存在发生氧惊厥的风险，特别是对一些敏感者。因此，有效预防氧惊厥，最大限度地安全用氧，对军事和民用潜水作业以及临床高压氧治疗都具有重要意义。但是，目前所能采取的预防措施相当被动，主要依靠限制吸氧的压力和时程预防氧惊厥发生，很大程度上限制了高分压氧的应用。依达拉奉(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，MCI-186)是一种新型强效氧自由基清除剂及抗氧化剂，目前正广泛用作治疗脑卒中的一线急救药物。至今未见抗氧化剂依达拉奉用于预防氧惊厥的报道。
发明内容
本发明要解决目前缺乏有效预防氧惊厥的药物的技术问题，提供一种依达拉奉的用途，用于制备预防氧惊厥的药物。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现一种依达拉奉的用途，用于制备预防氧惊厥的药物。所述依达拉奉的给药方式包括肌肉注射或静脉滴注。所述依达拉奉药物的剂型包括注射剂。本发明通过依达拉奉对氧惊厥首次放电潜伏期的影响实验和依达拉奉对大鼠皮层和海马中生化指标的影响实验证明，依达拉奉能显著抑制氧惊厥的发生，说明依达拉奉可以有效地预防氧惊厥，适用于开发氧惊厥的预防药物。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。图1是本发明的氧惊厥发病机理及依达拉奉对氧惊厥的作用机理示意图；图2是本发明实施例1依达拉奉对氧惊厥FED潜伏期的影响实验结果及脑电图示例图；图3是本发明实施例2中依达拉奉对皮层和海马组织中MDA的影响实验结果图；图4是本发明实施例2中依达拉奉对皮层和海马组织中H2A和NO的影响实验结果图；图5是本发明实施例2中依达拉奉对皮层和海马组织中抗氧化酶(S0D、GPx、CAT) 的影响实验结果图；图6是本发明实施例2中依达拉奉对皮层和海马组织中NOS的影响实验结果图。
具体实施例方式为了寻找有效预防氧惊厥的药物，本发明通过多次反复实验，终于发现依达拉奉预防氧惊厥的新用途。下面对氧惊厥的发病机理及依达拉奉的作用机理进行简要阐述(如图1所示)。氧惊厥的具体机制尚未明了，但已明确氧自由基(ROS)是其主要致病因素。氧惊厥的基本发病机制可概括如下在持续的高压氧(HBO)暴露下，脑组织内的氧分压(PO2)增高。增高的氧分压一方面引起ROS增多，超过脑组织内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶的抗氧化能力，神经细胞遭受氧化损伤， N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体受到激活，兴奋性递质增多，抑制性递质减少，从而引发氧惊厥；另一方面，脑组织内的氧分压增高后，一氧化氮合成酶(N0Q活性增高，L-精氨酸 (L-arginine)含量增高，从而导致一氧化氮(NO)含量增高。在NO的作用下，脑血管功能失调，血管扩张，脑血流增大，脑部的氧供增大，进一步增加脑内的氧分压，引发氧惊厥。本发明经下述实施例证实，依达拉奉(Edv)通过清除R0S、提高抗氧化酶水平和抑制NOS活性，可以有效抑制高压氧导致的脑组织脂质过氧化损伤，减轻神经细胞的氧化损伤，延长氧惊厥潜伏期，从而发挥预防氧惊厥的效果。本发明的下述实施例是在整体动物中预先给予一定量的依达拉奉，再进行氧惊厥造模，观察依达拉奉预防氧惊厥的效果，再进一步研究依达拉奉对大鼠皮层和海马组织中的脂质过氧化、ROS、NO、抗氧化酶以及NOS水平的影响。实施例1依达拉奉对氧惊厥首次放电潜伏期的影响实验1)动物准备健康雄性SD大鼠，购于美国比凯公司，第二军医大学动物中心提供， 饲养至体重250士 IOg用于实验。2)氧惊厥模型的制备将动物放入高压氧舱后，首先用纯氧以lL/s的气流速度洗舱5min，同时监测氧气浓度，待氧气浓度> 99%后，以lATA/min的速度勻速加压至6ATA后计时，保持压力稳定，加压及稳压过程中持续换气(0.3L/S)。暴露过程中，舱底铺一层钠石灰，以吸收动物呼出的CO2，舱内温度保持在22 ^°C。3)动物分组SD大鼠12只，随机分为生理盐水对照组和依达拉奉:3mg/kg体重组。体重达标准后用于实验。4)实验步骤(1)脑电极植入大鼠腹腔注射戊巴比妥(50mg/kg)，待大鼠完全麻醉后，固定于脑立体定位仪上。使其头部顶部保持水平，用75%酒精棉球消毒皮肤，剪开头顶部皮肤，分离皮下组织，剥离、刮掉骨膜，暴露颅骨。分别选定颅骨上适当位置，用颅骨钻钻出深度为 0. 5mm的小孔皮层电极，前囟后4mm，中线左旁开2mm ；参照电极，前囟后4mm，中线右旁开 2mm。将消毒后的电极短端植入小孔，用调好的磷酸锌黏合剂将电极固定于颅骨，缝合皮肤。全过程均无菌操作。术后将大鼠继续饲养3天，温度对-261，湿度40-60%，自由进水和摄合
P5 O(2)给药给药组在高压氧暴露30min前按;3mg/kg的剂量给予依达拉奉，腹腔注射。生理盐水对照组给予等量的0. 9%生理盐水，腹腔注射。(3)氧惊厥潜伏期测量用大鼠固定器将大鼠躯干固定，单独置于加压舱内，接好测脑电图的电极，其中接地电极导线接于大鼠前额皮毛。打开生理记录仪(P0WERLAB/8SP， AWnstrument公司，澳大利亚)，运行脑电记录软件。用纯氧洗舱(lL/s)，待测氧仪显示舱内氧浓度达到99%以上时，开始以lATA/min的速度勻速加压至6ATA，保持压力稳定，开始记录脑电，持续暴露至脑电图上出现首次放电(FED)及惊厥大发作，记录FED出现的时间。 舱内温度维持在22 ^°C。暴露结束后，以lATA/min的速度勻速减压至常压，出舱。结果如图2所示，依达拉奉显著延长FED潜伏期，表明依达拉奉可有效预防氧惊厥的发作。实施例2依达拉奉对大鼠皮层和海马中生化指标的影响实验1)动物准备及分组健康雄性SD大鼠，购于美国比凯公司，第二军医大学动物中心提供，饲养至体重250士 IOg用于实验。将动物随机分配到三组中，分别为正常对照组、生理盐水对照组和依达拉奉组。正常对照组不做任何处理，生理盐水组腹腔注射与依达拉奉等量的生理盐水后进行高压氧暴露，依达拉奉组腹腔注射依达拉奉(3mg/kg)后进行高压氧暴露。高压氧暴露生理盐水组和依达拉奉组动物给药30min后进舱，洗舱、加压及稳压过程同“实施例1”。暴露时间为20min。暴露结束后，以lATA/min的速度勻速减压至常压， 出舱。2)取材大鼠出舱后，腹腔注射过量戊巴比妥(100mg/kg)使大鼠安乐死，迅速断头，取出皮层和海马组织，液氮冷冻后放入-80 V冰箱保存。3)脑组织中丙二醛(MDA)的测定取适当冻存的皮层和海马，用Western及IP细胞裂解液(碧云天公司，江苏)进行勻浆，组织重量占裂解液的比例为10%。勻浆完毕后用 BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天公司，江苏)测定样品的蛋白浓度。准备好MDA检测试剂盒(碧云天公司，江苏)后，在离心管内加入0. Iml勻浆液、裂解液或PBS等适当溶液作为空白对照，加入0. Iml不同浓度标准品用于制作标准曲线，加入0. Iml样品用于测定；随后加入0. 2ml MDA检测工作液。混勻后，100°C或沸水浴加热15min。水浴冷却至室温，IOOOg 室温离心lOmin。取200 μ 1上清加入到96孔板中，随后用酶标仪在532nm测定吸光度。计算出样品溶液中的MDA含量后，通过单位重量的蛋白含量来表示样品中的MDA含量。结果表明依达拉奉可显著降低脑组织中MDA的水平(见图幻，说明依达拉奉可抑制高压氧导致的脂质氧化损伤。4)脑组织中H2A和NO的测定①H2A的测定取皮层和海马，按照每IOmg组织加入200微升Wfestern及IP细胞裂解液(碧云天公司，江苏)的比例进行勻浆。4°C约12000g 离心5min，取上清。先把过氧化氢检测试剂在冰上或冰水浴上融解，在检测孔或检测管内加入50 μ 1样品或标准品，然后在每个孔内加入100 μ 1过氧化氢检测试剂。轻轻振荡或敲打混勻，室温放置30min。然后立即测定A560，最后根据标准曲线计算出样品中过氧化氢的浓度。②NO的测定将组织样品勻浆，12000g离心5min，取上清。用勻浆液把IOmmol/L KNO2稀释成2、5、10、20、50ymol/L。准备好NO测定试剂盒(碧云天公司，江苏)，按照说明书依次加入标准品、样品和检测试剂，室温(25°C)孵育IOmin后测定A540。根据标准品曲线计算出样品中NO的浓度。结果表明依达拉奉可显著降低脑组织H2A和NO水平(见图4)，说明依达拉奉可抑制高压氧导致的脂质氧化损伤。5)脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和过氧化氢酶 (CAT)三种抗氧化酶的测定①SOD的检测动物用生理盐水(含0. 16mg/ml肝素钠)灌流清除血液后获取皮层和海马。取适量组织加入碧云天的Western及IP细胞裂解液(碧云天公司，江苏)在冰浴中进行勻浆(组织浓度为10%)，4°C离心取上清。准备好SOD检测试剂盒(碧云天公司，江苏)，在96孔板中加入样品和各种空白对照孔，加入酶工作液后充分混勻。37°C孵育20min，然后在450nm测定吸光度，计算出SOD酶活力。②GI3x的检测样品准备同SOD检测。准备好试剂盒后，在离心管中依次加入检测缓冲液、待测样品和GI5x检测工作液，混勻。加入4微升15mmol/L过氧化物试剂溶液后，用振荡器适当混勻。在25°C下测定A340，每隔30秒测定一次，连续测定:3min。计算GPx酶活力。③CAT的测定取皮层和海马，用Western及IP细胞裂解液(碧云天公司，江苏)裂解组织(组织浓度为10%)，再加入等体积的过氧化氢酶检测缓冲液稀释样品。准备好CAT检测试剂盒(碧云天公司，江苏)，先测定标准曲线。参考试剂盒说明书，取10 μ 1样品至1. 5ml塑料离心管中，加入过氧化氢酶检测缓冲液至体积为40微升，混勻。再加入10微升250mmol/L过氧化氢溶液，用移液器迅速混勻。25°C反应:3min。结束后加入450 μ 1过氧化氢酶反应终止液，颠倒混勻以终止反应。立即在另一塑料离心管内加入40 μ 1过氧化氢酶检测缓冲液，再加入10 μ 1已终止并混勻的上述反应体系，混勻，从中取10 μ 1加入到96孔板中的一个孔内。加入200 μ 1 显色工作液。25°C孵育20min后测定A520，计算CAT活性。结果表明，和对照组相比，依达拉奉可显著提高脑组织中S0D、GPx、CAT三种抗氧化酶的水平(见图幻，减轻神经细胞的氧化损伤。6)脑组织中一氧化氮合成酶(NOS)的测定动物用生理盐水(含0. 16mg/ml肝素钠)灌流清除血液后获取皮层和海马。取0. Ig组织加9倍的生理盐水0. 9ml制备成10% 组织勻浆，3000rpm离心lOmin。取上清50 μ 1测NOS活力。准备好NOS测定试剂盒(南京建成公司，南京)，Stnos(Snos)空白管、tnos测定管、iNos(诱导型nos)空白管和iNos 测定管，在测定管中加入双蒸水、上清液和各种试剂，混勻，在530nm处测定各管的吸光度值，计算TNOS和iNOS值，cN0S(结构型N0S)值即为TNOS值与iNOS值之差。结果表明依达拉奉可显著降低脑组织的TNOS和cNOS水平(见图6)，减轻神经细胞及血管内皮细胞的氧化损伤。以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
权利要求
1.一种依达拉奉的用途，其特征在于，用于制备预防氧惊厥的药物。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述依达拉奉的给药方式包括肌肉注射或静脉滴注。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物的剂型包括注射剂。
全文摘要
本发明公开一种依达拉奉的用途，用于制备预防氧惊厥的药物。本发明依达拉奉能有效提高抗氧化酶水平、清除氧自由基、抑制一氧化氮合酶活性，降低一氧化氮含量，从而有效预防氧惊厥的发生，适用于开发氧惊厥的预防药物。
文档编号A61P25/08GK102552249SQ20121000227
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月5日 优先权日2012年1月5日
发明者刘书林, 徐伟刚, 李昱, 李润平, 蔡志宇 申请人:中国人民解放军第二军医大学