专利名称：一种重组真菌主要过敏原与突变体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组真菌过敏原与突变体及其制备方法和应用。
背景技术：
真菌，是一种自然界广泛存在的真核生物，从生物学的观点来看，是一大类无根茎叶，不含叶绿素，不能利用无机物来制造食物，靠寄生或腐生生活的真核微生物，仅少数为单细胞，大多为多细胞，大多数真菌有分枝或不分枝的丝状体，能进行有性生殖和无性生殖。从形态上分为酵母菌、霉菌、担子菌。多数种具有食用和药用价值，并且许多是名贵药材，如灵芝、虫草、木耳等约百多种，但也有少数真菌在一定条件下会引起疾病，称为条件致病菌。如引起头皮屑产生的一种马拉色菌属的糠秕马拉色菌，它本身是一种人体表面的正常菌群，但在一定条件下由于环境因素的改变引起该菌群的不平衡生长，就会引起一系列的疾病，如花斑癣，脂溢性皮炎，头皮屑等，在我国大约有50%以上的人，都或多或少存在头皮屑，已严重影响到人们的生活质量。目前发现的真菌有10000种属，但只有100多种可能成为病原性真菌，目前有80种霉菌属已被鉴定在易感染群体中有可能成为IgE介导的过敏原，并且通过克隆cDNA得到编码的过敏原，已分离鉴定出23种属真菌过敏蛋白。目前研究中较常见的并且与生活密切相关的主要有以下种属，分别为Penicillium (青霉属)，Aspergillus (曲霉属)，Cladosporium (分支抱子菌属)，malassezia (马拉色菌属)，Ulocladium(单格抱属)，Chaetomium(毛壳菌属),Stachybotrys葡萄穗霉属。并且据统计调查，全世界有3%_10%的人群为真菌易感染人群。在23个真菌种属中已鉴定出的过敏蛋白，如Alternariaalternata 属有 10 种蛋白，Aspergillus fumigatus 属有 20 多种，Malassezia furfur 属有6种，Malassezia sympodialis属有10种等。真菌引起的过敏反应越来越受到广大研究者的重视。与花粉及其他过敏原不同，真菌以寄生或腐生的方式在动植物体表生存，在室内室外都遍布其足迹，其时空分布的广泛性，使得真菌引起的过敏反应也更普遍，成为影响人们生活质量的一大困扰，进一步真菌引起的过敏反应与花粉引起的IgE介导的I型过敏反应不同，真菌引起的过敏反应除了包括过敏性哮喘,过敏性鼻炎,过敏性鼻窦炎等往往还伴随着其他疾病，包括支气管肺曲霉病(ABPA)，超敏感性肺炎，中毒性肺炎等，并且真菌寄生在人体，可以通过产生毒素，蛋白酶和一些挥发性的混合物对气道造成损害。真菌引起的疾病较常见得还有皮肤病，包括特异性皮炎，异位性皮炎，脂溢性皮炎等，对于这些疾病，目前临床上主要采取涂擦一些抗真菌药，如复方雷琐辛酊、水氯酊、2%酮康唑洗剂、咪康唑霜、1%联苯苄唑酊或霜剂、1%特比萘芬霜，在联合抗真菌药治疗的过程中会使用到一些激素抗生素，这些治疗在短期内可能会有一定疗效，但经常会产生复发现象，并且激素及抗生素的使用，伴随引起一些负作用，长期对这种药的服用造成机体产生耐药性，达不到彻底治疗的效果。并且临床上有些真菌引起的皮肤病用抗真菌药并无疗效，对于真菌引起的皮肤病的治疗，采取有效正确的方法显得尤为重要。 另外，由于真菌时空分布的广泛性，进而引起的交叉反应也伴随而来，不仅真菌属之间存在交叉反应，真菌属中的过敏蛋白还会与人体自身的一些蛋白存在交叉反应，随着生物技术的发展，通过 RT-PCR 及 Imunicap, immunoblots, RAST 和 ELISA inhibition 等技术联合皮试试验，已经得出真菌之间广泛存在着交叉反应，如Aspergillus fumigatus中的 Aspfll 与 Betulaverrucosa 中的 Betv7, Catharanthusroseus 中的 Catrl 及 Malasezziasympodialis中的Malas6存在交叉反应,这些蛋白都属于Cyclophilin (系免疫抑制剂环胞霉素A的作用祀);对于Peroxiso malmembrane protein在不同种属中也存在交叉反应，如 Malasezziafurfur 中的 Malaf2, Malaf3, Malf5 与 Aspergillusfumigatus 中的 Aspf3,Malasezzia sympodialis中的Malasl等。另外研究报道,在一项AD (特异性皮炎)患者的试验中，36%的病人对Malasezzia sympodialis粗提物皮试试验显示阳性结果，同时,这些阳性病人血清对MnSOD蛋白和核糖体蛋白2也会产生阳性反应，在一组特异性皮炎患者并伴有异位性湿疹测试中，MnSOD蛋白的皮试测验显示阳性，这种自身内源性过敏蛋白的释放引起炎症反应的加重，从而引起自身免疫系统组织的损害，在ABPA病人中已经产生。目前已有20多种过敏蛋白都被鉴定出存在着交叉反应，并且某些蛋白由于与一些内源性蛋白之间存在交叉反应，使得这些蛋白产生过敏反应炎症的同时，自身内源性蛋白的交叉反应更加重了免疫反应炎症。临床检测发现对霉菌过敏的病人同时也对几种其他的真菌过敏。所以真菌引起的过敏反应，伴随着症状的并发性及复杂性，对真菌引起的疾病的正确诊断及治疗乃当务之急。有关病原性真菌引起的感染病因与遗传、内分泌、免疫状态，神经和环境等多因素有关。目前，治疗过敏性疾病主要方法有1)利用抗组胺药物以及类固醇药物可以缓解症状，但是不能彻底根除并且还有可能会带来副作用。2)特异性免疫治疗，被认为是过敏性疾病唯一针对病因的治疗方法，已得到普遍共识。而目前进行特异性免疫治疗主要是采用过敏原浸提液，如此一来另一个问题却异常突出由于提取物成分复杂，而且还含有大量非特异性抗原，致使标准化困难，严重影响了治疗效果和临床应用规范；同时，由于过敏原性的存在，即使是采用单纯的标准化过敏原进行免疫治疗也一定的风险。采用生物化学分离和纯化技术可以获得较纯过敏原，但是这种方法纯化工艺复杂且产量低，要消耗大量人力和财力，因此其广泛应用受到了较大的限制。相比较而言，利用基因工程技术，通过定点突变的方法获得低过敏原性或无过敏原性的重组真菌过敏原的突变体，在一定程度上可从源头上降低治疗过程中的风险，同时能够保留真菌过敏原的生物学活性。另外，重组过敏原的生产条件稳定，且标准化程序简单，有利于广泛应用于临床的诊断和治疗。因此，重组弱化过敏原将是一种很好的替代方法，有广阔的发展前景。
发明内容
本发明的目的在于针对上述存在的问题及天然真菌过敏原提取液的不足，在克隆表达重组真菌过敏原的基础上，利用生物信息学软件分析真菌过敏原的抗原表位，突变一个或多个抗原性高的位点，从而获得低过敏原性的真菌过敏原突变体，期望能够安全高效地应用于过敏性疾病的治疗。 本发明的另一个目的是提供一种编码上述重组真菌过敏原及其突变体的基因。本发明的另一个目的是提供一种含有上述基因的重组质粒载体。本发明的另一个目的是提供一种含有上述基因转化的重组表达宿主。本发明的另一个目的是提供一种上述重组真菌过敏原及其突变体的制备方法。本发明的另一个目的是提供一种重组真菌过敏原用作药物或者诊断试剂的制备方法。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案
本发明的重组真菌过敏原，是天然存在的真菌过敏原衍生的非天然存在的变异体，其核酸序列经密码子优化后，人工合成全长的重组真菌过敏原基因。采用生物信息学软件分析其抗原表位，针对一个或多个抗原性指数高的位点进行有目的的置换，获得重组真菌过敏原突变体的基因，使其在保持原有生物学活性和空间结构的基础上，能够有效地降低重组真菌过敏原的过敏原性。然后利用大肠杆菌表达系统，在人工控制的条件下，获得高纯度的重组真菌过敏原及其突变体蛋白。与天然真菌过敏原相比，该重组蛋白突变体与特异性IgE的结合性能明显减少，可安全地应用于过敏性基本的预防和治疗。一种重组真菌过敏原，其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示。上述重组真菌过敏原的突变体，是在重组真菌过敏原的突变体的基础上衍生的突变体，其中B细胞或/和T细胞表位的至少一个表面暴露的保守氨基酸残基被在天然存在的过敏原来源的分类学目内任何已知的同源蛋白质氨基酸序列中的相同位置不出现的另一残基取代，该突变体具有与天然出现的过敏原基本相同的a-碳骨架三级结构。本发明重组真菌过敏原的突变体的制备方法，是在重组真菌过敏原的突变体的基础上衍生的突变体，其中B细胞或/和T细胞表位的至少一个表面暴露的保守氨基酸残基被在天然存在的过敏原来源的分类学目内任何已知的同源蛋白质氨基酸序列中的相同位置不出现的另一残基取代，该突变体具有与天然出现的过敏原基本相同的a-碳骨架三级结构。更进一步地，所述表达宿主为大肠杆菌表达系统，该表达系统4.根据权利要求3所述重组真菌过敏原的制备方法，其特征在于所述表达宿主为大肠杆菌表达系统，该表达系统名称为Escherichia coli JM109_Mf 1，于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC N0:M2011150，保藏日期为2011年4月29日，保藏地点为中国.武汉.武汉大学；该表达宿主表达与纯化后即获得重组真菌过敏原。最详细的制备方法步骤如下
(1)从数据库中获取真菌过敏原的核酸序列，根据表达宿主的密码子偏好型对其进行密码子优化，优化后序列中GC含量为35飞5%，原氨基酸序列不变；
(2)人工合成优化后的核酸序列；
(3)经双酶切后，与表达载体连接，构建成重组载体；
(4)将重组载体转化表达宿主中，选择阳性转化物；
(5)在2(T38°C下，培养阳性转化物，用浓度为0.Of 2. Ommol/L的IPTG诱导重组蛋白表达，诱导温度为4 38°C ；
(6)所得培养物经裂解宿主细胞后，纯化获得高纯度的重组蛋白。
本发明所述重组真菌过敏原的突变体的制备方法包括如下步骤 Ca)采用生物信息学软件预测权利要求I所述重组真菌过敏原的氨基酸序列的优势抗原表位；
(b)采用定点法改变抗原性高的位点，用天然存在的过敏原来源的分类学目内任何已知的同源蛋白质氨基酸序列中的相同位置不出现的氨基酸残基取代原有的氨基酸残基；(C)获得真菌过敏原突变体的基因片段，经酶切后，与表达载体连接，构建成突变型重组载体；
(d)按照前述步骤(4) (6)的方法，获得高纯度的重组突变蛋白。本发明所述重组真菌过敏原及其突变体可以用于制备药物，制得的药物用于治疗变态反应性疾病并使对真菌过敏原乃至其它类型过敏的患者产生免疫耐受；或者用来诊断变态反应性疾病或者判断其它食品药品的过敏源性的高低。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明利用基因工程技术，经密码子优化后人工合成重组真菌过敏原的编码基因，并采用生物信息学软件分析其抗原表位，通过定点突变的方法，针对一个或多个抗原性高的位点进行定向置换，以降低其过敏源性，构建成低过敏原性的重组真菌过敏原突变体。利用在人工控制的条件下进行蛋白表达，获得高纯度的重组真菌过敏原及其突变体蛋白。与天然真菌过敏原相比，该重组蛋白突变体与特异性IgE的结合能力明显降低，可安全地应用于过敏性疾病的诊断与治疗乃至判断其它蛋白过敏原性的高低。
图I为真菌过敏原蛋白的表达与纯化电泳图。图中泳道从左至右分别为Marker ；未诱导菌体；诱导菌体；超声破碎上清；超声破碎沉淀；纯化蛋白。Marker从上至下分别为97. 4, 66. 2, 45. 0, 31. 0, 21. 0, 14. 4kD。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例I重组真菌过敏原的克隆与表达
(I)重组真菌过敏原核酸序列的确定=WNCBI数据库中获取天然真菌过敏原的核酸序列，GenBank序列号为X96486. 1，在该序列的C端加上方便纯化的亲和标签6*HIS、STREPII或S蛋白，然后分别在序列的N端和C端加上Nde I、Eco RKXho I、Pst I等酶切位点，得到重组真菌过敏原的目的基因片段MFl。(2)根据大肠杆菌的密码子偏好性，对目的基因MFl的核酸序列进行密码子优化，使得目的基因更适合在宿主菌中表达，优化后GC含量为35飞5%，原氨基酸序列不变，如SEQID NO: I 所示。(3)人工合成优化后的MFl基因序列。(4)经双酶切后，将目的片段MFl克隆到原核表达载体pET上，构建重组表达质粒。(5)将重组表达质粒pET-MFl转化入表达宿主菌Rosetta中。(6)选择含重组表达质粒pET-MFl的表达宿主菌Rosetta在LB培养基中30_37°C培养1-6小时，加入浓度为0. Of 2. 0 mmol/L IPTG诱导表达2-8小时，诱导温度为4-38°C。诱导后，离心收集菌体，进行SDS-PAGE检测目的蛋白的表达量(见图I)。(7)超声破碎法裂解菌体获得目的蛋白的包涵体，裂解液为15-100 mM Tris-Hcl,50-300 mM NaCl, 0. 05-1. 0 mM EDTA。(8)用透析法进行蛋白复性后，以8000-30000rpm的转速在4°C下离心15-30 min,
收集上清液。
(9)复性后得到的上清液，经6*HIS、STREPII或S蛋白标签的亲和层析柱获得高纯度的目的蛋白。实施例2重组真菌过敏原的抗原表位分析及突变位点的确定
(I)运用在线软件平台包括 SYFPEITHI，MHCPred, SYFPEITHI, BIMAS, NetMHC II，MHC-THREAD,EpiPredict, HLA-DR4 binding, ProPred, RankPep, SVMHC,PREDEP, PREDICT 等对重组真菌过敏原的氨基酸序列的抗原指数进行分析。综合各软件的分析，结果表明重组真菌过敏原氨基酸序列中145-164、189-208、239-258区域的抗原值较高。(2)针对抗原值比较高的一个或多个位点进行氨基酸置换，以弱化抗原性。将抗原性改造后的氨基酸序列再进行上述的抗原性分析，如此反复，筛选出抗原性显著降低的突变位点。实施例3重组真菌过敏原突变体的构建
(I)针对确定的突变位点，按照突变试剂盒提供方法设计突变体引物，Tm值一般要求大于78 °C，引物长度在25-45个碱基之间比较适宜。(2)根据突变试剂盒的要求，以重组真菌过敏原的重组表达质粒为模板，进行突变PCR。(3)用试剂盒中提供的酶消化PCR产物后，转化感受态细胞，挑取阳性克隆，测序检测突变是否成功。
权利要求
1.一种重组真菌过敏原，其特征在于是在重组真菌过敏原的基础上衍生的非天然存在的突变体，其中B细胞或/和T细胞表位的至少一个表面暴露的保守氨基酸残基被在天然存在的过敏原来源的分类学目内任何已知的同源蛋白质氨基酸序列中的相同位置不出现的另一残基取代，该突变体具有与天然出现的过敏原基本相同的a-碳骨架三级结构。
2.权利要求I所述重组真菌过敏原的突变体，其特征在于其氨基酸序列如SEQIDNO: I所示。
3.权利要求I所述重组真菌过敏原的制备方法，其特征在于包括如下步骤编码权利要求I所述重组真菌过敏原的基因依据相应的表达宿主的情况通过密码子优化得到，并以之获得重组载体后，转化大肠杆菌、酵母或植物，得到重组宿主，蛋白表达后得到权利要求I所述的重组真菌过敏原。
4.根据权利要求3所述重组真菌过敏原的制备方法，其特征在于所述表达宿主为大肠杆菌表达系统，该表达系统名称为Escherichia coli JM109_Mf 1，于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC N0:M2011150，保藏日期为2011年4月29日，保藏地点为中国.武汉.武汉大学；该表达宿主表达与纯化后即获得权利要求I所述的重组真菌过敏原。
5.根据权利要求3所述重组真菌过敏原的制备方法，其特征在于包括如下步骤 (1)从数据库中获取真菌过敏原的核酸序列,根据表达宿主的密码子偏好性对其进行密码子优化，优化后序列中GC含量为35 65%，原氨基酸序列不变； (2)人工合成优化后的核酸序列； (3)经双酶切后，与表达载体连接，构建成重组载体； (4)将重组载体转化表达宿主中，选择阳性转化物； (5)在2(T38°C下，培养阳性转化物，用浓度为0.Of 2. Ommol/L的诱导剂来诱导重组蛋白表达，诱导温度为4 38°C ； (6)所得培养物经裂解宿主细胞后，纯化获得高纯度的重组蛋白。
6.权利要求2所述重组真菌过敏原的突变体的制备方法，其特征在于包括如下步骤 Ca)采用生物信息学软件预测权利要求I所述重组真菌过敏原的氨基酸序列的优势抗原表位； (b)采用定点法改变抗原性高的位点，用天然存在的过敏原来源的分类学目内任何已知的同源蛋白质氨基酸序列中的相同位置不出现的氨基酸残基取代原有的氨基酸残基； (C)获得真菌过敏原突变体的基因片段，经酶切后，与表达载体连接，构建成突变型重组载体； Cd)按照权利要求5所述步骤(4) (6)的方法，获得高纯度的重组突变蛋白。
7.权利要求1-6中任意一条权利要求所述的重组真菌过敏原或其突变体在制备药物中的应用，该药物用于治疗变态反应性疾病并使对真菌过敏原乃至其它类型过敏的患者产生免疫耐受；或者用来诊断变态反应性疾病或者判断其它食品药品的过敏原性的高低。
8.权利要求7中所述的药物或诊断试剂，其特征在于它包含根据权利要求f6中任意一项的重组过敏原，任选与药用或者诊断试剂中可接受的赋形剂和/或载体，并且任选佐剂和/或偶联剂组合。
全文摘要
本发明公开了一种重组真菌过敏原与突变体及其制备方法和应用。本发明所述重组真菌过敏原是天然存在的过敏原衍生的非天然存在的变异体，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本发明利用基因工程技术，经密码子优化后人工合成重组真菌过敏原的编码基因，并采用生物信息学软件分析其抗原表位，通过定点突变的方法，针对一个或多个抗原性高的位点进行定向置换，以降低其过敏源性，构建成低过敏原性的重组真菌过敏原突变体。利用在人工控制的条件下进行蛋白表达，获得高纯度的重组真菌过敏原及其突变体蛋白。与天然真菌过敏原相比，该重组蛋白突变体与特异性IgE的结合能力明显降低，可安全地应用于过敏性疾病的诊断与治疗乃至判断其它蛋白质的过敏原性的高低。
文档编号A61K39/35GK102617715SQ201210089389
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月30日 优先权日2012年3月30日
发明者何颖, 刘雪婷, 程江丽, 邹泽红, 陈惠芳, 陶爱林 申请人:广州医学院第二附属医院