专利名称：RhoA的RNA干扰靶点序列在制备治疗青光眼药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及RhoA的RNA干扰靶点序列在制备治疗青光眼药物中的应用。
背景技术：
青光眼是目前全球第二位不可逆性致盲性眼病，它是一组以眼压升高或其他多种因素引起视神经损害，表现为视野损害、视盘凹陷扩大、视网膜神经纤维层萎缩的眼病。青光眼发生和发展的主要危险因素是高眼压的存在。青光眼的发病机制尚未完全阐明，小梁网部位房水外流阻力增大造成的病理性眼 压升高是引起原发性开角型青光眼的主要原因。小梁网细胞的生物学功能和构型依赖于肌动蛋白纤维及其结合蛋白组成的细胞骨架。Rho GTP酶是细胞骨架肌动蛋白微丝组建的重要调控因子，在肌动蛋白细胞骨架的调节中起核心作用。在哺乳动物中Rho亚家族按照其序列同源性分为6大类，其中以RhoA研究的最早也最为广泛。目前，抗青光眼的治疗包括使用房水形成抑制剂或增强巩膜葡萄膜流出的药物降低眼压，及改善滤过目的的手术治疗。而药物抗青光眼的方法已经显示出多种全身的和局部的毒副作用。目前，降低眼压的药物治疗主要有缩瞳药，肾上腺能受体激动剂，￠-阻断齐U，碳酸酐酶抑制剂，前列腺素衍生物等。例如，缩瞳药毛果芸香碱可以起视力模糊和其他不利的视觉副作用；碳酸酐酶抑制剂可引起恶心，消化不良，疲劳和代谢性酸中毒等全身毒副作用；￠-阻断剂对心脏兴奋和对支气管、骨骼肌血管的具有抑制作用。此类副作用可以导致患者适从性降低或终止治疗。鉴于青光眼的重要性及目前传统药物治疗的不当，针对青光眼发展基础性原因的基因靶向治疗越来越受到重视；然而，作为基因靶向性治疗手段之一的基因转染，其载体病毒载体的安全性及伦理性成为限制其临床应用的主要原因。例如，现在广泛使用的高效转染载体慢病毒载体，是人类免疫缺陷病毒-I (HIV-I)来源的一种病毒载体。由于HIV复杂的生物学特性，其安全性尚未得到很好的解决。RNA干扰是指生物中双链RNA诱导产生的一种特异的基因沉默现象。近几年来RNAi的研究取得了很大进展，使得这一技术迅速应用到多个研究领域，加速了对基因功能、遗传规律、信号转到机理的研究，并已将这一技术应用于癌症和病毒性疾病的基因治疗中，在眼科的应用研究也日益深入。Tolentino采用激光击破Br u ch膜建立脉络膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)动物模型，米用玻璃体腔注射VEGF-siRNA后,观察血管生成情况及新生血管的渗漏，结果发现VEGF-siRNA能显著抑制CNV的生成，明显减少CNV的渗漏，且未观察到出血、炎症、毒性反应；Nakamii ra等采用结膜下注射磷酸盐缓冲盐水制作的眼内炎症和纤维化的大鼠模型中，发现大鼠模型中TGF-siRNA明显减少炎症反应和基质沉着。然而RNA干扰在眼部直接降低眼压治疗青光眼的应用及SiRNA前房注射后的分布情况却罕有研究。
发明内容
本发明的目的是提供RhoA的RNA干扰靶点序列在制备治疗青光眼药物中的应用，所述的RhoA的RNA干扰靶点序列的核苷酸序列为5’ -GAAGTCAAGCATTTCTGTC-3’。本发明提出的RhoA的RNA干扰靶点序列-RhoA siRNA选择有效靶序列的依据
I、用RNA struct u re软件预测RhoA mRNA的二级结构,选择其中不形成发夹的片段,或者保证有十几个剪辑不形成发夹。2、片段19个碱基，有两个dT悬垂，同时GC含量在30% 55%，尽量避免GGG或CCC。3、检查序列的保守性，选择保守性高的。本发明的RhoA的RNA干扰靶点序列，其核苷酸序列如下5’ -GAAGTCAAGCATTTCTGTC-3’。根据RhoA的RNA干扰靶点序列设计的RNA干扰序列RhoA siRNA，其正义链为5' GAAGUCAAGCAUUUCUGUC dTdT 3'，反义链为 3' dTdT CUUCAGUUCGUAAAGACAG 5’。本发明以上述RhoA的RNA干扰靶点序列5’ -GAAGTCAAGCATTTCTGTC-3’获得的RhoA siRNA,将该 RhoA siRNA 转染人小梁网细胞(Human trabecular meshwork)和小鼠·成纤维细胞NIH/3T3并检测其干扰效率，结果发现，如图I所示，RhoA siRNA能降低体外人小梁网细胞(Human trabec u Iar meshwork)和小鼠成纤维细胞NIH/3T3中RhoA基因的mRNA的表达，干扰效率可高达80%左右。将非特异性cy31abeled siRNA与转染试剂混合再注入前房，妥布霉素眼膏涂眼，用免疫荧光观察Cy31abeled siRNA在前房组织中分布情况，结果发现，如图2和图3A所示,绝大部分cy31abeled siRNA(图2中红色标记)存在于前房角的小梁组织中，而角膜内皮和虹膜组织中却未发现cy31abeled siRNA的分布，为进一步特异性基因治疗提供了实验基础。前房注射RhoA siRNA后ld、7d眼前节照相系统记录眼部角膜混浊，虹膜充血等情况，晶体透明度等情况，对于组织学观察，用石蜡切片染色观察角膜内皮形态，结果发现，如图3所示，RhoA siRNA在眼部未见明显的毒性反应，手术临床观察未见角膜浑浊，水肿，未见晶状体混浊。染色角膜内皮亦未见异常。在慢性高眼压小鼠动物模型的前房注射RhoA siRNA，检测术眼眼压变化情况和RhoA mRNA的水平，结果如图4和5所示，地塞米松局部点眼后，眼压逐渐升高，至第28天眼压升高约7mmHg，在RhoA siRNA注射后第5天，眼压降至正常基线水平。地塞米松引起的慢性高眼压小鼠动物模型的前房组织中的RhoAmRNA升高，在注射RhoA siRNA后，RhoAmRNA水平下降了约50%，在体内具有良好的转染效率。由此可见，体内注射特异性片段RhoA siRNA能高效下调前房组织中RhoA基因和基因的表达量，影响应力纤维的形成，进而影响小梁细胞肌动蛋白细胞骨架结构和分布的改变，从而引起小梁细胞通道构型的变化，改变房水排出阻力，进而影响眼压，从而达到治疗青光眼的目的。因此，本发明的RhoA的RNA干扰靶点序列5’-GAAGTCAAGCATTTCTGTC-3’可应用于制备治疗青光眼药物中。优选，根据所述的RhoA的RNA干扰靶点序列设计的RNA干扰序列RhoA siRNA,其正义链为 5' GAAGUCAAGCAUUUCUGUC dTdT 3'，反义链为 3' dTdT CUUCAGUUCGUAAAGACAG5'，所述的治疗青光眼的药物是通过以下方法制备的用PBS将RhoA siRNA稀释成2iig/U 1，再按体积比3. 5 I. 5与转染试剂Lipofectamine RNAiMAX混合反应得到治疗青光眼的药物。根据本发明的RhoA的RNA干扰靶点序列5’ -GAAGTCAAGCATTTCTGTC-3’制备的RhoA siRNA能有效的降低RhoA mRNA的表达水平，高效下调前房组织中RhoA蛋白的表达量，影响应力纤维的形成，进而影响小梁细胞肌动蛋白细胞骨架结构和分布的改变，从而引起小梁细胞通道构型的变化，改变房水排出阻力，进而影响眼压，从而达到治疗青光眼的目的。
图I是SiRhoA的瞬时转染对人小梁网细胞和小鼠3T3细胞RhoA表达的影响，其中图IA表示对RhoA基因表达影响，图IB表示对RhoA蛋白表达影响，其中图IB中上两幅图表不对人小梁网细胞的RhoA蛋白表达的影响，而图IB中下两幅图表不对小鼠3T3细胞的RhoA蛋白表达的影响，对照表示的是PBS组，转染试剂表示的是单纯用转染试剂组，阴性对照表示的是阴性对照siRNA组，SiRhoA表示RhoA siRNA(siRhoA)和转染试剂Lipofectamine RNAiMAX 的混合液(以下同);图2是cy31abeled siRNA在前房的高密度分布及其在眼前段其他组织的分布情 况。图2A和2B表示的是前房注射7iig cy31abeled siRNA后24小时siRNA眼前段的分布情况。其中红色代表的是cy31abeled siRNA，蓝色代表的是细胞核染色。图3是SiRhoA体内转染后第一天和第七天眼前段照相(图3B)和组织学HE染色情况(图3C)。图3A(a)，(b)分别表示前房注射7 ii g cy31abeled siRNA在角膜内皮和虹膜的分布情况。红色表示的是cy31abeled siRNA，蓝色代表细胞核染色。图3B(a，b，c)分别代表注射PBS，阴性对照siRNA, SiRhoA后24小时眼前段照相；图3B(d, e, f)分别代表注射PBS，阴性对照siRNA, SiRhoA 7天后眼前段照相。图3C(a，b，c)分别代表注射PBS，阴性对照siRNA, SiRhoA后24HE染色；图3C(d，e，f)分别代表注射PBS,阴性对照siRNA,SiRhoA 7天后HE染色。图4是SiRhoA小鼠前房注射前后眼压变化的情况。图5是SiRhoA小鼠体内转染效率检测。
具体实施例方式以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例I :I、RhoA siRNA设计根据已有文献报道及实验经验，利用生物软件，依照GenBank发表的RhoA基因序列,设计并选择了软件评分最高的序列。最后采用NCBI GenBank (美国国立医学图书馆和美国国立卫生研究院编写)提供的BLAST软件，对选择的靶序列进行同源分析，排除siRNA非特异性地抑制小鼠和人的其他基因片段的可能。被委托设计序列和合成序列的公司为广州锐博生物有限公司。RhoA 的 RNA 干扰靶点序列5’ -GAAGTCAAGCAITTCTGTC-3’由此根据RhoA的RNA干扰靶点序列5’ -GAAGTCAAGCAITTCTGTC-3’设计的RhoAsiRNA(双链)的核苷酸序列为正义链5'GAAGUCAAGCAUUUCUGUC dTdT 3'反义链3'dTdT CUUCAGUUCGUAAAGACAG 5'，命名为 siRhoA。2、RhoA siRNA (siRhoA)转染人小梁网细胞(Human trabecular meshwork)和小鼠成纤维细胞NIH/3T3并检测其干扰效率。
转染前一天，将长势良好的人小梁网细胞(Human trabecular meshwork)和小鼠成纤维细胞NIH/3T3用胰酶消化，以每孔I X IO5个细胞接种到12孔板中Human trabecularmeshwork细胞的培养液为15%胎牛血清的DMEM/F12培养基，NIH/3T3的细胞培养液为10%胎牛血清的DMEM培养基)，待细胞长至融合度为60% 80%左右时即可用作转染。用不含胎牛血清的DMEM培养基稀释RhoA siRNA(siRhoA)至2. 8 y g，再将5 转染试剂 Lipofectamine RNA iMAX (Invitrogen)加至 2ml 上述稀释的含 RhoA siRNA (siRhoA)的不含胎牛血清的DMEM培养基中。将稀释后的RhoA siRNA (siRhoA)和转染试剂Lipofectamine RNA iMAX(Invitrogen)轻轻混勻，室温反应30min。将培养板中的培养液吸出，用无血清的DMEM洗涤2次并吸干。再将上述制备的RhoA siRNA (siRhoA)和转染试剂Lipofectamine RNA iMAX的混合液加入到培养板中，每孔1ml。置于37°C，5% CO2培养箱中培养4h后吸弃培养液，用PBS轻轻洗两遍，加入含有胎牛血清的DMEM培养液继续培养，24h后用Real Time PCR检测细胞的RhoA基因表达变化，48h后检测细胞的RhoA蛋白表达变化。以 PBS 空白对照、转染试剂 Lipofectamine RNA iMAX 和 Negative control (NC)分别作为对照组，转染试剂组和阴性对照组。
结果如图I所示，从图1(A，B)可以看出，RhoA siRNA能降低体外人小梁网细胞(Humantrabec u Iar meshwork)和小鼠成纤维细胞 NIH/3T3 中的 RhoA mRNA 的表达和 RhoA蛋白的表达量，干扰效率为80%左右，并且其干扰效率在小鼠成纤维细胞NIH/3T3中最高。3、非特异性cy31abeled siRNA在前房组织中分布情况的观察。用PBS稀释非特异性cy31abeled siRNA(产品名称为Cy3-NControl_05815 (2-OMe)，货物编号为siB10112100751，生产商广州锐博生物科技有限公司)至取 3.5iil cy31abeled siRNA 与 I. 5 y I 转染试剂 Lipofectamine RNA iMAX (Invitrogen)混合,室温反应30min备用。取成年小鼠准确称重，随机分组，用4. 3%水合氯醛按0. 20-0. 33ml/kg标准进行腹腔麻醉。常规消毒后，开睑，滴丁卡因滴眼液
2次角膜表面麻醉。在手术显微镜下用33G微量注射器抽取事先准备的cy3 labeled siRNA与转染试剂Lipofectamine RNA iMAX的混合物由角巩膜缘前约0. 3mm处进入前房，小心不要伤及晶体，并缓缓将混合物注入前房，注射后5秒钟再缓缓将注射针头抽出，每个前房5 体积的混合物。妥布霉素眼膏涂眼。用免疫荧光观察cy3 labeled siRNA在前房组织中分布情况。结果如图2和图3A所示，由图2可以看出，绝大部分cy3 labeled siRNA(图2中的红色荧光)存在于前房角的小梁组织中，而角膜内皮和虹膜组织中却未发现大量cy3IabeledsiRNA的分布(图3A)，为进一步特异性基因治疗提供了实验基础。4、RhoA siRNA眼内毒性的研究用PBS 稀释 RhoA siRNA 至 2 y g/y 1，取 3. 5 y I 再与转染试剂 Lipofectamine RNA iMAX (Invitrogen) I. 5u I混合，室温反应30min备用。在手术显微镜下用33G微量注射器抽取事先准备的RhoA siRNA与转染试剂Lipofectamine RNA iMAX的混合物由成年小鼠的角巩膜缘前约0. 3mm处进入前房，小心不要伤及晶体，并缓缓将混合物注入前房，注射后5秒钟再缓缓将注射针头抽出，每个前房5 u I体积的混合物，Id, 7d后眼前节照相系统记录眼部角膜混浊，虹膜充血等情况，晶体透明度等情况。对于组织学观察，用石蜡切片HE染色观察角膜内皮形态。其结果如图3(B，C)所示，从图3可以看出，RhoA siRNA(siRhoA)在眼部未见明显的毒性反应，手术临床观察未见角膜浑浊，水肿，未见晶状体混浊。HE染色角膜内皮亦未见异常。5、制备慢性高眼压小鼠动物模型及检测前房注射RhoA siRNA(siRhoA)前后眼压变化曲线。取6周成年小鼠准确称重，随机分为5组。其中一组用PBS眼水点左眼，另外其他四组用1%地塞米松眼水点眼，每日四次，共28天。期间用TONO-PEN AVIA压平眼压计每7天检测一次眼压，并记录及描绘眼压曲线图。用PBS稀释Rho A siRNA至2i!g/ia，取 3. 5 u I 再与转染试剂 Lipofectamine RNA iMAX (Invitrogen) I. 5 U I 混合，室温反应30min备用。在手术显微镜下用33G微量注射器抽取事先准备的RhoA siRNA与转染试剂Lipofectamine RNAiMAX的混合物由角巩膜缘前约0. 3mm处进入前房，小心不要伤及晶体，并缓缓将混合物注入前房，注射后5秒钟再缓缓将注射针头抽出，每个前房5 u I体积的混合物，于术后ld，2d，3d，4d，5d，6d，Id, 14d，21d检测术眼眼压变化情况。结果如图4所示， 从图4中可以看出，地塞米松局部点眼后，眼压逐渐升高，至第28天眼压升高约7mmHg。在RhoA siRNA注射后第5天，眼压降至正常基线水平。用转染试剂Lipofectamine RNAiMAX,地塞米松和PBS做相同处理，阴性对照为Negative control siRNA。6、RhoA siRNA(siRhoA)体内转染并检测其干扰效率取6周成年小鼠准确称重，用I %地塞米松眼水点眼，每日四次，共28天，由此得到慢性高眼压小鼠动物模型。用PBS稀释RhoA siRNA至2 y g/卩1，取3. 5 yl再与转染试剂 Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) I. 5 U I 混合，室温反应 30min 备用。注射 RhoAsiRNA的时间为地塞米松点眼28天后，第29天开始进行试验。取慢性高眼压小鼠动物模型，随机分组，用4. 3%水合氯醛按0. 20-0. 33ml/kg标准进行腹腔麻醉。常规消毒后，开睑，滴丁卡因滴眼液2次角膜表面麻醉。在手术显微镜下用33G微量注射器抽取事先准备的RhoAsiRNA与转染试剂Lipofectamine RNA iMAX的混合物由角巩膜缘前约0. 3mm处进入前房，小心不要伤及晶体，并缓缓将混合物注入前房，注射后5秒钟再缓缓将注射针头抽出，每个前房5 u I体积的混合物。用RT-PCR检测体内的RhoA基因的转染效率。用转染试剂Lipofectamine RNA iMAX和地塞米松做相同处理，以PBS和Negative control分别作为空白对照和阴性对照。结果如图5所示，由图5可以看出，地塞米松引起的慢性高眼压小鼠动物模型的前房组织中的RhoAmRNA升高，在注射RhoA siRNA (siRhoA)后，RhoAmRNA水平下降了约50%，在体内具有良好的转染效率。由此可见，体内注射RhoA siRNA能高效下调前房组织中RhoA基因的表达量，影响应力纤维的形成，进而影响小梁细胞肌动蛋白细胞骨架结构和分布的改变，从而引起小梁细胞通道构型的变化，改变房水排出阻力，进而影响眼压，从而达到治疗青光眼的目的。综上所述，本发明根据RhoA的RNA干扰靶点序列5’-GAAGTCAAGCATTTCTGTC-3’制备的RhoA siRNA可以用于制备治疗青光眼药物。
权利要求
1.RhoA的RNA干扰靶点序列在制备治疗青光眼药物中的应用，所述的RhoA的RNA干扰靶点序列的核苷酸序列为5’ -GAAGTCAAGCATTTCTGTC-3’。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，根据所述的RhoA的RNA干扰靶点序列设计的RNA干扰序列RhoA siRNA，其正义链为5' GAAGUCAAGCAUUUCUGUC dTdT 3'，反义链为3' dTdT CUUCAGUUCGUAAAGACAG 5'，所述的治疗青光眼的药物是通过以下方法制备的用PBS将RhoA siRNA稀释成2 u g/U 1，再按体积比3. 5 I. 5与转染试剂Lipofectamine RNAiMAX混合反应得到治疗青光眼的药物。
全文摘要
本发明公开了一种RhoA的RNA干扰靶点序列在制备治疗青光眼药物中的应用。根据本发明的RhoA的RNA干扰靶点序列5’-GAAGTCAAGCATTTCTGTC-3’制备的RhoA siRNA能有效的降低RhoA mRNA的表达水平，高效下调前房组织中RhoA基因的表达量，影响应力纤维的形成，进而影响小梁细胞肌动蛋白细胞骨架结构和分布的改变，从而引起小梁细胞通道构型的变化，改变房水排出阻力，进而影响眼压，从而达到治疗青光眼的目的。
文档编号A61K48/00GK102743764SQ20121010629
公开日2012年10月24日 申请日期2012年4月11日 优先权日2012年4月11日
发明者余敏斌, 刘茜, 吴开力 申请人:中山大学中山眼科中心