专利名称：一种治疗食管癌的中药的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药，特别是一种治疗食管癌的中药。
二、背景技术 食管癌是常见的恶性肿瘤之一，我国每年约有25万新诊断的食管癌病例，占全世界食管癌病例数的一半，并以河南、河北、陕西为食管癌发病率最高，特别是河南省林州一直为世界所关注，林州35-64岁男性发病率高达478. 87/10万，临床上治疗食管癌效果不佳，五年生存率不到15%。食管癌属于中医“噎嗝”范畴，对它认识具有悠久的历史和丰富的临床经验，临床上辨证治疗，合用放、化疗、手术，或单独应用中药，起到增效、减毒、改善生存质量、延长生存期等多种效应，进一步研究发现，部分中药能防治化学药物致癌、抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡、提高机体免疫力等，但是，目前临床上中医治疗食管癌多为辨证治疗，缺乏专用于治疗食管癌的新中药，因此，加强针对食管癌的中药研究开发，对于提高临床防治水平和能力，减少食管癌患者死亡率具有重要意义。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种治疗食管癌的中药，可有效解决临床上治疗食管癌效果不佳，食管癌患者死亡率高的问题。本发明解决的技术方案是该中药由重量计的旋覆花7-10份、当归4-7份、黄连3-6份制成，将旋覆花、当归、黄连粉碎，加入旋覆花、当归、黄连重量的10倍量体积浓度为98-75%的乙醇，室温下，时时振摇浸泡7天，过滤，得滤液，于45°C下旋转蒸发去除乙醇，再常规方法冷冻干燥或低温负压干燥成固态，粉碎即可，制成的中药占生药的重量比为
4.5-6. 5% (冷冻干燥或低温负压干燥均为常规方法，现有技术，不再多述)。产品特点1.组方小，费用低；2.疗效确切；3.纯中药制剂；4.安全便捷；5.符合中医药组方理论。中医认为食管癌多由忧思郁怒、饮食酒伤、年老体虚、它病转化等多种因素所引起，初起之时，气滞、痰阻、血瘀等邪气阻滞于食管，阻塞食管，使食管狭窄；病邪日久不祛，耗伤津血，脏腑失养，食管干涩，则饮食难下。病机包括气郁、痰阻、血瘀、气血津亏等，其中痰血互阻、毒邪郁滞最为常见，也是导致食管癌不断发展的主要机理。本发明中药中旋覆花味苦、辛、咸，性微温，归肺、胃经，具有降气止呕，消痰散结，通利血脉之功效；《神农本草经》认为它主治“结气，胁下满，惊悸；除水，去五脏间寒热，补中，下气”，《本草发明》则说“旋复花，消痰导饮、散结利气之味”;《本草纲目》还认为“旋复所治诸病，其功只在行水、下气、通血脉尔”；《医学人门》直接说它可“逐水，消痰，止咽噎”，由此旋覆花可以通过它的降气止呕、化痰散结、活血通脉的功效起到治疗食管癌的作用，在本发明中药中作为君药；当归，性温，味甘、辛，归肝、心、脾经，具有补血活血，调经止痛、润肠通便、下气止咳呕之作用。《神农本草经》认为它“味甘，温，主咳逆上气”；《药性论》说它可“止呕逆、虚劳寒热，破宿血”;《本草正》则说“当归，其味甘而重，故专能补血，其气轻而辛，故又能行血，补中有动，行中有补，诚血中之气药，亦血中之圣药也”；因此，当归和君药旋复花配合既可化痰活血起到散结消瘤的作用、又可降气止呕，同时又可以养血以补正气，缓解食管癌患者津枯血燥所致之便秘，在本发明中药中作为臣；黄连，味苦，性寒，归心、脾、胃、肝、胆、大肠经，具有泻火解毒、清热燥湿之功能，《神农本草经》认为它“味苦，寒，主治热气”，在本发明中，取其泻火解毒已消除痰瘀郁久所产生痰瘀毒、热毒，同时又以寒凉之性，制约旋复花、当归之温，使本发明中药寒热阴阳平和，为佐使药，三药配合，共凑降气化痰活瘀，清热解毒散结，抑制肿瘤生长之功能。
四
图I为本发明中药对Eca9706细胞生长的抑制作用时效关系(％ )图。 五具体实施例方式以下结合实际情况对本发明的具体实施方式
作详细说明实施例I本发明由重量计的旋覆花7份、当归4份、黄连3份制成，将旋覆花、当归、黄连粉碎，加入旋覆花、当归、黄连重量的10倍量体积浓度为98%的乙醇，室温下，时时振摇浸泡7天，过滤，得滤液，于45°C下旋转蒸发去除乙醇，再常规方法冷冻干燥成固态，粉碎。实施例2本发明由重量计的旋覆花8份、当归5份、黄连4份制成，将旋覆花、当归、黄连粉碎，加入旋覆花、当归、黄连重量的10倍量体积浓度为95%的乙醇，室温下，时时振摇浸泡7天，过滤，得滤液，于45°C下旋转蒸发去除乙醇，再常规方法冷冻干燥成固态，粉碎。实施例3本发明由重量计的旋覆花9份、当归6份、黄连5份制成，将旋覆花、当归、黄连粉碎，加入旋覆花、当归、黄连重量的10倍量体积浓度为85%的乙醇，室温下，时时振摇浸泡7天，过滤，得滤液，于45°C下旋转蒸发去除乙醇，再常规方法低温负压干燥成固态，粉碎。实施例4本发明由重量计的旋覆花10份、当归7份、黄连6份制成，将旋覆花、当归、黄连粉碎，加入旋覆花、当归、黄连重量的10倍量体积浓度为75%的乙醇，室温下，时时振摇浸泡7天，过滤，得滤液，于45°C下旋转蒸发去除乙醇，再常规方法低温负压干燥成固态，粉碎。本发明中药是基于食管癌病机，在整理和筛选古今治疗食管癌(噎膈)验方及实验室研究基础上此研发而成，具有降气化痰活瘀，清热解毒散结，抑瘤生长之功能，主治食管癌，中医辨证为痰气交阻、瘀血阻滞证，痰瘀互阻证兼热毒盛证等，本发明中药体内、外实验具有良好的抗食管癌作用，且毒性小，相关资料如下抗食管癌中药抑制肿瘤生长及急毒实验I. I 材料I. I. I 药物旋覆花,菊科植物欧亚旋覆花Inula britannica L.的干燥头状花序；黄连,毛茛科植物黄连Coptischinensis, Franch的根莖；当归，伞形科当归Angelica sinensis Diel的根；购于河南中医学院三附院，经河南中医学院中药鉴定专家鉴定为真品.1. I. 2细胞株人食管癌细胞株Eca9706购于中国医学科学院细胞中心。I. I. 3动物BALB/C(nu/nu)雌性裸小鼠，4_6周龄，由中科院上海实验动物中心/上海斯莱克实验动物有限公司提供。I. I. 4 主要试剂DMEM 高糖培养基(GIBCO)、胎牛血清(Hyclone)MTT(Sigma)I. I. 5主要仪器设备=Heraeus细胞培养箱(德国Kendro);倒置显微镜(ZESS)，紫外分光光度计(BioMate)，SG-603生物安全柜(Bake)，ELx800型酶标仪(BI0-TEK)，游标卡尺(上海量具刀刃厂)I. 2 方法I. 2. I药物提取中药旋覆花90g、当归60g、黄连50g，加入体积浓度为98_75 %的乙醇2000ml，室温下，时时振摇浸泡7天，过滤，得滤液，用旋转蒸发仪45°C浓缩至100ml，转移至蒸发皿，低温负压干燥，所得提取物置_20°C冰箱保存，备用，计算出制成的中药占生药的重量比为
4.5-6. 5%0I. 2. 2细胞培养生长于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于37°C、5% C02培养箱，每间隔48h更换一次培养基，试验时，细胞用消化液(含w = 0. 02%乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)和w = 0. 25%胰蛋白酶以I : I比例配制)进行消化，并接种于96孔板中或OlOO培养皿中。I. 2. 3裸小鼠饲养SPF级动物房，饲养的房间每2次/周紫外线照射，出入人员更换洁净工作衣，裸鼠食物、垫料进行湿热消毒后烘干使用，饮用水加入盐酸使PH在3-4之间，定期喂养消毒后的黄豆，一切严格无菌操作。I. 2. 4MTT法测定细胞生长抑制作用量效关系以1父104细胞/孔接种96孔平面培养板，于371，5% CO2，饱和湿度的CO2培养箱培养24小时。设对照组、中药组，每组3个复孔，药物剂量为12. 5 u g/ml、25 u g/ml、50 u g/ml、100 u g/ml,200 u g/ml，继续培养48小时，去除培养上清，每孔加入0. 5mg/ml的MTT 100ml，继续培养2小时，小心吸去上清，并加入100 u I DMSO溶解紫色沉淀，用酶标仪在波长为570nm(/630nm)，测定OD值，按公式抑制率(％ ) = (I-实验孔平均A570/630值/对照孔平均A570/630值)X 100%I. 2. 5MTT法测定细胞抑制作用实效关系选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞，用胰酶消化后，调至2. 5X IO4个/ml的细胞悬液，接种在96孔培养板中，200 u I/孔，37°C,5% CO2,培养24h，分别加入高(75%抑制率)、中(50%抑制率)、低剂量(25%抑制率)中药122 ii g/ml、77 ii g/ml、33 ii g/ml，每组6个复孔，分别于24h、36h、48h、72h检测，方法如上。I. 2. 6人食管癌细胞株Eca9706裸鼠移植瘤模型建立体外复苏、培养人食管癌细胞株Eca9706细胞，在细胞的指数生长期收集细胞，1000转/分离心，无血清DMEM培养基洗涤2次，计数，用不含血清的DMEM培养基，稀释至稀释至I. 5X IO6细胞/ml，以0. 2ml/鼠，右腋下皮下接种。30只裸小鼠，随机取6只为空白组，其余24只造模，造模裸小鼠随机分为4组，每组6只。4组分别为模型组、中药高剂量组、中剂量组、低剂量两组，根据生药和成品的比率、成人一天所用生药量及体外半数抑制率确定动物用药剂量，所有处理自造模后第二天开始高剂量组应用668mg/kg,中剂量组334mg/kg,低剂量组167mg/kg。每日一次,每只0. 2ml,自肿瘤长出之日起，每10天称体重，测量肿瘤大小，以上处理连续进行40天后，脱颈椎处死裸小鼠，剥离肿块。肿瘤大小和药物抑制率自肿瘤肉眼可见之日起，每10天用游标卡尺测量肿瘤的最长径L(mm)和垂直方向的最大横径W(mm),按李氏法V(mm3) = LXW2/2计算肿瘤体积,计算抑瘤率=(I-给药组平均瘤体积/对照组平均瘤体积)X 100%。1.2. 7急性毒性实验健康昆明种小鼠，雌雄各半，体重20±0.5g，郑州大学动物中心提供。
I. 2. 7. I半数致死量(LD50)的测定取小鼠50只，禁食12h，禁水2h，随机分为5(A B C DE)组，每组 10 只，灌服剂量分别为 5196mg/kg(A)、3111mg/kg⑶、1863mg/kg(C)、1116mg/kg(D)、668mg/kg(E),每只鼠每次灌胃0. 4ml,分别相当临床人日用量(折合成生药)的 233、140、84、50、30 倍。I. 2. 7. 2最大给药量测定动物数共20只，禁食12小时后给药，一次给药无法测出LD50，一日内连续两次给小白鼠灌胃给药5196mg/kg，每隔6小时一次，药后连续观察14天。I. 2. 8统计方法计量数据应用软件SpSS13. 0进行单因素方差分析，并应用该软件进行相关分析和曲线拟合。2.实验结果2. I中药对人食管癌细胞株Eca9706生长和形态的影响显微镜下观察，对照组细胞贴壁生长，细胞界限清楚，核分裂相明显，有伪足伸出；黄连组细胞呈条状，细胞轮廓非常明显，胞质极度粗糙，内充满多量颗粒状物质。2. 2中药对肿瘤细胞生长的影响中药可抑制人食管癌细胞株Eca9706细胞的生长，并且随药物浓度的增加，对细胞生长抑制呈现剂量-效应依赖关系(见表I)。表I中药对Eca9706细胞生长的抑制作用
药物浓度U g/ml)
药物剂量12. 52550100200
抑制率(％)_11. 81_28. 60 35. 26_55. 6598. 43应用概率法置信区间为95%计算半数抑制量(IC5tl) :76.84iig/ml，最高值为110. 25，最低值为 52. 95。2. 3中药对Eca9706细胞生长的抑制作用时效关系中药高、中、低剂量组可抑制人食管癌细胞株Eca9706细胞的生长，并且随时间而增加，对细胞生长抑制呈现时间-效应依赖关系，高剂量效果最好，中剂量效果次之(见图I)。2. 4中药对Eca9706移植瘤荷瘤裸鼠一般情况的影响整个实验过程各组动物都未出现死亡。模型组皮肤颜色枯槁无光泽，消瘦，精神委靡，弓背，余各组一般情况无太大差别，动物活动灵敏度由高到低依次为中剂量组> 高剂量组 > 低剂量 >模型组。2. 5中药对Eca9706移植瘤荷瘤裸鼠体重的影响20天之前各组小鼠体重接近，之后模型组体重随着时间增加而逐渐减轻，而各用药组缓慢增加，结果运用重复测量方差分析，所取各时间点因素交互作用有统计学差异(P=O. 0012)，除低剂量组外的各组与模型组比较差异均有统计学意义(P < O. 05)，高剂量和空白组和低剂量比有统计学意义(P < O. 05)，其他各组之间比较差异无统计学意义(P >
O.05)，(见表 2)。
表2中药对Eca9706移植瘤荷瘤裸鼠体重的影响
时间样品量(只)20天30天40天
空白组620·12±1·02 21·14±1·11 21·62±1·31
#
对照组619·23±0·98 18·76±0·72 17·21±1·12
高剂量621·46±1·21 20·66±1·32 20·16±1·23
#Θ
中剂量620·97±1·15 20·12±1·17 20·24±1·05
#Θ
620.16±0.85 19.68±1.25 19.71±1.28
低剂量* ☆注和对照组比较#ρ < O. 05，*ρ > O. 05 ;和空白组比较Θ ρ > O. 05，^p < O. 052. 6中药对Eca9706移植瘤增殖的抑制效果自接种至成瘤大约需要8天时间，瘤体在接种初期生长缓慢，接种32天左右时，瘤体快速生长，中药组高、中、低剂量组都有一定抑制肿瘤生长的作用，且具有一定剂量依赖性(见表3)。表3观察第20和40天的肿瘤体积和药物抑制情况)
■ ^iJ ( 0] 对照组(6只)高剂量(6只)中剂量组(6 ) 低剂量(6只)
日由20 OO nn-Loo on 21.86±15·71 36.08 ±21·24# 60.72±18·13
^天 82.00±29·20#Θ☆*
大74.56%5 6.00%25.95%
小40,, , co 66.29±27·81 96.78 ±32·15 142.58 ±38·46
抑天 212.23±46·63φ@Θ
制
68.76%54.40%32.81%注20天和对照组比较#p < O. 05，*p > O. 05 ;和低剂量组比较Θ ρ > O. 05，女ρ< O. 05。40天和对照组比较 p〈0. 01;和低剂量组比较 >0. 05, ip < O. 05。2. 7中药急性毒性实验结果半数致死量(LD50)的测定观察七天。结果动物无一死亡，没有引出半数致死量。最大给药量测定结果动物无一死亡，在第2次给药后，动物活动明显减少。但第2天后，动物就恢复正常活动。观察期间，除给药当天动物停止进食和有活动改变外，第2天起，动物恢复正常进食，活动也无异，体重有增长，毛色光亮，皮毛无疏松，口、眼、鼻、耳无异常分泌物，大小便正常。七天后处死动物，肉眼剖检心、肝、脾、肺、肾、胃肠等重要脏器，结果均未见异常改变。3.结论
3. I抗食管癌中药体外实验表现有很好的抗食管癌效应，并呈剂量和时间依赖性；3. 2抗食管癌中药能够很好抑制动物食管癌细胞移植瘤生长，呈剂量依赖性，对减弱肿瘤对动物的损伤，在体重和形态上对食管癌移植瘤动物有所改善；3. 3抗食管癌中药半数致死量未能测出；3. 4抗食管癌中药一日两次给药的最大给药量为5196mg/kg体重，按生药量计，相当于104g/kg体重,为临床用量的233倍,试验连续观察14天,动物无一死亡；3. 5抗食管癌中药有良好的抗食管癌作用，且毒性小，是治疗食管癌药物上的创新，有显著的临床意义。
权利要求
1.一种治疗食管癌的中药，其特征在于，由重量计的旋覆花7-10份、当归4-7份、黄连3-6份制成，将旋覆花、当归、黄连粉碎，加入旋覆花、当归、黄连重量的10倍量体积浓度为98-75%的乙醇，室温下，时时振摇浸泡7天，过滤，得滤液，于45°C下旋转蒸发去除乙醇，再常规方法冷冻干燥或低温负压干燥成固态，粉碎。
2.根据权利要求I所述的治疗食管癌的中药，其特征在于，由重量计的旋覆花7份、当归4份、黄连3份制成，将旋覆花、当归、黄连粉碎，加入旋覆花、当归、黄连重量的10倍量体积浓度为98%的乙醇，室温下，时时振摇浸泡7天，过滤，得滤液，于45°C下旋转蒸发去除乙醇，再常规方法冷冻干燥成固态，粉碎。
3.根据权利要求I所述的治疗食管癌的中药，其特征在于，由重量计的旋覆花8份、当归5份、黄连4份制成，将旋覆花、当归、黄连粉碎，加入旋覆花、当归、黄连重量的10倍量体积浓度为95%的乙醇，室温下，时时振摇浸泡7天，过滤，得滤液，于45°C下旋转蒸发去除乙醇，再常规方法冷冻干燥成固态，粉碎。
4.根据权利要求I所述的治疗食管癌的中药，其特征在于，由重量计的旋覆花9份、当归6份、黄连5份制成，将旋覆花、当归、黄连粉碎，加入旋覆花、当归、黄连重量的10倍量体积浓度为85%的乙醇，室温下，时时振摇浸泡7天，过滤，得滤液，于45°C下旋转蒸发去除乙醇，再常规方法低温负压干燥成固态，粉碎。
5.根据权利要求I所述的治疗食管癌的中药，其特征在于，由重量计的旋覆花10份、当归7份、黄连6份制成，将旋覆花、当归、黄连粉碎，加入旋覆花、当归、黄连重量的10倍量体积浓度为75%的乙醇，室温下，时时振摇浸泡7天，过滤，得滤液，于45°C下旋转蒸发去除乙醇，再常规方法低温负压干燥成固态，粉碎。
全文摘要
本发明涉及治疗食管癌的中药，可有效解决临床上治疗食管癌效果不佳，食管癌患者死亡率高的问题，其解决的技术方案是，由重量计的旋覆花7-10份、当归4-7份、黄连3-6份制成，将旋覆花、当归、黄连粉碎，加入旋覆花、当归、黄连重量的10倍量体积浓度为98-75%的乙醇，室温下，时时振摇浸泡7天，过滤，得滤液，于45℃下旋转蒸发去除乙醇，再常规方法冷冻干燥或低温负压干燥成固态，粉碎即可，制成的中药占生药的重量比为4.5-6.5%，本发明组方小，费用低，疗效确切，纯中药制剂，安全便捷，是治疗食管癌药物上的创新。
文档编号A61P35/00GK102614268SQ20121013182
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月28日 优先权日2012年4月28日
发明者刘学俊, 吴耀松, 尹素改, 陈玉龙, 马俊华 申请人:河南中医学院