疫苗组合物的制作方法

专利名称：疫苗组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及奈瑟氏球菌(Neisserial)免疫原性组合物和疫苗，它们的制备方法以及这种组合物在药物中的用途。更具体而言，它涉及包括抗原组合的疫苗组合物，正如在保护测定法或血清杀菌测定法中所测量的那样，其具有可使本发明的疫苗引发令人惊讶的良好免疫反应的性质。背景细菌中的奈瑟氏球菌菌株是很多人类病变的病原体，因此需要研制出可抗这些病原体的有效疫苗。特别是，淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)和脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)所引起的病变可通过接种疫苗而治疗。淋病奈瑟氏球菌是淋病的病原体，淋病是全世界所报道的最常见的性传播疾病之一，据估计每年有六千两百万个病例发病(Gertase等人，1998 Lancet 351 ； (Supp 1 3)2-4)。淋病的临床表现包括泌尿生殖道、咽喉或直肠粘膜炎症以及新生儿眼睛感染。妇女淋球菌(gonococcal)感染上升可导致不孕、子宫外妊娠、慢性盆腔炎和输卵管-卵巢脓肿形成。败血症、关节炎、心内膜炎和脑膜炎均与并发性淋病有关。大量淋球菌菌株对抗生素产生耐药性导致发病率以及与淋病有关的并发症增加。 用抗生素治疗淋病的吸引人的替代方案是利用接种疫苗而预防淋病。目前还没有抗淋病奈瑟氏球菌感染的疫苗。脑膜炎奈瑟氏球菌是一种重要的病原体，特别是在儿童和年轻人中。败血症和脑膜炎是侵入性脑膜炎球菌病(IMD)的最严重威胁生命的形式。这种疾病由于其较高的发病率和死亡率已经成为全世界的健康问题。根据荚膜多糖的抗原差异，已经鉴定出了 13种脑膜炎奈瑟氏球菌血清组，最普遍的是A、B和C，它们导致全世界90%的该疾病。血清组B是欧洲、美国和拉丁美洲几个国家中脑膜炎球菌病的最普遍原因。已经研制出了基于血清组A、C、W和Y的荚膜多糖的疫苗，它们表现出可控制脑膜炎球菌病的暴发(Peltola等人，1985PediatriCS76 ；91-96)。然而，血清组B的免疫原性较差，且仅主要诱导I gM同种型的短暂抗体反应(Ala’ Aldeen D和Cartwright K 1996， J. Infect. 33 ；153-157)。因此，目前还没有能够抗导致绝大多数温带国家中大多数该疾病的血清组B脑膜炎球菌的广泛有效的疫苗。尤为严重的是血清型B疾病在欧洲、澳洲和美洲的发生率日益增加，主要是在5岁以下的儿童中。抗血清组B脑膜炎球菌的疫苗的研制提出了一个特有的困难，即由于多糖荚膜与人神经细胞粘着分子的免疫学相似性导致其免疫原性较差。将疫苗生产的方案集中于脑膜炎球菌外膜的表面外露结构，但却被菌株之间这些抗原的显著变异所阻碍。进一步的研究采用由外膜小泡构成的疫苗，其包括很多构成细菌膜正常内含物的蛋白。这些的其中之一是抗脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B和C的VA-MENGOC- BC Cuban疫苗(Rodriguez 等人，1999Mem Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro 94 ;433_440)。设计这种疫苗用来抗古巴的侵入性脑膜炎球菌病，这种病不能通过使用荚膜多糖AC疫苗进行的接种程序而被消除。流行的血清组是B和C，且VA-MENGOC-BC 疫苗已经可以成功控制暴发，据估计该疫苗抗脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株的效能为83% (Sierra等人，19901η Neisseria，Walter Gruyter，Berlin，m. Atchman 等人(eds)p 129-134，Sierra 等人，1991， NIPH Ann 14;195_210)。该疫苗可有效抗特异性暴发，然而所引发的免疫反应不能抗脑膜炎奈瑟氏球菌的其它菌株。随后在拉丁美洲，在由同源和异源血清组B脑膜炎球菌菌株引起的流行病过程中进行的功效研究已在年龄稍大的儿童和成人中表现出一些功效，但它的有效性在感染危险最大的、年龄较小的儿童中明显偏低(Milagres等人，1994，Infect. Immun. 62 ； 4419-4424)。这种疫苗在具有多菌株地方病的国家，如UK效果怎样还不肯定。对抗异源菌株的免疫原性的研究仅证实了有限的交叉反应性血清杀菌活性，特别是在婴儿中(Tappero 等人，1999，JAMA 281 ；1520-1527)。第二种外膜小泡疫苗是在挪威，使用在斯堪的纳维亚流行的那些普遍血清型B 分离物研制的(Fredriksen等人，1991，NIPH Ann, 14 ；67-80) 该疫苗已在临床试验中进行了测试，并发现四个月后，它具有57%的保护功效(Bjune等人，1991，Lancet, 338 ； 1093-1096)。然而，外膜小泡在疫苗中的使用与某些问题有关。例如，OMV包括有毒的脂多糖且它们可包括免疫显性抗原，这些抗原或者是菌株特异性的，或者是可变表达的。已经描述过的几个方法都可用于克服外膜小泡制品疫苗的一些问题。WO 01/09350描述了例如通过降低毒性并修饰外膜小泡上存在的抗原而解决某些问题的方法。WO 01/52885描述了把外膜小泡与其它抗原组合在一起的可能性且包括了超过 2，000种潜在的奈瑟氏球菌蛋白列表，从该列表可推测研制出对更宽血清型范围都具有功效的疫苗。目前所用的抗-脑膜炎球菌疫苗存在着多种问题。基于蛋白的外膜疫苗倾向于特异性且仅对少数菌株有效。多糖疫苗也是次最优的，这是因为它们倾向于引发较差且短暂的免疫反应，特别是对血清组 BO^pow 等人 1986 ；Peltola 1998，Pediatrics 76 ；91-96)。奈瑟氏球菌感染提出了一个重要的保健问题，即对淋病奈瑟氏球菌而言，还没有可用的疫苗，或对脑膜炎奈瑟氏球菌而言，仅有有限的抗异源菌株的功效和能力的疫苗。显然需要研制抗奈瑟氏球菌感染更好的疫苗，它们能够改善目前所用疫苗的功效并抗更大范围的菌株。附图描述

图1.-对由tbpA和hsf表达被上调的重组脑膜炎奈瑟氏球菌菌株制备的OMV中的TbpA和Hsf的检测。通过用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析(4-20%梯度凝胶)分离 OMV 制品(10 μ g)。图2.-在大肠杆菌(E. coli)中产生的重组Hsf过客(passenger)结构域的检测， 10 μ g纯化的Hsf过客蛋白(第2和3道)通过12% SDS-PAGE凝胶上分离，并与分子量标记(第1道)相比较。
图3. -Hap过客纯度的分析，这是通过㈧考马斯染色，⑶银染，(C)抗_His5蛋白质印迹和(D)抗-大肠杆菌检测的。IOyg纯化抗原是在4-20%丙烯酰胺梯度凝胶上通过SDS-PAGE分离的。图4.-从脑膜炎奈瑟氏球菌菌株FAM20分离的FrpA和FrpC蛋白共有的序列相似性区。(A)脑膜炎奈瑟氏球菌菌株FAM20 RTX蛋白FrpA和FrpC的结构域组成。(B)从脑膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76获得的FrpA/C扩增产物。图5.-重组Frp23 (具有23个重复单位的FrpA/C保守区)抗原在大肠杆菌中的表达。用对照载体(pETMd)或重组构建体(分别为Frp3、Frp 13和Frp2;3)转化的大肠杆菌BL21DE3的非诱导(Ni)和诱导(I)的总细胞提取物的SDS-PAGE分析。用考马斯蓝(A) 将凝胶染色或将凝胶转移到硝化纤维素上并用抗_His6小鼠血清进行免疫检测。图6.-在大肠杆菌中表达的FHAB 2/3rd片段的优选DNA序列。图7.-来源于诱导大肠杆菌B121DE3提取物的重组FHAB 2/3rd的纯化。㈧纯化过程中的主要步骤。(B)对在纯化过程不同步骤采样的蛋白级分进行的SDS-PAGE分析。图8.-针对脑膜炎奈瑟氏球菌的FHAB 2/3r\ Hap、Hap过客结构域、Hsf和Hsf过客结构域抗原的抗-血清的粘附阻断活性。图9.-表示Hsf、TbpA和NspA在来源于不同脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的外膜小泡制品中的表达水平的考马斯蓝染色凝胶。第1道-分子量标记；第2道-从荚膜多糖被下调的菌株H44/76制备的外膜小泡；第3道-从荚膜多糖和PorA被下调的菌株H44/76制备的外膜小泡；第4道-从荚膜多糖和PorA被下调且NspA被上调的菌株H44/76制备的外膜小泡；第5道-从荚膜多糖和PorA被下调且Hsf被上调的菌株H44/76制备的外膜小泡；第6 道-从荚膜多糖和PorA被下调且TbpA被上调的菌株H44/76制备的外膜小泡；第7道-从荚膜多糖和PorA被下调且TbpA和Hsf被上调的菌株H44/76制备的外膜小泡；第8道-从荚膜多糖和PorA被下调且TbpA和NspA被上调的菌株H44/76制备的外膜小泡。详述本发明公开了奈瑟氏球菌抗原的特定组合，当它们组合在一起时，可使疫苗抗奈瑟氏球菌感染的功效令人惊讶地提高。奈瑟氏球菌感染要经历若干不同的阶段。例如，脑膜炎球菌的生活周期包括鼻咽定居、粘膜附着、进入血流、在血液中增殖、诱导中毒性休克、穿过血/脑屏障并在脑脊液和 /或脑脊膜中增殖。细菌表面上的不同分子参与感染周期的不同阶段。通过使用有效量参与奈瑟氏球菌感染的不同过程特定抗原的组合产生免疫反应，可获得具有令人吃惊的较高功效的奈瑟氏球菌疫苗。具体而言，来源于不同种类的特定抗原的组合可引发针对感染多个阶段的免疫反应，在这些不同种类的特定抗原中，有些参与附着到宿主细胞，有些参与铁的获得，有些是自体转运蛋白而有些是毒素。抗原的这种组合可令人吃惊地提高(优选协同提高)疫苗抗奈瑟氏球菌感染的功效，其中以最佳方式通过免疫反应针对细菌的不止一个功能。疫苗的功效可通过多种测定法评价。在动物模型中进行的保护测定法是本领域熟知的。此外，血清杀菌测定法(SBA)是最普遍认可的免疫学标记，以评价脑膜炎球菌疫苗的功效(Perkins 等人，J Infect Dis. 1998，177 :683-691)。抗原的某些组合(例如，某些自体转运蛋白和某些铁获得蛋白的组合)可导致动物模型测定法中的保护提高和/或协同产生更高的SBA效价。不希望受到理论的束缚，抗原的这种协同组合可通过抗原组合所产生免疫反应的许多特性实现。抗原本身在奈瑟氏球菌细胞上通常是表面外露的，倾向于保守且未以最佳杀菌反应所需的充足量存在于表面细胞上，该最佳杀菌反应由单独抗该抗原引起的抗体产生。将本发明抗原组合起来生产的制剂可导致杀菌抗体的有利组合，这些杀菌抗体与奈瑟氏球菌细胞的相互作用超出了临界阈值。在这种临界水平下，足量性质良好的抗体与细菌表面结合，从而通过补体有效杀死细菌并因此见到更高水平的杀菌作用。因为血清杀菌测定法(SBA)可密切反映疫苗候选物的功效，因此通过抗原组合获得的良好SBA效价可很好地表征包括该抗原组合的疫苗的保护功效。本发明涉及分离的或与另一抗原共同富含于混合物中的两种抗原组合的用途。当组合在一起时，这种抗原组合有利地相互作用，且优选协同引发杀菌活性更高的免疫反应(正如在血清杀菌测定法或 SBA中所测量的那样)，且优选高于由抗原单独引发的加成反应，更优选高于由至少1.2、 1. 5、2、3、4、5、6、7、8、9个因子，最优选由至少10个因子引发的加成反应。本发明的其它优点在于免疫原性组合物中来源于不同蛋白家族的本发明抗原组合可抗更大范围的菌株。本发明涉及包括很多(两种或多种)蛋白的免疫原性组合物，所述蛋白选自至少两个不同种类的蛋白，它们在奈瑟氏球菌中具有不同的功能。这种蛋白种类的例子是粘附素、自体转运蛋白、毒素、整合外膜蛋白和狗获得蛋白。本发明的疫苗组合在抗同源奈瑟氏球菌菌株(衍生抗原的菌株)且还优选在抗异源奈瑟氏球菌菌株的疫苗功效方面显示出令人吃惊的提高。本发明提供免疫原性组合物，它包括至少或恰好两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种不同的抗原，这些抗原选自下列至少或恰好两个、三个、四个或全部五个选自下述种类的抗原·至少一种奈瑟氏球菌粘附素；·至少一种奈瑟氏球菌自体转运蛋白；·至少一种奈瑟氏球菌毒素；·至少一种奈瑟氏球菌!^e获得蛋白；·至少一种奈瑟氏球菌膜相关蛋白(优选外膜蛋白，特别是整合外膜蛋白)。优选，本发明提供包括至少或恰好两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种不同奈瑟氏球菌抗原的免疫原性组合物。最优选这些抗原选自下列的至少或恰好两组、三组、四组或五组选自下述蛋白·选自 FhaB、NspA, PilC, Hsf、Hap、MafA, MafB, 0mp26、NMB0315、NMB 0995、NMB 1119和NadA的至少一种奈瑟氏球菌粘附素； 选自Hsf、Hap、IgA蛋白酶、AspA和NadA的至少一种奈瑟氏球菌自体转运蛋白；·选自 FrpA、FrpC、FrpA/C、VapD、匪-ADPRT、以及 LPS 免疫型 L2 和 LPS 免疫型 L3 之一或两者的至少一种奈瑟氏球菌毒素；·选自 TbpA、TbpB, LbpA, LbpB, HpuA, HpuB, Lipo28 (GNA2132)、Sibp、NMB0964、 NMB0293, FbpA, Bcp、BfrA, BfrB和P2086 (XthA)的至少一种奈瑟氏球菌Fe获得蛋白；或·选自 PilQ、0MP85、FhaC、NspA、TbpA、LbpA、TspA、TspB、TdfH、PorB、MltA、HpuB、CN 102552895 A
说明书
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HimD、HisD、GNA1870、0stA、HlpA(GNA1946)、匪B 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA和PldA的至少一种奈瑟氏球菌膜相关蛋白，优选外膜蛋白，优选整合外膜蛋白。本发明的抗原都是分离的，即它们被人工改变。优选，它们被纯化至某种程度，最优选超过40、50、60、70、80、90、95或99%纯度(与本发明免疫原性组合物的其它组分组合前)。优选本发明的免疫原性组合物包括至少一种奈瑟氏球菌粘附素和至少一种奈瑟氏球菌自体转运蛋白且任选包括奈瑟氏球菌毒素、奈瑟氏球菌1 获得蛋白或奈瑟氏球菌膜相关蛋白(优选整合外膜蛋白)。优选所述抗原选自上述抗原。优选本发明的免疫原性组合物包括至少一种奈瑟氏球菌粘附素和至少一种奈瑟氏球菌毒素且任选包括奈瑟氏球菌自体转运蛋白、奈瑟氏球菌狗获得蛋白或奈瑟氏球菌膜相关蛋白(优选整合外膜蛋白)。优选所述抗原选自上述抗原。优选本发明的免疫原性组合物包括至少一种奈瑟氏球菌粘附素和至少一种奈瑟氏球菌1 获得蛋白且任选包括奈瑟氏球菌毒素、奈瑟氏球菌自体转运蛋白或奈瑟氏球菌膜相关蛋白(优选整合外膜蛋白)。优选所述抗原选自上述抗原。优选本发明的免疫原性组合物包括至少一种奈瑟氏球菌粘附素和至少一种奈瑟氏球菌膜相关蛋白(优选整合外膜蛋白)且任选包括奈瑟氏球菌毒素、奈瑟氏球菌狗获得蛋白或奈瑟氏球菌自体转运蛋白。优选所述抗原选自上述抗原。优选本发明的免疫原性组合物包括至少一种奈瑟氏球菌自体转运蛋白和至少一种奈瑟氏球菌毒素且任选包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌狗获得蛋白或奈瑟氏球菌膜相关蛋白(优选整合外膜蛋白)。优选所述抗原选自上述抗原。优选本发明的免疫原性组合物包括至少一种奈瑟氏球菌自体转运蛋白和至少一种奈瑟氏球菌狗获得蛋白且任选包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌毒素或奈瑟氏球菌膜相关蛋白(优选整合外膜蛋白)。优选所述抗原选自上述抗原。优选本发明的免疫原性组合物包括至少一种奈瑟氏球菌自体转运蛋白和至少一种奈瑟氏球菌膜相关蛋白(优选整合外膜蛋白)且任选包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌Fe获得蛋白或奈瑟氏球菌毒素。优选所述抗原选自上述抗原。优选本发明的免疫原性组合物包括至少一种奈瑟氏球菌毒素和至少一种奈瑟氏球菌狗获得蛋白且任选包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌自体转运蛋白或奈瑟氏球菌膜相关蛋白(优选整合外膜蛋白)。优选所述抗原选自上述抗原。优选本发明的免疫原性组合物包括至少一种奈瑟氏球菌毒素和至少一种奈瑟氏球菌膜相关蛋白(优选整合外膜蛋白)且任选包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌自体转运蛋白或奈瑟氏球菌毒素。优选所述抗原选自上述抗原。优选本发明的免疫原性组合物包括至少一种奈瑟氏球菌!^e获得蛋白和至少一种奈瑟氏球菌膜相关蛋白(优选整合外膜蛋白)且任选包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌自体转运蛋白或奈瑟氏球菌毒素。优选所述抗原选自上述抗原。优选在本发明的免疫原性组合物中提供全部5组抗原。当具体提到蛋白时，优选是天然、全长的蛋白及其天然变体(即，从奈瑟氏球菌， 优选脑膜炎球菌菌株获得的天然蛋白)，它还可包括其抗原性片段(特别是在亚单位疫苗中)。这些是含有或包括从蛋白氨基酸序列上连续获取的至少10个氨基酸，优选20个氨基酸，更优选30个氨基酸，更优选40个氨基酸或最优选50个氨基酸的片段(此处常常具体描述的)。此外，抗原性片段是指与抗奈瑟氏球菌全长蛋白产生的抗体或通过用奈瑟氏球菌感染哺乳动物宿主产生的抗体进行免疫反应的片段。抗原性片段还包括当以有效剂量施用时，可针对奈瑟氏球菌感染引发保护性免疫反应的片段，更优选它可防止脑膜炎奈瑟氏球菌和/或淋病奈瑟氏球菌感染，最优选它可防止脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B感染。本发明还包括本发明奈瑟氏球菌蛋白的重组融合蛋白，或其片段。这些可将不同的奈瑟氏球菌蛋白或其片段组合在同一多肽中。可选择性地，本发明还包括奈瑟氏球菌蛋白或其片段的个体融合蛋白，即具有异源序列，如T-细胞表位或纯化标记的供给者，例如 β -半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-转移酶、绿色荧光蛋白(GFP)、附加表位如FLAG、myc标记、聚组氨酸、或病毒表面蛋白如流感病毒血细胞凝集素、破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197的融合蛋白。本发明的抗原NMB参照符号是指可从www. neisseria, org访问的序列参照符号。1.粘附素粘附素包括FhaB(W0 98/02547)、NadA(J. Exp. Med (2002) 195 :1445 ;NMB 1994)、也可称作 NhhA 的 Hsf (NMB 0992) (W0 99/31132)、Hap (NMB1985) (W0 99/55873)、 NspA(W096/29412), MafA(NMB 0652)和 MafB(NMB 0643) (Annu Rev Cell Dev Biol. 16 ； 423-457(2000) ；Nature Biotech 20 ；914-921 (2002)), 0mp26 (NMB 0181)、NMB 0315、NMB 0995、NMB 1119 和 PilC(Mol. Microbiol. 1997,23 ；879-892)。这些是参与奈瑟氏球菌与宿主细胞表面结合的蛋白。Hsf是粘附素的其中一个例子，同时也是自体转运蛋白。因此本发明的免疫原性组合物可包括Hsf与其它自体转运蛋白的组合，其中Hsf发挥其粘附素的作用。这些粘附素可来源于脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌或其它奈瑟氏球菌菌株。本发明还包括来源于奈瑟氏球菌的其它粘附素。FhaB此抗原已在WO 98/02547SEQ ID NO :38 (核苷酸3083-9025)中描述-还可参见 NMB 0497。本发明人已经发现!^haB在诱导单独的抗-粘附抗体方面特别有效，且特别是与本发明其它抗原组合时。虽然可使用全长冊动，本发明人已经发现特定的C-末端截短物至少令人惊讶地有效且优选甚至在对交叉-菌株的作用方面更有效。已经有利地显示出这种截短物更易克隆。本发明的^aB截短物通常与!^haB分子的N-末端三分之二，优选位于 1200-1600位置、更优选1300-1500位置、最优选1430-1440位置的新的C-末端相对应。具体的实施方案在1433或1436处具有C-末端。因此，本发明的这种!^haB截短物和包括这种截短物的疫苗是本发明的独立方面而且是本发明组合免疫原性组合物的组分。N-末端还可被截短达10、20、30、40或50个氨基酸。2.自体转运蛋白自体转运蛋白通常由信号序列、过客结构域和用于附着外膜的锚定结构域组成。自体转运蛋白的例子包括 Hsf (W0 99/31132) (NMB0992)、HMW、Hia(van Ulsen 等人， Immunol. Med. Microbiol. 200132 ；53-64), Hap (NMB1985) (WO 99/55873 ；van Ulsen 等人，Immunol. Med. Microbiol. 200132 ；53-64) 、UspA、UspA2> NadA (NMB 1994) (Comanducci 等人，J. Exp. Med. 2002 195 ； 1445-1454) > AspA (Infection and Immunity 2002,70(8)；4447-4461 ；NMB 1029)、Aida-I 样蛋白、SSh_2 和！"sh。NadA (J. Exp. Med (2002) 195 1445) 是自体转运蛋白的另一个例子，同时也是粘附素。本发明的免疫原性组合物因此包括NadA 与粘附素的组合，其中NadA作为自体转运蛋白发挥作用。这些蛋白可来源于脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌或其它奈瑟氏球菌菌株。本发明还包括来源于奈瑟氏球菌的其它自体转运蛋白。HsfHsf具有与自体转运蛋白共用的结构。例如，来源于脑膜炎奈瑟氏球菌菌株 H44/76的Hsf由氨基酸1-51组成的单一序列、表面外露且包括可变区(氨基酸52-106、 121-124、191-210和230-234)的成熟蛋白(氨基酸52-479)氨基末端的头区、颈区(氨基酸480-509)、疏水的α-螺旋区(氨基酸518-529)和其中4个跨膜链跨越外膜的锚定结构域(氨基酸539-591)。虽然全长Hsf可用于本发明的免疫原性组合物中，但是各种Hsf截短物和缺失物也可有利地使用，这取决于疫苗的类型。当Hsf用于亚单位疫苗中时，优选使用可溶性过客结构域的一部分；例如氨基酸 52-479的完全结构域，最优选其保守部分，例如氨基酸134-479的特别有利的序列。Hsf的优选形式可被截短，以缺失在WO 01/55182中公开的蛋白可变区。优选的变体可包括在WO 01/55182中限定的1、2、3、4、或5个可变区的缺失。在N或C末端的任何一端或两端，上述序列和下面描述的那些可被伸展或截短达1、3、5、7、10或15个氨基酸。Hsf的优选片段因此包括Hsf的整个头区，优选包含氨基酸52-473。Hsf的其它优选片段包括表面外露的头区，它包括一个或多个下列氨基酸序列52-62、76-93、116-134、 147-157、157-175、199-211、230-252、252-270、284-306、328-338、362-391、408-418、 430-440 和 469-479。当Hsf存在于外膜小泡制品中时，它可被表达为全长蛋白或优选被表达为由氨基酸1-51和134-591的融合体组成的有利变体(产生氨基酸序列134-C末端的成熟外膜蛋白)。Hsf的优选形式可被截短，从而缺失WO 01/55182中公开的蛋白可变区。优选的变体可包括在W001/55182中限定的1、2、3、4、或5个可变区的缺失。优选第一和第二个可变区缺失。优选的变体是使氨基酸序列52-237或Μ-237之间的残基缺失，更优选使氨基酸 52-133或55-133之间的残基缺失。所述成熟蛋白可缺少信号肽。Hap对来源于脑膜炎奈瑟氏球菌的Hap-样蛋白进行的计算机分析显示出至少3个结构域。以来源于菌株Η44/76的Hap-样序列为例，包含氨基酸1_42的结构域1编码自体转运蛋白家族特征件的sec依赖件信号肽,包含氨基酸43-950的结构域2编码很可能表面外露且易进入免疫系统的过客结构域，包含残基951-C末端(1457)的结构域3被预测编码可能装配成桶-样结构且被锚定在外膜中的β-链。因为结构域2可能是表面外露、良好保守的(在所有试验菌株中超过80% )且可作为亚单位抗原在大肠杆菌中产生，因此它代表了目标疫苗候选物。因为结构域2和3很可能是表面外露且良好保守的(Pizza等人，(2000)， Science 287 :1816-1820)，因此它们代表了目标疫苗候选物。结构域2被称作过客结构域。本发明的免疫原性组合物可包括全长Hap蛋白，优选被掺入到OMV制品中。本发明的免疫原性组合物还可包括Hap的过客结构域，在菌株H44/76中，其由氨基酸残基43-950组成。Hap的这一片段可特别有利地用于本发明的亚单位组合物中。在N或C末端的任何一端或两端，Hap过客结构域的上述序列可被伸展或截短达1、3、5、7、10、15、20、25、或30个
氨基酸。3.铁获得蛋白铁获得蛋白包括TbpA(NMB 0461) (W0 92/03467，US5912336, W093/06861 和 EP 586266)、TbpB (NMB 0460) (W0 93/06861 和 EP 586266)、LbpA (NMB 1540) (Med Microbiol(1999) 32 :1117)、 LbpB(NMB1541) (W0/99/09176)、 HpuA(U73112. 2) (Mol Microbiol. 1997,23 ；737-749)、HpuB (NC. 003116. 1)(Mol Microbiol. 1997,23 ；737-749)、 也被称作 XthA 的 P2086(NMB 0399)(13th International Pathogenic Neisseria Conference 2002)、FbpA (NMB 0634)、FbpB, BfrA (NMB 1207)、BfrB (NMB 1206)、也被称作 GNA2132 的 Lipo28(NMB 2132)、Sibp(NMB1882)、HmbR、HemH、Bcp (NMB 0750)、Iron (III)ABC 转运蛋白-通透酶蛋白(Tettelin 等人，Science 287 ；1809-1815 2000)、Iron (III) ABC 转运蛋白-周质(Tettelin 等人，Science 287 ；1809-1815 2000)、TonB 依赖性受体(NMB 0964和NMB 0293) CTettelin 等人，Science 287 ；1809-1815 2000)和转铁蛋白结合蛋白相关蛋白(Tettelin等人，Science 287 ；1809-1815 2000)。这些蛋白可来源于脑膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌或其它奈瑟氏球菌菌株。本发明还包括来源于奈瑟氏球菌的其它铁获得蛋白。TbpATbpA与TbpB相互作用在奈瑟氏球菌外膜上形成蛋白复合体，其结合转铁蛋白。在结构上，TbpA包括具有TonB箱的胞内N-末端结构域和活塞结构域，该活塞结构域为多个由短胞内环和较长的胞外环连接的跨膜β链。已经区别了 TbpB的两个家族，它们分别具有较高的分子量和较低的分子量。TbpB 的高和低分子量形式与TbpA的不同家族结合，可以同源性为基础区别该不同家族。尽管它们的分子量相似，但还是将它们称作高分子量和低分子量家族，这是因为它们与TbpB的高或低分子量形式结合(Rokbi 等人，FEMS Microbiol. Lett. 100 ；51，1993)。术语 TbpA (高) 和TbpA(低)用于表示TbpA的这两种形式，且与TbpB相似。本发明的免疫原性组合物可包括来源于脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、B、C、Y和W-135的TbpA和TbpB以及来源于包括淋病奈瑟氏球菌在内的其它细菌的铁获得蛋白。转铁蛋白结合蛋白TbpA和TbpB已经被分别称作 Tbpl 和 Tbp2 (Cornelissen 等人，Infection and Immunity 65 ；822，1997)。TbpA包括若干不同的区。例如，就来源于脑膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76的TbpA 而言，氨基末端的186个氨基酸形成内部球状结构域，22个β链跨越膜，形成β桶结构。 这些是由短胞内环和较大的胞外环连接的。胞外环2、3和5具有最高程度的序列变异性且环5是表面外露的。环5和4参与配体结合。TbpA的优选片段包括TbpA的胞外环。使用来源于脑膜炎奈瑟氏球菌菌株Η44/76 的TbpA序列，这些环与环1的氨基酸200-202、环2的氨基酸226-303、环3的氨基酸 ；348-395、环4的氨基酸438-471、环5的氨基酸512-576、环6的氨基酸609-625、环7的氨基酸661-671、环8的氨基酸707-723、环9的氨基酸769-790、环10的氨基酸814-844和环 11的氨基酸872-903相对应。在序列对比后，在其它Tbp蛋白中的相应序列也可构成优选片段。最优选的片段可包括构成TbP的环2、环3、环4或环5的氨基酸序列。
当本发明的免疫原性组合物包括TbpA时，它优选同时包括TbpA(高)和 TbpA(低)。虽然优选TbpA存在于OMV疫苗中，但它也可以是亚单位疫苗的一部分。例如，可被引入到本发明免疫原性组合物中的分离的铁获得蛋白也是本领域熟知的(W000/25811)。 它们可在细菌宿主中表达，使用洗涤剂提取(例如2% Elugent)并通过亲和层析或使用本领域熟知的标准柱层析技术纯化(OaWiill等人，Biochem J. 2002364 ；613-6)。当TbpA存在于OMV疫苗中时，它的表达可通过此处讨论的基因技术上调，或可优选通过亲代菌株在下述铁有限条件下生长而被上调。该方法还可导致可变铁-调节蛋白， 特别是FrpB的上调，其可变为免疫显性的且它因此可按下面所述有利地下调这种蛋白(特别是FrpB)的表达(且优选使编码这种蛋白的基因缺失)，以确保本发明的免疫原性组合物引发抗存在于大范围奈瑟氏球菌菌株中的抗原的免疫反应。它优选具有存在于免疫原性组合物中的TbpA (高)和TbpA (低)，且优选这是通过将来源于表达TbpA可选择形式的两种菌株的OMV混合获得的。4.毒素毒素包括FrpA (匪B 0585 ；NMB 1405)、FrpA/C (见下面的定义)、FrpC (NMB 1415 ；NMB 1405) (W0 92/01460), NM-ADPRT (NMB 1343) (13thInternational Pathogenic Neisseria Conference 2002 Masignani 等人，pl35)、VapD (NMB 1753)、脂多糖(LPS ；也被称作脂低聚糖或LOQ免疫型L2和LPS免疫型L3。FrpA和FrpC所含的区在这两个蛋白之间是保守的且所述蛋白的优选片段是含有该保守片段的多肽，优选含有FrpA/C序列的氨基酸227-1004。这些抗原可来源于脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌或其它奈瑟氏球菌菌株。本发明还包括来源于奈瑟氏球菌的其它毒素。在可选择性的实施方案中，毒素可包括参与毒性调节的抗原，例如在脂多糖合成中起作用的OstA。FrpA 禾口 FrpC脑膜炎奈瑟氏球菌编码两种RTX蛋白，它们被称作FrpA和FrpC，是在铁有限条件下分泌的(Thompson 等人，(1993) J. Bacteriol. 175 :811-818 ;Thompson 等人，(1993) Infect. Immun. 61 =2906-2911) RTX(重复毒素)蛋白家族在靠近它们的C-末端处共有下列一致序列的一系列9个氨基酸重复单位Leu Xaa Gly Gly Xaa Gly(Asn/Asp) AspXaa(LXGGXGN/dDX)。大肠杆菌HlyA中的重复单位被认为是Ca2+结合的位点。正如在图 4中所描绘的，脑膜炎球菌FrpA和FrpC蛋白，正如在菌株FAM20中所表征的，在它们的中心和C-末端区共有广泛的氨基酸相似性但在N-末端的相似性(如果有的话)非常有限。此外，由于9个氨基酸基序的重复(在FrpA中重复13次、在FrpC中重复43次)，在FrpA和 FrpC之间保守的区显示出某些多态性。本发明的免疫原性组合物可包括全长FrpA和/或FrpC或优选，含有在FrpA和 FrpC之间保守的序列的片段。所述保守序列是由9个氨基酸的重复单位构成的。本发明的免疫原性组合物优选包括多于3个重复单位、多于10个重复单位、多于13个重复单位、多于20个重复单位或多于23个重复单位。这种截短物具有较之全长分子更有利的性质且包含这种抗原并被掺入到本发明的免疫原性组合物中的疫苗形成本发明的独立方面。
在FrpA和FrpC之间保守的序列被命名为FrpA/C，且当FrpA或FrpC形成本发明免疫原性组合物的组分时，可有利地使用FrpA/C。FrpA序列的氨基酸277-1004是优选的保守区。在N或C末端的任何一端或两端，上述序列可被伸展或截短达1、3、5、7、10、15、20、 25、或30个氨基酸。LPSLPS (脂多糖，也被称作LOS-脂低聚糖)是奈瑟氏球菌外膜上的内毒素。已知LPS 的多糖部分可诱导杀菌抗体。LPS低聚糖部分内的异质性在不同的奈瑟氏球菌菌株之间产生结构和抗原多样性 (Griffiss等人，Inf. Immun. 1987 ；55 :1792-1800)。这已被用于将脑膜炎球菌菌株细分成 12 个免疫型(Scholtan 等人，JMed Microbiol 1994,41 :236-243)。免疫型 L3、L7 和 L9 在免疫学方面是相同的且在结构上是相似的(或甚至是相同的)并因此已被命名为L3、7、 9(或，为了本说明书的目的，统称为“L3”)。脑膜炎球菌LPS L3、7、9(L 3)、L2和L5可通过唾液酸化，或通过加入胞苷5 ‘- 一磷酸-N-乙酰基神经氨酸而被修饰。虽然L2、L4和 L6LPS在免疫学方面是可区别的，但它们在结构上相似，且在此处提到L2时，L4或L6在本发明的范围内可被任选替代。见M.P.Jenni ngs等人，Microbiology 1999，145，3013-3021 和Mol Microbiol 2002，43 :931_43，其中进一步举例说明了 LPS的结构和异质性。当LPS，优选脑膜炎球菌LPS包括在本发明的疫苗中时，优选且有利地存在免疫型L2和L3之一或两者。LPS优选存在于外膜小泡中(优选用低百分比的洗涤剂，更优选 0-0. 5%,0. 02-0. 4%,0. 04-0. 3%,0. 06-0. 2%,0. 08-0. 15%或 0. 1%，最优选脱氧胆酸盐 [D0C]提取小泡时)，还可以是亚单位疫苗的一部分。LPS可使用熟知的过程，包括热水-苯酚过程分离(Wesphal 和 Jann Meth. Carbo. Chem. 5 ；83-91 1965)。还可见 Galanos 等人， Eur J Biochem 9 :245_249，和 Wu 等人，1987，Anal Bio Chem 160:281-289。LPS 可简单使用或与T-细胞表位的来源，如破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM-197或OMV外膜蛋白缀合使用。使分离的LOS缀合的技术也是已知的(见，例如，EP 941738，其引入此处作为参考)。当LOS(特别是本发明的LOQ存在于疱制剂中时，优选通过使LOS与也存在于疱制剂上的一种或多种外膜蛋白(例如，脑膜炎球菌中的PorA或PorB)缀合的方法使LOS原位缀合。该方法可有利地提高疱制剂内LOS抗原的稳定性和/或免疫原性(提供T-细胞帮助)和/或抗原性-因此以其保护性最强的构象为非T-依赖性低聚糖免疫原提供T-细胞帮助-如在其天然环境中的、脑膜炎球菌外膜表面上的L0S。此外，LOS在疱内的缀合可导致LOS解毒(脂类A部分被稳定埋藏在外膜中，因此很少引起毒性)。因此，这里提到的从htrB_或msbB_突变体中分离疱，或通过向组合物中加入多粘菌素B的无毒肽功能性等价物的解毒方法(见 WO 93/14115, WO 95/03327、Velucchi 等人，(1997) J Endotoxin Res 4:1-12，和EP 976402，多粘菌素B的无毒肽功能性等价物的进一步描述-特别是(序列 KTKCKFLKKC，其中2个半胱氨酸形成二硫键)肽SAEP 2的使用)可能并不是必需的(但其可被加入到组合中用于增加安全性)。因此，本发明人已经发现包括疱的组合物可形成用于治疗或预防由衍生疱的生物所引起疾病的疫苗基础，其中存在于疱中的LOS已以疱内模式与同时存在于疱中的外膜蛋白缀合，其中这种疫苗基本上是无毒的且能够诱导抗其天然环境中的LOS的T-依赖性杀菌反应。
本发明因此进一步提供这种疱内LOS缀合的脑膜炎球菌疱制品。这种疱制品是否可从正极讨论的细菌(见WO 01/09350)中被分离出来，然后经过已知的缀合化学过程使LOS低聚糖部分上的基团(例如，NH2或C00H)与疱外膜蛋白上的基团(例如，NH2或C00H)缀合还在讨论。可使用利用戊二醛、甲醛、或戊二醛/甲醛混合物的交联技术，但优选使用选择性更强的化学过程如EDAC或EDAC/NHS(J. V. Staros, R. W.Wright 禾口 D. M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodi imide-mediated coup ling reactions.Analytical chemistry 156 220-222(1986)；和Bioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson(1996)pp 173-176)。可使用的、能够在LOS与蛋白分子之间生成共价键的其它缀合化学过程或处理在EP 941738 中描述。优选疱制品在没有荚膜多糖存在的条件下缀合。所述疱可从不(按照下面所述天然地或经由突变)产生荚膜多糖的菌株中分离，或可从绝大多数且优选全部污染荚膜多糖中纯化。以这种方式，疱内LOS缀合反应更加有效。优选存在于疱中的超过10、20、30、40、50、60、70、80、90、或95%的LOS是交联的/
缀合的。疱内缀合应优选整合下列方法的1、2或全部3个步骤缀合pH应大于pH 7.0， 优选大于或等于PH 7.5(最优选在pH 9下)；在反应过程中应当维持1-5%、优选2-4%、 最优选约3%蔗糖的条件；在缀合反应中应当将NaCl降到最低，优选0. 1M、0. 05M、0. 01M、 0. 005M、0. 001M、且最优选根本不存在。所有这些方法特征可确保在整个缀合过程中疱均保持稳定且保持在溶液中。EDAC/NHS缀合方法是疱内缀合的优选方法。EDAC/NHS优于甲醛，甲醛可交联至非常高的程度，由此不利地影响滤过率。EDAC与羧酸(如LOS中的KD0)反应，产生活性酯中间体。在有胺亲核试剂(如外膜蛋白，如PorB中的赖氨酸)存在的条件下，酰胺键是用异脲副产物的释放形成的。然而，EDAC-介导的反应的效能可通过Sul fo-NHS酯中间体的形成而增加。Sulfo-NHS酯在水溶液中存在的时间比EDAC单独与羧酸盐反应形成的活性酯要长。因此，更高产率酰胺键的形成可使用这种两阶段方法实现。EDAC/NHS缀合在 J. V. Staros, R. W. Wright 禾口 D. M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156 :220-222(1986)；禾口Bioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson(1996)pp 173-176 中讨论。优选在反应中使用0. 01-5mg EDAC/mg疱、更优选0. 05-lmg EDAC/mg疱。所用EDAC 的量取决于存在于样品中的LOS量，而其又依次取决于用于提取疱的脱氧胆酸盐(DOC) %。 在低％ DOC(例如，0. 1% )下，使用较大用量的EDAC(lmg/mg及以上)，然而在高％ DOC(例如0. 5% )下，使用较小用量的EDAC(0. 025-0. lmg/mg)以避免太多疱间交联。因此本发明的方法优选是用于产生疱内缀合LOS (优选脑膜炎球菌)的方法，该方法包括在有EDAC/NHS存在、pH 7. 0-pH 9. O (优选约pH 7. 5) ,1-5% (优选约3% )蔗糖、 且任选在基本上没有NaCl (如上所述)的条件下使疱缀合，并分离反应混合物中缀合疱的步骤。所述反应随后使用抗-LOS(例如，抗-L2或抗-U)mAb在反应混合物的蛋白质分离凝胶上进行，其显示随着反应时间的进行，疱中LOS的比例增大，LOS的分子量增加。
使用这种技术可回收的疱产率99%。人们发现EDAC是一种极好的疱内交联剂，这是因为它可使LOS与OMP充分交联， 用于提高LOS T-依赖性免疫原性，但不会使它交联至非常高的程度而导致如滤过率较差、 聚集和疱间交联的问题发生。所产生的疱的形态学与未缀合的疱相似(利用电子显微镜)。 此外，上述方案可避免发生过度交联(其可降低天然存在于疱表面上的保护性0ΜΡ，例如 TbpA或Hsf的免疫原性)。优选衍生疱的脑膜炎球菌是不能产生荚膜多糖的突变株(例如，下述突变株的其中一种，特别是SiaD-)。还优选可有效抗脑膜炎球菌病的免疫原性组合物同时包含L2和 L3疱，其中L2和L3L0S均与疱外膜蛋白缀合。此外，优选疱内缀合疱中的LOS结构与从 IgtB-脑膜炎球菌菌株衍生的一致(如下所述)。最优选免疫原性组合物包括疱内缀合的疱来源于不能产生荚膜多糖且是lgtB_的突变脑膜炎球菌菌株；包含来源于不能产生荚膜多糖的突变脑膜炎球菌菌株的L2和L3疱；包含来源于IgtB-突变脑膜炎球菌菌株的L2 和L3疱；或最优选包含来源于不能产生荚膜多糖且是lgtB_的突变脑膜炎球菌菌株的L2和 L3疱。可用于本发明的一般L3脑膜炎球菌菌株是H44/76menB菌株。一般的L2菌株是 B16B6menB菌株或39E脑膜炎球菌C型菌株。如上所述，本发明的疱已通过缀合作用被解毒至一定程度，且无需进一步解毒，然而进一步的解毒方法可用于增加安全性，例如，使用来源于htrB_或msbB_脑膜炎球菌菌株的疱或向疱组合物中加入多粘菌素B的无毒肽功能性等价物[与脂类A具有较高亲和性的分子](优选SEAP 2)(如上所述)。在上述方法中，提供脑膜炎球菌泡及含有疱的免疫原性组合物，其具有重要的抗原L0S，该抗原基本上无毒，没有自身免疫性问题，具有T-依赖性特征，存在于其天然环境中，且能够诱导抗超过90%脑膜炎球菌菌株的杀菌抗体反应(在L2+L3组合物的情况下)。优选疱内LOS缀合应整合下列方法的1、2、或全部3个步骤缀合pH应大于pH 7.0，优选大于或等于pH 7.5(最优选在pH 9下)；在反应过程中应当维持1-5%、优选 2_4%、最优选约3%蔗糖的条件；在缀合反应中应当将NaCl降到最低，优选0. 1M、0. 05M、 0. 01M、0. 005M.0. 00IM、且最优选根本不存在。所有这些方法特征可确保在整个缀合过程中疱保持稳定且保持于溶液中。虽然可通过各种技术和化学过程使LOS与外膜蛋白在疱内缀合，但EDAC/NHS缀合方法是疱内缀合的优选方法。EDAC/NHS优于甲醛，甲醛可交联至非常高的程度，由此对滤过率有不利的影响。EDAC与羧酸反应，产生活性酯中间体。在有胺亲核试剂存在的条件下， 酰胺键是用异脲副产物的释放形成的。然而，EDAC-介导的反应的效能可通过Sulfo-NHS 酯中间体的形成而增加。Sulfo-NHS酯在水溶液中存在的时间比EDAC单独与羧酸盐反应形成的活性酯要长。因此，更高产率酰胺键的形成可使用这种两阶段方法实现。EDAC/NHS 缀合在 J. V. Staros, R. W. Wright 禾P D. M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide—mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156 :220-222(1986)；和Bioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson(1996)pp 173-176 中讨论。因此本发明的方法优选是用于产生疱内缀合LOS (优选脑膜炎球菌)的方法，该方法包括在有EDAC/NHS存在、pH 7. 0-ρΗ 9. 0 (优选约pH 7. 5)的pH、l_5% (优选约3%)蔗糖、且任选基本上没有NaCl (如上所述)的条件下使疱缀合，以及从反应混合物中分离缀合疱的步骤。所述反应随后使用抗-LOS(例如，抗-L2或抗_L3)mAb在反应混合物的分离凝胶上进行，其显示随着反应时间的进行，疱中LOS的比例增大，LOS的分子量增加。使用这种技术可回收的疱产率99%。人们发现EDAC是一种极好的疱内交联剂，这是因为它可使LOS与OMP充分交联， 用于提高LOS T-依赖性免疫原性，但不会使它交联至非常高的程度而导致如滤过率较差和疱间交联的问题发生。此外，应当避免过度交联，从而避免天然存在于疱表面上的保护性 0ΜΡ，例如Tbp免疫原性的任何降低。5.整合外膜蛋白奈瑟氏球菌蛋白的其它种类也可以是包括在本发明奈瑟氏球菌疫苗中的候选物，且能够以令人吃惊的有效方式与其它抗原组合。膜相关蛋白、特别是整合膜蛋白且最有利地是外膜蛋白，特别是整合外膜蛋白可用于本发明的组合物中。这种蛋白的例子是也被称作OmplA的Pld A(NMB 0464) (W000/15801)，其是奈瑟氏球菌磷脂酶外膜蛋白。其它例子是 TspA(NMB 0341) (Infect. Immun. 1999,67 ；3533-3541)和 TspB (T-细胞刺激蛋白)(W0 00/03003 ；NMB 1548, NMB 1628 或 NMB1747)。其它例子包括 PilQ (NMB 1812) (W099/61620)、也被称作 D15-的 0MP85 (NMB0182) (W000/23593)、 NspA (U52066) (W096/29412)、FhaC (NMB 0496 或 NMB 1780)、PorB (NMB 2039) (Mol. Biol. Evol. 12 :363-370,1995)、HpuB (NC. 003116. 1)、TdfH(NMB1497) (Microbiology 2001，147 ； 1277-1290) ,OstA (NMB0280)、也被称作 GNA33 和 Lipo30 的 MltA(NMB0033) ,HtrA (NMB 0532 ； W099/55872)、HimD (NMB 1302)、HisD (NMB 1581)、GNA 1870 (NMB 1870)、HlpA (NMB 1946)、 NMB 1124,NMB 1162,NMB 1220,NMB 1313,NMB 1953、HtrA、TbpA(NMB 0461) (W0 92/03467) (还可见上面的铁获得蛋白)和LbpA (NMB 1541)。0MP85本发明的免疫原性组合物可包括全长0MP85，优选作为OMV制品的一部分。0MP85 的片段也可用于本发明的免疫原性组合物中，特别是，优选将由氨基酸残基1-475或 50-475组成的0MP85表面外露结构域掺入到本发明免疫原性组合物的亚单位组分中。在N 或C末端的任何一端或两端，0MP85的表面外露结构域的上述序列可被伸展或截短达1、3、 5、7、10、15、20、25、或30个氨基酸。优选删除0MP85片段的信号序列。OstAOstA可在脂多糖的合成中发挥作用且可被认为是毒性调节剂。OstA可选择性地包括在毒素类中，其中毒素种类被扩大至包括毒性调节剂以及毒素。免疫原性组合物免疫原性组合物是包括至少一种抗原的组合物，当给予宿主时，所述抗原能够产生免疫反应。优选，这种免疫原性制品能够产生抗奈瑟氏球菌，优选抗脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌感染的保护性免疫反应。本发明涉及包括至少两种抗原的免疫原性组合物，其优选可引发协同杀菌、保护性或粘附阻断反应的一种或多种。
本发明的SBA杀菌测定法这种协同反应可通过由抗原组合引发的SBA来表征，抗原组合引发的SBA较之由每个抗原单独引发的SBA要高至少50%、2倍、3倍、优选4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍且最优选10倍。优选SBA是相对于衍生抗原的同源性菌株测量的，且优选是相对于一组异源性菌株测量的。(见下面代表性小组，例如属于A-4聚簇的BZlO (B :2b :P1. 2)；属于ET-37 复合体的B16B6 (B :2a :Ρ1· 2)；和Η44/76 (B :15 :Ρ1· 7，16))。SBA是最普遍认可的免疫学标记，可评价脑膜炎球菌疫苗的功效(Perkins等人，J Infect Dis. 1998，177 :683-691)。令人满意的SBA可通过任何已知方法测定。SBA可利用从动物模型或人类受试者获得的血清进行(见实施例17-20)。用人血清进行SBA的优选方法如下。在第一次接种前、第二次接种后2个月和第三次接种后ι个月(1年中进行3次接种是一般的人类初次接种程序，例如在第0、2和4个月或第0、1、或6个月时给予)采集血液样品。这种人类初次接种程序可对1岁以下的婴儿进行(例如，与Hib接种同时进行)，或也可给2-4岁的儿童或青少年接种以测试这种初次接种程序的SBA。如果适合，可在初次接种后6-12个月以及激发剂量后1个月再次采集血液样品。如果在(初次接种程序的)第三支疫苗给药后一个月(在2-4岁儿童或青少年中，但优选在生命第一年的婴儿中)，抗衍生本发明抗原的脑膜炎球菌菌株的SBA(抗体稀释度)效价(与接种前效价相比)增加4倍的受试者百分比超过30%、优选超过40%、更优选超过50%、最优选超过60%受试者，那么对于具有同源杀菌活性的抗原或疱制品而言， SBA是令人满意的。当然，如果它也可相对于衍生它的脑膜炎球菌菌株引发令人满意的SBA的话，则具有异源杀菌活性的抗原或疱制品也可构成具有同源杀菌活性的疱制品。如果在(初次接种程序的)第三支疫苗给药后一个月(在2-4岁儿童或青少年中，但优选在生命第一年的婴儿中)，抗脑膜炎球菌3种异源菌株的SBA (抗体稀释度)效价(与接种前效价相比)增加4倍的受试者百分比超过20%、优选超过30%、更优选超过 35%、最优选超过40%受试者，那么对于具有异源杀菌活性的抗原或疱制品而言，SBA是令人满意的。这种试验是具有异源杀菌活性的抗原或疱制品是否可诱导抗各种脑膜炎球菌菌株的交叉杀菌抗体的良好表征。所述三种异源菌株应当优选具有彼此不同且优选与制备或衍生具有异源杀菌活性的抗原或疱制品的菌株不同的电泳型(ET)-复合体或多基因座序列分型(MLST)模式(见Maiden等人，PNAS USA 1998，95 :3140-5)。本领域技术人员应当能够很容易地测定具有不同ET-复合体的三种菌株，其可反映在脑膜炎球菌之间，特别是脑膜炎球菌B型菌株之间观察到的基因多样性，这些菌株被认为是重要疾病负担的原因和 /或代表认可的MenB剧毒谱系(见Maiden等人，见上)。例如，可使用的三种菌株是下列 属于 A-4 聚簇的 BZlO (B :2b :P1. 2)；属于 ET-37 复合体的 B16B6 (B :2a :Ρ1· 2)；和属于 ΕΤ-5 复合体的Η44/76 (B 15 =Pl. 7，16)，或属于同一 ET/聚簇的任何其它菌株。这种菌株可用于测试从例如属于ET-S复合体的脑膜炎球菌菌株CU385(B 4 =Pl. 15)制备或衍生的、具有异源杀菌活性的抗原或疱制品。可使用的其它样品菌株来源于谱系3流行性克隆(例如， NZ124[B 4 :P1. 7,4]) 另一 ET-37 菌株是 NGP165(B :2a :Ρ1· 2)。测量SBA活性的方法是本领域已知的。例如，可使用的方法在W099/09176的实施例IOC中描述。在一般情况中，所试验的菌株培养物是在生长的对数期(优选在铁缺失的条件中-通过向生长培养基中加入铁螯合剂如EDDA)生长的。可将其悬浮在具有BSA的培养基(如具有0. 3% BSA的Hanks培养基)中，以便获得调至约20000CFU/ml的试验细胞悬浮液。一系列反应混合物可通过将一系列2倍稀释的试验血清(优选在56°C热灭活 30分钟)[例如，50 μ 1/孔体积]和20000CFU/ml试验的脑膜炎球菌菌株悬浮液(例如， 25 μ 1/孔体积)混合而制备。应培养(例如，37°C 15分钟)并振摇(例如，210rpm)反应小瓶。此外，终反应混合物[例如，100 μ 1体积]还可包含补体源[如，25%终体积的预试幼兔血清]，并按照上面所述培养[例如，37°C 60分]。无菌的聚苯乙烯U-底96-孔微量滴定平板可用于该测定法。可使用多道移液器从每个孔中采集等分试样[例如，10 μ 1]，滴在Mueller-Hinton琼脂平板(优选含有Isovitalex和热灭活的马血清)上并培养(例如，在37°C、5% CO2中培养18小时)。优选，单独的菌落高达80CFU/等分试样。将下列三种试验样品用作对照缓冲液+细菌+补体；缓冲液+细菌+灭活补体；血清+细菌 +灭活补体。SBA效价可使用程序直接计算，该程序可对数据进行加工从而得到稀释度的测量值，该测量值与通过回归计算得到的50%细胞死亡相对应。动物保护测定法可选择性地，协同反应可通过抗原组合在动物保护测定法中的功效而表征。例如， 可使用实施例12或13中描述的测定法。优选，与单独使用抗原，特别是抗原的次优剂量相比，通过抗原组合而得到保护的动物数量明显增加。用于防止淋病奈瑟氏球菌感染的成功疫苗可能需要不止一个下列要素血清和/ 或粘膜抗体的产生以促进补体介导的淋球菌死亡，和/或通过白细胞如多形核白细胞提高吞噬作用并杀死微生物，和/或防止淋球菌附着于宿主组织；诱导细胞介导的免疫反应，它们也可参与保护。本发明疱淋病疫苗制品功效的提高可通过分析诱导的血清和/或粘膜抗体免疫反应来评价，它们具有抗粘附和/或调理性和/或杀菌活性，如其他人所述(McChesney D 等人，Infect. Immun. 36 :1006,1982 ；Boslego J^A :Efficacy trial of a purified gonococcl pilus vaccine, in Program and Abstracts of the 24th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Washington, American Society for Microbiology, 1984 ；Siegel M ^A, J. Infect. Dis 145 :300,1982 ；de la Pas, Microbiology,141(Pt4) :913-20,1995)。近来描述了由淋病奈瑟氏球菌所致的生殖器感染小鼠模型(Plante M，J. Infect. Di s. ,182 :848-55, 2000)。本发明疱淋病疫苗功效的提高还可通过其防止或降低淋病奈瑟氏球菌在这种小鼠感染模型中定居的能力而评价。粘附阻断测定法可选择性地，协同反应可通过抗原组合在粘附阻断测定法中的功效而表征。例如， 可使用实施例11中描述的测定法。优选与使用抗单独抗原产生的抗血清，特别是次优剂量的抗体相比，由抗抗原组合产生的抗血清诱导的阻断程度显著提高。亚单位组合物本发明的免疫原性组合物可以是一种亚单位组合物。亚单位组合物是在将组分混合形成抗原性组合物之前，其中组分已经被分离并纯化到至少50%、优选至少60%、70%、80%、90%纯度的组合物。本发明的免疫原性亚单位组合物优选包括选自下列的至少2种抗原ThaB、PilC, Hsf、Hap、NadA、0MP85、IgA蛋白酶、AspA、AspA的过客结构域、Hsf的过客结构域、Hap的过客结构域、FrpA, FrpC, TbpA, TbpB, LbpA, LbpB, HpuA, HpuB, TspA, TspB, PldA, PilQ, FhaC, NspAJP LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。亚单位组合物可以是水溶性蛋白的水溶液。它们可包含洗涤剂、优选非-离子、两性离子或离子洗涤剂，以便使抗原的疏水部分溶解。它们可包含脂类，这样就可形成脂质体结构，使抗原以跨越脂膜的结构呈递。外膜小泡制品脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B(menB)分泌足量的外膜疱从而使得能够以工业规模制造它们。外膜小泡还可经由用洗涤剂提取细菌细胞的方法制备(见例如，EP 11243)。本发明的免疫原性组合物还可包括具有至少两种抗原的外膜小泡制品，所述抗原已被上调，或者被重组上调或通过其它方式被上调，包括在铁-缺失条件下生长。在这种外膜小泡制品中被上调的抗原的例子包括NspA、Hsf, Hap、0MP85、TbpA (高)、TbpA(低)、 LbpA、TbpB、LbpB、PilQ, AspA、TdfH, PorB、HpuB、P2086、匪-ADPRT、MafA、MafB 禾Π PldA。这种制品还可任选包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。来源于奈瑟氏球菌菌株的疱制品的制备可通过本领域技术人员熟知的任何方法获得。优选使用在 EP 301992、US5, 597，572、EP 11243 或 US4, 271，147、Frederikson 等人(NIPH Annals[1991]，14 :67-80)、Zollinger 等人，(J. Clin. Invest. [1979], 63 :836-848)、Saunders 等人，(Infect. Immun. [1999]，67 :113-119)、Drabick 等人 (Vaccine [2000], 18 :160-172)或W001/09350 (实施例8)中公开的方法。通常，使用洗涤剂，优选脱氧胆酸盐提取0MV，且核酸被任选酶促除去。纯化是通过超速离心后，任选接着进行大小排阻层析实现的。如果包括本发明2种或多种不同的疱，则它们可在单一容器中组合形成本发明的多价制品(虽然制品也被认为是多价的，如果本发明的不同疱是处于单独容器中的单独组合物，但它们是在同一时间[由同一医师]给予宿主的]。OMV制品通常是通过0.2μπι滤器过滤而灭菌的，且优选贮存在蔗糖溶液(例如3%)中，该蔗糖溶液已知可使疱制品溶解。蛋白在外膜小泡制品内的上调可通过将基因的附加拷贝插入到衍生OMV制品的奈瑟氏球菌菌株中而获得。可选择性地，可将衍生OMV制品的奈瑟氏球菌菌株中的基因启动子交换成较强的启动子。这种技术在W001/09350中描述。与从未修饰的脑膜炎奈瑟氏球菌(例如菌株Η44/76)衍生的OMV中存在的蛋白水平相比，蛋白的上调将导致OMV中存在的蛋白水平更高。优选所述水平要高1. 5、2、3、4、5、7、10或20倍。当LPS是OMV中的附加抗原时，使用低浓度提取洗涤剂(例如，脱氧胆酸盐或D0C) 的方案可优选用于OMV制备方法中，以便保持高水平的结合LPS而特别除去有毒的结合较差的 LPS。所用 DOC 的浓度优选 0-0. 5% D0C,0. 02-0. 4% D0C,0. 04-0. 3% D0C，更优选 0. 06% -0. 2% DOC 或 0. 08-0. 15% D0C，最优选约或准确的 0. 1% D0C。“强的启动子序列”是指增加编码目标抗原的基因转录的调节控制元件。“上调表达”是指相对于未修饰(即天然存在的)疱而言，可提高目标抗原表达的任何方式。应当了解‘上调’的量取决于特定的目标抗原，但不会超出破坏疱的膜完整性的量。抗原的上调是指较之未修饰的疱高至少10%的表达。优选高至少50%。更优选高至少100% 0倍)。最优选高3、4、5、7、10、20倍。可选择性地或附加地，上调表达是指就代谢或营养变化而言表达是非-条件性的，特别是在TbpA、TbpB, LbpA和LbpB的情况下。优选当从在铁有限条件中生长的细菌中衍生疱时，评价表达水平(例如在有铁螯合剂存在的条件下)。又为了清楚的目的，术语‘将细菌菌株进行改造以产生较少所述抗原’或下调是指相对于未修饰的(即天然存在的疱)而言，优选通过缺失使目标抗原表达(或功能性基因产物的表达)降低的任何方式，这样表达较之未修饰的疱要低至少10%。优选低至少50% 且最优选完全缺乏。如果下调蛋白是酶或功能性蛋白，则下调可通过引入一次或多次突变而获得，导致酶或功能活性降低10%、20%、50%、80%或优选100%。调节奈瑟氏球菌蛋白表达所需的改造步骤可以以本领域技术人员已知的各种方式进行。例如，可插入序列(例如，启动子或开放阅读框)，并通过转座子插入技术破坏启动子/基因。例如，上调基因的表达时，可经由转座子将强启动子插入到基因起始密码子的直到21Λ上游(更优选200-600bp上游，最优选约400bp上游)。还可利用点突变或缺失(特别是对基因的下调表达而言)。然而，这种方法可能相当不稳定或不确定，且因此优选改造步骤是经由同源重组事件进行。优选，该事件发生在细菌染色体上至少30个核苷酸的序列(诱重组区)和在菌株内转化的载体上至少30个核苷酸的序列(第二诱重组区)之间。优选该区是40-1000 个核苷酸，更优选100-800个核苷酸，最优选500个核苷酸。这些诱重组区应当足够相似， 这样它们就能够在十分严格的条件下彼此杂交。用于进行此处所述基因修饰事件的方法(如通过重组事件将基因上调或下调并将其它基因序列引入到奈瑟氏球菌基因组中)在W001/09350中描述。可在奈瑟氏球菌中被整合的一般强启动子是 porA、porB、lgtF、Opa, pllO、1st、和 hpuAB。PorA 和 PorB 是优选的组成型强启动子。已经确定了 PorB启动子活性包含在与PorB起始密码子上游的核苷酸1-250相对应的片段中。通过在铁有限培养基中生长而上调抗原的表达本发明外膜小泡制品中某些抗原的上调优选通过分离在铁有限条件下生长的奈瑟氏球菌亲代菌株中的外膜小泡而实现。培养基中低浓度的铁将导致参与铁获得的蛋白表达增加，包括TbpA、TbpB、LbpA、LbpB、HpuA、HpuB和P2086。这些蛋白的表达由此被上调而无需重组修饰所涉及的基因，例如通过插入较强的启动子或插入基因的附加拷贝。本发明还包括通过在铁有限培养基中生长而上调铁获得蛋白，其中所述基因也已被重组修饰。铁有限是通过向培养基中加入铁螯合剂而实现的。适宜的铁螯合剂包括2，2-双吡啶，EDDHA (乙二胺-二(ο-羟基苯乙酸)和Desferal (甲磺酸去铁胺，Sigma)。Desferal 是优选的铁螯合剂且以10-100 μ Μ、优选25-75 μ Μ、更优选50-70 μ Μ、最优选60 μ M的浓度加入到培养基中。培养基的铁内含物主要来源于酵母提取物和大豆胨组分，且存在的用量可根据批次而变化。因此，在不同批的培养基中，不同浓度的Desferal对于获得铁获得蛋白的上调是最佳的。本领域技术人员应当能够很容易地测定最佳浓度。在基础条件下，应向培养基中加入充足的铁螯合剂，从而上调所需铁-调节蛋白的表达，但也不能过量而不利地影响细菌的生长。
优选将通过在铁有限条件下生长的铁获得蛋白的上调与其它抗原的重组上调组合，从而获得本发明的外膜小泡。πτ辆_ -腳_細牛_脈周/ _在细菌菌株中，很多表面抗原都是可变的且因此只能抗一组有限的紧密相关的菌株。本发明一方面涉及本发明的外膜小泡，其中其它蛋白的表达减少，或优选编码可变表面蛋白的基因缺失。这种缺失导致产生疱的细菌菌株当以疫苗形式给药时，抗各种菌株交叉反应性的潜能更强，这是由于保守蛋白(留存在外膜上)对接种者的免疫系统施加了更强的影响。可在本发明疱免疫原性组合物中被下调的奈瑟氏球菌中这种可变抗原的例子包括 PorA、PorB、Opa0可被下调或切断的其它类型基因是在体内可被细菌很容易地接通(表达)或切断的基因。因为由这种基因编码的外膜蛋白并不总是存在于细菌上，因此这种蛋白在疱制品中的存在还可由于上述原因而对疫苗有效性有害。下调或缺失的优选例子是奈瑟氏球菌 Opc蛋白。由含Opc的疱疫苗诱导的抗-Opc免疫性仅具有有限的保护能力，这是因为感染生物很容易变为Opc。例如，这些可变或非-保护基因的表达可被下调，或最终被切断。如此则具有将免疫系统集中于更好抗原上的优点，所述抗原仅少量存在于疱外表面上。下调还指表面外露的，上述外膜蛋白的可变免疫显性环可被改变或缺失，从而产生免疫显性较低的外膜蛋白。下调表达的方法在W001/09350中公开。在本发明的疱免疫原性组合物中被下调的优选蛋白组合包括PorA与OpA、PorA与OpC、OpA与OpC、PorA与OpA与OpC。已知有4种不同的Opa基因存在于脑膜炎球菌基因组(Aho等人，199IMol. Microbiol. 5 :1429-37)中，因此当提到Opa的表达被下调时，它是指优选存在于脑膜炎球菌中的1、2、3或(优选)全部4种基因都被下调。这种下调通常可按照W001/09350所述基因工程进行或通过查找很容易发现的、天然的、稳定的脑膜炎球菌菌株而进行，它们自Opa 基因座的表达较低或没有。这种菌株可使用Poolman等人(1985J. Med. Micro. 19 :203-209) 描述的技术发现，其中Opa-细胞具有与表达Opa的细胞不同的表型，这可通过在平板上或显微镜下观察细胞外观而见到。一旦找到，在进行发酵以使Opa缺失后，通过在细胞内含物上进行蛋白质印迹而显示出该菌株是稳定的0pa_。当外膜小泡中某些抗原的上调是通过在铁有限条件下生长而实现的时，可变蛋白 FrpB (Microbiology 142 ；3269-3274, (1996) J. Bacteriol. 181 ；2895-2901 (1999))也可被上调。本发明人已经发现，按照W001/09350所述通过下调全部蛋白的表达或通过使FrpB 可变区缺失而在这些环境下下调FrpB表达是有利的。如此可确保由免疫原性组合物引发的免疫反应针对存在于大范围菌株中的抗原。在本发明的疱免疫原性组合物中，FrpB的下调优选与PorA和OpA、PorA和OpC、OpA和OpC、PorA和OpA和OpC的下调组合。在本发明可选择性的实施方案中，外膜小泡中的FrpB被下调，所述外膜小泡是从不是在铁有限条件下生长的奈瑟氏球菌菌株制备的。LPS 解毒本发明免疫原性组合物中的疱可经由W001/09350公开的LPS解毒方法解毒。本发明LPS解毒的具体方法包括使WOO1/09350中公开的htrB和/或msbB酶被下调/缺失。 奈瑟氏球菌的msbB和htrB基因还分别被称作IpxLl和lpxL2 (W000/26384)且这些基因的缺失突变是通过失去一个仲酰基链的msbB-突变LOS和失去两个仲酰基链的htrB-突变 LOS而从表型方面表征的。WO 93/14155和WO 95/03327描述了可用于本发明组合物中的多粘菌素B的无毒肽功能性等价物。这种方法优选与疱提取方法组合，疱提取方法包括使用低水平的D0C、优选 0-0. 3% D0C、更优选0. 05% -0. 2% D0C、最优选约或准确的0. 1% DOC0LPS解毒的其它方法包括如上所述向疱制品中加入多粘菌素B的无毒肽功能性等价物(优选SAEP 2)。交叉反应件多糖将细菌外膜疱从有荚膜的革兰氏阴性菌中分离出来常常导致荚膜多糖的共-纯化。在某些情况下，这种“污染”材料可显示有用，这是因为多糖可提高由其它疱组分产生的免疫反应。然而在其它情况下，污染性多糖材料在细菌疱制品中的存在可证明对疱在疫苗中的应用有害。例如，已经显示出至少在脑膜炎奈瑟氏球菌的情况下，血清组B荚膜多糖不会带来保护免疫性且很容易在人类中诱导不利的自身免疫反应。因此，可将本发明的外膜小泡从细菌菌株中分离出来用于疱的生产，其已被改造成没有荚膜多糖。这样一来疱即适用于人类。这种疱制品的特别优选的例子是来源于没有荚膜多糖的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B的疱制品。这可通过使用修饰的疱产生菌株实现，其中荚膜生物合成和/或输出所需的基因已损坏。编码荚膜多糖生物合成或输出的基因的灭活可通过(优选使用上述同源重组技术)使控制区、编码区或两者突变(点突变、缺失或插入)，或通过降低这种基因酶功能的任何其它方式而实现。此外，荚膜生物合成基因的灭活还可通过反义过量表达或转座子诱变而实现。优选方法是使多糖生物合成及输出所需的脑膜炎奈瑟氏球菌Lps基因的一部分或全部缺失。就该目的而言，置换质粒PMF121 (在Frosh等人，1990，Mol. Microbiol. 4 1215-1218中所述)可用于传递使cpSCAD(+galE)基因聚簇缺失的突变。已经对抗L3或L2LPS所产生抗体的安全性产生了疑问，这是由于与存在于人鞘糖脂中的乳-N-neotetraose 低聚糖基团(Gal β 1_4G1cNAc3 l_3Gal β l_4Glc3 1-)相似的结构的存在。尽管已经有很多人安全接种了脱氧胆酸盐提取的含有残余量L3LPS的小泡疫苗(G. Bjune 等人，Lancet (1991)，338，1093-1096 ；GVG. Sierra 等人，NIPH ann (1991)，14， 195-210)，LOS糖末端部分的缺失可有利地防止与存在于人组织表面的结构的任何交叉反应。在优选实施方案中，IgtB基因的灭活产生中间体LPS结构，其中缺少末端半乳糖残基和唾液酸(突变留下L2和L3L0S中的4GlcNAc0 l-3Gal β 1-461οβ 1-结构)。这种中间体可在L3和L2LPS菌株中获得。LPS的可选择性且不太优选的(短的)版本可通过关闭 IgtE基因获得。LPS的其它选择性且不太优选的版本可通过关闭IgtA基因获得。如果选择这种IgtA-突变，优选还可关闭IgtC表达从而防止形成非免疫原性Ll免疫型。LgtB_突变体是最优选的，这是因为本发明人已经发现这是用于解决安全性问题同时仍然保留可诱导杀菌抗体反应的LPS保护性低聚糖表位的最佳截短。因此，还包含L2或L3制品(纯化的或在分离的疱中)的本发明免疫原性组合物或脑膜炎球菌疱制品通常有利地来源于奈瑟氏球菌菌株(优选脑膜炎球菌)，它们已被基因工程改造成永久性下调来源于lgtB、IgtA或IgtE基因的功能性基因产物的表达，优选通过切断基因，最优选通过使基因启动子和/或开放阅读框的全部或一部分缺失。
当本发明上述免疫原性组合物来源于脑膜炎球菌B菌株时，还优选除去荚膜多糖 (其还包含人-样糖结构)。虽然可将很多基因切断以实现此目的，但本发明人有利地显示优选已将疱产生菌株进行基因工程改造以永久下调SiaD基因的功能性基因产物的表达 (即，下调α -2-8聚唾液酸转移酶的活性)，优选通过切断基因，最优选通过使基因启动子和/或开放阅读框的全部或一部分缺失。这种灭活在WO 01/09350中描述。siaD (也被称作synD)突变是多种突变中最有利的，可除去荚膜多糖的人-相似表位，这是因为突变中仅有一种对LOS保护性表位的生物合成没有作用，因此在最终使用LOS作为保护性抗原的方法中是有利的，且对细菌生长的作用最小。因此本发明的优选方面是上述疱免疫原性制品， 其来源于lgtE_siaD_、lgtA_siaD_或优选lgtB_siaD_脑膜炎球菌B突变株。所述菌株本身是本发明的另一方面。虽然由于上述原因siaD—突变是优选的，但也可使用切断脑膜炎球菌B荚膜多糖合成的其它突变。因此，可将疱产生菌株进行基因工程改造以永久下调来源于下列一种或多种基因的功能性基因产物的表达ctrA、ctrB, ctrC、ctrD、synA(相当于synX和siaA)、 synB(相当于siaB)或synC(相当于siaC)基因，优选通过切断基因，最优选通过使基因启动子和/或开放阅读框的全部或一部分缺失。Igtr突变可与这些突变的一种或多种组合。 优选IgtB-突变与这些突变的一种或多种组合。因此本发明另一方面是上述疱免疫原性制品，其来源于脑膜炎球菌B的这种组合突变株。所述菌株本身是本发明的另一方面。含有各种Igt基因，包括IgtB和IgtE的奈瑟氏球菌基因座及其序列是本领域已知的(见M. P. Jennings等人，Microbiology 1999，145，3013-3021和其中引证的参考文献， 以及 J. Exp. Med. 180 :2181-2190 [1994])。当把全长(未-截短的)L0S用于终产品中时，希望LOS没有被唾液酸化(因为这种LOS可产生抗绝大多数危险的、侵入性脑膜炎球菌B菌株的免疫反应，所述菌株也未被唾液酸化)。在这种情况下，使用具有缺失synA (相当于synX和siaA)、synB (相当于siaB)或 synC(相当于siaC)基因的荚膜阴性菌株是有利的，这是因为这种突变也可导致menB LOS 不能被唾液酸化。在疱制品中，特别是在用低浓度DOC提取的制品中，可使用LPS作为本发明免疫原性组合物中的抗原。然而，可有利地将lgtE、IgtA(特别是与IgtC组合)、或优选IgtB基因/基因产物的酶功能下调/缺失/灭活，以便除去人样乳-N-neotetraose结构。包含用于生物合成LPS低聚糖结构的Igt基因的奈瑟氏球菌基因座(及其序列)是本领域已知的 (Jennings 等人，Microbiology 1999 145 :3013-3021 和其中引证的参考文献，以及 J. Exp. Med. 180 :2181-2190 [1994])。优选IgtB (或功能性基因产物)被下调/缺失，这是因为它可留下完整的LPS保护性表位。在本发明的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B疱制品中，SiaD和IgtB的下调/缺失是优选的，(虽然，在脑膜炎球菌B疱产生菌株中也可使用lgtB_与ctrA_、ctrB_、ctrC_、ctrD_、 synA"(相当于synX—和siaAO、synB"(相当于siaB)或syn(T(相当于siaC)中任何一个的组合)，得到具有最佳安全性和LPS保护性表位保留的疱制品。本发明的另一方面是上述疱免疫原性制品，其来源于脑膜炎球菌B的这种组合突变株。所述菌株本身是本发明的另一方面。本发明的免疫原性组合物可包括至少1、2、3、4或5种不同的外膜小泡制品。当包括两种或多种OMV制品时，本发明至少一个抗原在各OMV中被上调。这种OMV制品可来源于相同种类和血清组的奈瑟氏球菌菌株或优选来源于不同种类、血清组、血清型、亚血清型或免疫型的奈瑟氏球菌菌株。例如，免疫原性组合物可包括一种或多种外膜小泡制品，其含有免疫型L2的LPS和含有免疫型L3的LPS的一种或多种外膜小泡制品。L2或L30MV制品优选来源于稳定的菌株，其在LPS低聚糖合成基因座具有最小的相变异性。与亚单位组合物组合的外膜小泡本发明的免疫原性组合物还可包括亚单位组合物和外膜小泡。有若干抗原由于它们的溶解性而特别适于包括在亚单位组合物中。这种蛋白的例子包括ThaB、NspA, Hsf的过客结构域、Hap的过客结构域、AspA的过客结构域、AspA、0MP85、FrpA、FrpC, TbpB, LbpB, PilQ。外膜小泡制品具有选自下列的至少一种不同抗原，其在外膜小泡中已被重组上调 NspA, Hsf、Hap、0MP85、TbpA(高)、TbpA(低)、LbpA, TbpB, LbpB, NadA, TspA, TspB, PilC, PilQ、TdfH, PorB, HpuB, P2086、匪-ADPRT、MafA, MafB 和 PldA ；且任选包括 LPS 免疫型 L2 和LPS免疫型L3之一或两者。本发明具体的免疫原件组合物在下列具体组合中，当抗原组合存在于泡中时，这种抗原组合应如上所述被上调。本发明特别优选的实施方案包括自体转运蛋白和铁获得蛋白，更优选Hsf和 TbpA (高)和/或TbpA (低)。这种免疫原性组合物可优选进一步包括OMP 85、FrpA、FrpC、 LbpA, LbpB, Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、TspA、NadA, TspB、PilQ、FhaC, NspA、PldA, HimD, HisD、GNA1870, OspA、HlpA、FhaB, PilC、0mp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、TdfH, PorB、HpuB、P2086、NM-ADPRT、VapD和Hap中的至少一种。所有上述免疫原性组合物还可包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。本发明的另一优选实施方案包括Hsf和选自下列的至少一种其它抗原FrpA、 FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、TbpA、P2086、HpuA、HpuB、Lipo28、Sibp、Hap、AspA、 IgA 蛋白酶、0MP85、NspA、PilQ、HimD, HisD、GNA1870、OspA、HlpA、FhaC, NadA, PldA, TspA、 TspB, TdfH, PorB和FhaB。所有上述免疫原性组合物还可包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。优选组合包括Hsf和0MP85(任选与Hap、FrpA或LbpB的一个或多个)； Hsf和Hap (任选与FrpA、LbpB或0MP85的一个或多个)；Hsf和FrpA (任选与Hap、LbpB或 0MP85的一个或多个)；Hsf和LbpB (任选与Hap、0MP85或FrpA的一个或多个)。由于Hsf 既是粘附素又是自体转运蛋白，因此特别优选的组合包括Hsf、0MP85、TbpA, LPS免疫型L2 和/或L3，优选在多价疱制品中，其具有所提供的所有5组抗原的成员。优选TbpA(低)和 TbpA (高)均存在。本发明的另一免疫原性组合物包括!^haB和选自下列的至少一种其它抗原FrpA、 FrpC, NM-ADPRT、VapD, LbpB, LbpA, TbpB, HpuA、HpuB, P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、 NMB0293、TdfH、PorB、PldA、Hap、IgA 蛋白酶、AspA、PilQ、HimD, HisD、GNA1870、OspA、HlpA、 0MP85、NspA、PilC、0mp26、NMB0315、NMB0995、NMB 1119、NadA, PldA、TbpA, Hsf、TspA 和 TspB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。优选组合包括!^haB和Hsf (任选与 0MP85、LbpB、Hap 或 FrpA 的一个或多个)；FhaB 和 0MP85 (任选与 LbpB、Hap 或 FrpA 的一个或多个)JhaB和LbpB (任选与Hap或FrpA的一个或多个)JhaB和Hap (任选与FrpA)。 优选组合包括i^haB、LbpB, Hsf (作为0ΜΡ)和FrpA，其具有所提供的全部5组抗原的成员。
本发明的另一免疫原性组合物包括NspA和选自下列的至少一种其它抗原FrpA、 FrpC, NM-ADPRT, VapD, LbpB, LbpA, TbpB, TbpA, HpuA, HpuB, P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、
和LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。优选组合包括NspA和Hsf (任选与0MP85、 Hap、LbpA或TbpA的一个或多个)；NspA和0MP85 (任选与Hap、LbpA或TbpA的一个或多个)；Ns pA和Hap (任选与LbpA或TbpA的一个或多个)；Ns pA和LbpA (任选与TbpA)。特别优选的组合包括NspA、Hsf、TbpA、LPS免疫型L2和/或L3，优选在多价疱制品中，其具有所提供的全部5组抗原的成员。优选TbpA(低)和TbpA(高)均存在。本发明没有要求保护具有WO 00/25811中所公开的抗原的个别组合的免疫原性组合物。优选，如果它们的抗原内含物仅由转铁蛋白结合蛋白和NspA组成(或在疱疫苗中，上调的或富聚的抗原内含物仅由转铁蛋白结合蛋白和NspA组成)，则这类免疫原性组合物或疫苗不包括在本发明内，然而可包括由NspA以及TbpA(高)和TbpA(低)组成或包括NspA以及TbpA(高)和TbpA(低)的特定抗原(或上调的抗原)组合。任选地，没有要求保护包括转铁蛋白结合蛋白和NspA的组合(亚单位)或上调(疱)的组合物或疫苗。本发明另一免疫原性组合物包括NadA和选自下列的至少一种其它抗原FrpA、 FrpC, NM-ADPRT, VapD, LbpB, LbpA, TbpB, TbpA, P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、 Hap、0MP85、NspA、PilQ、HimD, HisD、GNA1870、OspA、HlpA、HpuA, HpuB, AspA, IgA 蛋白酶、 PldA, Hsf、TspA、TspB、TdfH, PorB,以及 LPS 免疫型 L2 和 LPS 免疫型 L3 之一或两者。本发明另一免疫原性组合物包括TbpA(低)和选自下列的至少一种抗原FrpA、 FrpC、匪-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、I gA 蛋白酶、NspA、HpuA、HpuB、Hap、0MP85、NspA (当与 TbpA(高)组合时)、PilQ、HimD, HisD、GNA1870、OspA、HlpA、PilC、0mp26、NMB0315、 NMB0995、NMBl 119、MafA、MafB, AspA、NadA、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH, PorB 禾口 haB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。优选组合包括TbpA (低)和Hsf和LbpA ； TbpA (低)禾口 0MP85 (任选与LbpA和Hap之一或两者)；TbpA (低)禾口 LbpA和Hap。本发明另一免疫原性组合物包括TbpA(高)和选自下列的至少一种其它抗原 FrpA、FrpC, NM-ADPRT, VapD, LbpB, LbpA、TbpB, Hap、0MP85、NspA (当与 TbpA (低)组合)、 PilC、0mp26、NMB0315、NMB0995、NMB 1119、PilQ、HimD, HisD、GNA1870、OspA、HlpA、MafA, MafB, AspA、IgA 蛋白酶、PldA, FhaB, NadA, PldA, Hsf、TspA、TspB、TdfH, PorB 禾口 FhaB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。优选组合包括TbpA (高)和Hsf和LbpA ； TbpA (高)禾口 0MP85 (任选与LbpA和Hap之一或两者)；TbpA (高)禾口 LbpA和Hap。本发明另一免疫原性组合物包括LbpA和选自下列的至少一个其它抗原FrpA、 FrpC,匪-ADPRT、VapD, LbpB, TbpB, Hap、0MP85、NspA、PilC、0mp26、NMB0315、NMB0995、NMB 1119、NadA、PldA, TbpA, Hsf、TspA、TspB、MafA, MafB, IgA 蛋白酶、AspA、FhaB、PilQ、HimD, Hi sD、GNA1870、OspA、HlpA、TdfH, PorB 和 FhaB 以及 LPS 免疫型 L2 和 LPS 免疫型 L3 之一或两者。优选组合包括LbpA和Hsf (任选与Hap)。本发明另一免疫原性组合物包括LbpB和选自下列的至少一个其它抗原FrpA、 FrpC,匪-ADPRT、VapD, LbpA, TbpB, Hap、0MP85、NspA、PilC、0mp26、NMB0315、NMB0995、NMB 1119、NadA、PldA, TbpA, Hsf、TspA、TspB、MafA, MafB, IgA 蛋白酶、AspA、FhaB、PilQ、HimD, HisD、GNA1870、OspA、HlpA、TdfH, PorB 和 FhaB、以及 LPS 免疫型 L2 和 LPS 免疫型 L3 之一或两者。优选组合包括LbpB和Hsf (任选与0MP85、Hap或FrpA的一个或多个)；LbpB和 0MP85 (任选与Hap或FrpA的一个或多个)；LbpB和Hap (任选与FrpA)。本发明另一免疫原性组合物包括0MP85和选自下列的至少一个其它抗原FrpA、 FrpC, NM-ADPRT, VapD, LbpB, LbpA, TbpB, TbpA, HpuA, HpuB, P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、 NMB0293、Hap、IgA 蛋白酶、As pA、Hsf, Ns pA、PilC、0mp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、 MafA、MafB, NadA、PldA、Hsf、TspA、TspB、Pi 1Q、TdfH, PorB 和 FhaB,以及 LPS 免疫型 L2 和 LPS免疫型L3之一或两者。优选组合包括0MP85和Hsf (任选与LbpA或NspA的一个或多个)；0MP85和LbpA (任选与Hap和NspA的一个或多个)；0MP85和Hap (任选与NspA)。本发明另一免疫原性组合物包括Hap和选自下列的至少一个其它抗原FrpA、 FrpC,匪-ADPRT、VapD, LbpB, LbpA, TbpB, TbpA, HpuA, HpuB, P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、 NMB0293、PilQ、HimD, HisD、GNA1870、OspA、HlpA、NspA、IgA 蛋白酶、AspA、0MP85、NspA、 PilC、0mp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA, MafB, NadA, PldA, Hsf、TspA、TspB、TdfH, PorB和FhaB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。本发明另一免疫原性组合物包括FrpA和选自下列的至少一个其它抗原LbpB、 LbpA, TbpA, TbpB, HpuA, HpuB, P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、PilQ、HimD, HisD、 GNA1870、OspA、HlpA、TspA、TspB、Hap、IgA 蛋白酶、AspA、NadA, FhaB、PilQ、HimD, HisD、 GNA1870、OspA、HlpA、0MP85、NspA、PilC、0mp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA, MafB, PldA, Hsf、TspA, TspB, TdfH, PorB 和 FhaB、以及 LPS 免疫型 L2 和 LPS 免疫型 L3 之一或两者。本发明另一免疫原性组合物包括FrpC和选自下列的至少一个其它抗原LbpB、 LbpA, TbpA, TbpB, HpuA, HpuB, P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、PilQ、HimD, HisD、 GNA1870、OspA、HlpA、TspA、TspB、Hap、IgA 蛋白酶、AspA、NadA, FhaB、0MP85、NspA、PilC、 0mp26、NMB0315、NMB0995、NMB 1119、MafA、MafB、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorB 和 FhaB、 以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。本发明另一免疫原性组合物包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者以及选自下列的至少一个其它抗原LbpB、LbpA, TbpA, TbpB, HpuA, HpuB, P2086、Lipo28, Sibp、 NMB0964、NMB0293、PilQ、HimD, HisD、GNA1870、OspA、HlpA、TspA、TspB、Hap、IgA 蛋白酶、 AspA、NadA、FhaB、0MP85、Ns pA、PilC、0mp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA、MafB、PldA、 Hsf、TspA、TspB、TdfH, PorB 和 FhaB。本发明免疫原性组合物中的优选抗原组合包括如下组合，该组合包含铁获得蛋白、自体转运蛋白和i^haB ；铁获得蛋白、自体转运蛋白和PilC ；铁获得蛋白、自体转运蛋白和NadA ；铁获得蛋白、自体转运蛋白和FrpA ；铁获得蛋白、自体转运蛋白和PilQ ；铁获得蛋白、自体转运蛋白和TspA ；铁获得蛋白、自体转运蛋白和TspB ；铁获得蛋白、自体转运蛋白和NspA ；铁获得蛋白、自体转运蛋白和FrpC ；更优选包含铁获得蛋白、自体转运蛋白和Hap ； 铁获得蛋白、自体转运蛋白和FrpA/C ；铁获得蛋白、自体转运蛋白和LbpB ；铁获得蛋白、自体转运蛋白和0ΜΡ85Φ15)。最优选，掺入0MP85(DM)作为外膜小泡制品的一部分。包含LPS的本发明免疫原性组合物优选具有与T-辅助细胞表位来源，优选蛋白缀合的LPS，且就OMV中的LPS而言，优选外膜蛋白。特别优选的实施方案包括已经与OMP在外膜小泡制品中(如上所述)原位(优选疱内)缀合的LPS。
本发明的免疫原性组合物可包括来源于脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、B、C、Y、W_135 或淋病奈瑟氏球菌的抗原(蛋白、LPS和多糖)。优选本发明的免疫原性组合物或疫苗不由WO 00/71725第3页第18行-第52页第2行表中所列的SEQ ID的特定组合和/或WO 00/71725中实施例1_11描述的任何单个
组合组成和/或含有这些组合。优选，本发明不要求保护W001/5^85中公开的个别组合。目合本发明的免疫原性组合物还可包括细菌荚膜多糖或低聚糖。荚膜多糖或低聚糖可来源于下列一种或多种脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、C、Y、和/或W-135、流感嗜血杆菌 b (Haemophilus influenzae b)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、A 组链球菌、 B组链球菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococca saureus)禾口表皮葡萄球菌(Stapylocoaus epidermidis)。本发明另一方面是含有本发明抗原性组合物和其它抗原的疫苗组合物，其可有利地用于抗某些疾病状况，包括与病毒或革兰氏阳性菌有关的那些。在其中一个优选组合中，本发明的抗原性组合物是用下列脑膜炎球菌荚膜多糖或低聚糖的1、2、3或优选全部4种配制的，其可以是简单的或与蛋白载体A、C、Y或W-135缀合的。优选本发明的免疫原性组合物是用A和C;或C;或C和Y配制的。这种含有源自脑膜炎奈瑟氏球菌，优选血清组B的蛋白的疫苗可被有利地用作通用的脑膜炎球菌疫苗。在另一优选实施方案中，本发明的抗原性组合物，优选用简单或缀合的脑膜炎球菌荚膜多糖或低聚糖A、C、Y或W-135的1、2、3或全部4种配制(如上所述)的，是用缀合的流感嗜血杆菌b荚膜多糖或低聚糖，和/或一种或多种简单或缀合的肺炎球菌荚膜多糖或低聚糖配制的。任选地，所述疫苗还可包括一种或多种蛋白抗原，它们可保护宿主免受肺炎链球菌感染。这种疫苗可被有利地用作通用脑膜炎疫苗。在又一优选实施方案中，本发明的免疫原性组合物是用来源于脑膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血杆菌b、肺炎链球菌、A组链球菌、B组链球菌、金黄色脓葡萄球菌或表皮葡萄球菌中一种或多种的荚膜多糖或低聚糖配制的。肺炎球菌的荚膜多糖抗原优选选自血清型1、 2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F(最优选选自1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F)。进一步优选的实施方案包括流感嗜血杆菌的PRP荚膜多糖。进一步优选实施方案包括金黄色葡萄球菌的5型、8型或336荚膜多糖。进一步优选实施方案包括表皮葡萄球菌的I型、II型或III型荚膜多糖。进一步优选实施方案包括B组链球菌的Ia型、Ic型、II型或III型荚膜多糖。进一步优选实施方案包括A组链球菌的荚膜多糖，优选还包括至少一种M蛋白且更优选多种类型的M蛋白。本发明这种荚膜多糖可与载体蛋白如破伤风类毒素、破伤风类毒素片段C、白喉类毒素、CRM197、肺炎球菌溶血素、蛋白D(US6342224)非-缀合或缀合。所述多糖缀合物可通过任何已知的偶联技术制备。例如，可经由硫醚键使多糖偶联。这种缀合方法依靠用1-氰基-4-二甲氨基四氟硼酸吡啶镥(CDAP)活化多糖而形成氰酸酯。活化多糖可因此与载体蛋白上的氨基直接偶联或经由间隔基团偶联。优选，使用包括形成硫醚键的杂络合化学过程使氰酸酯与己二胺偶联，使氨基-衍生的多糖与载体蛋白偶联。这种缀合物在PCT公开申请 W093/15760Uniformed Services University 中描述。
缀合物还可通过如US 4365170 (Jennings)和 US467!3574 (Anderson)中描述的直接还原胺化方法制备。其它方法在EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中描述。其它方法包括通过碳二亚胺缩合使己二酸酰胼(ADH)衍生的溴化氰活化的多糖与蛋白载体偶联(Chu C.等人，Infect. Immunity, 1983 245 256)。当包括低聚糖时，优选使它们缀合
在一起。优选的肺炎球菌蛋白抗原是在肺炎球菌外表面上暴露的那些肺炎球菌蛋白(在肺炎球菌至少部分生活周期内能够由宿主免疫系统识别)，或是由肺炎球菌分泌或释放的蛋白。最优选，所述蛋白是毒素、粘附素、2-组分信号转导蛋白、或肺炎链球菌的脂蛋白，或其片段。特别优选的蛋白包括，但不限于肺炎球菌溶血素(优选通过化学处理或突变解毒)[Mi tchell 等人，Nucleic Acids Res. 1990 年 7 月 11 日:18(13) :4010 "Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2. ”，Mitchell 等人，Biochim Biophys Acta 1989 年 1 月 23 日；1007(1) :67-72, "Expression of the pneumolys in gene in Escherichia coli :rapid purification and biological properties. WO 96/05859 (A. Cyanamid)> WO 90/06951 (Paton φ 人)、WO 99/03884 (NAVA) ] ；PspA 及其跨膜缺失变体(US 5804193-Briles 等人)； I3SpC及其跨膜缺失变体(W0 97/09994-Briles等人)；I^saA及其跨膜缺失变体(Berry 禾口 Paton, Infect Immun 1996 年 12 月；64(12) :5255-62, "Sequence heterogeneity of PsaA, a 37~kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcuspneumoniae")；肺炎球菌胆碱结合蛋白及其跨膜缺失变体；CbpA及其跨膜缺失变体(W097/41151、W0 99/51266)；甘油酸 _3_ 磷酸-脱氢酶 Qnfect. Immun. 1996 64 3544) ；HSP70 (W0 96/40928) ；PcpA (Sanchez-Beato 等人，FEMS Microbiol Lett 1998,164 207-14) ；M样蛋白(EP 0837130)和粘附素18627 (EP 0834568)。进一步优选的肺炎球菌蛋白抗原是W098/18931中公开的那些，特别是W098/18930和PCT/US99/30390中选择的那些。本发明的免疫原性组合物/疫苗还可任选包括由其它革兰氏阴性菌，例如粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhal is)或流感嗜血杆菌制备的外膜小泡制品。粘膜炎莫拉氏菌疱制品本发明的免疫原性组合物还可包括来源于粘膜炎莫拉氏菌的OMV制品。如 W001/09350所述，基因工程改造的OMV制品可来源于粘膜炎莫拉氏菌。优选将下列基因 (编码保护性抗原)的一种或多种上调0MP106(W097/41731和W096/34960)、HasR(PCT/ EP99/03824)、PilQ (PCT/EP99/03823)、0MP85 (PCT/EP00/01468)、lipo06 (GB9917977. 2)、 lipolO(GB 9918208. 1) , lipoll (GB 9918302. 2) , lipol8(GB 9918038. 2) , P6 (PCT/ EP99/03038)、ompCD、CopB(Helminen ME 等人，(1993) Infect. Immun. 61 :2003-2010)、 D15 (PCT/EP99/03822)、OmplAl (PCT/EP99/06781)、Hly3 (PCT/EP99/03257)、LbpA 禾口 LbpB(W0 98/55606)、TbpA 和 TbpB(W097/13785 和 WO 97/32980)、OmpE、UspAl 和 UspA2(WO 93/03761)、和0mp21。作为可被异源引入到其他革兰氏阴性菌中的基因，它们也是优选的。优选将下列基因的一个或多个下调CopB、OMP106, OmpBl, TbpA, TbpB, LbpA、和 LbpB0优选将下列基因的一个或多个下调htrB、msbB和ΙρχΚ。
优选将下列基因的一个或多个上调pmrA、pmrB、pmrE、和pmrF。流感嗜血杆菌疱制品本发明的免疫原性组合物还可包括来源于流感嗜血杆菌的OMV制品。如 W001/09350所述，基因工程改造的OMV制品可来源于流感嗜血杆菌。优选将下列基因(编码保护性抗原)的一个或多个上调D15(W094/U641)、P6(EP 281673)、TbpA (W096/40929、 W095/13370)、TbpB(W096/40929 ；W095/13370)、P2、P5(W0 94/26304),0MP26(W097/01638)、 HMWl、HMW2、HMW3、HMW4、Hia、Hsf、Hap、Hin47、和Hif (该操纵子中的所有基因均应被上调以将菌毛蛋白上调)。作为可被异源引入到其他革兰氏阴性菌中的基因，它们也是优选的。优选将下列基因的一个或多个下调P2、P5、Hif、IgAl_蛋白酶、HgpA、HgpB、HMWl、 HMW2、Hxu、htrB、msbB 和 IpxK。优选将下列基因的一个或多个上调pmrA、pmrB、pmrE、和pmrF。本发明的免疫原性组合物/疫苗还可任选包括抗白喉、破伤风和百日咳鲍特氏菌 (Bordetella pertussis)感染中一种或多种的抗原。百日咳鲍特氏菌组分可被杀死，无论是全细胞百日咳鲍特氏菌(Pw)还是无细胞的百日咳鲍特氏菌0 ),其包含来源于PT、FHA 和69kDapertactin的至少一种抗原(优选2或所有3种)。通常，提供抗白喉和破伤风保护的抗原是白喉类毒素和破伤风类毒素。类毒素是化学灭活的毒素或通过引入点突变而灭活的毒素。免疫原性组合物/疫苗还可任选地包括一种或多种保护宿主免受非-分型 (non-typeable)流感嗜血杆菌、RSV感染的抗原和/或一种或多种可保护宿主免受流感病毒感染的抗原。这种疫苗可有利地用作通用中耳炎疫苗。优选的非分型流感嗜血杆菌蛋白抗原包括丝束蛋白(US 5766608)和含有来自丝束蛋白的肽的融合蛋白(例如，LBl融合蛋白)(US5843464_0hio State Research Foundation)、0MP26、P6、蛋白 D、TbpA、TbpB、Hia、Hmwl、Hmw2、Hap、禾口 D15。优选的流感病毒抗原包括完整的、活的或灭活的病毒、脱落流感病毒，其在卵或 MDCK细胞中生长，或非洲绿猴肾细胞株系细胞或完整的流感病毒体(如R.Gluck，Vaccine， 1992，10，915-920所述)或其纯化或重组蛋白，如HA、NP、NA、或M蛋白、或其组合。优选的RSV(呼吸道合胞病毒)抗原包括F糖蛋白、G糖蛋白、HN蛋白、M蛋白或其衍生物。本发明的免疫原性组合物可包括粘膜炎莫拉氏菌蛋白，包括TbpA(W097/13785 ； W099/52947) ,TbpB (W097/13785 ；W099/5^47 ;Mathers 等人，FEMS Immunol Med Microbiol 1997 19 ；231-236 ；Myers 等人 Infect Immun 1998 66 ；4183-4192)、LbpA, LbpB (Du 等人， Infect Immun 1998 66 ;3656_3665)、UspAl、UspA2 (Aebi 等人，Infect Immun. 1997 65; 4367-4377)、OMP106 (US6214981)、Ton-B 依赖性受体(W000/78968)、CopB (Sethi 等人， Infect. Immun. 199765 ；3666-3671)、和 HasR受体(W000/78968)；流感嗜血杆菌的蛋白包括 HMW(St Geme 等人，Infect Immunl998 66 ；364-368) ,Hia (St Geme 等人，J. Bacteriol. 2000 182 ；6005-6013)、Tbpl (W096/40929 ；W095/13370)、Tbp2 (W096/40929 ；W095/13370 ； Gray-Owen 等人，Infect Immun 1995 63 ;1201_1210)、LbpA、LbpB (Schryvers 等人，1989， 29 :121-130)、HasRJon B-依赖性受体(Fleishmann 等人，Science 1995 269 ；496-512), 血红蛋白-结合蛋白、HhuA(Cope 等人，Infect Immun 200068 ；4092-4101)、HgpA(Maciver等人，hfect Immun 199664 ;3703_3712)、HgbA、HgbB 和 HgbC (Jin 等人，hfect Immun 199664 ；3134-3141) ,HxuA (Cope 等人，Mol Microbiol 199413 ；863-873) ,HxuC (Cope 等人， Infect Immun 200169 ；2353-2363)；来源于脑膜炎奈瑟氏球菌的蛋白，包括Tbpl、Tbp2、 FbpA、FbpB、BfrA、BfrB CTettelin 等人，Science 2000287 ； 1809-1815) ,LbpA,LbpB 和 HmbR0疫苗制剂本发明的优选实施方案是还可含有药学上可接受赋形剂或载体的本发明免疫原性组合物的疫苗制剂。来源于上述任何一种修饰菌株的外膜小泡制品的制备可通过本领域技术人员熟知的任何一种方法实现。优选使用EP 301992、US5，597，572、EP 11243或US 4，271，147中公开的方法。更优选使用W001/09350中描述的方法。疫苗制品通常在疫苗设计中描述(“The subunit and adjuvant approach"(eds Powell M.F.& Newman M. J.) (1995) Plenum Press New York)。本发明的疫苗制剂中可向本发明的抗原性组合物施加佐剂。适宜的佐剂包括铝盐如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝，但还可以是钙盐(特别是碳酸钙)、铁盐或锌盐，或可以是酰化酪氨酸或酰化糖，阳离子或阴离子衍生的多糖或聚磷腈的不溶性悬浮液。可使用的适宜Thl佐剂系统包括单磷酰基脂类A，特别是3-脱-0-酰化单磷酰基脂类A和单磷酰基脂类A、优选3-脱-0-酰化单磷酰基脂类A (3D-MPL)与铝盐(优选磷酸铝)的组合。增强的系统包括单磷酰基脂类A和皂苷衍生物的组合，特别是WO 94/00153 中公开的QS21与3D-MPL的组合，或如WO 96/33739中公开的反应原性较低的组合物，其中用胆固醇猝灭QS21。WO 95/17210中描述了特别有效的、包含QS213D-MPL和生育酚的水包油乳液的佐剂，且其是优选的制剂。所述疫苗可包括皂苷，更优选QS21。它还可包括水包油乳液和生育酚。含有寡核苷酸的未甲基化的CpG(W0 96/02555)是THl反应的优选诱导剂，且适用于本发明。本发明的疫苗制品可用于保护或治疗易感染的哺乳动物，其中经由全身或粘膜途径给予所述疫苗。这些给药可包括经由肌内、腹膜内、皮内或皮下途径注射；或经由粘膜给予口腔/消化、呼吸、泌尿生殖道。因此本发明其中一个方面是使人类宿主免疫而抗革兰氏阴性菌感染所引起的疾病的方法，该方法包括给予所述宿主免疫保护剂量的本发明OMV制
P
ΡΠ O选择每个疫苗剂型中的抗原量，其可诱导免疫保护反应且没有一般疫苗的明显的副作用。这种量可根据所用的特定免疫原以及如何提供而变化。通常预期每个剂型包含 1-100 μ g蛋白抗原或OMV制品，优选5-50 μ g，且最一般5-25 μ g。特定疫苗的最佳用量可通过标准研究确定，该标准研究包括观察受试者中的适宜免疫反应。初次接种后，受试者可接受一次或若干次适当间隔的加强免疫。本发明的疫苗优选是免疫保护性且无毒的，并适于儿童和青少年使用。给儿科使用时，它是指小于4岁的儿童。免疫保护性是指令人满意地满足上述SBA和/或动物保护模型和/或粘附阻断测定法。无毒是指通过熟知的LAL和热原性测定法测量，疫苗中的内毒素活性水平不大于令人满意的水平。
本发明的多核苷酸“多核苷酸”通常是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的 RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链的DNA，单链和双链区混合的DNA，单链和双链的RNA，单链和双链区混合的RNA，包含单链或，更通常双链或单链与双链区混合的DNA和RNA的杂交分子。此外“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或同时包含RNA与DNA的三链区。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA，和具有由于稳定性或其它原因而被修饰的主链的DNA或RNA。“修饰”碱基包括，例如，三苯甲基化的碱基和特殊碱基如肌苷。已经对DNA和RNA进行了各种修饰；因此，“多核苷酸”包括一般天然存在的多核苷酸的化学、酶或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特征性的DNA和RNA 的化学形式。“多核苷酸”还包括相对较短的多核苷酸，通常被称作寡核苷酸。本发明另一方面涉及免疫/疫苗制剂，其包含一种或多种多核苷酸。这种技术是本领域已知的，见,例如Wolff等人，Science (1990) 247 1465-8。这种疫苗包含编码与上述本发明蛋白组合相对应的多种蛋白的一种或多种多核苷酸。来源于这种多核苷酸的蛋白的表达将受到真核启动子的控制，该启动子能够驱动在哺乳动物细胞内表达。此外所述多核苷酸可包含编码其它抗原的序列。可驱动表达的真核启动子的例子包括来源于病毒的病毒启动子，包括腺病毒启动子、逆转录病毒启动子。可选择性地，哺乳动物启动子可用于驱动表达。本发明其它方面本发明另一方面包括用于治疗或预防奈瑟氏球菌病的方法，包括在宿主需要时， 给予其保护剂量(或有效量)的本发明疫苗。脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、B、C、Y或W135 和/或淋病奈瑟氏球菌感染可被有利地预防或治疗。本发明还包括本发明疫苗在制备用于治疗或预防奈瑟氏球菌感染的药物中的用途。此外奈瑟氏球菌感染包括由脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、B、C、Y、W-135和/或淋病奈瑟氏球菌引起的感染。本发明另一方面是可衍生本发明外膜小泡(如上所述，具有本发明重组上调的至少两种蛋白)的基因工程改造的奈瑟氏球菌菌株。这种奈瑟氏球菌菌株可以是脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌。所述菌株还可被改造(如上所述)以下调其它奈瑟氏球菌蛋白的表达，包括LgtB、 LgtE, SiaD, OpC、OpA, PorA, FrpB, msbB 和 HtrB 中 1、2、3、4、5、6、7 或 8 个的表达。用于下调的优选组合包括至少LgtB和SiaD的下调(优选缺失)、至少PorA和OpC的下调、至少 PorA和OpA的下调以及至少PorA、OpA和OpC的下调。本发明另一方面是制备本发明免疫原性组合物或疫苗的方法。这些方法包括将至少两种来源于奈瑟氏球菌的分离抗原或蛋白混合在一起的步骤，其可以以来源于本发明奈瑟氏球菌菌株的疱形式存在，从而制备本发明的免疫原性组合物，另一制备本发明疫苗的方法包括将本发明的免疫原性组合物与药学上可接受的载体组合的步骤。也包括在本发明中的制备本发明免疫原性组合物的方法包括分离奈瑟氏球菌培养物中的外膜小泡的步骤。这种方法可包括将至少两种外膜小泡制品混合的又一步骤，优选其中至少一种外膜小泡制品包含免疫型L2的LPS且至少一种外膜小泡制品包含免疫型L3的LPS。本发明还包括这种方法，其中所述外膜小泡制品是通过用0-0. 5%浓度的DOC提取而分离的。0.3%-0.5%浓度的DOC用于将LPS含量减到最小。在OMV制品中，其中LPS 作为抗原是保守的，0-0. 3%、优选0. 05% -0. 2%、最优选约0. 浓度的DOC用于提取。血影细胞或被杀死的全细胞疫苗本发明人预期对疱制品和疫苗的上述改进可很容易地扩展至血影细胞或被杀死的全细胞制品和疫苗(具有相同的优点)。可从其制备疱制品的本发明修饰的革兰氏阴性菌菌株还可用于制备血影细胞和被杀死的全细胞制品。从革兰氏阴性菌菌株制备血影制品 (具有完整外膜的空细胞)是本领域熟知的(见例如WO 92/01791)。杀死全细胞以制备用于疫苗中的灭活细胞制品的方法也是熟知的。术语‘疱[或0MV]制品’和‘疱[或0MV]疫苗’以及本文献所描述的方法因此，因本发明目的起见，可分别应用于本发明的术语‘血影制品’和‘血影疫苗’和‘被杀死的全细胞制品’和‘被杀死的全细胞疫苗’。抗体和被动免疫本发明另一方面是制备用于预防或治疗奈瑟氏球菌感染的免疫球蛋白的方法，包括用本发明疫苗使受体免疫并分离受体中免疫球蛋白的步骤。通过该方法制备的免疫球蛋白是本方面的另一方面。包含本发明免疫球蛋白以及药学上可接受载体的药物组合物是本发明的另一方面，其可制备用于治疗或预防奈瑟氏球菌病的药物。用于治疗或预防奈瑟氏球菌感染的方法是本发明的另一方面，该方法包括给予患者有效量的本发明的药物制品。用于多克隆抗体产生的接种物通常是通过将抗原性组合物分散在适于人类使用的生理学耐受的稀释剂，如生理盐水或其它佐剂中，从而形成含水组合物而制备的。将免疫刺激量的接种物给予哺乳动物，然后使接种的哺乳动物维持一段时间，这段时间足以使抗原性组合物诱导保护性抗体。可通过熟知的技术，如亲和层析分离抗体至所需的程度(Harlow和Lane Antibodies ；a laboratory manual 1988)。抗体可包括来源于通常使用的各种动物，例如，山羊、灵长类动物、驴、猪、马、豚鼠、大鼠或人的抗血清制品。给所述动物抽血并回收血清。按照本发明生产的免疫球蛋白可包括完整的抗体、抗体片段或亚片段。抗体可以是任何种类，例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的完整免疫球蛋白，嵌合抗体或对本发明两种或多种抗原具有双重特异性的杂交抗体。它们还可以是片段，例如F(ab' )2、Fab’、Fab、 Fv等，包括杂交片段。免疫球蛋白还包括天然的、合成的或基因工程改造的蛋白，它们可通过与特异性抗原结合形成复合体而像抗体一样发挥作用。可将本发明的疫苗给予受体，然后受体作为免疫球蛋白的来源发挥作用，该免疫球蛋白是在应答特异性疫苗的攻击时产生的。然后经由常规的血浆分离方法从如此治疗过的受试者所捐献的血浆中获得超免疫球蛋白。将所述超免疫球蛋白给予另一受试者，从而产生抗或治疗奈瑟氏球菌感染的抗性。本发明的超免疫球蛋白特别用于治疗或预防儿童、 无免疫应答个体或在需要治疗对而个体在应答接种免疫时没时间产生抗体的奈瑟氏球菌病。本发明另一方面是一种药物组合物，它包含对本发明免疫原性组合物至少两种组分具有反应性的两种或多种单克隆抗体(或其片段；优选人或人源化的)，该药物组合物可用于治疗或预防革兰氏阴性菌，优选奈瑟氏球菌，更优选脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌， 最优选脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B所引起的感染。
这种药物组合物包括单克隆抗体，它们可以是任何种类，例如IgG、IgM、IgA、IgD 或IgE的完整免疫球蛋白，嵌合抗体或对本发明两种或多种抗原具有特异性的杂交抗体。 它们还可以是片段，例如F(ab' )2, Fab'、！^ab、Fv等，包括杂交片段。制备单克隆抗体的方法是本领域熟知的，且包括脾细胞与骨髓瘤细胞的融合体 (Kohler 禾口 Milstein 1975 Nature 256 ；495 ；Antibodies-a laboratory manual Harlow and Lane 1988)。可选择性地，单克隆Fv片段可通过筛选适宜的噬菌体展示库而获得 (Vaughan TJ等人，1998Nature Biotechnology 16 ；535) 利用已知方法，单克隆抗体可以是人源化的或部分人源化的。本专利说明书中引证的所有参考文献或专利申请均引入此处作为参考。本发明人指出此处每个例子中的术语“包括(comprising) ”、“包括(comprise)，， 和“包括(comprises)”可分别任选用“由的组成(consisting of)”、“由的组成(consist of)”和“由的组成(consists of)”替代。本发明的工业应用方法除非另有详细描述，下面的实施例是使用本领域那些技术人员熟知且常规的标准技术进行的。实施例仅是举例说明，而不是对本发明的限制。实施例1綱■夕卜■/!、■丨丨口口口辅血辭目B白妨法W001/09350提供用于制备外膜小泡并处理衍生外膜小泡的细菌菌株的详细方法。 当外膜小泡保留有脂蛋白如TbpB或脂多糖时，优选使用低水平或不使用脱氧胆酸盐的分离方法。实施例2 =Hsf蛋白抗原在缺少功能性CPs基因但表达PorA的重组脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株中的上调如W001/09350实施例中所述，在某些国家，PorA在外膜小泡中的存在可能是有利的，且可增强重组改良泡的疫苗功效。在下列实施例中，我们使用修饰的PCMK⑴载体上调 Hsf蛋白抗原在缺少功能性cps基因但表达PorA的菌株中的表达。原始的pCMK(+)载体包括在表达Iacr的大肠杆菌宿主中被抑制，但在脑膜炎奈瑟氏球菌中是转录活性的嵌合 porA/lacO启动子。在修饰的pCMK(+)中，天然的porA启动子用于驱动hsf基因的转录。编码Hsf的基因是使用下表中提供的HSFOl-NdeI和HSF 02_NheI寡核苷酸引物进行PCR扩增的。由于HSFOl-NdeI引物的序列，所表达Hsf蛋白的5’末端包括两个甲硫氨酸残基。PCR 扩增所用的条件是由供应商描述的那些(HiFi DNA聚合酶，Boehringer Mannheim, GmbH)。 热循环如下25次(940C 1分钟，48°C 1分钟，72°C 3分钟)和1次(72°C 10分钟，4°C直到回收)。随后在pCMK(+)送递载体相应限制位点中克隆相应的扩增子。在该重组质粒中， 即所设计的pCMK(+)-Hsf中，我们通过重组PCR策略使存在于嵌合porA/lacO启动子中的 IacO缺失。pCMK(+)-Hsf质粒被用作模板以使下列2个单独的DNA片段PCR扩增-片段1包括porA5’诱重组区，卡那霉素抗性基因和porA启动子。所用的寡核苷酸引物RPl (McII)和RP2在下表中提供。RPl引物与紧在Iac操纵子上游的序列同源。-片段2包括来源于porA基因的Shine-Dalgarno序列、hsf基因和porA3，重组区。所用的寡核苷酸引物RP3和RP4(ApaI)在下表中提供。RP3引物与紧在Iac操纵子下游的序列同源。片段1的3’末端和片段2的5’末端具有48个碱基重叠。将各500ng PCR(1和2)用于使用引物RPl和RP4进行的终PCR反应。将所得的终扩增子亚克隆到用SacII和ApaI限制酶切的pSL1180载体中。使用QIAGEN maxipr印试剂盒大规模纯化修饰质粒pCMK(+)-Hsf，并将2 μ g该材料用于转化缺少功能性cps基因的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株。为了维持porA的表达，通过PCR和蛋白质印迹筛选方法的组合来选择单一交换产生的整合。将通过PorA-特异性PCR和蛋白质印迹被证实为阳性的卡那霉素抗性克隆在-70°C以甘油原液贮存用于进一步的研究。将细菌(相当于约5. IO8个细菌)重悬浮于 50 μ 1 PAGE-SDS缓冲液中，冷冻(_20°C ) /沸腾(100°C ) 3次，然后通过PAGE-SDS电泳在 12. 5%凝胶上分离。Hsf 的表达是在来源于 NmB[Cps-，PorA+]或 NmB[Cps_，PorA+, Hsf+] 的全细胞细菌溶菌产物(WCBL)中检测的。考马斯染色可检测出Hsf表达的显著增加(相当于内源性Hsf水平)。该结果证实修饰pCMK(+)-Hsf载体是功能性的且可成功用于上调外膜蛋白的表达，不会消除主要PorA外膜蛋白抗原的产生。
这项工作中使用的寡核苷酸
寡核苷酸岸列备注(S )HsfOl-Nde5'- GGA ATT CCA TAT GAT GAA CAA AAT ATA CCG C-3,Ndel克隆位点Hsf02-Nhe5'-QTA GCT AGC TAG CTT ACC ACT GATAAC CGA C -3'Nhel克隆位点GFP-mut-Asn5'-AAC TGC AGA ATT AAT ATG AAA GGA GAA GAA CTT TTC-3'☆nl克隆位点与NdeI相容GFP-Spc5'-GAC ATA CTA GTT TAT TTG TAG AGC TCA TCC ATG-3'Spel克隆位点与NdeI相容RPl (SacII)5'- TCC CCG CGG GCC GTC TQA ATA CATCCCGTC-3'Sada克隆位点RP25'-CAT ATG GGC TTC CTT TTG TAA ATT TGA GGQ CAA ACA CCC GAT ACG TCTTCA-3'RP3S'-AGA CGT ATC GGG TGT TTG CCC TCA AAT TTA CAA AAG GAA GCC CAT ATG -3'RP4(ApaI)5'-GGG TAT TCC GGG CCC TTC AGA CGG CGC AGC AGG-3'却β 克隆位点实施例3 利用启动子置换上调脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B的tbpA基因实验的目的是用较强的porA启动子置换tbpA基因的内源性启动子区，以上调 TbpA抗原的产生。就该目的而言，启动子置换质粒是用大肠杆菌克隆方法构建的。位于tbpA编码区列上游的DNA区(731bp)是在脑膜炎奈瑟氏球菌菌株ATCC 13090的私立 Incyte I^athoSeq数据库中发现的。该DNA包含编码TbpB抗原的序列。所述基因是在操纵子中组织的。TbpB基因将缺失并被CmR/porA启动子弹夹置换。就该目的而言，与t bpB基因的509bp 5，侧翼区、2139bp的tbpB编码序列、87bp的基因间序列以及tbpA编码序列的前483个核苷酸相对应的3218bp的DNA片段是用含有吸收序列和NheI及HindIII限制位点(下划线)的寡核苷酸 BAD16(5，-GGC CTA GCT AGC CGT CTG AAG CGA TTA GAG TTTCAA AAT TTA TTC-3，)和 BAD 17 (5，-GGC CAA GCT TCA GAC GGC GTT CGACCG AGT TTG AGC CTT TGC-3'，)从脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B基因组DNA扩增的。用High Pure Kit (BoerhingerMannheim，德国)纯化该PCR片段并将其直接克隆到pGemT载体(ftOmega，美国)中。使该质粒进行循环PCR诱变(Jones和Winistofer (1992))以便(i)插入适宜的限制位点，使 CmR/PorA启动子盒克隆和(ii)使209bp的tbpB 5，侧翼序列和tbpB编码序列缺失。循环 PCR是用含有适宜限制位点)(maI、BglII和XhoI (下划线)的BAD 18(5'-TCC CCC GGG AAG ATC TGG ACG AAA AATCTC AAG AAA CCG—3，)禾口 BAD 19 (5，-GGA AGA TCT CCG CTC GAG CAA ATTTAC AAA AGG AAG CCG ATA TGC AAC AGC AAC ATT TGT TCC G_3，)寡核苷酸进行的。 CmR/PorA启动子弹夹是使用含有适宜限制位点Xmal、SpeI, BglII和B10I (下划线)的引物 BAD21 (5' -GGA AGA TCT CCG CTC GAGACA TCG GGC AAA CAC CCG-3 ’ )禾口 BAD20(5' -TCC CCC GGG AGA TCT CACTAG TAT TAC CCT GTT ATC CC-3，)，按照先前所述从 pUC D15/0mp85 质粒扩增的。将该PCR片段克隆到循环PCR质粒中。该质粒用于转化脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B[cps-]和[cps-porA-]菌株。通过在tbpA上游区中进行双重交换进行整合可将 PorA启动子直接插入到tbpA ATG的上游。t施例4 两种杭原TbDA和Hsf的表汰被卜.i周的脑腊炎奈瑟EB求菌血B菌株的构律实验目的是同时上调TbpA和Hsf在同一脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株中的表达。TbpA的产生是通过用较强的porA启动子置换其内源性启动子区而被上调的(启动子置换)。在本文中，位于tbpA上游的tbpB基因缺失，且TbpB蛋白不再存在于外膜中。Hsf 的表达是通过在PorA基因座插入相应基因的第二个拷贝(同源重组)而被上调的(基因送递)。两种菌株已经在W001/09350独立专利中描述。两种策略中所用的选择标记(CmK 或KanK)可使两种整合到同一染色体中。通过Qiagen Genomic 尖端 500-G 方案从重组 Nm. Bcps_/TbpA+/PorA+ 菌株提取总基因组DNA。用DraIII限制酶限制酶切10 μ g DNA，并用于通过经典转化方案转化脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B。用于转化的细胞是重组NmB cpS-/HSf+/PorA+(通过1次交换到porA 基因座中而进行的同源重组)或重组NmB cpS-/HSf+/PorA-(通过2次交换到porA基因座中而进行的等位基因交换/同源重组)。将它们平板接种在含200 μ tg/ml卡那霉素的GC 琼脂上过夜，在GC液体培养基IOmMMgCl2中被稀释到DO65tl = 0. 1，并在用力搅拌的条件下与 IOyg DraIII限制酶切的基因组DNA于37°C温育6小时。在含有200 μ g/ml卡那霉素和 5 μ g/ml氯霉素的GC培养基上选择由于双重交换事件(PCR筛选)产生的重组脑膜炎奈瑟氏球菌，并分析iTbpA和Hsf在OMV制品中的表达。如图1所示，与从对照NmB cps-菌株制备的OMV相比，从"TbpA/Hsf重组NmB菌株制备的OMV中的1TbpA和Hsf产生显著增加。各蛋白在双重重组体中的过量表达水平可与在相应的单一重组体中获得的表达水平相比较。 TbpA和Hsf的过量表达水平是在PorA+和PorA-菌株中比较的(没有给出数据)。这些数据共同证实了 (i)TbpA和Hsf在脑膜炎奈瑟氏球菌中的表达可共同且相伴地被上调，且 (ii)可获得富含TbpA和Hsf的重组泡并用于免疫。实施例5 两种抗原TbpA和NspA的表达被上调的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株的构建实验目的是同时上调TbpA和NspA在同一脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株中的表达。TbpA的产生是通过用较强的porA启动子置换其内源性启动子区而被上调的(启动子置换)。NspA的表达是通过在porA基因座插入相应基因的第二个拷贝(同源重组)而被上调的(基因送递)。两种菌株已经在独立专利W001/09350描述。两种策略中所用的选择标记(0^或1(&1^)可使两种整合到同一染色体中。通过Qiagen Genomic 尖端 500-G 方案从重组 NmBcps_/TbpA+/PorA+ 菌株提取总基因组DNA。用AatII限制酶限制酶切IOyg DNA，并用于通过经典转化方案转化脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B。用于转化的细胞是重组NmB cps-/NspA+/PorA+0将它们平板接种在含200 μ g/ml卡那霉素的GC琼脂上过夜，在GC液体培养基IOmM MgCl2中被稀释到DO65tl = 0. 1，并在用力搅拌的条件下与IOyg AatII限制酶切的基因组DNA于37°C温育6小时。在含有200 μ g/ml卡那霉素和5 μ g/ml氯霉素的GC培养基上选择由于双重交换事件(PCR筛选)产生的重组脑膜炎奈瑟氏球菌，并分析TbpA和NspA在OMV制品中的表达。与从对照 NmB cps-菌株制备的OMV相比，从TbpA/NspA重组NmB菌株制备的OMV中的TbpA和NspA 产生显著增加。各蛋白在双重重组体中的过量表达水平可与在相应的单一重组体中获得的表达水平相比较。这些数据共同证实了 (i)TbpA和NspA在脑膜炎奈瑟氏球菌中的表达可共同且相伴地被上调，且(ii)可获得富含TbpA和NspA的重组疱并用于免疫。实施例6 两种抗原NsdA和D15/0iro85的表汰被上调的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株的构津实验的是同时上调NspA和D15/0mp85在同一脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株中的表达。D15/0mp85的产生是通过用较强的porA启动子置换其内源性启动子区而被上调的(启动子置换)。NspA的表达是通过在porA基因座插入相应基因的第二个拷贝(同源重组)而被上调的(基因送递)。两种菌株已经在独立专利W001/09350中描述。两种策略中所用的选择标记(0^或1(&1^)可使两种整合组合到同一染色体中。通过Qiagen Genomic 尖端 500-G 方案从重组 NmB cps-/D15_0mp85/PorA+ 菌株提取总基因组DNA。用AatII限制酶限制酶切10 μ gDNA,并用于通过经典转化方案转化脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B。用于转化的细胞是重组NmB cps-/NspA+/PorA-0将它们平板接种在含200 μ g/ml卡那霉素的GC琼脂上过夜，在GC液体培养基，IOmMMgCl2中被稀释到DO65tl =0. 1，并在用力搅拌的条件下与10 μ g AatII限制酶切的基因组DNA于37°C温育6小时。 在含有200 μ g/ml卡那霉素和5 μ g/ml氯霉素的GC培养基上选择由于双重交换事件(PCR 筛选)产生的重组脑膜炎奈瑟氏球菌，并分析NspA和D15/0mp85在OMV制品中的表达。与从对照NmB cps-菌株制备的OMV相比，从NspA/D15_0mp85重组NmB菌株制备的OMV中的 NspA和D15/0mp85产生显著增加。各蛋白在双重重组体中的过量表达水平可与在相应的单一重组体中获得的表达水平相比较。这些数据共同证实了 (i)NspA和0mp85在脑膜炎奈瑟氏球菌中的表达可共同且相伴地被上调，且(ii)可获得富含NspA和0mp85的重组泡并用于免疫。实施例7 重组Hsf形式在大肠杆菌中的产生和纯化对来源于脑膜炎奈瑟氏球菌的Hsf-样蛋白进行的计算机分析揭示了至少4个结构域。将来源于菌株H44/76的Hsf序列作为参考，包含氨基酸1-51的结构域1编码自体转运蛋白家族特征性的sec-依赖性信号肽，包含氨基酸52-473的结构域2编码很可能是表面外露的目.易讲入免疫系统的过客结构域，包含氨基酸474-534的结构域3编码蛋白低聚所需的推定卷曲螺旋结构域及绞链(颈部)区，包含残基535-C末端的结构域4被预测编码可能装配成桶-样结构且被锚定在外膜中的B-链(Henderson等人，(1998)，TrendsMicrobiol. 6 :370-378 ;Hoiczyk 等人，(2000), EMBO 22:5989-5999)。因为结构域 2 和 3 很可能是表面外露的，且很好保守的(在所测试的所有菌株中超过80% ；如Pizza等人， (2000), Science 287 :1816-1820所述)，它们代表了目标疫苗候选物。就该目的而言，结构域2 (被称作Hsf过客结构域)和结构域2+3(被称作Hsf颈部区+卷曲螺旋结构域) 在大肠杆菌中表达并被纯化。编码氨基酸52-473 (Hsf过客)和52-534 (Hsf n+cc)的DNA 片段是用加入末端Rca 1(正向引物)和BioI (反向引物)限制位点的寡核苷酸进行PCR 扩增的。纯化的扩增子是用RcaIAhoI在供应商建议的条件下消化的；且随后被克隆到 pET24d (Novagen Inc.，Madi sonffl)大肠杆菌表达载体的 NcoI (与 real 相容)/XhoI 位点中。选择重组质粒并用于制备纯化重组质粒。进行表达研究时，将这些载体(pET-Hsfpas 和pET-Hsf ncc)引入到大肠杆菌菌株B121DE3 (Novagen)中，其中，T7聚合酶的基因受到异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)-可调节的Iac启动子的控制。Novablue(DEiB) [pET-24b/ BASB029]大肠杆菌重组菌株的液体培养物(700ml)是在37°C搅拌下生长的，直到600nm的光密度(0D600)达到0. 6。在该时间点，加入IPTG至ImM终浓度，使培养物再生长4小时。 然后10，OOOrpm离心该培养物，将沉淀在-20°C冷冻至少10小时。融化后，在细胞溶解之前，22°C下，利用Rarmie破裂器通过两种途径将沉淀(680ml培养物)重悬浮于pH7. O的 20mM磷酸盐缓冲液中30分钟。4°C下，15，OOOrpm(Beckman J2-HS离心机，JA-20转子)离心溶解的细胞30分钟使其成为沉淀。将上清液上样到在pH8. 0的20mM Tris-HCl缓冲液中平衡的Q-琼脂糖快速流动柱(Pharmacia)上。流过后，用5倍柱体积的pH8. 0的20mM Tris-HCl缓冲液洗涤柱子。利用溶于pH8. 0的20mM Tris-HCl缓冲液中的250mM NaCl溶液洗脱柱上的重组蛋白。收集抗原阳性级分，并相对于PH7. 0的20mM磷酸盐缓冲液透析过夜。然后将0. 5M NaCl和20mM咪唑加入到透析样品中。然后将样品应用在Ni-NTA琼脂糖柱Oliagen)上，该柱是在含500mMNaC 1和pH7. 0的20mM咪唑的20mM磷酸盐缓冲液中平衡的。流过后，用5倍柱体积含500mM NaCl和20mM咪唑的pH7. 0的20mM磷酸盐缓冲液洗涤柱子。用溶于PH7. 0的20mM磷酸盐缓冲液中的IOOmM咪唑溶液洗脱污染物。用溶于pH7. 0 的20mM磷酸盐缓冲液中的250mM咪唑溶液洗脱重组蛋白。收集抗原阳性级别并相对于含 150mM NaCl的pH6. 8的IOmM磷酸盐缓冲液透析。如图2所示，从柱上洗脱富聚的(据估计在CBB染色的SDS-PAGE中的纯度高于90% ) Hsf-样过客蛋白，它们迁移到约47kDa (估计的相对分子量)处。该多肽对5-组氨酸基序产生的小鼠单克隆抗体是反应性的。这些数据共同表明Hsf过客及Hsf ncc基因可以以重组形式在大肠杆菌中表达并纯化。实施例8 重组Hap过客在大肠杆菌中的产生和纯化对来源于脑膜炎奈瑟氏球菌的Hap-样蛋白进行的计算机分析揭示了至少3个结构域。将来源于菌株H44/76的Hap-样序列作为参考，包含氨基酸1_42的结构域1编码自体转运蛋白家族特征性的sec-依赖性信号肽，包含氨基酸43-950的结构域2编码很可能是表面外露的且易进入免疫系统的过客结构域，包含氨基酸951-C末端(1457)的结构 Ml被预测编码可能装配成桶-样结构且被锚定在外膜中的链。因为结构域2很可能是表面外露的，且很好保守的(在所测试的所有菌株中超过80%)并可能作为亚单位抗原在大肠杆菌中产生，所以它代表了目标疫苗候选物。因为结构域2和3很可能是表面外露的，且很好保守的(在所测试的所有菌株中超过80% ；如Pizza等人，(2000)，Science287 1816-1820所述)，所以它们代表了目标疫苗候选物。就该目的而言，结构域2 (被称作Hap
36过客结构域)在大肠杆菌中表达并被纯化。编码氨基酸43-950 (Hap过客)的DNA片段是用加入末端NcoI (正向引物)和BioI (反向引物)限制位点的寡核苷酸进行PCR扩增的。纯化的扩增子是用NcoIAhoI在供应商建议的条件下消化的；且随后被克隆到pET24d(NOVagen Inc. ,Madi son WI)大肠杆菌表达载体的NcolAhoI位点中。选择重组质粒并大规模纯化。 进行表达研究时，将这些载体(pET-Hap pass)引入到大肠杆菌菌株B121DE3 (Novagen)中， 其中，T7聚合酶的基因受到异丙基-β -D硫代半乳糖苷(IPTG)-可调节的Iac启动子的控制。在发酵罐中培养大肠杆菌BL21「DET-HaD pass!将主接种物的等分试样级分 (100 μ 1)在 FEC013AA 平板(大豆胨 A320g/L、酵母提取物 5g/L、NaCl 5g/L、琼脂 18g/L、蒸馏水加到1L)上扩散，并在37°C下生长20小时。收获菌苔并重悬浮于含0. 9% NaCl的无菌水中。该溶液用于以批量模式在20L发酵罐中的FEC011AC培养基(大豆胨Mg/L、酵母提取物 48g/L、MgS04/7H20 0. 5g/L、K2HP042g/L、NaH2P04/2H200. 45g/L、甘油(87% )40g 和蒸馏水加到 1L)上接种。维持温度(30°C )、pH(6.8，Na0H 25% /H3P0425% )、压力(500mbar) 恒定，以20L/分换气。在这些条件中，通过调整搅拌速度(lOO-lOOOrpm)将溶解的氧压维持在20%。生长8小时后加入诱导物(IPTGUmM) (OD = 27.8)。6小时(OD = 49. 2)和 16H30(0D = 48.6)后收集样品(6L)，离心收获生物量，并在_20°C贮存相应的颗粒状物。Hap过客的纯化HAP过客是以批量模式自发酵罐纯化的。开发了纯化流程(见下面)。
权利要求
1.免疫原性组合物，其包含a)奈瑟氏球菌自体转运蛋白抗原NadA或Hsf;b)奈瑟氏球菌!^e获得蛋白抗原LipM8或TbpA；和c)包含LPS免疫型L3的外膜小泡组合物；并且，其中所述抗原当存在于外膜小泡中时，已在外膜小泡中被上调。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述的奈瑟氏球菌自体转运蛋白抗原和奈瑟氏球菌狗获得蛋白抗原是经分离的。
3.根据权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其中所述的免疫原性组合物包含亚单位组合物和所述的外膜小泡组合物。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述的外膜小泡组合物包含LPS免疫型L3，7，9。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述的外膜小泡组合物包含可利用0. 02-0. 4%的脱氧胆酸盐提取获得的一定浓度的LPS免疫型L3。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的免疫原性组合物，其中至少一种奈瑟氏球菌抗原来自脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)。
7.根据权利要求6的免疫原性组合物，其中，全部的奈瑟氏球菌抗原来自脑膜炎奈瑟氏球菌。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的免疫原性组合物，其中，进一步包含一种或多种细菌荚膜多糖或寡糖。
9.根据权利要求8的免疫原性组合物，其中，所述的荚膜多糖或寡糖来自于下述细菌， 所述细菌选自脑膜炎奈瑟氏球菌血清型A，C，Y和W-135。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的免疫原性组合物，其中，进一步包含佐剂。
11.根据权利要求10的免疫原性组合物，其中，所述的佐剂包含铝盐。
12.根据权利要求11的免疫原性组合物，其中，所述的铝盐是氢氧化铝凝胶。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的免疫原性组合物，其中，所述的奈瑟氏球菌自体转运蛋白抗原是NadA。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的免疫原性组合物，其中，所述的奈瑟氏球菌！^ 获得蛋白抗原是LipM8。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的免疫原性组合物，其中进一步包含抗原，所述进一步包含的抗原是奈瑟氏球菌膜相关蛋白。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的免疫原性组合物，其中进一步包含选自 GNA1870, Hap，LbpB 和 0mp85 的抗原。
17.根据权利要求15或16所述的免疫原性组合物，其中进一步包含的抗原是经分离的。
全文摘要
本发明涉及用于治疗和预防奈瑟氏球菌病的免疫原性组合物和疫苗。本发明的免疫原性组合物含有选自包括粘附素、自体转运蛋白、毒素、铁获得蛋白和膜相关蛋白(优选整合外膜蛋白)在内的至少两个不同种类抗原的抗原组合。这种抗原组合能以抗奈瑟氏球菌生活周期不同方面的免疫反应为目标，产生更有效的免疫反应。
文档编号A61K39/095GK102552895SQ201210028610
公开日2012年7月11日 申请日期2003年7月31日 优先权日2002年8月2日
发明者C·戈拉, C·费龙, F·-X·J·贝尔泰, J·普尔曼, P·德诺埃, R·比曼斯, V·魏南茨 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司