专利名称：有效抑制流感病毒聚合酶活性的多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物信息学领域。更具体地，本发明涉及流感病毒PBl的模拟结构及针对该结构的有效抑制流感病毒聚合酶活性的多肽。
背景技术：
流感病毒，属于正粘病毒科，是极易发生突变的负链RNA病毒。它是引起流行性感冒(简称流感)的病原体，在历史上多次引起流行性感冒大流行如1918年西班牙流感大流行，造成多达5000万人死亡，1957年流感，引起全球15亿人发病。流感病毒的流行为全球的经济和社会发展造成了巨大的危害。所以针对流感病毒的防治是摆在我们面前的一项重要任务。现在使用的有效的流感药物有Amantadine、Ostamivir、Zanamivir等,分别针对 流感病毒的离子通道蛋白(M2)，及表面蛋白(NA)。但是这些小分子药物也存在一些问题，如抗性病毒的出现等(18、24)。所以，我们需要更多的手段来抑制流感病毒的传播。流感病毒的基因组由8个基因片段组成，共编码11个蛋白。流感病毒聚合酶是由3个蛋白(PB2、PB1、PA)组成的异源三聚体复合物，是负责流感病毒复制和转录的重要复合物。PB2主要负责Cap binding，PA主要有核酸内切酶活性，负责切割5’端“帽子”结构，而PBl是聚合酶的核心蛋白，负责RNA链的延伸，单独和PB2，PA都有很强的相互作用。另外流感病毒聚合酶在体内要行使功能还需要NP蛋白的辅助，NP蛋白负责结合到病毒的基因组RNA上，保持RNA的结构稳定性，另外NP也能和PB2相互作用从而调控转录和复制的过程(9、11、25)。对流感病毒聚合酶的功能研究用的最多的是流感病毒聚合酶的微型复制系统(minireplicon system),即在细胞中表达流感病毒聚合酶行使功能所需要的4个蛋白PB2、PB1、PA和NP，另外再表达一个RNA报告基因，报告基因反向互补克隆在流感病毒保守的基因组RNA(vRNA)启动子的5’端和3’端之间，报告基因最初会被细胞内的RNA聚合酶I复合物转录出一个5’和3’端带有流感病毒的启动子的RNA(报告基因是反向互补的)，然后细胞内表达的流感病毒聚合酶会识别该启动子RNA，从而复制出报告基因为正向克隆的mRNA，从而在细胞中翻译出报告基因的蛋白产物(22、23)。简单的讲细胞中转染表达RNA报告基因的载体后，只要细胞中有足够的流感病毒聚合酶或流感病毒，就能在细胞中检测到报告基因的表达(17、18、22)，这也是用来研究针对流感病毒聚合酶的药物的很好的系统，当药物能有效抑制流感病毒聚合酶活性的时候，报告基因的表达量就会低，反之会闻。在进化上，流感病毒聚合酶结构和功能都非常的保守，针对流感病毒聚合酶的药物相对于针对表面蛋白的药物来讲具有更好的广谱性和耐药性。到现在，PA的两个亚基结构已被解析，PB2有近1/2的结构被解析，而PBl的两端有少部分结构外，还没有更多的PBl的结构数据(25)。随着对流感病毒聚合酶结构和功能认识的不断深入，现在流感病毒聚合酶成为人们研制流感药物的新的有效的靶点
发明内容
我们通过对PBl结构的模拟，以及通过将诺沃克病毒(Norwalk virus) RdRp晶体结构(PDB ID 3BSN)中的RNA对接(称为“dock”)到我们模拟的PBl的结构上，发现PBl的氨基酸序列中的第481位至第515位的片段(下文中称为PBl 481-515，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示)可能参与PBl与RNA的结合。细胞学实验表明PBl 481-515对流感病毒聚合酶具有抑制效果。病毒学实验表明PBl 481-515对流感病毒的复制具有很好的抑制效果。并且发现PBl 481-515与已报道的对流感病毒聚合酶有抑制效果的片段PBln 1-25AA(SEQ ID NO. 2) (18)在抑制病毒复制方面效果相当。因此，本发明的多肽PBl481-515具有非常好的实用价值和应用前景。更具体地，本发明提供以下各项I. 一种用于抑制流感病毒聚合酶活性的多肽，它的氨基酸序列包括流感病毒聚合酶亚基PBl 481-515位的氨基酸片段(SEQ ID N0:1)。2. 一种用于抑制流感病毒聚合酶活性的多肽，所述多肽包括SEQ ID NO :1的截短体，所述截短体与SEQ ID NO 1相比在N端和/或C端缺少15个以下的氨基酸，优选地缺少10个以下的氨基酸。3.根据2的多肽，其中所述截短体与SEQ ID NO : I相比在N端缺少10个或5个
氨基酸。4.根据2的多肽，其中所述截短体与SEQ ID NO : I相比在N端缺少10个氨基酸并且在C端缺少5个氨基酸。5. 一种用于抑制流感病毒聚合酶活性的多肽，所述多肽是在根据I至4中任一项的多肽的C端添加了序列为YGRKKRRQRRRPP的13个氨基酸的衍生多肽。6.核苷酸序列，其编码根据前述中任一项的多肽。7.包括根据6的核苷酸序列的表达载体。8.包含根据7的表达载体的细胞。9. 一种使用根据1-5中任一项的多肽来抑制流感病毒聚合酶活性的方法，所述方法包括将根据7的载体提前转染到之后会被病毒感染的人细胞中。10.根据1-5中任一项的多肽、根据6的核苷酸序列、根据7的表达载体或根据8的细胞在制备用于抑制流感病毒聚合酶活性的药物中的应用。下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
图I是流程框图，其表示模拟构建PBl三维结构的流程；图2是模拟构建的PBl整体结构的示意图；图3A显示PBl 481-515片段对流感病毒聚合酶的抑制效果；图3B显示I3Bl 481-515片段在N端和/或C端缺少5个或10个氨基酸的截短体对流感病毒聚合酶的抑制效果；图4A显示PBl 481-515片段对流 感病毒H1N1A/WSN/33复制的抑制效果；图4B显示PBl 481-515片段对流感病毒H9N2A/Quail/HK/Gl/97复制的抑制效果。图5显示在PBl 481-515的截短体PBl 491-515的C端添加了序列为YGRKKRRQRRRPP的13个氨基酸的衍生肽(491-515-TAT)在体外对流感病毒聚合酶转录活性的抑制效果
具体实施例方式实施例I、PBl三维结构的模拟由于PBl和已有晶体结构的RNA dependent RNA polymerase (依赖RNA的RNA聚合酶，RdRp)序列的相似性非常低，很难用已有的常规的基于模板的模建方法来模建PBl的结构。在本文中本发明人将已知的PBl的功能信息加入常规的基于模版的结构模拟方法FR-t5 (7)来找最优的PBl的模板。 首先挑选用于模拟PBl结构的模板，挑选PBl的模板所用的信息包括PB1的111-636区域为PBl的RdRp核心区和PBl的5个保守的基序(motif) (pre_A、A、B、C、D)区域(2、13)。根据设计的方法找到的打分最高的前20个蛋白中，大部分模板是正链RNA病毒的RdRp。打分最高的三个模板从高到低依次为诺沃克病毒(Norwalk Virus, NV) (6)、手足口病病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV) (5)和登革热病毒(Dengue Virus,DV) (8)的RdRps。我们选取排在第一位的NV RdRP (PDB ID 2B43，1208-1695AA)为模板用Swiss-Model(I)来构建PBl的结构。序列比对时一个原则是优先将5个基序的位点比对准确，另一个原则是尽可能不在模板二级结构中间加入“间隔”，保持二级结构的完整性。序列和结构比对分析NV和DV的RdRp发现，DV RdRp多了一个“Flap”结构，从而使其不能结合双链RNA(4、10)，而PBl和NV RdRp都能结合双链RNA启动子(promoter) (3、12、15)，说明NV RdRp是非常适合用于构建PBl结构的模板。如图I所示，PBl模建的流程包括4个步骤步1)要模拟区域的选择，2)位点限制的折叠识别，3)模版的选择和4)模板构建优化实施例2、PBl 481-515片段的挑选如在图2A中所示，本发明的模拟的PBl结构呈现出RdRp典型的“闭合的右手”的拓扑结构。该结构的中心是由手指(fingers) (71-266，314-405AA)，手掌(palm) (267-313，406-501AA)和拇指(thumb) (502-600AA)组成的一个通道，这个通道是结合RNA模板的通道(RNA template channel)。整个结构中包含5个保守的基序。4个保守位点D405、G406、D445和K481均位于RNA模板的通道周围；图2B是将图2A沿纵坐标旋转180°得到的图。将已知的诺沃克病毒RdRp晶体结构(PDB ID 3BSN)中的RNA对接(称为“dock”)到本发明模拟的PBl的结构中，可以看到在本发明模拟的PBl结构的中心形成的RNA模板的通道正好可以容纳一个双链的RNA，本发明的PBl 481-515的位置正好位于所对接的RNA周围。
PBl的481位-515位氨基酸区域非常保守，并且包含了基序E (在负链RNA病毒中是非常保守的)(20)，这个片段在如上所述的模拟的含有RNA的PBl的结构模型中可能参与了 PBl对RNA的结合，可见这个片段在流感病毒复制过程中功能非常重要，在体内过表达该片段后，该片段可能会和PBl竞争性结合RNA，从而抑制PBl的功能及病毒的复制。我们选这个片段进行进一步的检测。实施例3、将多肽片段PBl 481-515构建到真核表达载体上用定点突变的方法将获得自He，W等的载体pcDNA3. 1_6HA(14)中的NdeI 酶切位点突变掉，引物为 NdeI-F :CATCAAGTGTATCGTATGCCAAGTAC ;NdeI-R :CGTACTTGGCATACGATACACTTGATG。测序正确后记为 pcDNA3. 1-6HA-M,设计引物Flag_F CCCAAGCTTCATATGGACTACAAAGACGATGACGACAAGGGATCCGTGAGCAAGGGCGAGGAG ;FI ag-R : CCGGAATTCCCCGGGACTACTTGTACAGCTCGTCCATGC,将 Flag-GFP 从模板 pEGFP-Nl (购自 clontech)中扩增出来，用Hindlll、EcoRI酶切所得到的PCR产物并回收，将该切好的PCR产物连接到用Hindlll、EcoRI (Takara公司生产)酶切并回收的载体pcDNA3. 1-6HA-M上，得到pFA-Flag-GFP，其中Flag两边带有Ndel、BamHI的酶切位点(下划线表示)，测序正确后，用于之后的载体构建。设计特异引物(481-F: CCATTATGGCCCCATATGCCCAAGTCTTACATAAATCGGACAGGAAC ；481-R CGACATGTTTTTTGGATCCCCCCTAGGATCCAGACACTCCAAAGCTGGGCA)将 PBl 481-515 从模板pBD-PBl(来自于1996年在广东的鹅体内分离的A型高致病性禽流感H5N1的基因，毒株名称为A/Goose/Guangdong/l/96(H5Nl) (8,19))中扩增出来，用 NdeI、BamHI (Takara 公司生产)双酶切所得的PCR产物和载体pFA-Flag-GFP，用T4连接酶(Takara公司生产)进行连接，转化到TOPlO感受态细胞(购自北京GenStar公司)中，测序鉴定正确并在本文中记为 PFA-PB1481-515-GFP，即将 pFA-Flag-GFP 载体中的 Flag 片段替换为 PBl 481-515 片段。其他片段的克隆都采用同样的策略。下文中除非另外说明，就用pFA-peptide-GFP表示表达多种肽(peptide)与GFP相连的融合蛋白(peptide_GFP)的载体。实施例4、将多肽片段PBl 481-515的截短体构建到真核表达载体上PBl 481-515截短体是在PBl 481-515的N端和C端截去若干个(例如5个或10个)氨基酸的不同截短体。将所述截短体构建到实施例3中所述的真核表达载体上，所用方法与实施例3中所述基本相同，不同之处在于当从模板扩增目的片段时，使用以下表I中的引物以获得相应的截短体克隆。表IPBl 481-515的不同截短体的构建
权利要求
1.一种用于抑制流感病毒聚合酶活性的多肽，它的氨基酸序列包括流感病毒聚合酶亚基PB1481-515位的氨基酸片段(SEQ ID NO 1)0
2.一种用于抑制流感病毒聚合酶活性的多肽，所述多肽包括SEQ ID NO :1的截短体，所述截短体与SEQ ID NO 1相比在N端和/或C端缺少15个以下的氨基酸，优选地缺少10个以下的氨基酸。
3.根据权利要求2的多肽，其中所述截短体与SEQID NO : I相比在N端缺少10个或5个氨基酸。
4.根据权利要求2的多肽，其中所述截短体与SEQID NO : I相比在N端缺少10个氨基酸并且在C端缺少5个氨基酸。
5.一种用于抑制流感病毒聚合酶活性的多肽，所述多肽是在根据权利要求I至4中任一项的多肽的C端添加了序列为YGRKKRRQRRRPP的13个氨基酸的衍生多肽。
6.核苷酸序列，其编码根据前述权利要求中任一项的多肽。
7.包括根据权利要求6的核苷酸序列的表达载体。
8.包含根据权利要求7的表达载体的细胞。
9.一种使用根据权利要求1-5中任一项的多肽来抑制流感病毒聚合酶活性的方法，所述方法包括将根据权利要求7的载体提前转染到之后会被病毒感染的人细胞中。
10.根据权利要求1-5中任一项的多肽、根据权利要求6的核苷酸序列、根据权利要求7的表达载体或根据权利要求8的细胞在制备用于抑制流感病毒聚合酶活性的药物中的应用。
全文摘要
提供了一种用于抑制流感病毒聚合酶活性的多肽，它的氨基酸序列包括流感病毒聚合酶亚基PB1481-515位的氨基酸。同时发现在所述多肽的N端和/或C端缺少5个或10个氨基酸的截短体以及在所述多肽和它的上述截短体的C端添加了序列为YGRKKRRQRRRPP的13个氨基酸的衍生多肽也具有类似的对流感病毒聚合酶活性的抑制作用。
文档编号A61K48/00GK102617712SQ201210088960
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月29日 优先权日2012年3月29日
发明者吴爱平, 李春峰, 蒋太交 申请人:中国科学院生物物理研究所