专利名称：免疫原性组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含缀合到载体蛋白上的细菌荚膜糖，尤其是那些脑膜炎奈瑟氏球菌(N. meningitidis)糖。其还涉及包含这样的糖缀合物的疫苗和疫苗试剂盒、制备所述免疫原性组合物和疫苗的方法以及本发明疫苗和免疫原性组合物在治疗中的用途。其还涉及使用糖缀合物抗感染的免疫方法以及糖缀合物在制备药物方面的用途。
背景技术：
脑膜炎奈瑟氏球菌是革兰氏阴性人感染性病原体，其能够引起细菌性脑膜炎。以有机体的荚膜多糖为基础，脑膜炎奈瑟氏球菌的十二个血清群已经得到了鉴定(A，B, C，H， I，K，LJ9E，W135，X，Y和Z)。血清群A(MenA)是导致撒哈拉以南非洲地区的流行病的最常见原因。血清群B和C是导致发展中国家的大多数情况的原因，剩余的情况是由W135和Y 引起的。包含缀合到载体蛋白上的脑膜炎奈瑟氏球菌糖的免疫原性组合物是本领域已知的；载体蛋白具有将T细胞非依赖型多糖抗原转化为能够引发免疫记忆应答的T细胞依赖型抗原的已知作用。例如WO 02/58737公开了一种含有纯化的荚膜多糖的疫苗，所述纯化的荚膜多糖来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和Y，并且是缀合到载体蛋白上的。然而，该申请教导所有的多糖必须基本上以同样的方式(通过相同的连接基连接到相同的蛋白载体上)进行缀合。仍存在对开发改善的抗奈瑟氏脑膜炎缀合疫苗的需要。本发明涉及提供一种脑膜炎球菌多糖缀合疫苗，其中可以设计每种多糖的缀合方式(而不是统一的)以获得有效的组合疫苗。特别地，将某些脑膜炎球菌糖以高的糖蛋白比例缀合到它们的蛋白载体上而其它的糖以低比例缀合是有利的。
发明内容
因此，在本发明的一个方面中提供了一种包含至少2种不同脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的免疫原性组合物，其中一种或多种所述糖选自由缀合到蛋白载体上的MenA、MenC、 MenY和MenW组成的第一组，其中糖蛋白的比例(w/w)在1 2_1 5之间，一种或多种不同的糖选自由缀合到蛋白载体上的MenA、MenC, MenY和MenW组成的第二组，其中糖蛋白的比例(w/w)在5 1-1 1.99之间。在MenW疫苗中，Men W糖与载体蛋白的比例可以在5 1-1 1. 99， 2:1-1: 1.99，1.5 1-1 1. 8，1 1-1 1. 7，1 1.2-1 1.6或1 1.4-1 1. 5(w/ w)之间。在MenY疫苗中，Men Y糖与载体蛋白的比例可以在5 1-1 1. 99，2:1-1: 1.99，1.5 1-1 1. 9，1 1-1 1. 8，1 1.1-1 1.6或1 1.3-1 1. 4(w/ w)之间。在MenA疫苗中，Men A糖与载体蛋白的比例可以在1 2_1 5,1 2.4-1 4， 1 2.7-1 3. 5 或 1 2.9-1 3. l(w/w)之间。在 Men C 疫苗中，Men C 糖与载体蛋白的比例可以在 5 1-1 1.99,2 1-1 1.99，1.5 1-1 1.8，1. 3 1-1 1.6， 1.2 1-1 1.4 或 1.1 1-1 1. 2(w/w)之间，或者在 1 2-1 5，1 2.5-1 4.5， 1 2. 7-1 4. 3，1 3-1 4 或 1 3.3-1 3.5(w/w)之间。缀合物中糖与载体蛋白的比例(w/w)是使用灭菌后的缀合物确定的。蛋白的量是使用 Lowry 试验(例如 Lowry 等人(1951) J. Biol. Chem. 193,265-275 或 Peterson 等人 Analytical Biochemistry 100,201-220(1979))确定的，糖的量对于 MenA 来说是使用 ICP-OES (感应耦合等离子体发射光谱)确定的，对于MenC来说是使用DMAP试验确定的而对于MenW和MenY来说是使用间苯二酚试验(Resorcinol assay)确定的(Monsigny等人 (1988)Anal. Biochem. 175，525—530)。通过连接物缀合的糖通常比直接缀合到载体蛋白上时具有更高的载体蛋白结合。 例如，在本发明的MenAC疫苗中，MenA糖可以通过连接物缀合到载体蛋白上而MenC直接地缀合。在MenCY疫苗中，MenC可以通过连接物缀合而MenY直接地缀合。在MenACWY疫苗中，MenA可以通过连接物缀合而MenCWY直接地缀合，或者MenAC可以通过连接物缀合而 MenffY直接地缀合。在本发明进一步的方面中，提供了包含至少2种分别缀合到同类载体蛋白(例如DT，CRM 197，蛋白D或TT)上的不同糖的免疫原性组合物，其中一种或多种糖是在以 1:2-1: 5之间的糖蛋白比例(w/w)缀合到载体蛋白上的，一种或多种不同的糖是以在 5:1-1: 1.99之间的糖蛋白比例(w/w)缀合到蛋白载体上的。例如，在MenAC疫苗中，可以将MenA以在1 2_1 5之间的糖蛋白比例(w/ w)缀合到载体蛋白上，而将MenC以在5 1-1 1. 99之间的糖蛋白比例(w/w)缀合到蛋白载体上。在MenCY疫苗中，可以将MenC以在1 2_1 5之间的糖蛋白比例(w/w) 缀合到载体蛋白上，而将MenY以在5 1-1 1. 99之间的糖蛋白比例(w/w)缀合到蛋白载体上。在MenACWY疫苗中，可以将MenAC以在1 2_1 5之间的糖蛋白比例(w/w) 缀合到载体蛋白上，而将MenWY以在5 1-1 1.99之间的糖蛋白比例(w/w)缀合到蛋白载体上，或者可以将MenA以在1 2_1 5之间的糖蛋白比例(w/w)缀合到载体蛋白上，而将MenCWY以在5 1-1 1. 99之间的糖蛋白比例(w/w)缀合到蛋白载体上。根据本发明进一步的方面，提供了一种使人宿主对由脑膜炎奈瑟氏球菌引起的疾病具有免疫性的方法，其包括向宿主给药以免疫保护剂量的本发明免疫原性组合物或疫
田ο根据本发明更进一步的方面，提供了一种用于治疗或预防由脑膜炎奈瑟氏球菌引起的疾病的本发明免疫原性组合物。根据本发明更进一步的方面，提供了本发明免疫原性组合物或疫苗在制备用于治疗或预防由脑膜炎奈瑟氏球菌所引起的疾病的药物方面的用途。
附图描述
图I-A-条形图显示了在抗-MenY ELISA中的GMC应答。ENYTTO12是由天然MenY 多糖制备的MenY-TT缀合物。ENYTTO14是由微流化MenY多糖制备的MenY-TT缀合物，其中所述MenY多糖经历了 40个周期的微流化作用。ENYTTOMbis是由微流化MenY多糖制备的 MenY-TT缀合物，其中所述MenY多糖经历了 20个周期的微流化作用。-B-条形图显示了在抗-MenY SBA试验中的GMT应答。ENYTTO12是由天然MenY 多糖制备的MenY-TT缀合物。ENYTTO14是由微流化MenY多糖制备的MenY-TT缀合物，其中所述MenY多糖经历了 40个周期的微流化作用。ENYTTOMbis是由微流化MenY多糖制备的 MenY-TT缀合物，其中所述MenY多糖经历了 20个周期的微流化作用。详细描述本发明的一个方面提供了一种包含至少2种不同的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的免疫原性组合物，其中一种或多种所述糖选自由缀合到蛋白载体上的MenA(脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A荚膜糖),MenC (脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C荚膜糖),MenY (脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y荚膜糖)和MenW(脑膜炎奈瑟氏球菌血清群W135荚膜糖)组成的第一组，其中糖蛋白的比例(w/V)在1 2-1 5之间，一种或多种不同的糖选自由缀合到蛋白载体上的MenA、MenC、MenY和MenW组成的第二组，其中糖蛋白的比例(w/w)在5 1-1 1.99 之间。更具体地说是，所述组合物包含至少2种不同的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，其中一种或多种所述糖选自由缀合到蛋白载体上的MenA和MenC组成的第一组，其中糖蛋白的比例(w/w)在1 2-1 5之间，一种或多种不同的糖选自由缀合到蛋白载体上的MenC、 MenY和MenW组成的第二组，其中糖蛋白的比例(w/w)在5 1_1 1.99之间。在一个方面中，免疫原性组合物含有MenW糖，其中Men W糖与载体蛋白的比例在 5 1-1 1.99,2 1-1 1.99，1.5 1-1 1.8，1 1-1 1. 7，1 1.2-1 1.6 或1 1.4-1 1.5(w/w)之间。在进一步的方面中，免疫原性组合物含有MenY糖，其中 Men Y 糖与载体蛋白的比例在 5 1-1 1.99,2 1-1 1.99,1.5 1-1 1.9， 1 1-1 1.8，1 1. 1-1 1.6 或 1 1.3-1 1. 4 (w/w)之间。在进一步的方面中，免疫原性组合物含有MenA糖，其中Men A糖与载体蛋白的比例在1 2_1 5，1 2.4-1 4、 1 2.7-1 3. 5 或 1 2.9-1 3. 1 (w/w)之间或者在 5 1-1 1.99，2 1-1 1.99， 1.5 1-1 1.8,1.3 1-1 1.6,1.2 1-1 1.4 或 1. 1 1-1 1.2 (w/w)之间。 在进一步的方面中，免疫原性组合物含有MenC糖，其中Men C糖与载体蛋白的比例在 5:1-1: 1.99,2 1-1 1.99，1.5 1-1 1.8，1. 3 1-1 1.6，1. 2 1-1 1.4 或 1.1 1-1 1. 2 (w/w)之间，或者在 1 2-1 5,1 2.5-1 4. 5，1 2.7-1 4.3， 1 3-1 4 或 1 3. 3-1 3.5(w/w)之间。更具体地说是，第一组可以由MenA和MenC组成，第二组由MenC、MenY和MenW组成。本发明的一个具体实施方案是下述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含=MenA 荚膜糖，其中Men A糖与载体蛋白的比例在1 2-1 5，1 2.4-1 4，1 2.7-1 3.5 或1 2.9-1 3.1(w/w)之间[其可以任选地通过连接物缀合到载体蛋白上]和 MenC荚膜糖，其中Men C糖与载体蛋白的比例在5 1-1 1.99,2 1-1 1.99， 1.5 1-1 1.8,1.3 1-1 1.6,1.2 1-1 1.4 或 1. 1 1-1 1.2 (w/w)之间 [其可以任选地直接缀合到载体蛋白上]；MenC荚膜糖，其中Men C糖与载体蛋白的比例在1 2-1 5,1 2.4-1 4，1 2.7-1 3. 5 或 1 2.9-1 3. 1 (w/w)之间[其可以任选地通过连接物缀合到载体蛋白上]和MenY荚膜糖，其中Men Y糖与载体蛋白的比例在 5:1-1: 1.99,2 1-1 1.99，1.5 1-1 1.8，1. 3 1-1 1.6，1. 2 1-1 1.4 或1.1 1-1 1.2(w/w)之间[其可以任选地直接缀合到载体蛋白上];MenA和MenC荚膜糖，其中Men A和C糖与载体蛋白的比例在1 2-1 5，1 2.4-1 4，1 2.7-1 3.5 或1 2.9-1 3. 1 (w/w)之间[其可以任选地通过连接物缀合到载体蛋白上]和MenY和 Men W荚膜糖，其中Men Y和W糖与载体蛋白的比例在5 1-1 1.99，2 1-1 1.99， 1.5 1-1 1.8,1.3 1-1 1.6,1.2 1-1 1.4 或 1. 1 1-1 1.2 (w/w)之间 [其可以任选地直接缀合到载体蛋白上]；MenA荚膜糖，其中Men A糖与载体蛋白的比例在 1 2-1 5,1 2.4-1 4，1 2. 7-1 3. 5 或 1 2.9-1 3. 1 (w/w)之间[其可以任选地通过连接物缀合到载体蛋白上]和MenC、MenY和Men W荚膜糖，其中Men Y和W和C糖与载体蛋白的比例在 5 1-1 1. 99,2 1-1 1.99，1.5 1-1 1. 8，1. 3 1-1 1.6， 1.2 1-1 1.4或1.1 1-1 1.2 (w/w)之间[其可以任选地直接缀合到载体蛋白上]。 在这些实施方案的任何一种中，还可以包含Hib缀合物，其直接地或通过连接物连接到载体蛋白(参见上文或下文中的载体列表，例如TT，和糖蛋白的比例)上。在整个本说明书中，术语“糖”可以表示多糖或低聚糖，或者两者都包含。多糖是从细菌中分离出来的，或者是从细菌中分离出来并通过已知方法(参见例如EP4975M和 EP497525)以及任选地通过微流化作用将尺寸调整到某一程度的。可以调整多糖的尺寸从而减少多糖样品的粘度和/或改善缀合产品的过滤性。低聚糖的重复单元数少(一般地具有5-30个重复单元)，其一般是水解的多糖。各脑膜炎奈瑟氏球菌(和/或Hib)荚膜糖可以缀合到独立地选自TT、DT、CRM197、 TT的C片段和蛋白D的载体蛋白上。可用于本发明缀合物的蛋白载体的更加全面的列表呈现于下文中。虽然可以将一种或多种脑膜炎奈瑟氏球菌(和/或Hib)荚膜糖缀合到与其它糖不同的载体蛋白上，但是在一个实施方案中它们是全部缀合到相同的载体蛋白上的。 例如可以将它们全部缀合到相同的选自TT、DT、CRM 197,TT的C片段和蛋白D的载体蛋白上。由于CRM197与DT的区别仅在于一个氨基酸，因此在本文的上下文中认为它们是相同的载体蛋白。在一个实施方案中，将存在的所有脑膜炎奈瑟氏球菌(和/或Hib)荚膜糖都缀合到TT上。如果组合物中2种或2种以上糖的蛋白载体是相同的，则可以将所述糖缀合到蛋白载体的相同分子上(有2种以上的不同的糖缀合在载体分子上)[参见例如 W004/083251 ；例如可以向单一的载体蛋白上缀合MenA和MenC ；MenA和MenW ；MenA和 MenY ；MenC 禾口 MenW ；MenC 禾口 MenY ；Men W 和 MenY ；MenA、MenC 禾口 MenW ；MenA、MenC 禾口 MenY ； MenA、MenW 禾口 MenY ；MenC、MenW 禾口 MenY ；MenA、MenC、MenW 禾口 MenY ；Hib 禾口 MenA ；Hib 禾口 MenC ； Hib和MenW;或Hib和MenY]。或者可以将各糖分别缀合到蛋白载体的不同分子上(蛋白载体的每种分子仅有一类糖缀合在其上面)。本申请第一方面的免疫原性组合物还可以具有本发明第二方面的任意或全部附加特征，反之亦然。本发明的第二方面提供了一种包含至少2种分别缀合到同类载体蛋白上的不同糖的免疫原性组合物，其中一种或多种糖是以在1 2-1 5之间[高比例]的糖蛋白比例(w/V)缀合到载体蛋白上的，一种或多种不同的糖是以在5 1-1 1.99之间[低比例]的糖蛋白比例(w/V)缀合到蛋白载体上的。“分别缀合到同类载体蛋白上”的意思是指将糖各自地缀合到相同的载体上(即， 不同的糖不是缀合到相同蛋白载体的相同分子上的)。荚膜糖可以是缀合到同类载体蛋白上，所述载体蛋白独立地选自TT、DT、CRM 197、 TT的C片段和蛋白D。下文中给出了可用于本发明缀合物中的蛋白载体的更全面的列表。 由于CRM 197和DT的区别仅在于一个氨基酸，所以在本文的上下文中认为它们是相同的载体蛋白。在一个实施方案中，存在的所有荚膜糖都是缀合到TT上的。高比例(1 2-1 5)和低比例(5 1-1 1.99)的糖可以选自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A荚膜糖(MenA)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C荚膜糖(MenC)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y荚膜糖(MenY)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群W荚膜糖(MenW)、b型流感嗜血杆菌 (H. influenzae)荚膜糖(Hib)、B群链球菌(Mi^ptococcus) I群荚膜糖、B群链球菌II群荚膜糖、B群链球菌III群荚膜糖、B群链球菌IV群荚膜糖、B群链球菌V群荚膜糖、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus) 5型荚膜糖、金黄色葡萄球菌8型荚膜糖、来自伤寒杀门氏菌(Salmonella typhi)的Vi糖、脑膜炎奈瑟氏球菌LPS (例如L3和/或L2)、卡他莫拉菌(M. catarrhaliS)LPS、流感嗜血杆菌LPS和来自任意荚膜肺炎球菌糖的糖例如来自血清型:1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 或33F。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物是由来自同属细菌(例如，奈瑟氏球菌属、链球菌属、葡萄球菌属或嗜血杆菌属)的两种或两种以上的不同的糖组成的，或者包含来自同属细菌的两种或两种以上的不同的糖。在一个实施方案中，MenA是高比例的糖；在另一个中Men W是低比例的糖；在另一个中MenY是低比例的糖；在另一个中MenC是高比例的糖；在另一个中MenC是低比例的糖； 在另一个中Hib是高比例的糖。包含MenA/C的疫苗可以分别是高/低比例，包含MenC/Y 的疫苗可以分别是高/低比例，包含MenA/C/W/Y的疫苗可以分别是高/高/低/低比例， 而包含MenA/C/W/Y的疫苗可以分别是高/低/低/低比例。本发明各方面的概述将包含在本发明药物(免疫)组合物中的本发明的糖(特别是脑膜炎奈瑟氏球菌糖和/或Hib荚膜糖)是缀合到载体蛋白上的，所述载体蛋白例如是破伤风类毒素(TT)、破伤风类毒素片段C、破伤风类毒素的无毒突变株[注意，为了本发明的目的，所有这样的TT 变形株均被认为是同一类载体蛋白]、白喉类毒素(DT)、CRM197、白喉类毒素的其它无毒突变株[例如 RM176、CRM 197、CRM228、CRM 45 (Uchida 等人，J. Biol. Chem. 218 ；3838-3844， 1973) ；CRM 9,CRM 45、CRM102、CRM103 和 CRM 107 以及 Nicholls 和 Youle 在 Genetically Engineered Toxins,Ed =Frankel,Maecel Dekker Inc. 1992 中描述的其它突变株；Glu—148 到Asp的缺失或突变、Gin或Ser和/或Ala 158到Gly的突变以及US4709017或US 4950740中公开的其它突变；残基Lys 516、Lys 526、Phe530和/或Lys 534中的至少一或多种的突变以及US 5917017或US6455673中公开的其它突变；或US 5843711中公开的片段](注意，为了本发明的目的，所有这样的DT变形株均被认为是同一类载体蛋白)、肺炎球菌的肺炎球菌溶血素(Kuo等人(1995nnfect Immun 63 ;2706_13)、OMPC(脑膜炎球菌的外膜蛋白-通常提取自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B-EP0372501)、合成肽(EP0378881，EP0427347)、热休克蛋白(W093/17712，WO 94/03208)、百日咳蛋白(W0 98/58668， EP0471177)、细胞因子、淋巴因子、生长因子或激素(W0 91/01146)、包含多个人类⑶4+T细胞抗原表位的人工蛋白，其中所述人工蛋白来自由抗原衍生的多种病原体O^alugi等人 (2001) Eur J Immunol 31 ；3816-3824)例如附9 蛋白(Baraldoi 等人(2004) Infect Immun 72 ；4884-7)肺炎球菌表面蛋白I3SpA(W) 02/091998)、铁吸收蛋白(W0 01/72337)、难辨梭状芽孢杆菌毒素A或B(W0 00/61761)或蛋白D(EP594610和W000/56360)。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物在其所含有的至少两种、三种、四种或每种糖(例如脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖和/或Hib)中(独立地)使用了同一类型的载体蛋白。在一个含有Hib和脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的实施方案中，可以将Hib缀合到与至少两种、三种、四种或每种脑膜炎奈瑟氏球菌糖所缀合的载体蛋白相同类型的载体蛋白上。 例如，将2、3、或4种脑膜炎奈瑟氏球菌糖(MenA、C、Y、W)独立地缀合到破伤风类毒素上以制备2、3或4缀合物，并且任选地将Hib也缀合到TT上。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含缀合到选自TT、DT、CRM197、TT 的C片段和蛋白D的载体蛋白上的脑膜炎奈瑟氏球菌糖。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含缀合到选自TT、DT、CRM197、TT的C片段和蛋白D的载体蛋白上的Hib糖。本发明的免疫原性组合物任选地包含至少一种脑膜炎球菌糖(例如，MenA ；MenC ； Menff ；MenY ；MenA 和 MenC ；MenA 和 Menff ；MenA 和 MenY ；MenC 和 Men W ；Men C 和 MenY ；Men W 和 Men Y ；MenA、MenC 禾口 MenW ；MenA、MenC 禾口 Men Y ；MenA^Menff 禾口 MenY ；MenC^Menff 禾口 MenY 或MenA、MenC, Menff和MenY)缀合物，所述缀合物的Men糖与载体蛋白的比例在1 5至 5 1，1 2至 5 1，1 0.5至1 2. 5 或 1 1. 25 至 1 2.5(w/w)之间。本发明免疫原性组合物任选地包含Hib糖缀合物，所述缀合物的Hib与载体蛋白的比例在1 :5至5: 1;1:2至2: 1 ；1 1至1:4;1:2至1: 3. 5之间；或者在 1 2. 5或1 3左右，或刚好为1 2. 5或1 3 (w/w)。在一个实施方案中，本发明免疫原性组合物所包含的脑膜炎奈瑟氏球菌糖和/或 Hib糖缀合物是通过连接物，例如双官能连接物，缀合到载体蛋白上的。连接物任选地是异双官能的或同双官能的，其具有例如反应性氨基基团和反应性羧酸基团、2个反应性氨基基团或者两个反应性羧酸基团。连接物具有例如4到20，4到12，5到10个碳原子。可能的连接物是ADH。其它连接物包括B-丙酰胺基(W0 00/10599)、硝基苯-乙胺(Gever等人(1979)Med. Microbiol. Immunol. 165 ；171-288)、卤代烧基卤化物(US4057685)、糖苷键 (US4673574, US4808700)、己二胺和 6-氨基己酸(US4459286)。存在于本发明免疫原性组合物中的糖缀合物可以通过任何已知的偶联技术制备。 缀合方法可以借助用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)使糖活化以形成氰酸酯。这样，活化的糖就可以直接地或通过间隔(连接)基团被偶合到载体蛋白的氨基上。例如，间隔物可以是胱胺或半胱胺以提供硫醇化糖，所述硫醇化糖能够通过硫醚键偶合到载体上，所述硫醚键是在与马来酰亚胺-活化载体蛋白(例如使用GMBQ或卤代乙酰化载体蛋白(例如使用碘代乙酰亚胺或溴乙酸N-琥珀酰亚胺酯)反应后获得的。任选地，将氰酸酯(任选地是通过CDPA化学制得的)与己二胺或ADH偶合，并将氨基-衍生化的糖用碳二亚胺(例如EDAC或EDC)化学通过蛋白载体上的羧基缀合到载体蛋白上。这样的缀合物描述于 PCT 公开申请 WO 93/15760 Uniformed Services University 和 WO 96/08348 和 WO96/29094 中。其它合适的技术使用了碳二亚胺、酰胼、活性酯、降冰片烷、对-硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU。许多描述于WO 98/42721中。缀合可以使用羰基连接物，其可以通过使糖的游离羟基基团与CDI反应(Bethell等人J. Biol. Chem. 1979,254 ； 2572-4，Hearn等人J. Chromatogr. 1981. 218 ；509-18)后接着与蛋白反应以形成氨基甲酸酯连接而形成。其可以包括将异头端基还原为伯羟基；任选地进行伯羟基基团的保护/脱保护反应，所述反应为使伯羟基与CDI反应以形成氨基甲酸CDI酯中间体以及使氨基甲酸 CDI酯中间体与蛋白上的氨基偶合。缀合物也可以如US 4365170 (Jennings)和 US 467；3574 (Anderson)中所描述的那样通过直接还原氨化的方法来制备。其它方法描述于EP-0-161-188、EP-208375和 EP-0-477508 中。进一步的方法包括将溴化氰(或CDAP)活化的糖通过碳二亚胺缩合作用(Chu C.等人hfect. Immunity, 1983M5256)，例如使用EDAC，偶合到蛋白载体上，其中所述糖是用己二酸二酰胼(ADH)衍生化的。在一个实施方案中，将糖上的羟基(任选地为活化的羟基，例如用氰酸酯活化的羟基)直接地或间接地(通过连接物)连接到蛋白上的氨基或羧基上。当存在连接物时，将糖上的羟基任选地连接到连接物上的氨基上，例如通过使用CDAP缀合。可以将连接物(例如ADH)中的其它氨基基团缀合到蛋白上的羧酸基团上，例如通过使用碳二亚胺化学，例如通过使用EDAC。在一个实施方案中，在将连接物缀合到载体蛋白上之前，先将Hib或脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖(或通常所说的糖)缀合到第一连接物上。或者在缀合到糖上之前，可以先将连接物缀合到载体上。通常，蛋白载体上可以用于偶合/缀合的化合物基团的类型如下A)羧基(例如通过天冬氨酸或谷氨酸)。在一个实施方案中该基团被直接连接到糖上的氨基基团上，或者用碳二亚氨化学例如用EDAC连接到连接物上的氨基基团上。B)氨基(例如通过赖氨酸)。在一个实施方案中该基团被直接连接到糖上的羧基基团上，或者用碳二亚氨化学例如用EDAC连接到连接物上的羧基基团上。在一个实施方案中该基团被直接连接到糖上的用CDAP或CNBr活化的羟基上，或者连接到连接物上的这样的基团上；连接到具有醛基的糖或连接物上；连接到具有琥珀酰亚胺酯基的糖或连接物上。C)巯基(例如通过半胱氨酸)。在一个实施方案中将该基团连接到溴或氯乙酰化的糖上，或者用马来酰亚胺化学连接到连接物上。在一个实施方案中该基团是用双二重氮联苯胺(bis diazobenzidine)活化/改性的。D)羟基(例如通过酪氨酸)。在一个实施方案中该基团是用双二重氮联苯胺活化 /改性的。E)咪唑基(例如通过组氨酸)。在一个实施方案中该基团是用双二重氮联苯胺活化/改性的。F)胍基(例如通过精氨酸)。
G)吲哚基(例如通过色氨酸)。 在糖上，能够用于偶合的通常是以下基团0H、COOH或NH2。醛基能够在本领域已知的不同处理后产生，所述处理例如用高碘酸盐、酸解、过氧化氢等。直接偶合法糖-OH+CNBr或 CDAP----->氰酸酯 +NH2_Prot—— >缀合物糖-醛+NH2-Prot-— > 西佛碱 +NaCNBH3----->缀合物糖-C00H+NH2_Prot+EDAC----->缀合物糖-NH2+C00H_Pr。t+EDAC----->缀合物通过间隔物(连接物)的间接偶合法糖-OH+ CNBr 或 CDAP-----> 氰酸酉旨 +NH2----NH2----->
糖——NH2+C00H-Prot+EDAC------>缀合物糖-OH+CNBr或 CDAP—— >氰酸酯 +NH2——SH----->糖-----SH+SH-Prot (具
有暴露的半胱氨酸的天然蛋白或是通过例如SPDP将蛋白的氨基改性后获得的)——> 糖-S-S-Prot 糖-OH+CNBr或CDAP----->氰酸酯+NH2——SH----->糖——SH+马来酰亚
胺-Prot (氨基的改性物)------>缀合物糖-C00H+EDAC+NH2——NH2----->糖——NH2+EDAC+C00H-Prot----->缀合物糖-C00H+EDAC+NH2——SH----->糖-----SH+SH-Prot (具有暴露的半胱氨酸的
天然蛋白或是通过例如SPDP将蛋白的氨基改性后获得的)—— > 糖-S-S-Prot糖-C00H+EDAC+NH2——SH----->糖——SH+马来酰亚胺-Prot (氨基的改性
物)------>缀合物糖-醛+NH2——NH2----->糖——NH2+EDAC+C00H-Prot----->缀合物注意除了以上的EDAC，还可以使用任何合适的碳ニ亚胺。总之，通常可以用于与糖偶合的蛋白载体化学基团的类型是氨基(例如赖氨酸残 基上的)、C00H基团(例如天冬氨酸和谷氨酸残基上的)和SH基团(如果能够获得的话) (例如半胱氨酸残基上的)。在一个实施方案中，将Hib糖，当存在吋，用CNBr、或CDAP、或CDAP与碳ニ亚胺化 学(例如EDAC)的结合、或CNBr与碳ニ亚胺化学(例如EDAC)的结合来缀合到载体蛋白 上。任选地Hib是用CNBr和碳ニ亚胺化学缀合的，其中所述碳ニ亚胺化学任选地为EDAC。 例如，用CNBr连接糖和连接物，接着用碳ニ亚胺化学连接连接物和蛋白载体。在一个实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖(或通常所说的糖)中的至少ー种 是直接缀合到载体蛋白上的；任选地将MenW和/或MenY和/或MenC糖直接缀合到载体蛋 白上。例如将 MenW ；MenY ；MenC ；MenW禾ロ MenY ；MenW 禾ロ MenC ；MenY 禾ロ MenC ；或 MenW、MenY 禾ロ MenC直接连接到载体蛋白上。任选地，脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖中的至少ー种是通过CDAP 直接缀合的。例如将 Menff ；MenY ；MenC ；Menff 禾ロ MenY ；Menff 禾ロ MenC ；MenY 禾ロ MenC ；或 Menff, MenY和MenC通过CDAP直接连接到载体蛋白上(參见WO 95/08348和WO 96/29094)。在 一个实施方案中，将所有的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖均缀合到破伤风类毒素上。任选地，MenW和/或Y糖与载体蛋白的比例在1 0. 5到1 2(w/w)之间，和/ 或MenC糖与载体蛋白的比例在1 0. 5到1 4或1 0. 5到1 1. 5 (w/w)之间，尤其 是当这些糖是直接连接到所述蛋白上的吋，其中所述连接任选地使用了 CDAP。在一个实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖(或通常所说的糖)中的至少ー种是通过连接物，例如双官能连接物，缀合到载体蛋白上的。所述连接物任选地是异双官能的或是同双官能的，其具有例如反应性氨基基团和反应性羧酸基团、2个反应性氨基基团或者 2个反应性羧酸基团。连接物具有例如4到20，4到12，5到10个碳原子。可能的连接物是 ADH。在一个实施方案中，MenA ；MenC ；或MenA和MenC是通过连接物缀合到载体蛋白 (例如破伤风类毒素)上的。在一个实施方案中，至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖是通过连接物使用CDAP和 EDAC缀合到载体蛋白上的。例如，如上所述地将MenA ；MenC ；或MenA和MenC通过连接物 (例如那些在其端基上具有两个胼基的连接物如ADH)用CDAP和EDAC缀合到蛋白上。例如， 用CDAP将糖缀合到连接物上，用EDAC将连接物缀合到蛋白上。任选地，对于MenA ；MenC ；或 MenA和MenC来说，通过连接物的缀合导致糖与载体蛋白的比例在1 0. 5到1 6 ;1 1 到1 5或1 2到1 4之间。对于含有缀合到相同载体上的多种糖的组合疫苗来说，一个值得考虑的问题是载体的免疫抑制作用可能使用了太多的载体从而可能抑制了免疫应答。用统一的方法缀合载体将向免疫系统呈现相似的B-和T-细胞抗原表位的混合。然而，如果一种糖和另一种糖的缀合发生在载体蛋白内不同化学基团上，则蛋白载体在怎样将它们自身呈现给免疫系统方面可能会有某种程度的不同。因此，对于本发明的所有方面来说，本文中还提供了包含至少2种分别缀合到同类载体蛋白(例如破伤风类毒素)上的不同糖的免疫原型组合物，其中一种或多种糖是通过蛋白载体上的第一类化学基团缀合到载体蛋白上的，一种或多种糖是通过蛋白载体上的第二类(不同的)化学基团缀合到载体蛋白上的。第一和第二类化学基团可以存在于蛋白载体中在蛋白载体的相互排斥的第一和第二系列氨基酸(例如一个系列中的某些天冬氨酸/谷胺酸残基和第二系列中的某些赖氨酸/精氨酸残基)上。例如可以将一种糖缀合到载体上的羧基上，将另一种缀合到氨基上。 这样的缀合可以包括每种不同缀合物的在单独的B-和/或T-细胞抗原表位上的缀合例如在MenAC疫苗中，可以将MenA连接到载体蛋白上的第一类化学基团(例如羧基)上，将MenC连接到第二基团(例如氨基)上。在MenCY疫苗中，可以将MenC连接到载体蛋白上的第一类化学基团(例如羧基)上，将MenY连接到第二基团(例如氨基)上。 在MenACWY疫苗中，可以将MenAC连接到载体蛋白上的第一类化学基团(例如羧基)上，将 MenWY连接到第二基团(例如氨基)上，或者可以将MenA连接到载体蛋白上的第一类化学基团(例如羧基)上，将MenCWY连接到第二基团(例如氨基)上。在一个实施方案中，2缀合物可以包括连接到同类载体上的同类糖，但是其是通过不同缀合化学进行的。在其它的实施方案中，将2种不同的糖缀合到蛋白载体上的不同基团上。“分别缀合到同类载体蛋白上”的意思是指将糖各自缀合到相同的载体上(即，不一起使用蛋白载体相同分子上的第一和第二化学基团两者来缀合糖的片段，而考虑用蛋白载体第一部分上的第一化学基团来缀合第一个糖，考虑用蛋白载体第二部分上的第二化学基团来缀合第二个糖)。在一个实施方案中，蛋白载体上的第一和第二类化学基团是存在于载体蛋白上的单独的B-和/或T-细胞抗原表位上的。也就是说，它们彼此存在于不同系列的B-和/或τ-细胞抗原表位上。可以使用已知的方法例如以下两种方法中的一种或两种来预测载体的 B-细胞抗原表位2D-结构预测和/或抗原指数预测。2D-结构预测可以使用PSIPRED程序进行(来自 David Jones,Brunei Bioinformatics Group,Dept. Biological Sciences, Brunei University, Uxbridge UB83PH, UK)。抗原指数可以以 Jameson 和 Wolf 所描述的方法(CABI0S 4:181-186[1988])为基础进行计算。该程序中使用的参数是抗原指数和抗原肽的最小长度。在该程序中可以使用对于最少5个连续氨基酸的0. 9的抗原指数作为初始值。T-辅助细胞抗原表位是结合在HLA类II型分子上的肽，并且其能够被T-辅助细胞识别。对有效T-辅助细胞抗原表位的预测可以基于已知技术进行，所述已知技术例如 Sturniolo 等人描述的 TEPIT0PE 法。(Nature Biotech. 17 :555-561 [1999]) 存在于蛋白载体上的第一和第二化学基团任选地是彼此不同的，并且理想地是易于用于缀合目的的天然化学基团。它们可以独立地选自羧基、氨基、巯基、羟基、咪唑基、胍基和吲哚基。在一个实施方案中，第一化学基团是羧基，第二基团是氨基，或者为相反。对于这些基团在上文中有更加详细的解释。在一个具体的实施方案中，免疫原性组合物包含至少2中不同的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，其中一种或多种选自由MenA和MenC组成的第一组，其中所述MenA和MenC是通过蛋白载体上的第一类化学基团(例如羧基)缀合到载体蛋白上的，一种或多种不同的糖选自由MenC、MenY和MenW组成的第二组，其中所述MenC、MenY和MenW是通过蛋白载体上的第二类化学基团(例如氨基)缀合到载体蛋白上的。在进一步的实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含通过第一类化学基团(例如羧基)缀合的MenA，和通过第二类化学基团(例如氨基)缀合的MenC。在另一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含通过第一类化学基团(例如羧基)缀合的MenC，和通过第二化种学基团(例如氨基)缀合的MenY。在另一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含通过第一类化学基团(例如羧基)缀合的MenA，和通过第二化种学基团(例如氨基)缀合的MenC、MenY和MenW。在另一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含通过第一类化学基团(例如羧基)缀合的MenA和MenC，和通过第二化种学基团(例如氨基)缀合的MenY和MenW。在任意以上的实施例中，还可以存在缀合到同类蛋白载体上的Hib。可以将Hib通过第一或第二类化学基团缀合到载体上。在一个实施方案中，其是通过羧基缀合的。在一个实施方案中，MenA荚膜糖，当存在时其至少是部分0-乙酰化的，从而使得至少50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或98 %的重复单元在至少一个位置上是0-乙酰化的。0-乙酰化例如出现在至少50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或98 %的重复单元的至少 0-3位置上。在一个实施方案中，MenC荚膜糖，当存在时其至少是部分0-乙酰化的，从而使得至少 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或 98% 的(α 2 — 9)-连接 NeuNAc 重复单元在至少一或两个位置上是0-乙酰化的。0-乙酰化例如出现在至少30^^40%,50%、 60%、70%、80%、90%、95%或98%的重复单元的0_7和/或0_8位置上。在一个实施方案中，MenW荚膜糖，当存在时，其至少是部分0_乙酰化的，从而使得至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的重复单元在至少一或两个位置上是0-乙酰化的。0-乙酰化例如出现在至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的重复单元的0-7和/或0-9位置上。在一个实施方案中，MenY荚膜糖，当存在时，其至少是部分0-乙酰化的，从而使得至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的重复单元在至少一或两个位置上是0-乙酰化的。0-乙酰化出现在至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90%、95%或98%的重复单元的7和/或9位上。0-乙酰化的百分比是指含有0-乙酰化基团的重复单元的百分比。可以在缀合前和/或缀合后在糖中对其进行测量。在本发明的一个实施方案中，免疫原性组合物中所存在的糖或者所存在的各脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖是缀合到TT上的。在进一步的实施方案中，各类脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖是分别缀合到不同类型的载体蛋白上的。在进一步的实施方案中，各脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖缀合物的糖载体比是1 5-5 1或1 1-1 4(w/w)。在进一步的实施方案中，至少一种、两种或三种脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖缀合物是直接缀合到载体蛋白上的。在进一步的实施方案中，Men W禾口 /或MenY, Menff和/或MenC、MenY和/或MenC、或者MenW 和MenC和MenY是直接缀合到载体蛋白上的。在进一步的实施方案中，至少一种、两种或三种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物是通过CDAP化学直接缀合的。在进一步的实施方案中，MenW 和/或Y糖与载体蛋白的比例在1 0.5到1 2(w/w)之间。在进一步的实施方案中， MenC糖与载体蛋白的比例在1 0. 5到1 2(w/w)之间。在进一步的实施方案中，至少一种、两种或三种脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖是通过连接物(其可以是双官能的具有两个反应性氨基(例如ADH)或两个反应性羧基或者一端具有反应性氨基而另一端具有反应性羧基)缀合到载体蛋白上的。连接物能够具有4到12个碳原子。在进一步的实施方案中，所述的或每种通过连接物缀合的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖都是用CDAP化学缀合到连接物上的。在进一步的实施方案中，载体蛋白是使用碳二亚胺化学，任选地使用EDAC缀合到连接物上的。在进一步的实施方案中，所述的或每种脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖均是在将载体蛋白缀合到连接物上之前缀合到连接物上的。在进一步的实施方案中，MenA是通过连接物缀合到载体蛋白上的(MenA糖与载体蛋白的比例可以在1 2到1 5 (w/w)之间)。在进一步的实施方案中，MenC是通过连接物缀合到载体蛋白上的(MenC糖与载体蛋白的比例可以在 1 2 到 1 5(w/w)之间)。本发明的免疫原性组合物任选地包含一或多种糖缀合物，其中各糖在缀合前的平均尺寸大于50kDa、75kDa、IOOkDa, 1 IOkDa, 120kDa或130kDa。在一个实施方案中，缀合后的缀合物能够容易地过滤通过0. 2微米的过滤器使得与过滤前的样品相比，过滤后能够获得大于50、60、70、80、90或95%的收率。特别是，本发明的免疫原性组合物包含脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，所述荚膜糖来自缀合到载体蛋白上的血清群A、C、W和Y中的至少一种、两种、三种或四种，其中至少一种、 两种、三种或四种或者每种脑膜炎奈瑟氏球菌糖的平均尺寸(重均分子量；Mw)在50kDa、 60kDa、75kDa、100kDa、l 10kDa、120kDa 或 130kDa 以上。免疫原性组合物可以包含脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，所述荚膜糖来自缀合到载体蛋白上的血清群A、C、W和Y中的至少一种、两种、三种或四种，其中至少一种、两种、三种或四种或者每种脑膜炎奈瑟氏球菌糖是天然糖，或者是相对于天然多糖重量平均分子量用最高达XI. 5、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9或XlO的因子调整过尺寸的。
为了本发明的目的，“天然多糖”是指已经经历过以减小糖的尺寸为目的的方法的糖。在通常的纯化过程中，多糖的尺寸会稍微地减小。这样的糖仍然是天然的。只有当多糖已经用调整尺寸的技术调整过尺寸后才认为所述多糖不再是天然的。为了本发明的目的，“用最高达X2的因子调整尺寸”的意思是指用下述方法处理过的糖，所述方法试图减小糖的尺寸但却将其尺寸保持在天然多糖尺寸的一半以上。X3、X4等也是以同样的方式解释的，S卩，糖是用下述方法处理过的，所述方法试图减小多糖的尺寸但却将其尺寸保持在天然多糖尺寸的三分之一、四分之一以上等。在本发明的一个方面，免疫原性组合物包含脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，所述荚膜糖来自缀合到载体蛋白上的血清群A、C、W和Y中的至少一种、两种、三种或四种，其中至少一种、两种、三种或四种或者每种脑膜炎奈瑟氏球菌糖是天然多糖。在本发明的一个方面，免疫原性组合物包含脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，所述荚膜糖来自缀合到载体蛋白上的血清群A、C、W和Y中的至少一种、两种、三种或四种，其中至少一种、两种、三种或四种或者每种脑膜炎奈瑟氏球菌糖是用最高达X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9或XlO的因子调整过尺寸的。本发明的免疫原性组合物任选地包含缀合物脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C荚膜糖 (MenC)、血清群A荚膜糖(MenA)、血清群W135荚膜糖(MenW)、血清群Y荚膜糖(MenY)、血清群C和Y荚膜糖(MenCY)、血清群C和A荚膜糖(MenCA)、血清群C和W荚膜糖(MenCW)、血清群A和Y荚膜糖(MenAY)、血清群A和W荚膜糖(MenAW)、血清群W和Y荚膜糖(MenWY)、 血清群A、C和W荚膜糖(MenACff)、血清群A、C和Y荚膜糖(MenACY)、血清群A、W135和Y 荚膜糖(MenAffY)、血清群C、W135和Y荚膜糖(MenCffY)；或血清群A、C、W135和Y荚膜糖 (MenACWY)。这是本文所提到的“一种、两种、三种或四种”，或血清群A、C、W和Y中，或各脑膜炎奈瑟氏球菌糖中的“至少一种”的定义。在一个实施方案中，至少一种、两种、三种、四种或每种脑膜炎奈瑟氏球菌糖的通过 MALLS 确定的平均尺寸在 50kDa 到 1500kDa、50kDa 到 500kDa、50kDa 到 300kDa、IOlkDa 到 1500kDa、IOlkDa 到 500kDa、IOlkDa 到 300kDa 之间。在一个实施方案中，MenA糖，如果存在，其分子量通过MALLS为50_500kDa、 50-100kDa、100-500kDa、55-90kDa、60-70kDa 或 70_80kDa 或 60_80kDa。在一个实施方案中，MenC糖，如果存在，其分子量通过MALLS为100_200kDa、 50-100kDa、100-150kDa、101-130KDa、150-210kDa 或 180_210kDa。在一个实施方案中，MenY糖，如果存在，其分子量通过MALLS为60_190kDa、 70-180kDa、80-170kDa、90-160kDa、100-150kDa 或 110-140kDa、50_100kDa、100_140kDa、 140-170kDa 或 150_160kDa。在一个实施方案中，MenW糖，如果存在，其分子量通过MALLS为60_190kDa、 70-180kDa、80-170kDa、90-160kDa、100-150kDa 或 110-140kDa、50-100kDa、120_140kDa。本文中糖的分子量或平均分子量是指在缀合之前测量的糖的重均分子量，其是通过MALLS测量的。MALLS技术是本领域所熟知的，其一般是如实施例2中所描述的那样进行的。对于脑膜炎双球菌糖的MALLS分析，可以联合使用两个塔(TSKG6000和5000PWxl)，并且糖是在水中洗脱的。糖是使用光散射检测器(例如装有488nm的IOmW氩激光器的Wyatt DawnCN 102526723 A
DSP)和干涉测量折光计(例如装有PlOO管和498nm的红色滤光片的WyattOtilab DSP)检测的。在一个实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌糖是天然多糖，或者是在通常的提取过程中减小了尺寸的天然多糖。在一个实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌糖是通过机械切割，例如通过微流化作用或超生处理调整过尺寸的。微流化作用和超生处理具有能够将较大的天然多糖的尺寸减小到足以提供可过滤缀合物的优势。尺寸调整是通过不超过 X20、X10、X8、X6、X5、X4、X3 或 X2 的因子进行的。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物，所述缀合物是由天然多糖和用不超过X20的因子调整过尺寸的糖的混合物制成的。例如， 来自MenC和/或MenA的糖是天然的。例如，来自MenY和/或MenW的糖是用不超过X20、X 10、X8、X6、X5、X4、X3或X2的因子调整过尺寸的。例如，免疫原性组合物含有由MenY和/或MenW和/或MenC和/或MenA制成的缀合物，其中所述MenY和/或 Menff和/或MenC和/或MenA是用不超过X 10的因子调整过尺寸的和/或是微流化的。 例如，免疫原性组合物含有由天然MenA和/或MenC和/或MenW和/或MenY制成的缀合物。例如，免疫原性组合物包含由天然MenC制成的缀合物。例如，免疫原性组合物包含由天然MenC和用不超过X 10的因子调整过尺寸的和/或微流化的MenA制成的缀合物。例如，免疫原性组合物包含由天然MenC和用不超过XlO的因子调整过尺寸的和/或微流化的MenY制成的缀合物。在一个实施方案中，糖的多分散性是1-1. 5，1-1. 3，1-1. 2，1-1. 1或1-1. 05，在缀合到载体蛋白上以后，缀合物的多分散性是1. 0-2. 5，1. 0-2. 0. 1. 0-1. 5，1. 0-1. 2，1. 5-2. 5， 1. 7-2. 2或1. 5-2. 0。所有的多分散性都是通过MALLS测量的。任选地调整糖的尺寸直到其是从细菌中分离出的多糖尺寸的1.5、2、4、6、8、10、 12、14、16、18 或 20 倍。在一个实施方案中，各脑膜炎奈瑟氏球菌糖或者是天然多糖，或者是用不超过XlO的因子调整过尺寸的。在一个实施方案中，每种脑膜炎奈瑟氏球菌糖均是天然多糖。在进一步的实施方案中，至少一种、两种、三种或四种脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖是通过微流化作用调整过尺寸的。在进一步的实施方案中，各脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖是用不超过X 10的因子调整过尺寸的。在进一步的实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物是由天然多糖和用不超过Xio的因子调整过尺寸的糖的混合物制成的。在进一步的实施方案中， 来自血清群Y的荚膜糖是用不超过Xio的因子调整过尺寸的。在进一步的实施方案中， 来自血清群A和C的荚膜糖是天然的多糖，而来自血清群W135和Y的糖是用不超过X 10 的因子调整过尺寸的。在进一步的实施方案中，各脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的平均尺寸在50kDa到300KDa或50kDa到200kDa之间。在进一步的实施方案中，免疫原性组合物包含MenA荚膜糖，其中所述MenA荚膜糖的平均尺寸大于50kDa，75kDa, IOOkDa,或者其平均尺寸在50-IOOkDa或55-90kDa或60_80kDa之间。在进一步的实施方案中，免疫原性组合物包含MenC荚膜糖，其中所述MenC荚膜糖的平均尺寸大于50kDa，75kDa, IOOkDa,或者在 100-200kDa,100-150kDa,80-120kDa,90-1IOkDa,150_200kDa，120_240kDa，140_220kDa， 160-200kDa或190-200kDa之间。在进一步的实施方案中，免疫原性组合物包含MenY荚膜糖，其中所述MenY荚膜糖的平均尺寸大于50kDa，75kDa，1 OOkDa，或者在60_190kDa 或 70-180kDa 或 80_170kDa 或 90_160kDa 或 100-150kDa、110-150kDa、110_145kDa 或 120-140kDa之间。在进一步的实施方案中，免疫原性组合物包含MenW荚膜糖，其中所述 Menff荚膜糖的平均尺寸大于50kDa、75kDa、100kDa，或者在60_190kDa或70_180kDa或 80-170kDa 或 90_160kDa 或 100_150kDa，140_180kDa，150_170kDa 或 110_140kDa 之间。本发明的免疫原性组合物可以包含缀合到载体蛋白上的b型流感嗜血杆菌 (H. influenzae)荚膜糖(Hib)。其可以缀合到选自TT、DT、CRM197、TT的C片段和蛋白D 的载体蛋白上，例如缀合到TT上。可以将Hib糖缀合到与至少一种、两种、三种或全部脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖缀合物相同的载体蛋白上，例如缀合到TT上。在Hib荚膜糖缀合物中 Hib与载体蛋白的比例可以在1 5到5 l(w/w)之间，例如在1 1到1 4、1 2到 1 3.5之间，或者在1 3(w/w)左右。Hib荚膜糖可以是通过连接物(参见上面)缀合到载体蛋白上的。连接物可以是双官能的(具有两个反应性氨基，例如ADH，或者具有两个反应性羧酸基团，或者一端具有反应性氨基另一端具有反应性羧酸基团)。其可以具有4到 12各碳原子。可以将Hib糖缀合到载体蛋白上，或者使用CNBr或CDAP缀合到连接物上。 载体蛋白可以通过连接物用包含碳二亚胺化学，任选地为EDAC化学(因此使用载体上的羧基化学基团)的方法缀合到Hib糖上。Hib糖缀合物的剂量可以在0. 1到9μ g、l到5μ g 或2到3yg糖之间。在进一步的实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含Hib糖缀合物和至少两种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物，其中所述Hib缀合物以比所述至少两种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物的平均糖剂量低的糖剂量存在。或者，所述Hib缀合物以比所述至少两种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物中的每一种的糖剂量低的糖剂量存在。例如，Hib缀合物的剂量可以比所述至少两种其它脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物的平均或最低糖剂量低至少10 %、20 %、30 %、 40%、50%、60%、70% 或 80%。平均剂量是通过将所有的其它糖的剂量相加再除以其它糖的数目而确定的。所述其它糖是指免疫原性组合物中除Hib以外的所有的糖，其能够包括脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖。“剂量”是向人给予的免疫原性组合物或疫苗的量。Hib糖是b型流感嗜血杆菌的磷酸聚核糖基核糖醇(PRP)荚膜糖，或者是由其衍生的低聚糖。“至少两种其它细菌糖缀合物”意思是指除Hib缀合物以外的两种其它细菌糖缀合物。所述的两种其它细菌缀合物可以包括脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物。本发明的免疫原性组合物可以包含由脑膜炎奈瑟氏球菌、肺炎链球菌、A组链球菌、B组链球菌、伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌中的一种或多种衍生的其它糖缀合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含由脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、 W135和Y中的一种或多种衍生的荚膜糖。一个进一步的实施方案包含由肺炎链球菌衍生的荚膜糖。所述肺炎球菌荚膜糖抗原任选地选自血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、 11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F(任选地选自血清型 1、3、4、5、6B、 7F、9V、14、18C、19F和23F)。一个进一步的实施方案包含金黄色葡萄球菌的5型、8型或336 荚膜糖。一个进一步的实施方案包含表皮葡萄球菌的I型、II型或III型荚膜糖。一个进一步的实施方案包含来自伤寒沙门氏菌的Vi糖。一个进一步的实施方案包括B组链球菌的Ia型、Ic型、II型、III型或V型荚膜糖。一个进一步的实施方案包含A组链球菌的荚膜糖，任选地进一步包含至少一种M蛋白和更任选地多种类型的M蛋白。
本发明的免疫原性组合物还可以包含DIPa或DTPw疫苗(例如一种含有DT、TT 以及全细胞百日咳(Pw)疫苗或无细胞百日咳(Pa)疫苗(包含例如百日咳类毒素、FHA、 pertactin以及任选地agglutinogins2和幻的疫苗)。这样的组合物还可以包含抗乙型肝炎的疫苗(例如其可以包含乙型肝炎表面抗原[HepB]，其任选地是吸附在磷酸铝上的)。 在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含DTPwifepBHibMenAC疫苗，其中的MenAC 组分是如上所述的。 在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物进一步包含来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B的抗原。所述抗原任选地是来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B (MenB)或调整过尺寸的多糖或由其衍生的低聚糖的荚膜多糖，所述荚膜多糖可以是缀合在蛋白载体上的。所述抗原任选地是如 EP301992、W0 01/09350, WO 04/14417, WO 04/14418 和 WO 04/14419 中所描述的那些来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B的外膜囊制备物。通常，本发明免疫原性组合物所包含的每种糖缀合物的剂量可以在2到20μ g、3 至Ij IOyg或4至lj7yg||之间。在一个实施方案中，本发明免疫原性组合物所包含的每种脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的剂量可以在0. 1-20 μ g ；1-10 μ g ；2-10 μ g ；2. 5-5 μ g之间，或者在5 μ g左右或恰好为 5 μ g ；或者在2. 5 μ g左右或恰好为2. 5 μ g。在一个实施方案中，本发明免疫原性组合物所含有的Hib糖缀合物的糖剂量可以在0. 1至Ij 9 μ g ;1至Ij 5 μ g或2至Ij 3 μ g之间，或者在2. 5 μ g左右或恰好为2. 5 μ g。在进一步的实施方案中，本发明的免疫原性组合物所含有的Hib糖缀合物的糖剂量例如在0. 1到 9 μ g ； 1到5g或2到3 μ g之间，或者在2. 5 μ g左右或恰好为2. 5 μ g，和所含有的每种脑膜炎奈瑟氏球菌多糖缀合物的糖剂量在2到20 μ g、3到10 μ g或4到7 μ g之间，或者恰好为 5 μ go为了本发明的目的，“左右”或“大约”被定义为在所给出范围的10%上下以内。在一个实施方案中，本发明免疫原性组合物所含有的Hib糖缀合物的糖剂量例如小于至少两种、三种、四种或每种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物平均糖剂量的90%，80%， 75%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%^ 10%o Hib糖的糖剂量例如是至少两种、三种、四种或每种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物平均糖剂量的20 %到60 %、30 %到60 %、40 %到60 % 或者50%左右或恰好为50%。在一个实施方案中，本发明免疫原性组合物所含有的Hib糖缀合物的糖剂量例如小于至少两种、三种、四种或每种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物最低糖剂量的90%，80%， 75%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%^ 10%o Hib糖的糖剂量例如是至少两种、三种、四种或每种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物最低糖剂量的20 %到60 %、30 %到60 %、40 %到60 % 或者50%左右或恰好50%。在本发明的一个实施方案中，所述至少两种、三种、四种或每种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物中的每一种的糖剂量任选地是相同的或近似相同的。本发明免疫原性组合物的实例是由以下物质组成或含有以下物质的组合物Hib缀合物和MenA缀合物和MenC缀合物，任选地各糖的剂量比为1 2 2，1 2 1,1 4 2,1 6 3,1 3 3,1 4 4,1 5 5,1 6 6 (w/w)。任选地，MenA的糖剂量大于MenC的糖剂量。Hib缀合物和MenC缀合物和MenY缀合物，任选地各糖的剂量比为1 2 2， 1 2 1,1 4 2,1 4 1,1 8 4,1 6 3,1 3 3,1 4 4,1 5 5, 1:6: 6 (w/w) 0任选地，MenC的糖剂量大于MenY的糖剂量。Hib缀合物和MenC缀合物和MenW缀合物，任选地各糖的剂量比为1 2 2， 1 2 1,1 4 2,1 4 1,1 8 4,1 6 3,1 3 3,1 4 4,1 5 5, 1:6: 6 (w/w)。任选地，MenC的糖剂量大于MenW的糖剂量。Hib缀合物和MenA缀合物和MenW缀合物，任选地各糖的剂量比为1 2 2， 1 2 1,1 4 2,1 4 1,1 8 4,1 6 3,1 3 3,1 4 4,1 5 5, 1:6: 6 (w/w) 0任选地，MenA的糖剂量大于MenW的糖剂量。Hib缀合物和MenA缀合物和MenY缀合物，任选地各糖的剂量比为1 2 2， 1 2 1,1 4 2,1 4 1,1 8 4,1 6 3,1 3 3,1 4 4,1 5 5, 1:6: 6 (w/w) 0任选地，MenA的糖剂量大于MenY的糖剂量。Hib缀合物和MenW缀合物和MenY缀合物，任选地各糖的剂量比为1 2 2， 1 2 1，1 1 2，1 4 2，1 2 4.1 4 1，1 1 4，1 3 6，1 1 3， 1 6 3,1 3 3,1 4 4,1 5 5,1 6 6 (w/w)。任选地，MenY 的糖剂量大于MenW的糖剂量。MenA、MenC、MenW 和 MenY，其糖剂量比为 1 :1:1:1 或 2:1:1:1 或 1:2:1:1 或 2:2:1:1 或 1:3:1:1 或 1:4:1:1 (w/w)。本发明进一步的方面是包含本发明免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂的疫苗。在一个实施方案中，将本发明的免疫原性组合物缓冲到或调节到pH7. 0到8. 0或 pH 7. 2到7. 6之间，或pH 7. 4左右或恰好为pH 7. 4。本发明的免疫原性组合物或疫苗任选地是在稳定剂例如多元醇如蔗糖或海藻糖的存在下冻干的。任选地，本发明的免疫原性组合物或疫苗含有足以使对免疫原的免疫应答加强的量的助剂。合适的助剂包括，但不限于，铝盐(磷酸铝或氢氧化铝)、角鲨烯混合物(SAF-1)、 胞壁肽、皂草苷衍生物、分枝杆菌细胞壁制品、单磷酰脂质A、霉菌酸衍生物、非离子嵌段共聚物表面活性剂、Quil A、霍乱毒素B亚单位、聚磷腈及其衍生物、和免疫刺激复合物 (ISCOMs)例如Takahashi等人，(1990) Nature 344 :873-875中所描述的那些免疫刺激复合物。对于以上所讨论的脑膜炎奈瑟氏球菌或HibMen组合物，不使用任何铝盐助剂，或者根本不使用任何助剂是有利的。对于所有的免疫原性组合物或疫苗来说，免疫原的免疫有效量必须是凭经验确定的。所考虑的因素包括免疫原性、免疫原是否将会被复合到或共价附着到助剂或载体蛋白或其它载体上，给药途径和给药的致免疫剂量的数量。本发明的药物组合物或疫苗中可以存在不同浓度的活化剂。一般地，物质的最低浓度是获得其使用目所必须的量，而最高浓度是能够保留在溶液中的最大量，或者是能够保持均勻地悬浮在初始混合物内的最大量。例如，治疗剂的最小量任选地是能够提供单一治疗有效剂量的量。对于生物活性物质来说，其最低浓度是在重组过程中具有生物活性所必需的量，最高浓度是不能够再保持均勻悬浮的点处的浓度。在单剂单位的情况下，所述量即为单一治疗使用量。通常，可以预期每种制剂能够包含I-IOOyg的蛋白抗原，任选地为5-50yg或5-25yg。例如，缀合物中细菌糖的剂量是10-20 μ g、5-10 μ g、2. 5-5 μ g或 1-2. 5μ g糖。通过对所述疫苗进行全身或粘膜途径的给药，本发明的疫苗制品可以用于保护或治疗易受感染的哺乳动物(例如人类患者)。所述人类患者任选地是婴儿(12个月以下)、 初学走路的孩子(12-24、12-16或12-14个月)、儿童(2_10、3_8或3-5岁)、青少年(21-21、 14-20或15-19岁)或成人。这些给药可以包括经由肌内、腹膜内、皮内或皮下路线的注射； 或者通过粘膜给药到达口腔/消化系统、呼吸系统、泌尿生殖系统处。疫苗的产期内给药对于治疗肺炎或中耳炎来说是优选的(因为这样能够更有效地预防鼻咽部携带肺炎球菌，并因此能够在其最初阶段减少感染)。虽然本发明的疫苗可以作为单剂给药，但也可以将其各组分一起进行同时或不同时的共同给药(例如如果疫苗中存在糖，则可以同时对这些糖进行分别给药，或者是在给药以细菌蛋白疫苗1-2周后再对这些糖进行给药以彼此获得免疫应答的最佳协调)。除了单一的给药途径以外，还可以使用2种不同的给药途径。例如，可以对病毒抗原进行ID(皮内)给药，而对细菌蛋白进行IM(肌内)或IN(产期内)给药。如果存在糖，则可以对它们进行IM(或ID)给药，并对细菌蛋白进行IN(或ID)给药。此外， 对于初种制剂，本发明的疫苗可以用IM的方式给药，对于加强制剂可以用IN的方式。疫苗制品通常描述于 Vaccine Design( "The subunit and adjuvant approach" (Powell M. F. & Newman M. J.编辑)(1995)Plenum Press New York)中。月旨质体内部的胶囊化描述于Ful lerton，美国专利4，235，877中。本发明进一步的方面是一种用于伴随或顺序给药的免疫试剂盒，其包含两种多价免疫原性组合物以用于在宿主内提供保护作用从而抵抗由百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、破伤风杆菌(Clostridium tetani)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)和脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)以及任选地流感嗜血杆菌 (Haemophilus influenzae)所引起的疾病。例如，所述试剂盒任选地包含第一容器，所述第一容器中包含一种或多种破伤风类毒素(TT)，白喉类毒素(DT)，和全细胞或无细胞百日咳组分和第二容器，所述第二容器中包含如上所述的本发明免疫原性组合物(例如那些包含Men或HibMen糖缀合物组合的免疫原性组合物)。本发明进一步的方面是一种用于伴随或连续给药的免疫试剂盒，其包含两种多价免疫原性组合物以用于在宿主内提供保护作用从而抵抗由肺炎链球菌(Streptococcus pneumonias)和脑膜炎奈瑟氏球菌以及任选地流感嗜血杆菌引起的疾病。例如，所述试剂盒任选地包含第一容器，所述第一容器中包含载体蛋白与来自肺炎链球菌的荚膜糖[其中所述荚膜糖任选地来自选自1，2，3，4，5，6A，6B，7F，8，9N，9V，10A,11A,12F,14，15B,17F,18C,19A,19F，20，22F，23F 和 33F 的肺
炎球菌血清型]的一种或多种缀合物。和第二容器，所述容器中包含如上所述的本发明免疫原性组合物(例如那些包含Men或HibMen糖缀合物组合的免疫原性组合物)。Hib缀合物和脑膜炎奈瑟氏球菌多糖缀合物的例子如上所述。一般地，本发明免疫试剂盒中的(或者任意以上所描述的本发明免疫原性组合物中的)肺炎链球菌疫苗将包含糖抗原(任选地是缀合的)，其中所述糖衍生自选自1，2，3， 4，5，6A，6B，7F，8，9N，9V，10A,11A,12F,14，15B,17F,18C,19A,19F，20，22F，23F 和 33F 的肺炎球菌血清型中的至少四种。任选地，所述的四种血清型包括6B，14，19F和23F。任选地， 组合物中包括至少7种血清型，例如那些衍生自血清型4、6B、9V、14、18C、19F* 23F的。任选地，组合物中包括大于7种的血清型，例如包括至少10、11、12、13或14种血清型。例如一个实施方案中的组合物包含衍生自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F和任选地 3(所有均任选地是缀合的)的10或11荚膜糖。在本发明的一个实施方案中包含了至少13 种糖抗原(任选地是缀合的)，虽然其它的糖抗原，例如23元(例如血清型1，2，3，4，5，6B， 7F，8，9N，9V，10A, 11A, 12F, 14，15B, 17F, 18C, 19A, 19F，20，22F，23F 和 33F)也能够通过本发明预期到。能够将肺炎球菌糖独立地缀合到任何已知的载体蛋白上，所述载体蛋白例如 CRM197、破伤风类毒素、白喉类毒素、蛋白D或以上所提到的任何其它载体蛋白。任选地，本发明的免疫试剂盒还包含第三部分。例如，所述试剂盒任选地包含第一容器，所述第一容器中含有一种或多种破伤风类毒素(TT)，白喉类毒素(DT)，和全细胞或无细胞百日咳组分和第二容器，所述第二容器中包含载体蛋白与来自肺炎链球菌的荚膜糖[其中所述荚膜糖任选地来自选自1，2，3， 4，5，6A，6B，7F，8，9N，9V，10A,11A,12F,14，15B,17F,18C,19A,19F，20，22F，23F 和 33F 的肺
炎球菌血清型]的一种或多种缀合物。和第三容器，所述容器中包含如上所述的本发明免疫原性组合物(例如那些包含Men或HibMen糖缀合物组合的免疫原性组合物)。本发明进一步的方面是一种本发明免疫原性组合物或疫苗的的制备方法，其包括将本发明的糖进行混合的步骤，例如将脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖与药学上可接受的赋形剂进行混合，所述脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖来自缀合到载体蛋白上的血清群A、C、W和Y中的至少一种、两种、三种或全部四种。本发明进一步的方面是一种对人类宿主进行免疫以抵抗由脑膜炎奈瑟氏球菌以及任选地流感嗜血杆菌感染所引起的疾病的方法，所述方法包括向宿主给药以免疫保护剂量的本发明免疫原性组合物或疫苗或试剂盒，任选地使用单剂。本发明的一个独立的方面是一种用免疫原性组合物使人类宿主免疫的方法，所述免疫原性组合物包含至少2种选自血清群A、C、W和Y(任选地为MenA、C、W和Y)的不同脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖缀合物，其中单一剂量的给药(任选地是对少年、成人或孩子的给药)导致在给药一个月后进行的血液检查中给出在测量对MenA、MenC、MenW和/或MenY的应答水平的SBA试验中应答者超过50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或95 %的结果。任选地SBA 试验是如实施例9中所描述的，并如实施例9中所描述的那样对应答者进行评价。本发明一个进一步独立的方面是一种包含MenA、MenC, Menff和/或MenY缀合物的免疫原性组合物，其能够在单剂使用后引发免疫应答，从而使得超过50^^60^^70 ^ 80%、90%或95%的接种人类受试者(儿童、少年或成人)在对接种后一个月时抽取的血液进行的SBA试验中能够归为应答者一类(任选地使用实施例9中所描述的标准)。这样的免疫原性组合物任选地具有本文所描述的进一步的结构特征。本发明的一个进一步的方面是本发明免疫原性组合物在治疗或预防由脑膜炎奈瑟氏球菌和任选地流感嗜血杆菌感染所引起的疾病方面的用途。本发明的一个进一步的方面是本发明免疫原性组合物或疫苗或试剂盒在制备用于治疗或预防由脑膜炎奈瑟氏球菌和任选地流感嗜血杆菌感染所引起的疾病的药物方面的用途。根据发明人的意图，在所有情况中，本文中的术语“包含”、“含有”和“包括”是分别与术语“由...组成”、“由...组成的”和“由...组成地”可任选地替换的。本专利说明书中所引用的全部参考文献或专利申请均在此引入作为参考。所附的实施例解释说明了本发明。除另外详细描述的那些以外，以下实施例均是采用标准技术进行的，其对于本领域技术人员来说是熟知的并且是常规的。实施例是解释说明性的，其不用于限定本发明。
具体实施例方式实施例实施例1-多糖綴合物的制备通过由Chu等人开发的偶合化学方法Qnfection and Immunity 1983,40(1), 245-256)实现流感嗜血杆菌(Hib)PRP多糖到TT上的共价键合。通过加入CNBr并在pH 10. 5下培养6分钟对Hib PRP多糖进行活化。将pH降低到pH 8. 75并加入己二酸二酰胼 (ADH)，继续培养90分钟。通过使用1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺(EDAC) 的碳二亚胺缩合将活化的PRP连接到纯化的破伤风类毒素上。向活化的PRP中加入EDAC以达到0.6mg EDAC/mg活化PRP的最终比例。将pH调节到5. 0并加入纯化的破伤风类毒素以达到ang TT/mg活化PRP。在温和的搅拌下将所产生的溶液放置三天。在通过0.45 μ m 膜的过滤之后，将缀合物在用在0. 2M NaCl中平衡过的s印hacryl S500HR(Pharmacia，瑞典)柱上进行纯化。MenC-TT缀合物是使用天然多糖(通过MALLS测量超过150kDa的)制备的或者是被轻微微流化过的。MenA-TT缀合物是用超过60kDa的天然多糖或轻微微流化多糖制备的，所述超过60kDa是通过实施例2中的MALLS法测量的。MenW和MenY-TT缀合物是用 100-200kDa左右的调整过尺寸的多糖制备的，其中所述100_200kDa左右是通过MALLS (参见实施例2)测量的。通过使用勻浆器Emulsiflex C-50装置的微流化作用来调整尺寸。然
28后将多糖通过0. 2 μ m过滤器进行过滤。活化和偶合是如W096/29094和WO 00/56360中所描述的那样进行的。简单地说是，将2M NaCl中的pH 5. 5-6. 0且浓度为10_20mg/ml的多糖与CDAP溶液(100mg/ml，在乙腈/WFI, 50/50中新制备的)进行混合以达到0. 75/1或1. 5/1的最终CDAP/多糖比例。 1.5分钟后，用氢氧化钠将pH升高到pH 10.0。三分钟后，加入破伤风类毒素以达到以下蛋白/多糖比例，所述比例对MenW来说为1. 5/1，对MenY来说为1. 2/1，对MenA来说为1. 5/1 或者对MenC来说为1.5/1。继续反应一到两个小时。偶合步骤之后，加入甘氨酸以达到7. 5/1的最终甘氨酸/PS(w/w)比例，并将pH调节到pH 9. O。将混合物放置30分钟。使用10 μ m的Kleenpak过滤器澄清缀合物，然后将其装载到kphacryl S400HR柱上，所述柱子使用的洗脱缓冲液是的150mM NaCl、IOmM或5mM TrispH7. 5。将临床批次在Opticap 4灭菌膜上过滤。所产生的缀合物具有1 1_1 5 (w/ w)的平均糖蛋白比例。实施例Ia-本发明MenA和MenC多糖缀合物的制备MenC-TT缀合物是使用天然多糖(通过MALLS测量超过150kDa的)制备的，或者是被轻微微流化过的。MenA-TT缀合物是使用超过60kDa的天然多糖或轻微微流化过的多糖制备的，其中所述超过60kDa是通过实施例2中的MALLS法测量的。通过使用勻浆器 Emulsiflex C-50装置的微流化作用来调整尺寸。然后将多糖通过0. 2 μ m的过滤器进行过
滤ο为了将MenA荚膜多糖通过间隔物缀合到破伤风类毒素上，使用了以下的方法。通过偶合化学方法来实现多糖与间隔物(ADH)的共价键合，所述偶合化学方法使多糖在控制条件下通过氰基化试剂，1-氰基4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸盐(CDAP)得到活化。间隔物通过其胼基来与氰基化的PS进行反应，从而在间隔物与多糖之间形成稳定的异脲连接。用新制备的100mg/ml CDAP的乙腈/水(50/50 (v/v))溶液处理10mg/ml的MenA 溶液(pH 6. 0) [3. 5g]以获得0. 75 (w/w)的CDAP/MenA比例。1. 5分钟后，将pH升高到pH 10. O。三分钟后，加入ADH以获得8. 9的ADH/MenA比例。将溶液的pH降低到8. 75并且保持该pH继续反应2小时(温度保持在25°C )。将PSAAH溶液浓缩到其初始体积的四分之一，然后使用截点为IOkDa的Filtron Omega膜用30体积的0. 2M NaCl进行渗滤(diaf iltered)，过滤滞留物。在缀合(碳二亚胺缩合)反应之前，对纯化TT溶液和PSAAH溶液进行稀释以达到 10mg/ml 的 PSAAH 浓度和 10mg/ml 的 TT 浓度。为了达到0. 9mg EDAC/mg PSAAH的最终比例，向PSAH溶液(2g糖)中加入 EDACd-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺)。将pH调节到5. O。用蠕动泵(在60 分钟内)加入纯化的破伤风类毒素以达到angTT/mg PSAAH。在+25°C在搅拌下将所产生的溶液放置60分钟以达到120分钟的最终偶合时间。通过加入pH 7. 5的IM Tris-Hcl (最终体积的1/10)对溶液进行中和并在+25°C下放置30分钟，然后在+2°C到+8°C下放置过夜。使用10 μ m的过滤器澄清缀合物，并使用kphacryl S400HR柱(Pharmacia，瑞典) 进行纯化。该柱是在IOmM Tris-HCKpH 7.0)中平衡过的，将0. 075M NaCl和缀合物(大约 660mL)载样到所述柱子上(+2°C到+8°C)。洗脱池(elution pool)是作为^Onm下光密度的函数选择的。当吸光度增加到0.05时开始收集。持续收集直到Kd达到0.30。将缀合物在+20°C下过滤消毒，然后在+2°C到+8°C下储存。所产生的缀合物具有1 2-1 4(w/ w)的糖蛋白比例。为了将MenC荚膜多糖通过间隔物缀合到破伤风类毒素上，使用了以下的方法。通过偶合化学方法来实现多糖与间隔物(ADH)的共价键合，所述偶合化学方法使多糖在控制条件下通过氰基化试剂，1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸盐(CDAP)得到活化。间隔物通过其胼基与氰基化的PS进行反应，从而在间隔物与多糖之间形成了稳定的异脲连接。用新制备的100mg/ml CDAP的乙腈/水(50/50 (v/v))溶液处理20mg/ml的MenC 溶液(pH 6. 0) [3. 5g]以获得1. 5 (w/w)的CDAP/MenC比例。1. 5分钟后，将pH升高到pH 10.0。在活化过程中加入pH 5M NaCl以获得2M NaCl的最终浓度。三分钟后，加入ADH以获得8. 9的ADH/MenC比例。将溶液的pH降低到8. 75并且保持该pH继续反应2小时(温度保持在25°C )。将PSCAH溶液浓缩到150mL的最小体积，然后使用截点为IOkDa的Filtron Omega 膜用30体积的0. 2M NaCl进行渗滤，过滤滞留物。在缀合反应之前，将纯化TT溶液和PSCAH溶液(2g规模的)在0. 2M NaCl中进行稀释以达到15mg/ml的PSCAH浓度和20mg/ml的TT浓度。为了达到aiig TT/mg PSCAH，向PSCAH溶液中加入纯化的破伤风类毒素。将pH调节到5. O。用蠕动泵(在10分钟内)加入EDAC(16. 7mg/ml Tris 0. IM pH 7. 5中的)以达到0.5mg EDAC/mg PSCAH的最终比例。在+25°C，在搅拌和pH调节下将所产生的溶液放置 110分钟以达到120分钟的最终偶合时间。然后通过加入pH 9. O的IM Tris-Hcl (最终体积的1/10)对溶液进行中和并在+25°C下放置30分钟，然后在+2°C到+8°C下放置过夜。使用10 μ m的过滤器澄清缀合物，并使用kphacryl S400HR柱(Pharmacia，瑞典) 进行纯化。该柱是在IOmM Tris-HCKpH 7.0)中平衡过的，将0. 075M NaCl和缀合物(大约460mL)载样到所述柱子上(+2°C到+8°C )。洗脱池是作为280nm下光密度的函数选择的。当吸光度增加到0.05时开始收集。持续收集直到Kd达到0.20。将缀合物在+20°C下过滤消毒，然后在+2°C到+8°C下储存。所产生的缀合物具有1 2-1 4 (w/w)的糖蛋白比例。实施例2-使用MALLS确定分子量将检测器与HPLC排阻柱连接，样品从所述排阻柱中得到洗脱。一方面，激光散射检测器测量了大分子溶液在16度角散射的光强度，另一方面，在线设置的干涉测量折光计 (interferometric refractometer)提供了对洗脱样品的量的测量。由此可以确定溶液中大分子的密度、尺寸和形状。重均分子量(Mw)的定义是所有物质重量与它们各自分子量的乘积的总和，再除以所有物质的重量和。a)重均分子量-Mw-
权利要求
1.一种包含至少2种不同脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的免疫原性组合物，其中一种或多种所述糖选自由缀合到蛋白载体上的MenA、MenC、MenY和MenW组成的第一组，其中糖 蛋白的比例(w/V)在1 2-1 5之间，一种或多种不同的糖选自由缀合到蛋白载体上的 MenA、MenC、MenY和MenW组成的第二组，其中糖蛋白的比例(w/w)在5 1-1 1. 99之间。
2.如权利要求1中所述的包含至少2种不同脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的免疫原性组合物，其中一种或多种所述糖选自由缀合到蛋白载体上的MenA和MenC组成的第一组，其中糖蛋白的比例(w/w)在1 2-1 5之间，一种或多种不同的糖选自由缀合到蛋白载体上的MenC、MenY和MenW组成的第二组，其中糖蛋白的比例(w/w)在5 1-1 1. 99之间。
3.如权利要求1或权利要求2中所述的免疫原性组合物，其中存在MenW并且MenW糖与载体蛋白的比例在 5 1-1 1.99,2 1-1 1.99,1. 5 1-1 1.8,1 1-1 1.7、 1 1.2-1 1.6或 1 1.4-1 1.5(w/w)之间。
4.如权利要求1-3中任意一项所述的免疫原性组合物，其中存在MenY并且MenY糖与载体蛋白的比例在 5 1-1 1.99,2 1-1 1.99,1. 5 1-1 1.9,1 1-1 1.8、 1 1.1-1 1.6或 1 1.3-1 1.4(w/w)之间。
5.如权利要求1-4中任意一项所述的免疫原性组合物，其中存在MenA并且MenA糖与载体蛋白的比例在 1 2-1 5、1 2.4-1 4、1 2.7-1 3. 5 或 1 2.9-1 3. 1 (w/ w)之间。
6.如权利要求1-5中任意一项所述的免疫原性组合物，其中存在MenC并且Men C糖与载体蛋白的比例在 5 1-1 1. 99,2 1-1 1. 99,1. 5 1-1 1. 8,1. 3 1-1 1.6、 1.2 1-1 1.4 或 1.1 1-1 1.2 (w/w)之间。
7.如权利要求1-5中任意一项所述的免疫原性组合物，其中存在MenC并且Men C糖与载体蛋白的比例在 1 2-1 5、1 2.5-1 4. 5,1 2.7-1 4. 3,1 3-1 4 或 1 3.3-1 3. 5 (w/w)之间。
8.如权利要求1-7中任意一项所述的包含至少2种不同脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的免疫原性组合物，其中一种或多种所述糖选自由通过连接物缀合到载体蛋白上的MenA、MenC、 MenY和MenW组成的第一组，而一种或多种不同的糖选自由直接缀合到载体蛋白上的MenA、 MenC、MenY和MenW组成的第二组。
9.如权利要求8中所述的包含至少2种不同的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的免疫原性组合物，其中一种或多种所述糖选自由通过连接物缀合到载体蛋白上的MenA和MenC组成的第一组，一种或多种不同的糖选自由直接缀合到载体蛋白上的MenC、MenY和MenW组成的第二组。
10.如权利要求9中所述的免疫原性组合物，其包含通过连接物缀合到载体蛋白上的 MenA荚膜糖，和直接缀合到载体蛋白上的MenC荚膜糖。
11.如权利要求9中所述的免疫原性组合物，其包含通过连接物缀合到载体蛋白上的 MenC荚膜糖，和直接缀合到载体蛋白上的MenY荚膜糖。
12.如权利要求9中所述的免疫原性组合物，其包含通过连接物缀合到载体蛋白上的 MenA和MenC荚膜糖，和直接缀合到载体蛋白上的MenY和MenW荚膜糖。
13.如权利要求9中所述的免疫原性组合物，其包含通过连接物缀合到载体蛋白上的 MenA荚膜糖，和直接缀合到载体蛋白上的MenC、MenY和MenW荚膜糖。
14.如前述权利要求任意一项中所述的免疫原性组合物，其中各脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖均是缀合到载体蛋白上的，所述载体蛋白独立地选自TT、DT、CRM197、TT的C片段和蛋白D。
15.如前述权利要求任意一项中所述的免疫原性组合物，其中各脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖是缀合到相同载体蛋白上的，所述载体蛋白选自TT、DT、CRM197、TT的C片段和蛋白D。
16.如前述权利要求任意一项中所述的免疫原性组合物，其中各脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖均是缀合到TT上的。
17.如前述权利要求任意一项中所述的免疫原性组合物，其中各脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖是分别缀合到单独的载体蛋白上的。
18.如前述权利要求任意一项中所述的免疫原性组合物，其中至少一种、两种或三种脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖缀合物是直接缀合到载体蛋白上的。
19.如权利要求18中所述的免疫原性组合物，其中MenW和/或MenY, Menff和/或 MenC, MenY和/或MenC，或者MenW和MenC和MenY是直接缀合到载体蛋白上的。
20.如权利要求18或19中所述的免疫原性组合物，其中至少一种、两种或三种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物是通过CDAP化学直接缀合的。
21.如权利要求1-20任意一项中所述的免疫原性组合物，其中至少一种、两种或三种脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖是通过连接物缀合到载体蛋白上的。
22.如权利要求21中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物是双官能的。
23.如权利要求21或22中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物具有两个反应活性氨基基团。
24.如权利要求21或22中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物具有两个反应活性羧酸基团。
25.如权利要求21或22中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物一端具有反应活性氨基基团，另一端具有反应活性羧酸基团。
26.如权利要求21-25中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物具有4到12个碳原子。
27.如权利要求21或22中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物是ADH。
28.如权利要求21-27任意一项中所述的免疫原性组合物，其中通过连接物缀合的所述或各脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖是用CDAP化学缀合到连接物上的。
29.如权利要求21-28中所述的免疫原性组合物，其中所述载体蛋白是使用碳二亚胺化学，任选地使用EDAC，缀合到连接物上的。
30.如权利要求21- 任意一项中所述的免疫原性组合物，其中所述或各每种脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖是在将载体蛋白缀合到连接物上之前缀合到连接物上的。
31.如权利要求21-30任意一项中所述的免疫原性组合物，其中MenA是通过连接物缀合到载体蛋白上的。
32.如权利要求21-31任意一项中所述的免疫原性组合物，其中MenC是通过连接物缀合到载体蛋白上的。
33.如前述权利要求任意一项中所述的免疫原性组合物，其包含来自血清群A、C、W135 和Y中至少两种的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，将所述荚膜糖缀合到载体蛋白上以产生脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖缀合物，其中各脑膜炎奈瑟氏球菌糖的平均尺寸均在50kDa、75kDa、 100kDa、l 10kDa、120kDa 或 130kDa 以上。
34.如权利要求33中所述的免疫原性组合物，其中各脑膜炎奈瑟氏球菌糖是天然多糖或者是用不超过XlO的因子调整过尺寸的。
35.如权利要求33或34中所述的免疫原性组合物，其中至少一种、两种、三种或四种脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖是通过微流化调整过尺寸的。
36.如权利要求33或34中所述的免疫原性组合物，其中各脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖是天然多糖。
37.如权利要求33或34中所述的免疫原性组合物，其中各脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖是用不超过XlO的因子调整过尺寸的。
38.如权利要求33或34中所述的免疫原性组合物，其中脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物是由一些天然多糖与用不超过XlO的因子调整过尺寸的其它糖的混合物制备的。
39.如权利要求38中所述的免疫原性组合物，其中来自血清群Y的荚膜糖是用不超过XlO的因子调整过尺寸的。
40.如权利要求38或39中所述的免疫原性组合物，其中来自血清群A和C的荚膜糖是天然多糖，而来自血清群W135和Y的糖是用不超过X 10的因子调整过尺寸的。
41.如权利要求33-40中所述的免疫原性组合物，其中各脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的平均尺寸在50kDa到300kDa或者50kDa到200kDa之间。
42.如权利要求33-41中所述的免疫原性组合物，其包含平均尺寸大于50kDa、75kDa、 IOOkDa或者平均尺寸在50-100kDa或55_90kDa或60_80kDa之间的MenA荚膜糖。
43.如权利要求33-42中所述的免疫原性组合物，其包含平均尺寸大于50kDa、75kDa、 IOOkDa 或者在 100-200kDa、100-150kDa、80-120kDa、90-110kDa、150-200kDa、120-240kDa、 140-220kDa、160-200kDa 或 190_200kDa 之间的 MenC 荚膜糖。
44.如权利要求33-43中所述的免疫原性组合物，其包含平均尺寸大于50kDa、75kDa、 IOOkDa 或者在 60-190kDa 或 70_180kDa 或 80_170kDa 或 90_160kDa 或 100_150kDa、 110-145kDa 或 120_140kDa 之间的 MenY 荚膜糖。
45.如权利要求33-44中所述的免疫原性组合物，其包平均尺寸大于50kDa、75kDa、 IOOkDa 或者在 60-190kDa 或 70_180kDa 或 80_170kDa 或 90_160kDa 或 100_150kDa、 140-180kDa、150-170kDa 或 110_140kDa 之间的 MenW 荚膜糖。
46.如前述权利要求任意一项中所述的免疫原性组合物，其中各糖缀合物的剂量在2 到20 μ g、3到10 μ g、4至Ij 7 μ g的糖之间，或者大约(或恰好)为5 μ g的糖。
47.如前述权利要求任意一项中所述的免疫原性组合物，其进一步包含缀合到载体蛋白上的b型流感嗜血杆菌荚膜糖(Hib)。
48.如权利要求47中所述的免疫原性组合物，其中所述b型流感嗜血杆菌荚膜糖是缀合到选自TT、DT、CRM197、TT的C片段和蛋白D的载体蛋白上的。
49.如权利要求47或48中所述的免疫原性组合物，其中所述Hib糖是缀合到与至少一种、两种、三种或全部脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖缀合物相同的载体蛋白上的。
50.如权利要求47-49中所述的免疫原性组合物，其中所述Hib糖是缀合到TT上的。
51.如权利要求47-50中所述的免疫原性组合物，其中在Hib荚膜糖缀合物中Hib与载体蛋白的比例在1 5到5 l(w/w)之间。
52.如权利要求51中所述的免疫原性组合物，其中在Hib荚膜糖缀合物中Hib与载体蛋白的比例在1 1到1 4、1 2到1 3. 5之间，或者在1 3(w/w)左右。
53.如权利要求47-52中所述的免疫原性组合物，其中所述Hib荚膜糖是通过连接物缀合到载体蛋白上的。
54.如权利要求53中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物是双官能的。
55.如权利要求53或M中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物具有两个反应活性氨基基团。
56.如权利要求53或M中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物具有两个反应活性羧酸基团。
57.如权利要求53或M中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物一端具有反应活性氨基基团，另一端具有反应活性羧酸基团。
58.如权利要求53-57中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物具有4到12个碳原子。
59.如权利要求53或M中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物是ADH。
60.如权利要求47-59任意一项中所述的免疫原性组合物，其中所述Hib糖是使用 CNBr或CDAP缀合到载体蛋白或连接物上的。
61.如权利要求53-60中所述的免疫原性组合物，其中所述载体蛋白是使用包含碳二亚胺化学，任选地EDAC化学的方法通过连接物缀合到Hib糖上的。
62.如权利要求47-61任意一项中所述的免疫原性组合物，其包含Hib糖缀合物和至少两种其它的细菌糖缀合物，其中Hib缀合物以比所述至少两种其它细菌糖缀合物的平均剂量低的剂量存在。
63.如权利要求62中所述的免疫原性组合物，其中Hib缀合物以比所述至少两种其它细菌糖缀合物中的每一种的剂量低的剂量存在。
64.如权利要求62或63中所述的免疫原性组合物，其中所述的至少两种其它细菌糖缀合物包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C荚膜糖(MenC)缀合物。
65.如权利要求62-64任意一项中所述的免疫原性组合物，其中所述的至少两种其它细菌糖缀合物包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y荚膜糖(MenY)缀合物。
66.如权利要求62-65任意一项中所述的免疫原性组合物，其中所述的至少两种其它细菌糖缀合物包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A荚膜糖(MenA)缀合物。
67.如权利要求62-66任意一项所述的免疫原性组合物，其中所述的至少两种其它细菌糖缀合物包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清群W135荚膜糖(MenW)缀合物。
68.如权利要求62-67任意一项中所述的免疫原性组合物，其中所述的至少两种其它细菌糖缀合物包含衍生自以下菌株的肺炎球菌荚膜糖，所述菌株选自血清型1、2、3、4、5、 6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F。
69.如权利要求62-68任意一项中所述的免疫原性组合物，其中所述的至少两种其它细菌糖缀合物包含伤寒杀门氏菌Vi (S. typhi Vi)荚膜糖。
70.如权利要求62-69任意一项中所述的免疫原性组合物，其中Hib糖缀合物的剂量在 0. 1 至Ij 9 μ g，1 至Ij 5 μ g 或 2 至Ij 3 μ g 的H之间。
71.如权利要求62-70任意一项中所述的免疫原性组合物，其中所述的至少两种其它糖缀合物中的每一种的剂量在2到20 μ g、3到10 μ g或4到7 μ g糖之间，或者在5 μ g糖左右或恰好为5yg糖。
72.如权利要求62-71任意一项中所述的免疫原性组合物，其中Hib糖缀合物的糖剂量小于90 %、75 %或60 %，或者在20 %到60 %之间或者是50 %左右的所述至少两种其它糖缀合物的平均糖剂量。
73.如权利要求62-72任意一项所述的免疫原性组合物，其中Hib糖缀合物的糖剂量小于90 %、75 %或60 %，或者在20-60 %之间或者是50 %左右的所述至少两种其它糖缀合物中每一种的糖剂量。
74.如权利要求62-73任意一项中所述的免疫原性组合物，其中在Hib缀合物和在两种或两种以上的所述至少两种其它细菌糖缀合物中使用了相同的载体蛋白。
75.如权利要求1-74任意一项中所述的免疫原性组合物，其包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B的外膜囊制备物或荚膜糖。
76.一种疫苗，其包含如权利要求1-75任意一项所述的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂。
77.一种用于伴随或顺序给药的免疫试剂盒，其包含两种多价免疫原性组合物以用于在宿主内提供保护作用从而抵抗由百日咳杆菌、破伤风杆菌、白喉棒杆菌、流感嗜血杆菌以及脑膜炎奈瑟氏球菌所引起的疾病，所述试剂盒包含第一容器，所述第一容器中包含破伤风类毒素(TT)，白喉类毒素(DT)，和全细胞或无细胞百日咳组分和第二容器，所述第二容器中包含如权利要求1-75任意一项所述的免疫原性组合物。
78.—种如权利要求76中所述的疫苗的制备方法，其包括将权利要求1-75任意一项所述的免疫原性组合物与药学上可接受的赋形剂相混合的步骤。
79.一种使人宿主对由脑膜炎奈瑟氏球菌感染所引起的疾病具有免疫力的方法，其包括向宿主给药以免疫保护剂量的如权利要求1-77所述的免疫原性组合物或疫苗。
80.用于治疗或预防由脑膜炎奈瑟氏球菌感染所引起的疾病的如权利要求1-75中所述的免疫原性组合物。
81.如权利要求1-75中所述的免疫原性组合物在制备用于治疗或预防由脑膜炎奈瑟氏球菌感染所引起疾病的药物中的用途。
82.一种包含至少2种分别缀合到同类载体蛋白上的不同糖的免疫原性组合物，其中一种或多种糖是在以1 2-1 5之间的糖蛋白比例(w/w)缀合到载体蛋白上的，一种或多种不同的糖是以5 1-1 1.99之间的糖蛋白比例(w/w)缀合到蛋白载体上的。
83.如权利要求82中所述的免疫原性组合物，其中一种或多种糖是通过蛋白载体上的第一类化学基团缀合到载体蛋白上的，而一种或多种糖是通过蛋白载体上的第二类化学基团缀合到载体蛋白上。CN 102526723 A
84.如权利要求83中所述的免疫原性组合物，其中通过蛋白载体上的第一类化学基团缀合到载体蛋白上的一种或多种糖与通过蛋白载体上的第二类化学基团缀合到载体蛋白上的一种或多种糖不同。
85.如权利要求83或84中所述的免疫原性组合物，其中一种或多种糖是通过蛋白载体上的羧基基团缀合到载体蛋白上的，一种或多种糖通过蛋白载体上的氨基基团缀合到载体蛋白上的。
86.如权利要求83-85中所述的免疫原性组合物，其中蛋白载体上的第一和第二类化学基团存在于载体蛋白上的单独的B和/或T细胞抗原表位上。
87.如权利要求82-86中所述的免疫原性组合物，其中所述糖选自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A荚膜糖(MenA)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C荚膜糖(MenC)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y荚膜糖(MenY)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群W荚膜糖(MenW)、B群链球菌I群荚膜糖、 B群链球菌II群荚膜糖、B群链球菌III群荚膜糖、B群链球菌IV群荚膜糖、B群链球菌V 群荚膜糖、金黄色葡萄球菌5型荚膜糖、金黄色葡萄球菌8型荚膜糖、来自伤寒杀门氏菌的 Vi糖、脑膜炎奈瑟氏球菌LPS (例如L3和/或L2)、卡他莫拉菌LPS、流感嗜血杆菌LPS和来自任意荚膜肺炎球菌糖的糖例如来自血清型:1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、 12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 或 33F。
88.如权利要求82-87中所述的免疫原性组合物，其中载体蛋白选自TT、DT、CRM197、 TT的C片段和蛋白D。
89.如权利要求82-88中所述的免疫原性组合物，其中载体蛋白是TT。
90.如权利要求82-89中所述的免疫原性组合物，其包含至少2种不同的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，其中一种或多种所述糖选自由缀合到载体蛋白上的MenA和MenC组成的第一组，其中糖蛋白的比例(w/V)在1 2-1 5之间，而一种或多种不同的糖选自由缀合到载体蛋白上的MenC、MenY和MenW组成的第二组，其中糖蛋白的比例(w/w)在 5:1-1: 1.99 之间。
91.如权利要求90中所述的免疫原性组合物，其中MenW糖与载体蛋白的比例在 5:1-1: 1.99,2 1-1 1.99,1. 5 1-1 1.8,1 1-1 1. 7,1 1.2-1 1.6 或 1 1.4-1 1.5(w/w)之间。
92.如权利要求90或91中所述的免疫原性组合物，其中MenY糖与载体蛋白的比例在 5:1-1: 1.99,2 1-1 1.99,1. 5 1-1 1.9,1 1-1 1.8,1 1.1-1 1.6 或 1 1.3-1 1.4(w/w)之间。
93.如权利要求90-92任意一项中所述的免疫原性组合物，其中MenA糖与载体蛋白的比例在 1 2-1 5、1 2.4-1 4、1 2.7-1 3. 5 或 1 2.9-1 3. l(w/w)之间。
94.如权利要求90-93任意一项中所述的免疫原性组合物，其中MenC糖与载体蛋白的比例在 5 1-1 1.99,2 1-1 1.99,1. 5 1-1 1.8,1. 3 1-1 1.6、 1.2 1-1 1.4 或 1.1 1-1 1.2(w/w)之间。
95.如权利要求90-94任意一项中所述的免疫原性组合物，其中MenC糖与载体蛋白的比例在 1 2-1 5、1 2.5-1 4. 5、1 2. 7-1 4. 3、1 3-1 4 或 1 3.3-1 3. 5 (w/ w)之间。
96.如权利要求90-95中所述的免疫原性组合物，其包含至少2种不同的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，其中一种或多种糖选自由MenA和MenC组成的第一组，其中所述MenA和 MenC是通过蛋白载体上的第一类化学基团缀合到载体蛋白上的，一种或多种不同的糖选自由MenC、MenY和MenW组成的第二组，其中所述MenC、MenY和MenW是通过蛋白载体上的第二类化学基团缀合到载体蛋白上的。
97.如权利要求96中所述的免疫原性组合物，其中第一类化学基团是蛋白载体上的羧基基团，第二类化学基团是蛋白载体上的氨基基团。
98.如权利要求96或97中所述的免疫原性组合物，其包含通过第一类化学基团缀合的 MenA和通过第二类化学基团缀合的MenC。
99.如权利要求96-98中所述的免疫原性组合物，其包含通过第一类化学基团缀合的 MenC和通过第二化类学基团缀合的MenY。
100.如权利要求96-99中所述的免疫原性组合物，其包含通过第一类化学基团缀合的 MenA和通过第二类化学基团缀合的MenC、MenY和MenW。
101.如权利要求96-99中所述的免疫原性组合物，其包含通过第一类化学基团缀合的 MenA和MenC以及通过第二类化学基团缀合的MenY和MenW。
102.如权利要求96-101中所述的免疫原性组合物，其进一步包含缀合到载体蛋白上的来自b型流感嗜血杆菌的荚膜糖(Hib)。
103.如权利要求102中所述的免疫原性组合物，其中Hib是缀合到与脑膜炎奈瑟氏球菌糖同类的载体蛋白上的。
104.如权利要求103中所述的免疫原性组合物，其中Hib是通过第一或第二类化学基团缀合到载体蛋白上的。
105.如权利要求82-104中所述的免疫原性组合物，其中以1 2-1 5之间的糖蛋白比例(w/w)缀合到载体蛋白上的一种或多种糖(例如MenA和/或MenC)是通过连接物缀合的。
106.如权利要求105中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物是双官能的。
107.如权利要求105或106中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物具有4到12个碳原子。
108.如权利要求105-107中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物具有两个反应活性氨基基团。
109.如权利要求105-107中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物具有两个反应活性羧酸基团。
110.如权利要求105-107中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物一端具反应活性氨基基团，另一端具有反应活性羧酸基团。
111.如权利要求105-108中所述的免疫原性组合物，其中所述连接物是ADH。
112.如权利要求105-111中所述的免疫原性组合物，其中通过连接物缀合的各荚膜糖是用CDAP化学缀合到连接物上的。
113.如权利要求105-112中所述的免疫原性组合物，其中载体蛋白是使用碳二亚胺化学，任选地使用EDAC，缀合到连接物上的。
114.如权利要求105-113中所述的免疫原性组合物，其中所述或各荚膜糖是在将载体蛋白缀合到连接物上之前缀合到连接物上的，或者所述连接物是在其缀合到载体蛋白上之前缀合到糖上的。
115.如权利要求82-114中所述的免疫原性组合物，其中以5 1-1 1.99之间的糖 蛋白比例(w/w)缀合到载体蛋白上的一种或多种糖(例如MenY、MenW和/或MenC)是直接缀合的。
116.如权利要求82-115中所述的免疫原性组合物，其是如权利要求1-75所述的免疫原性组合物。
117.—种包含至少2种分别缀合到同类载体蛋白上的不同糖的免疫原性组合物，其中一种或多种糖是通过蛋白载体上的第一类化学基团缀合到蛋白载体上的，其中糖蛋白比例(w/w)在1 2-1 5之间，和一种或多种不同的糖是通过蛋白载体上的第二类化学基团缀合到蛋白载体上的，其中糖蛋白比例(w/V)在5 1-1 1.99之间。
118.如权利要求117中所述的免疫原性组合物，其中通过蛋白载体上的第一类化学基团缀合到载体蛋白上的一种或多种糖与通过蛋白载体上的第二类化学基团缀合到载体蛋白上的一种或多种糖不同。
119.如权利要求117或118中所述的免疫原性组合物，其中一种或多种糖是通过蛋白载体上的羧基基团缀合到载体蛋白上，一种或多种糖是通过蛋白载体上的氨基基团缀合到载体蛋白上。
120.如权利要求117-118任意一项中所述的免疫原性组合物，其中蛋白载体上的第一和第二类化学基团存在于载体蛋白上的单独的B和/或T细胞抗原表位上。
121.如权利要求117-118任意一项中所述的免疫原性组合物，其中所述糖选自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A荚膜糖(MenA)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C荚膜糖(MenC)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y荚膜糖(MenY)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群W荚膜糖(MenW)、B群链球菌 I群荚膜糖、B群链球菌II群荚膜糖、B群链球菌III群荚膜糖、B群链球菌IV群荚膜糖、B 群链球菌V群荚膜糖、金黄色葡萄球菌5型荚膜糖、金黄色葡萄球菌8型荚膜糖、来自伤寒杀门氏菌的Vi糖、脑膜炎奈瑟氏球菌LPS、卡他莫拉菌LPS、流感嗜血杆菌LPS和来自任意荚膜肺炎球菌糖的糖。
122.如权利要求121所述的免疫原性组合物，其中所述糖选自来自血清型1、2、3、4、 5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 或 33F 的荚膜肺炎球菌糖的糖。
全文摘要
本发明公开了免疫原性组合物。本申请公开了一种包含至少2种不同脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的免疫原性组合物，其中一种或多种所述糖选自由缀合到蛋白载体上的MenA、MenC、MenY和MenW组成的第一组，其中糖∶蛋白的比例(w/w)在1∶2-1∶5之间，一种或多种不同的糖选自由缀合到蛋白载体上的MenA、MenC、MenY和MenW组成的第二组，其中糖∶蛋白的比例(w/w)在5∶1-1∶1.99之间。
文档编号A61K39/116GK102526723SQ201210028358
公开日2012年7月4日 申请日期2006年6月23日 优先权日2005年6月27日
发明者C·卡皮奥, D·布特里奥, J·普尔曼, P·德内尔, P·迪维维耶, R·L·比曼斯 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司