专利名称：蓖麻毒素b链蛋白的免疫调节新用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药领域，具体涉及蓖麻毒素B链蛋白在免疫调节方面的新用途。
背景技术：
蓖麻毒素(ricin toxin, RT)源自蓖麻籽的糖蛋白，分子量64kDa。蓖麻毒素的全毒素由A、B两条多肽链通过一个二硫键连接在一起。RTA是一种核糖体灭活蛋白，在哺乳动物细胞内可抑制蛋白质合成；RTB链无毒，具有凝集素活性，可与细胞表面的半乳糖或甘露糖的受体结合，协助A链进入细胞内发挥生物学功能。RTB是一个两叶形或 铃形结构的分子，由不同的两个球形区域构成相同的折叠拓扑结构，每一个区域又包括三个亚区 (α，β，Y)，只有Ia和2β有明显的半乳糖结合活性。当两个球形区域都突变时，RTB将失去凝集素活性。目前普遍认为RTB链没有免疫活性。RTB基因与病毒基因连接后融合表达，得到的融合蛋白质具有病毒的抗原性，RTB蛋白能与细胞上含半乳糖的糖蛋白或糖脂结合，具有良好的免疫效果，因此RTB常用作蛋白质表达载体。蓖麻毒素B链蛋白通过基因克隆方法获得，见《蓖麻毒素B链的克隆表达与鉴定》，食品与生物技术学报，2009，28 (1), 作者刘文森等。
发明内容
本发明提供一种蓖麻毒素B链蛋白的免疫调节新用途。蓖麻毒素B链蛋白在制备免疫调节剂中的应用。蓖麻毒素B链蛋白在制备肿瘤辅助治疗剂中的应用。本发明研究发现蓖麻毒素B链蛋白可以促进小鼠腹腔巨噬细胞分泌Ν0，活化巨噬细胞杀伤肿瘤细胞，体内体外实验证实其单独作用可以促进小鼠脾淋巴细胞的增殖，还可协同ConA和LPS促进小鼠脾T、B淋巴细胞的增殖，增强NK细胞活性，具有免疫调节作用。
图1是蓖麻毒素B链蛋白对腹腔巨噬细胞NO分泌的影响图； 图2是蓖麻毒素B链蛋白对巨噬细胞细胞毒作用的影响图3是蓖麻毒素B链蛋白体外对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响图； 图4是蓖麻毒素B链蛋白体内对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响图； 图5是蓖麻毒素B链蛋白体内对小鼠NK细胞活性的影响图。
具体实施例方式蓖麻毒素B链蛋白在制备免疫调节剂中的应用。蓖麻毒素B链蛋白在制备肿瘤辅助治疗剂中的应用。蓖麻毒素B链蛋白以下称RTB链蛋白。 实施例1 :RTB链蛋白对腹腔巨噬细胞NO分泌的影响试剂与药品RTB链蛋白，自制，溶于生理盐水中，稀释成不同浓度(下同)，NO检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。动物Balb/c小鼠购自卫生部长春生物制品所实验动物室。方法采用NO检测试剂盒检测小鼠腹腔巨噬细胞NO的分泌。处死小鼠，腹腔注射5 m PBS,轻揉小鼠腹部，剪开腹部，重复冲洗腹腔2或3次；取制备好的巨噬细胞，调整细胞数为1 X IO7个/ml ；将巨噬细胞接种到96孔培养板，加入不同浓度RTB链蛋白100 μ 1/ 孔，24h后收取上清，采用NO检测试剂盒检测小鼠腹腔巨噬细胞NO分泌。结果如图1所示，RTB链蛋白对小鼠腹腔巨噬细胞NO分泌具有时间和剂量依赖性，10 μ g/ml和100 μ g/ml剂量浓度均可刺激NO分泌。LPS为阳性对照。100 μ g/ml与阳性对照组比较差异显著(P<0. 05)。实施例2: RTB链蛋白对巨噬细胞细胞毒作用的影响
试剂与药品RTB链蛋白，自制，RPMI-1640培养基购自GIBCO公司。动物Balb/c小鼠购自卫生部长春生物制品所实验动物室。方法MTT法检测小鼠腹腔巨噬细胞毒作用。处死小鼠，腹腔注射5 ml PBS，轻揉小鼠腹部，剪开腹部，重复冲洗腹腔2或3次；取制备好的巨噬细胞，调整细胞数为1 X IO7 个/m ；每孔0. Iml将巨噬细胞接种96孔培养板，分别加入不同浓度RTB链蛋白置37°C，5% C02培养箱中培养48h，加入B16靶细胞(效靶比为10 :1)作用48h ；终止培养前，每孔加入 10 μ 1 MTT,继续孵育4h，每孔加入100 μ 1 DMSO,振摇lOmin，于570nm波长处测定吸光度值 (A 值)。结果如图2所示，三个剂量浓度均可增强巨噬细胞肿瘤杀伤活性。实施例3 =RTB链蛋白体外对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响试剂与药品脂多糖及ConA购自Sigma公司，MTT购自Sigma公司。动物Balb/c小鼠购自卫生部长春生物制品所实验动物室。方法
3.1 MTT法检测RTB链蛋白对未活化小鼠脾淋巴细胞增殖影响。无菌制备小鼠脾淋巴细胞悬液，调整细胞浓度为IX IO7个/ml，加入96孔细胞板每孔100 μ 1，再加入不同浓度 RTB链蛋白各100 μ 1，培养44h，收取上清备用，每孔加入10 μ 1 ΜΤΤ，继续孵育4h，每孔加入 100 μ 1 DMSO，振摇IOmin,于540nm波长处测定吸光度值(A值)。计算增值指数Si，(SI= 样品孔吸光值/阴性对照孔吸光值)。3. 2 MTT法检测RTB链蛋白对LPS和ConA活化T、B淋巴细胞细胞增殖影响。无菌制备小鼠脾淋巴细胞悬液，调整细胞浓度为1 X IO7个/ml，加入96孔细胞板每孔100 μ 1，再加入不同浓度RTB链蛋白及Con A ΙΟΟμΙ，使Con A终浓度为2. 5 μ g/ml，培养44h，收取上清备用，每孔加入10 μ 1 ΜΤΤ,继续孵育4h，每孔加入100 μ 1 DMSO,振摇lOmin，于MOnm波长处测定吸光度值(A值)。计算增值指数SI (SI=样品孔吸光值/阴性对照孔吸光值)。结果如图3所示，RTB链蛋白在单独作用时对小鼠脾淋巴细胞的增殖具有明显作用，与ConA和LPS协同作用时，RTB链蛋白在三个剂量水平均能明显刺激T、B淋巴细胞的增殖，并且随着剂量的增加，其刺激增殖的能力也明显增加，与阳性对照组相比差异显著 (Ρ<0· 01)。实施例4 =RTB链蛋白体内对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响试剂与药品脂多糖及ConA购自Sigma公司，MTT购自Sigma公司； 动物Balb/c小鼠购自卫生部长春生物制品所实验动物室。方法
4. 1 RTB链蛋白免疫Balb/c小鼠。将Balb/c小鼠随机分成5组，分为生理盐水组，实验组(40mg/kg、20mg/kg、10mg/kg)，弗氏佐剂阳性对照组。分别于0、7天免疫2次，第二次免疫后3天处死小鼠。4. 2 MTT法检测RTB链蛋白对未活化小鼠脾淋巴细胞增殖影响。无菌制备小鼠脾淋巴细胞悬液，调整细胞浓度为1 X IO7个/ml，加入96孔细胞板每孔100 μ 1，再加入不同浓度RTB链蛋白各100μ 1，培养44h，收取上清备用，每孔加入10μ 1 ΜΤΤ，继续孵育4h，每孔加入100 μ 1 DMS0,振摇lOmin，于MOnm波长处测定吸光度值(A值)。计算增值指数SI (SI= 样品孔吸光值/阴性对照孔吸光值)
4.3 MTT法检测RTB链蛋白对LPS和ConA活化T、B淋巴细胞增殖影响。无菌制备小鼠脾淋巴细胞悬液，调整细胞浓度为1 X IO7个/ml，加入96孔细胞板每孔100 μ 1，再加入不同浓度RTB链蛋白及Con A 100 μ 1，使Con A终浓度为2. 5 μ g/ml，培养44h，收取上清备用， 每孔加入10 μ 1 MTT，继续孵育4h，每孔加入100 μ 1 DMSO,振摇IOmin,于540nm波长处测定吸光度值(A值)。计算增值指数SI (SI=样品孔吸光值/阴性对照孔吸光值)。结果如图4所示，RTB链蛋白在单独作用时对小鼠脾淋巴细胞的增殖具有明显作用，与ConA和LPS协同作用时，RTB链蛋白在三个剂量水平均能明显刺激T、B淋巴细胞的增殖，并且随着剂量的增加，其刺激增殖的能力也明显增加，与阳性对照组相比差异显著 (Ρ<0· 01)。实施例5 =RTB链蛋白体内对小鼠NK细胞活性的影响试剂与药品=MTT购自Sigma公司；
动物Balb/c小鼠购自卫生部长春生物制品所实验动物室。方法
5.1 RTB链蛋白免疫Balb/c小鼠。将Balb/c小鼠随机分成4组，分为生理盐水组，实验组(40mg/kg、20mg/kg、10mg/kg)。分别于0、7天免疫2次，第二次免疫后3天处死小鼠。5. 2 MTT法检测RTB链蛋白对NK细胞活性影响。无菌制备小鼠脾淋巴细胞悬液， 调整细胞浓度为IX IO7个/ml，加入96孔细胞板每孔100 μ 1，加入YAK-1靶细胞，设10:1 效靶比，培养18h，每孔加入10 μ 1 ΜΤΤ，继续孵育4h，每孔加入ΙΟΟμ 1 DMS0，振摇lOmin，于 540nm波长处测定吸光度值(A值)。结果如图5所示，10mg/kg和20mg/kg剂量浓度均可提高NK细胞活性，与阴性对照组相比差异显著(p<0. 05)
权利要求
1.蓖麻毒素B链蛋白在制备免疫调节剂中的应用。
2.蓖麻毒素B链蛋白在制备肿瘤辅助治疗剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及蓖麻毒素B链蛋白在免疫调节方面的新用途，属于医药领域范围。蓖麻毒素B链蛋白在制备免疫调节剂中的应用，蓖麻毒素B链蛋白在制备肿瘤辅助治疗剂中的应用。蓖麻毒素B链蛋白可以活化小鼠腹腔巨噬细胞，促进小鼠脾T、B淋巴细胞增殖，增强NK细胞活性，具有免疫调节作用，可作为免疫调节剂，并可用于肿瘤的辅助治疗。
文档编号A61P37/02GK102552876SQ201210036819
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月17日 优先权日2012年2月17日
发明者万家余, 侯峰, 刘文森, 刘林娜, 孙玉成, 徐静, 许娜, 钱军 申请人:中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所