专利名称：抗血管性血友病因子a3区双功能性单克隆抗体的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，具体的说是涉及抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体在制备抗血栓药物中的应用
背景技术：
血栓(thrombi),是指在人体血管内形成的血块,血栓形成(thrombosis)是指血管内形成血凝块的过程，血栓形成是人体重要的保护机制，避免个体在遭遇创伤时过量的血液溢出。人体同时存在抑制血栓形成的因素，防止血栓无限制扩大和异常的血栓形成，即抗凝系统。当血栓完成了止血后，体内还存在清除血栓的纤溶机制，纤溶激活物/纤溶抑制物调解体内的纤溶活性。这样，止血与抗凝，纤溶与抗纤溶两个系统的相互作用，相互平衡，保证了人体内的血液在正常生理情况下能够在血管内正常流动，既不形成血栓，也不出血，在创伤时形成血栓止血，止血后血栓又能够被清除。但如果上述机制失衡，血栓形成过多堵塞官腔则成为血栓性疾病，血管内所形成的血栓随着血液流动的方向飘落，当遇到直径小于血栓的血管时引起血管堵塞即栓塞(embolism)。由于这两个过程是相互关联的，故临床上将其一并称作血栓栓塞性疾病。流行病学研究显示，随着生活条件的改善及人口的老龄化，血栓栓塞性疾病的发病率逐年增加。据世界卫生组织统计，全球每年有1500万人死于血栓栓塞性疾病，我国每年血栓栓塞性疾病的发病人数近1000万，其中病死人数高达100万，致残率也很高。此外，血栓栓塞性疾病容易引发心肌梗死、卒中、外周动脉疾病、肺栓塞等严重并发症，严重危害人类健康。因此深入研究血栓形成机制以及开发抗血栓新靶点的创新药物是目前医药领域急待解决的问题。近年来，对血小板在血栓形成过程中分子机制研究促进了分子靶向药物的发展，其中以针对血小板糖蛋白(GP) Ilb/IIIa的单克隆抗体阿昔单抗(abciximab, Reopro)为代表，临床应用已取得了良好的抗血栓治疗效果。然而，由于阿昔单抗也存在引起严重出血的潜在危险，特别是在亚洲人群中出血副作用更严重，还未在亚洲推广应用，所以在一定程度上阻碍了这类药物的临床应用。为了克服抗血栓药物的缺陷，近来抗血小板粘附作为新的抗血栓治疗手段正在兴起，人们试图通过抑制胶原-血管性血友病因子(VWF)-血小板GPIb轴来阻断血小板与胶原的起始粘附，即在血栓形成早期阶段阻止血小板的黏附和活化，以达到既能对抗血栓形成，又能减少出血的危险性的目的。
发明内容
本发明提供了抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体的新应用，即抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体SZ-125在制备抗血栓药物中的应用。血栓形成是由血小板在血管受损部位的粘附开始的。血小板粘附是血小板表面膜受体与暴露的血管内皮下细胞外基质蛋白，如VWF，胶原蛋白，纤维连接蛋白，玻璃连接蛋白和层连接蛋白等结合完成的。血小板粘附后形成单层血小板，随后，血小板被激动剂如肾上腺素，ADP，胶原蛋白或凝血酶等激活。激活的血小板在膜表面暴露出GPIIb a /IIIa受体，纤维蛋白原与之结合后介导血小板聚集。GPIIb a/IIIa与其他黏附蛋白如VWF等结合后也可引起血小板交叉结合和聚集。由此可见，VWF分子与胶原的结合所引起的血小板粘附是血栓形成的初始途径。因此VWF成了治疗性药物受人瞩目的祀点。 本申请发明人制备了针对胶原-血管性血友病因子(VWF)-血小板GPIb轴新靶点的双功能单克隆抗体SZ-123和SZ-125，已在申请号为CN200910027568. I的中国专利中公开。体外试验研究表明，双功能单克隆抗体SZ-123和SZ-125不仅抑制胶原与血管性血友病因子(VWF)的相互作用，也抑制血管性血友病因子(VWF)与血小板GPIb的相互作用，进一步的研究显示在高剪切状态下，SZ-123和SZ-125在体外抑制血小板在胶原表面上的粘附作用，体外试验显示了巨大抗血小板粘附的潜力。然而体外实验只是基础实验，影响因素简单，实验结果只能作为初期筛查，无法推用到复杂的动物及人类。为了进一步研究抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体SZ-123和SZ-125在体内的抗血栓作用药用价值，本发明采用我们选取更接近人类的动物-猕猴作为研究对象，运用动脉血栓Folts模型，静脉注射给药不同剂量的单克隆抗体SZ-125，将单克隆抗体SZ-125静脉给药，然后观察给药后不同时间点的抗血栓的效果，用超声血流仪监测动物血管损伤部位给药前后周期性血流减少CFR值，统计给药前后各I小时内CFRs次数的改变，其中，所述单克隆抗体SZ-125为保藏编号为CGMCC NO. 2501的杂交瘤细胞株SZ-125分泌的单克隆抗体。结果显示猕猴每公斤体重分别静脉注射给药抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体SZ-1250. lmg、0. 3mg和0. 6mg后，与阴性对照组静脉注射生理盐水(Omg/Kg)比较，给药后三组试验动物均能显著抑制周期性血流减少(CFR)值(P<0.01)。抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体SZ-125在猕猴体内分别给药0. lmg、0. 3mg和0. 6mg/Kg后与生理盐水组比较，具有显著地抑制CFRs作用(P < 0. 01)，并且单克隆抗体SZ-125对猕猴的CFRs抑制作用在猕猴体内是剂量依赖性地，而且当给药剂量达到0. 6mg/Kg时几乎能完全抑制CFRs值。采用相同方法，将单克隆抗体SZ-123静脉给药，观察给药后不同时间点的抗血栓的效果，结果与静脉给药单克隆抗体SZ-125结果相似。因此本发明提供了抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体在制备周期性血流减少抑制剂中的应用。 在一个具体实施方式
中本发明观察了单克隆抗体SZ-125对猕猴体内血浆VWF与胶原的结合的影响，结果显示在0. lmg/Kg剂量组中，在给药15分钟到I小时内，SZ-125抑制其血浆VWF与胶原结合分到达50%。在0. 3mg/Kg和0. 6mg/Kg剂量组，给药5分钟其抑制率就接近100% (到达最高值是85%和94% )，在2小时以内其抑制率分别保持在80%和92%以上。而在0. 6mg/Kg剂量组中，给药24小时还有44%抑制率。结果表明本发明所述抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体SZ-125在动物体内具有明显的抑制血浆VffF与胶原的结合的作用。采用相同方法，观察单克隆抗体SZ-123对猕猴体内血浆VWF与胶原的结合的影响，结果与静单克隆抗体SZ-125结果相似。因此，本发明提供了抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体在制备周期性血流减少抑制剂中的应用。在一个具体实施方式
中，本发明通过观察单克隆抗体SZ-125对猕猴体内血小板聚集功能的影响，检测抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体对瑞斯脱霉素(Ristocetin)诱导的血小板聚集的抑制作用。结果显示在给药单克隆抗体SZ-1250. Img/Kg、0. 3mg/Kg和0. 6mg/Kg的不同剂量后，与给药前比较，给药15分钟和30分钟就到达血小板聚集最大抑制率，给药I小时后，血小板聚集抑制率开始下降，在2小时以内其最大血小板聚集率分别降至20%以下。表明本发明抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体SZ-125在动物体内具有抑制瑞斯脱霉素(Ristocetin)诱导的人血小板聚集的作用。采用相同方法，观察单克隆抗体SZ-123对猕猴体内血小板聚集功能的影响，结果与静单克隆抗体SZ-125结果相似。因此，本发明提供了抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体在制备血小板聚集的抑制剂中的应用另外，本发明将猕猴分别给予不同剂量的单克隆抗体SZ-125，在给药0min、5min、15min、30min、lh、2h、4h和24h时间点采血(血样以终浓度0. 38%的枸橼酸钠和0.2%EDTANa2分别抗凝)后，观察各时间点动物体内的SZ-125水平、VWF抗原水平和SZ-125与VffF结合的占有率。结果显示，与给药前比较，SZ-125在给药5分钟到4小时内保持较高的水平，在24小时后下降到最高水平的10%左右。而各时间点血浆VWF水平没有显著变化。SZ-125在给药5分钟到4小时内保持较高的在VWF的占位百分率，在0. 6mg/Kg组中，在给药5分钟到4小时内其VWF的占位百分率是92%到100%，在给药24小时时，还有80%以上的VWF占位百分率；在0. 3mg/Kg组中，在给药5分钟到2小时内其VWF的占位百分率在85%以上，在给药24小时时，还有56. 3% VffF的占位百分率。结果表明单克隆抗体SZ-125与VWF有很高的亲和力，在猕猴体内抗血栓药效作用保持较宽的时间窗。此外，本发明还将猕猴分别给予不同剂量的单克隆抗体SZ-125，在给药Omin、5min、15min、30min、lh、2h、4h和24h时间点采血(血样以终浓度0. 38%的枸橼酸钠和0. 2% EDTANa2分别抗凝)后,观察各时间点动物体内的血小板数和出血时间，同时观察给药前后血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(Fg)等凝血指标，检测单克隆抗体SZ-125-在动物体内抗动脉血栓效果和出血影响。结果显示，与给药前比较，每组动物给药后各时间点的血小板数没有显著下降，出血时间不延长,对各时间点的血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶时间(TT)均不显著延长、血浆纤维蛋白原(Fg)水平不下降。结果表明，单克隆抗体SZ-125对猕猴体内血小板数没有显著下降，出血时间不延长，凝血功能不影响，作为抗血栓药物没有出血副作用，降低出血的风险。采用相同方法观察，单克隆抗体SZ-123与VWF同样有很高的亲和力，在猕猴体内抗血栓药效作用保持较宽的时间窗，而且静脉注射单克隆抗体SZ-123后，结果与静单克隆抗体SZ-125结果相似，不同时间点血小板数也没有显著下降，出血时间不延长，凝血功能不影响。综上所述，抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体SZ-125和SZ-123在动物体内具有显著地抑制周期性血流减少(CFRs)作用，而且不但抑制血浆VWF与胶原的结合，而且也抑制瑞斯脱霉素(Ristocetin)诱导的人血小板聚集,具有双功能抑制血栓形成的作用。由此可见，抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体是从动脉血栓形成的源头，即是针对血小板粘附的新靶点(胶原-VWF-血小板)从早期预防血栓的形成。此外，抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体与VWF有很高的亲和力，在猕猴体内抗血栓药效作用保持较宽的时间窗，而且对猕猴体内血小板数、出血时间不延长以及凝血功能不影响，作为抗血栓药物没有出血副作用。因此本发明提供了抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体在制备抗血栓药物中的应用 。本发明所述抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体为申请号为CN200910027568. I的中国专利中的筛选获得的杂交瘤细胞株SZ-125和SZ-123所产生的单克隆抗体。其中，所述抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体优选为保藏编号为CGMCC NO. 2501的杂交瘤细胞株SZ-125分泌的单克隆抗体。本发明还提供了一种抗血栓的药物制剂，由有效量的抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体和药学上可接受的辅料组成。本领域技术人员可将所述抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体直接或间接加入制备不同剂型时所需的药学上可接受的各种常用辅料，以常规药物制剂方法，制成常用剂型如注射剂、粉针剂等剂型。所述制剂可以通过以下方式中的适合方式给药局部给药、静脉、肌肉、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内或颅内注射或输入，或借助一种外植的储器用药，其中优选肌注、腹膜内或静脉内用药方式。本发明所述抗血栓药物制剂的使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、给药时间、代谢速率、病程严重程度以及诊治医师的主观判断。本领域的技术人员根据上述因素可以容易地决定使用剂量和使用方法。
图I示实施例2给药前后猕猴周期性血流减低(CFRs)变化代表性记录图，猕猴给药前记录I小时内CFRs (-60分钟到0分钟)，然后静脉注射给药单克隆抗体SZ-125(0mg/Kg、0. Img/Kg、0. 3mg/Kg和0. 6mg/Kg)后再记录I小时CFRs (0分钟到60分钟)，箭头为给药时间点和给药剂量；图2示实施例2SZ-125不同给药剂量对猕猴的CFRs抑制作用，静脉推注不同剂量的单克隆抗体SZ-125 (0. Img/Kg、0. 3mg/Kg、0. 6mg/Kg和阴性对照组Omg/Kg),给药前后分别记录各I小时的CFRs，横坐标为单克隆抗体SZ-125的浓度，纵坐标为单克隆抗体SZ-125对CFRs的抑制率，每组动物n = 6，数据代表每组动物的平均数，“#”= P < 0. 01，“*”= P< 0. 05 ；图3示实施例3SZ-125体内不同给药剂量对猕猴的血浆VWF与胶原结合抑制作用的检测图，静脉推注不同剂量的单克隆抗体SZ-125(0. lmg/Kg,0. 3mg/Kg、0. 6mg/Kg和阴性对照组Omg/Kg),分别采血测定给药0min、5min、15min、30min、lh、2h、4h和24h后，单克隆抗体SZ-125对血浆VWF与胶原的结合的抑制作用，横坐标为单克隆抗体SZ-125给药时间，纵坐标为SZ-125对血浆VWF与胶原结合的抑制率(％ )，每组动物n = 6，数据代表每组动物的平均数；图4示实施例4SZ-125体内不同给药剂量对猕猴的血小板聚集的抑制作用的检测图，静脉推注不同剂量的单克隆抗体SZ-125(0. lmg/Kg,0. 3mg/Kg、0. 6mg/Kg和阴性对照组Omg/Kg),分别米血测定Omin、15min、30min、lh、2h、4h和24h后，单抗SZ-125对瑞斯托霉素(终浓度2. 5mg/mL)诱导的血小板聚集的抑制作用，横坐标为单克隆抗体SZ-125给药时间，纵坐标为SZ-125对血小板凝集的抑制率(％ ),每组动物n = 6,数据代表每组动物的平均数。
具体实施例方式本发明实施例公开了抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体在制备抗血栓药物中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。实施例I :动物分组和设计给药方案；(I)实验动物云南猕猴(苏州西山中科实验动物有限公司，实验动物生产许可证SCXK (苏)2007-0005 ;实验动物使用许可证SYXK :(苏)2006-0003。2-3. 5岁龄，实验开始时体重4. 0-5. 5Kg，24只，雌雄各半。(2)给药方案将猕猴为阴性对照组(n = 6)和给药组试验(n = 18)，给药组又分成高剂量组(n=6)、中剂量组(n = 6)和低剂量组(n = 6)三组,来研究SZ-125在称猴体内抗动脉血栓药物效果。给药组高、中和低剂量分成三组动物，每组猕猴给药剂量每公斤体重分别为0. 6mg/Kg、0. 3mg/Kg和0. lmg/Kg。给药途径为无菌静脉推注，每个动物药物以目前临床应用的生理盐水稀释至5mL后静脉推注，阴性对照组分别静脉推注5mL无菌生理盐水。(3)采血方案每组动物分别在用药0min、5min、15min、30min、lh、4h、12h和24h时间点采血，
全血血小板计数用2% EDTA-2Na(l/9)抗凝当天测定，其他所有血样以终浓度0. 38%的枸橼酸钠抗凝，血小板聚集试验全血立即分离富含血小板血浆2小时内测定完毕，剩余的0. 38%的枸橼酸钠抗凝全血分离血浆后冻-80°C冰箱测定其他观察指标。实施例2 SZ-125猕猴周期性血流减低(CFRs)变化的影响猕猴以3%戊巴比妥钠(30mg/kg)静脉注射麻醉后，加热操作台维持动物体温于370C。手术仔细分离股动脉长约5cm，将直径0. 5cm的软硅胶C型外周血管超声探头包绕在近心端血管外。实验过程中持续记录股动脉平均流速。猕猴稳定30min后，使用3个具有弹簧装置的动脉夹完全阻断血流20s，每个动脉夹间隔2mm，损伤血管壁。在损伤血管中段放置直径大小合适的硬质自制C型环，在C形环和动脉间隙插入直径3. Omm的球囊导管(美国Cordis公司，3. OmmX IOmm)用长3cm,宽0. 8cm的输液皮条封闭C形环缺口，球囊导管充气并保持压力使血管狭窄65% -80%。可观察到由于血小板黏附和聚集所造成的血流逐步减低，当血流逐步下降为0时，解除狭窄，通过机械作用冲走血栓，恢复血流。这一血流减低，随后通过机械作用冲走血栓，恢复血流的重复过程，称为周期性血流减低(CFR)。如果需要，可再次损伤血管内皮和进一步使血管狭窄。稳定描记2个CFR后正式开始实验，记录I小时内CFR发生次数，描记I小时后，按实施例I给药方案分别静脉注射给药不同剂量的单克隆抗体SZ-125，总体积(包括冲洗静脉通 路的生理盐水)共5mL，Imin内注射完毕，给药后继续描记CFRl小时。用超声血流仪监测动物血管损伤部位给药前后周期性血流减少CFR值，结果见图1，统计给药前后各I小时内CFR次数计算SZ-125不同给药剂量对猕猴的CFRs的抑制率，结果见图。由图I结果可见三组称猴每公斤体重分别静脉注射给药0. lmg、0. 3mg和0. 6mg后，与阴性对照组静脉注射生理盐水(Omg/Kg)比较，给药后三组试验动物均能显著抑制周期性血流减少(CFR)值。由图2结果可见单克隆抗体SZ-125在猕猴体内分别给药0. Img,
0.3mg和0. 6mg/Kg后与生理盐水组比较，具有显著地抗血栓作用(P < 0. 01)，并且单克隆抗体SZ-125对猕猴的CFRs抑制作用在猕猴体内是剂量依赖性地，而且当给药剂量达到
0.6mg/Kg时几乎能完全抑制CFRs值。实施例3 SZ-125体内抑制猕猴血浆VWF与胶原结合包板将人胎盘III型胶原(Sigma公司产品)溶于包被缓冲液，以20 y g/mL包被于多孔ELISA板，100 u L/孔，4°C湿盒过夜；次日，用PBS-0. 05% Tween洗涤3次后，用封闭液200 u L/孔封闭，4°C湿盒过夜；次日PBS-0. 05% Tween洗涤3次后备用或_20°C冻存。检测将实施例I获得的各时间点的待测的猕猴血浆给药前、后各时间点0. 38%的枸橼酸钠抗凝血浆加入上述包被III型胶原酶标板各孔中，空白对照孔加入2% BSA-PBS溶液，37°C温育2h ；PBS-0. 05% Tween洗涤3次后加入I : 4000稀释的辣根过氧化物标记的兔抗人vWF多抗(DakoCytomation公司),37°C温育Ih ；PBS-0. 05% Tween洗漆6次后以TMB显色，4M H2SO4终止反应，在酶标仪上测定450nm处各孔OD值。计算各时间点血浆内VWF与胶原的结合率与VWF与胶原结合的抑制率，统计结果见图3。其中，给药后各时间点血浆内VWF与胶原的结合率=给药后各时间点血浆内测定的对应OD值/给药前(Omin)血浆内测定的对应OD值，SZ-125在体内抑制VWF与胶原的结合的抑制率=(I-结合率)X 100%。由图3结果可见，抗VWF A3区单克隆抗体SZ-125在0. lmg/Kg组中，在给药15分钟到I小时内，SZ-125抑制其血浆VWF与胶原结合分到达50%。在0. 3mg/Kg和0. 6mg/Kg剂量组，给药5分钟其抑制率就接近100% (到达最高值是85%和94% )，在2小时以内其抑制率分别保持在80%和92%以上。实验表明本发明的单克隆抗体SZ-125在动物体内具有抗血栓的作用。实施例4 SZ-125体内抑制猕猴血小板聚集率按实施例I所述方法分组给药，每组动物分别在用药0min、5min、15min、30min、lh、4h、12h和24h时间点采血采集猕猴全血5mL(3. 8%柠檬酸钠1/9抗凝)，IOOXg离心lOmin，取上层富含血小板血浆(PRP)，然后在血小板聚焦仪上分别用2. 5mg/mL瑞斯托霉素(Ristocetin, Sigma公司产品)诱导血小板聚集，记录最大血小板聚集率，统计结果见图4。由图4结果可见，抗VWF A3区单克隆抗体SZ-125在0. lmg/Kg组中，在给药15分钟到30分钟内，最大血小板聚集率仅为35%。在0. 3mg/Kg和0. 6mg/Kg剂量组，给药15分钟到30分钟内，最大血小板聚集率最高值是50%和70%，给药I小时后，血小板聚集抑制率开始下降，在2小时以内其最大血小板聚集率分别降至20%以下。实验表明本发明的单克隆抗体SZ-125在动物体内具有抑制瑞斯脱霉素(Ristocetin)诱导的人血小板聚集的作用。实施例5 SZ-125在猕猴体内对SZ-125水平和VWF抗原(VWF Ag)水平的影响I、猕猴体内SZ-125水平测定包板将羊抗鼠IgG(Beckman_Coult，USA)以包被缓冲液(0. 1M，pH9. 6碳酸盐缓冲液)稀释到5g/mL包被于多孔ELISA板，IOOii L/孔，4°C湿盒过夜；次日，用PBS-0. 05%Tween洗涤3次后，用封闭液200 u L/孔封闭，4°C湿盒过夜；次日PBS-0. 05% Tween洗涤3次后备用或_20°C冻存。
检测倍比(I 2)稀释的猕猴血浆样品和SZ-125标准品同时加入酶标板中37°C反应Ih后，用PBS-0. 05% Tween洗涤3次后，结合的SZ-125与HRP标记的羊抗鼠IgG 37°C反应Ih，然后用PBS-0. 05% Tween洗涤6次后以TMB显色，3M H2SO4终止反应，在酶标仪上测定450nm处各孔OD值，以SZ-125标准品横坐标，相应OD值为纵坐标，作直线回归方程后计算猕猴血浆中SZ-125含量。统计结果见表I。2、猕猴体内VWF抗原(VWF Ag)水平测定包板将抗VWF单克隆抗体SZ_29(本室研制)溶于包被缓冲液(0. 1M，pH9. 6碳酸盐缓冲液)，以g/mL包被于多孔ELISA板，100 iil/孔，4°C湿盒过夜；次日，用PBS-0. 05% Tween洗涤3次后，用封闭液200 yl/孔封闭，4°C湿盒过夜；次日PBS-0. 05%Tween洗涤3次后备用或_20°C冻存。检测正常人混合血浆以I : 20、1 50,1 100,1 200,1 500,1 1000 六
个稀释度作为标准曲线，100 Ii L/孔,将实施例I获得的各时间点的0. 38%的枸橼酸钠抗凝全血分离的待测猕猴血浆作I : 50稀释，均以0.2%BSA-PBS为稀释液，空白对照孔加入
0.2% BSA-PBS溶液，37°C温育2h ；PBS-0. 05% Tween洗涤3次后，加入I 1000稀释的辣根过氧化物标记的抗VWF单克隆抗体SZ-34，IOOii L/孔，37°C温育2h ；PBS-0. 05% Tween洗涤6次后以TMB显色，3M H2SOj*止反应，在酶标仪上测定450nm处各孔OD值。以正常人混合血浆的6个稀释度的对数为横坐标，相应OD值为纵坐标，作直线回归方程后计算含量，以正常人混合血浆的VWF =Ag定为10ug/mL，统计结果见表I。表I体内给药SZ-125各时间点血浆的SZ-125水平和VWF抗原水平(ug/mL)
给药剂量 05 min 15 min 30 min Ih 2 h4 h 24 h
SZ-125 Q.6mg/Kg 0 5.0 士 1.3 6.7 士 1.3 6.6 土 1.5 4.1 士 1.3 2.9 士 0.8 2.0 士 1.0 0.6 土 0.2水平 0.3mg/Kg ~ 0 1.3士0.6 3.4士0.9 3.7±0~ 2.8士0.8 . 2.1 士 1.0 1.4士0.7 0.4土0.5
__0. lmg/Kg 0 0.3 士 0.1 0.4 士 0.2 0.4 士 0.1 0.3 士 0.1 0.2 士 0.1 0.15 士 0.1 0.1 士 0.1
VWF Q.6mg/Kg ' 10.7士 1.9 _9.8士2.4 1(15±1.4 9.2±1~8~ 9.4士3.3 . 9.7士1.6 _10.5士3.5 ~9^8±2.5抗原水 0.3mg/Kg 11.6±1.6 10.4±0.9 10.1±1.6 9.1±1.5 9.0 士 3.3 10.4±0.5 11.1±1.4 10.5 士 3.5^ 0. lmg/Kg 9.4 士 2.3 10.7±1.2 8.9士1.7 10.1 士 2.1 8.3 士 3.1 12.0±5.3 9.8 士 3.1 10.1 士 2.8由表I结果可见，抗VWF A3区单克隆抗体SZ-125在三组猕猴体内分别静脉注射给药0. lmg/Kg,0. 3mg/Kg和0. 6mg/Kg后，每组动物分别与给药前比较，SZ-125在给药5分钟到4小时内保持较高的水平，在24小时后下降到最高水平的10%左右，而给药后各时间点猕猴体内血浆VWF抗原(VWF=Ag)水平没有显著改变。实施例6 SZ-125在猕猴体内对VWF占有率的影响包板将抗VWF多克隆抗体(DakoCytomation公司)I : 1000溶于包被缓冲液(0. 1M，pH9. 6碳酸盐缓冲液)，包被于多孔ELISA板，IOOiU/孔，4°C湿盒过夜；次日，用PBS-0. 05% Tween洗涤3次后，用封闭液200 yl/孔封闭，4°C湿盒过夜；次日PBS-0. 05%Tween洗涤3次后备用或_20°C冻存。检测将实施例I获得的各时间点的0. 38 %的枸橼酸钠抗凝全血分离的待测的猕猴血浆分别倍比稀释，37°C预保温5min后，分别加入上述酶标板孔中37°C保温2小时，每一个对应的猕猴血浆要分别做100%的VWF占有率(每一个对应稀释的样品要加入饱和量的SZ-125，终浓度为6ug/mL)。结合的SZ-125与辣根过氧化物标记的羊抗鼠1gG(Beckman-Coulter 公司产品)，37°C保温 I 小时，PBS-0. 05% Tween 洗涤 6 次后以 TMB显色，3M H2SO4终止反应，在酶标仪上测定450nm处各孔OD值。计算VWF占有率，统计结果见表2。其中，每一个猕猴血浆内VWF占有率％ =(每个样品0D450nm/对应每个样品含有饱和量的 SZ-125 的 0D450nm) X 100%。表2体内给药SZ-125不同剂量后各时间点VWF占有率)
权利要求
1.抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体在制备抗血栓药物中的应用。
2.抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体在制备周期性血流减少抑制剂中的应用。
3.抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体在制备血浆VWF与胶原的结合的抑制剂中的应用。
4.抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体在制备血小板聚集的抑制剂中的应用。
5.根据权利要求I 4任意一项所述应用，其特征在于，所述抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体为保藏编号为CGMCC NO. 2501的杂交瘤细胞株SZ-125分泌的单克隆抗体。
6.一种抗血栓药物制剂，其特征在于，由有效量的抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体和药学上可接受的辅料组成。
7.根据权利要求6所述药物制剂，其特征在于，所述药物制剂为注射剂或粉针剂。
全文摘要
本发明涉及医药领域，公开了抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体在制备抗血栓药物中的应用。抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体在动物体内具有显著地抑制周期性血流减少(CFRs)作用，不但抑制血浆VWF与胶原的结合，也抑制瑞斯脱霉素诱导的人血小板聚集。此外抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体与VWF有很高的亲和力，在猕猴体内抗血栓药效作用保持较宽的时间窗，而且对猕猴体内血小板数、出血时间不延长以及凝血功能不影响，作为抗血栓药物没有出血副作用。其中，所述抗血管性血友病因子A3区双功能性单克隆抗体为保藏编号为CGMCC NO.2501的杂交瘤细胞株SZ-125分泌的单克隆抗体。
文档编号A61P7/02GK102614513SQ201210106259
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月12日 优先权日2012年4月12日
发明者季顺东, 江淼, 赵益明, 阮长耿 申请人:苏州大学附属第一医院