专利名称：一种静脉注射用肝靶向白介素-12/壳聚糖纳米给药系统及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种靶向给药系统，具体涉及一种静脉注射用肝靶向白介素-12/壳聚糖纳米给药系统及其制备方法。
背景技术：
白介素-12 (Interleukin-12，IL-12)因其具有强大的抗肿瘤活性及抗转移作用而被广泛重视。然而，自从1997年报道了 2例在II期临床中静脉注射IL-12致死的病例以来(Leonard JP, et al. Effects of single-dose interleukin_12exposureon interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production.Blood. 1997; 90:2541-8) IL-12临床应用至今停止不前。多年来，各国科学家一直在寻找降低其毒副作用的有效方法。壳聚糖(Chitosan，CS)作为一种具有生物相容性、可降解性、低毒性的聚阳离子天然高分子材料，且具有理化性质的可修饰性，近年来成为生物治疗载体的研究热。近期有学者通过制备IL-12/壳聚糖纳米粒注射液，提高了 IL-12的生物利用率，成功抑制了小鼠膀胱内肿瘤的生长(Zaharoff DA, et al. Intravesicalimmunotherapy of superficial bladder cancer with chitosan/interleukin-12.Cancer Res. 2009;69:6192-9.)。但这种瘤内注射的给药方式仅限于部分可触及肿瘤的局部治疗，系统性给药仍然面临靶向性差、毒副作用大的风险。我国是肝脏疾病的高发区，因此研制新型肝靶向给药系统，可减少药物用量、降低毒副作用。肝靶向IL-12载体系统能通过肝内释放IL-12改善肝内免疫微环境，不仅能提高原发性肝癌的疗效，还能有效预防结直肠癌肝转移。肝靶向给药系统根据导向机理而论可分为被动靶向和主动靶向，前者指载药微粒被单核-巨噬细胞(尤其是肝的Kuffer细胞)摄取，通过正常生理过程运送到肝脏的治疗方法；而后者是指用“靶向分子”修饰的药物载体，如用去唾液酸糖蛋白受体介导的靶向药物。由于糖类分子能提高药物和肿瘤细胞的亲和力，有利于药物通过肿瘤细胞，因此壳聚糖作为一种多聚多糖阳离子，是肿瘤药物的最适宜载体之一。中国专利CN101254308A公布了用甘草次酸-聚乙二醇修饰壳聚糖纳米粒的制备方法，该发明充分利用甘草次酸的高度肝靶向性，通过不同位点对其亲水改性制备成大分子复合物，实现了肝靶向定位，但没有提供该复合载药的肝内药物释放效率的详细资料。中国专利CN101766820A公布了用三聚磷酸负离子、戊二醛交联壳聚糖纳米粒，再将叶酸连接到该载体上。中国专利CN102225051A利用了羧甲基壳聚糖的pH敏感性及叶酸的肿瘤靶向性，制备了叶酸-羧甲基壳聚糖修饰pH敏感性纳米多柔比星(Doxorubicin)纳米脂质体。这类复合载体均利用了羧甲基壳聚糖PH敏感性的特性，由叶酸类靶向分子实现了肿瘤靶向的目的，但不具有肝靶向定位的功效
发明内容
本发明的发明目的是提供一种静脉注射用肝靶向白介素-12/壳聚糖纳米给药系统，该载药系统根据被动肝靶向机制，筛选肝靶向性强的纳米球制备条件；利用修饰后纳米球的两性电解质性质制备pH敏感性载药系统。为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是一种静脉注射用肝靶向白介素-12/壳聚糖纳米给药系统，它是以肝靶向化合物多聚磷酸钠-壳聚糖为载体材料，交联包埋白介素-12 (IL-12)制成，纳米球粒径为200 500nm，载药率为2 25% ;所述壳聚糖的脱乙酰度彡80%。上述静脉注射用肝靶向白介素-12/壳聚糖纳米给药系统的制备方法，包括如下步骤(I)制备多聚磷酸钠-壳聚糖修饰白介素-12纳米球分别配制浓度为I 5 ii g/mL的白介素-12水溶液和浓度为I 5mg/mL的壳聚 糖醋酸溶液，壳聚糖的脱乙酰度彡80%，将上述两溶液以体积比I : 3 I : 6混匀，在磁力搅拌200 400r/min条件下,缓慢滴加浓度为0. 5 I. 6mg/mL的三聚磷酸钠水溶液,加入的三聚磷酸钠溶液的总体积为白介素-12水溶液体积的0. 5 4倍，获得白介素-12纳米球悬液；(2)将步骤(I)获得的悬液加入醋酸-醋酸钠缓冲液中混匀，所述悬液和醋酸-醋酸钠缓冲液的体积比I : I I : 3为，用冰乙酸调节pH值至5. 5 6. 5间，均匀交联后微孔滤膜过滤，配制成多聚磷酸钠化学修饰的白介素-12壳聚糖纳米球悬液。优选的技术方案，所述步骤(I)中，白介素-12水溶液的浓度为2iig/mL，壳聚糖醋酸溶液的浓度为2mg/mL，上述两溶液的体积比为I : 3，三聚磷酸钠水溶液的浓度为0. 84mg/mL，加入的三聚磷酸钠溶液的总体积为白介素-12水溶液体积的I. 2倍。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点I.本发明采用多聚磷酸钠对壳聚糖的表面进行修饰，减少了纳米粒表面的正电荷，阻止了与血液循环中富含负电荷的调理素的中和作用，延缓了单核巨噬细胞系统的清除，增加了纳米粒通过血液循环进入肝脏的机会，具有良好的肝靶向性；2.本发明合理选择了纳米球各组成成分的浓度和相互间的比例关系、纳米球的粒径，实验表明，获得的给药系统在PH6. 5条件下16小时后药物释放率>60%。
图I是实施例2中壳聚糖与三聚磷酸钠之间的比例对纳米球粒径的影响图。图2是实施例3中IL-12浓度对纳米球粒径的影响图。图3是实施例4中不同粒径FITC标记IL-12纳米球小鼠尾静脉注射24小时后体内分布情况。图4是实施例5中pH敏感性CS/TGF- ^ IsiRNA纳米药物缓释系统在不同pH条件下药物释放率。图5是实施例7中IL-12纳米球对小鼠CRC肝转移的影响。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述
实施例I :多聚磷酸钠-壳聚糖修饰IL-12纳米球制备分别配制浓度为2 u g/mL的IL-12水溶液ImL和浓度为2mg/mL的壳聚糖(脱乙酰度> 80%)醋酸溶液3mL，将上述两溶液混匀，在磁力搅拌200 400r/min条件下，缓慢滴加浓度为0. 84mg/mL的三聚磷酸钠I. 2mL,均匀交联后微孔滤膜过滤，配制成多聚磷酸钠化学修饰的IL-12壳聚糖纳米球悬液。
实施例2 :不同壳聚糖与三聚磷酸钠之间的比例对纳米球粒径的影响分别配制浓度为2 u g/mL的IL-12水溶液ImL和浓度为I 5mg/mL的壳聚糖醋酸溶液，壳聚糖的脱乙酰度> 80%，将上述两溶液混匀，在磁力搅拌200 400r/min条件下，缓慢滴加浓度为0. 5 I. 6mg/mL的三聚磷酸钠水溶液，均匀交联后微孔滤膜过滤，粒度仪检测不同壳聚糖与三聚磷酸钠之间的比例对纳米球粒径的影响，参见图I所示，其中，横坐标是壳聚糖与三聚磷酸钠的质量比。实施例3 :不同IL-12浓度对纳米球粒径的影响分别配制浓度为0. 5 10 ii g/mL的IL-12水溶液ImL和浓度为2mg/mL的壳聚糖(脱乙酰度> 80%)醋酸溶液3mL，将上述两溶液混匀，在磁力搅拌200 400r/min条件下，缓慢滴加浓度为0. 84mg/mL的三聚磷酸钠I. 2mL,均匀交联后微孔滤膜过滤，粒度仪检测不同IL-12浓度对纳米球粒径的影响，参见附图2所示。实施例4 :多聚磷酸钠修饰壳聚糖纳米球肝靶向性检测①不同粒经FITC-多聚磷酸钠-壳聚糖纳米粒制备称取IOmg异硫氰酸荧光素(FITC)，溶于IOmL无水乙醇中，在磁力搅拌条件下逐滴加入到20mL多聚磷酸钠-壳聚糖醋酸溶液(壳聚糖多聚磷酸钠分别为2 ；4 ；8 ;16)，避光反应使FITC上的碳原子与壳聚糖上的氨基反应以便进行标记。分别用纳米粒度仪检测纳米粒度。②动物实验小鼠尾静脉注射纳米悬液0. 2ml,用活体成像仪(KODAK In-Vivo Imaging System FX Pro)于不同时间检测纳米粒的组织分布和肝靶向性。③荧光测定法检测纳米粒组织分布。给药后分别于I、12和24hr，将小鼠处死，定量称取肝脏、肾脏、脾脏和和血液，加入9倍体积IM的HCI溶液离心，取上清液用荧光光谱测定仪(F — 4000型，HITACHI，Japan)测定荧光强度FI，用组织回收率R (Recovery ratio)和组织重量进行校正。Fsa、Fbl和Fst分别代表样品、空白对
照和标准对照的荧光强度；Cst和Csa分别代表标准对照和样品浓度。
权利要求
1.一种静脉注射用肝靶向白介素-12/壳聚糖纳米给药系统，其特征在于它是以肝靶向化合物多聚磷酸钠-壳聚糖为载体材料，交联包埋白介素-12制成，纳米球粒径为200 500nm，载药率为2 25% ;所述壳聚糖的脱乙酰度彡80%。
2.权利要求I所述静脉注射用肝靶向白介素-12/壳聚糖纳米给药系统的制备方法，其特征在于包括如下步骤 (1)制备多聚磷酸钠-壳聚糖修饰白介素-12纳米球 分别配制浓度为I g/mL的白介素-12水溶液和浓度为I 5mg/mL的壳聚糖醋酸溶液，壳聚糖的脱乙酰度彡80%，将上述两溶液以体积比I : 3 I : 6混匀，在磁力搅拌200 400r/min条件下，缓慢滴加浓度为0. 5 I. 6mg/mL的三聚磷酸钠水溶液，加入的三聚磷酸钠溶液的总体积为白介素-12水溶液体积的0. 5 4倍，获得白介素-12纳米球悬液； (2)将步骤(I)获得的悬液加入醋酸-醋酸钠缓冲液中混匀，所述悬液和醋酸-醋酸钠缓冲液的体积比I : I I : 3为，用冰乙酸调节pH值至5. 5 6. 5间，均匀交联后微孔滤膜过滤，配制成多聚磷酸钠化学修饰的白介素-12壳聚糖纳米球悬液。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(I)中，白介素-12水溶液的浓度为2 u g/mL,壳聚糖醋酸溶液的浓度为2mg/mL，上述两溶液的体积比为I : 3，三聚磷酸钠水溶液的浓度为0. 84mg/mL，加入的三聚磷酸钠溶液的总体积为白介素-12水溶液体积的I. 2 倍。
全文摘要
本发明公开了一种静脉注射用肝靶向白介素-12/壳聚糖纳米给药系统及其制备方法。所述给药系统是以肝靶向化合物多聚磷酸钠-壳聚糖为载体材料，交联包埋白介素-12制成，纳米球粒径为200～500nm，载药率为2～25%；所述壳聚糖的脱乙酰度≥80%。由三聚磷酸钠和壳聚糖交联制备纳米粒以包裹白介素-12，获得所述给药系统。本发明具有良好的肝靶向性；获得的给药系统在pH6.5条件下16小时后药物释放率>60%。
文档编号A61P35/00GK102641495SQ20121013839
公开日2012年8月22日 申请日期2012年5月7日 优先权日2012年5月7日
发明者王守立 申请人:苏州大学