包含获得自肋软骨的软骨细胞的人工软骨及其制备方法

专利名称：包含获得自肋软骨的软骨细胞的人工软骨及其制备方法
技术领域：
本发明涉及ー种包含获得自助软骨的软骨细胞的人工软骨及其制备方法。
背景技术：
关节软骨损伤是ー种非常常见的影响数百万人关节的问题。由于在这些组织中没有血管和缺少干细胞，成熟软骨的再生能力受到了限制。虽然扩大到软骨下骨的缺损会激发纤维或纤维软骨组织的形成，其还是将经受早期退化，因为该修复组织在生物化学和生物力学方面不同于透明软骨。已经开发了各种用于修复关节软骨缺损的临床处理，但成就有限。骨髄刺激方法(精细关节整形外科和钻孔关节整形外科)穿透软骨下骨，并刺激骨髄内的多能干细胞把 缺损修复成为纤维组织或纤维软骨。然而，这些方法具有如下缺点修复的纤维软骨缺乏如同正常透明软骨具有的生物化学和生物力学性质。更进一歩，对大面积缺损、骨关节炎和年老的病人，它们的作用也没有被证明。对于小尺寸的缺损，骨软骨/软骨的移植是简单和有效的，但是如果组织是从低重量部位向高重量部位移动，由于移植部位的非生理承重，将引起有害的压缩。骨膜和软骨膜移植具有引起新细胞集结的潜在益处，所述新细胞集结能够构造软骨，但也具有缺点透明样修复组织有通过软骨骨发生而钙化的趋势。此外，已经发展了几个基于细胞的利用软骨细胞、间充质干细胞(MSC)、骨膜细胞和软骨膜细胞的エ艺。成软骨祖细胞例如间充质干细胞、骨膜细胞和软骨膜细胞作为修复骨软骨缺损的潜在细胞源变得越来越流行。然而，所述祖细胞构造关节软骨细胞的能力是受限的，而且病人的年龄与临床结果直接相关。更进一歩，据报道该修复透明样组织有钙化的趋势。自体关节软骨细胞移植(ACT)已经被临床应用于关节软骨的小缺损，但仅有限的成就被报道。虽然关节软骨细胞可以被轻易地通过酶消化从成熟关节软骨中分离，但是采集和移植这两步需要侵入关节，并且是相当昂贵的。因此自体关节软骨细胞移植不能被应用到超过两个的小损伤、尺寸大于IOcm2的损伤、类风湿性或免疫相关的关节炎病人和由于随年龄增长关节软骨退化的老年病人。此外，仅关节软骨体积的百分之一到ニ是软骨细胞，其中对于培养物，大约2000细胞/mg人关节软骨可以被分离用于培养。对于自体关节软骨细胞移植步骤，如果以类似于正常人膝关节发现的细胞密度植入，平均3cm2的缺损需要9X IO6细胞。事实上，由于26%的年龄小于40的有IV级软骨软化损伤的病人具有多处损伤，自体关节软骨细胞移植需要更多的细胞。因此，为以类似于正常人关节软骨所示细胞密度来充分填充缺损的体积，需要大量的软骨细胞。在用于细胞扩充的连续单层培养期间，软骨细胞趋于停止表达软骨特异蛋白多糖和II型胶原，并转到表达产生少量蛋白多糖的I型胶原。这种去分化是限制体外细胞扩充和自体关节软骨细胞移植应用的主要问题。更进一歩，肋软骨是哺乳动物体内最大的永久透明软骨，其已经被建议作为关节软骨、外耳和气管的重构中用于自体移植的可能的替代供给源。肋软骨已经被用于修复小关节，例如拇指指节间关节和颞下颌关节中骨软骨的缺损。肋软骨作为供给组织看起来与关节软骨相比有几个优点。甚至在80岁或 更老的病人中也检测到了活动的增殖软骨细胞，而且小于60岁的病人有大量的肋软骨可用。另外，肋软骨是充足的，而且其容易的外科可及性允许对供体部位较小的损害。因此，如果肋软骨具有与关节软骨的透明软骨相同的表现型，它可以被认为是用于治疗各种关节软骨紊乱病最有益的来源，例如类风湿性关节炎、骨关节炎和关节软骨缺损。然而，迄今为止，仅进行了移植肋软骨本身到关节软骨部分的自体组织移植，还没有尝试从肋软骨分离软骨细胞通过组织工程方法来再生关节软骨。此外，单独软骨细胞或软骨形成细胞的移植已经被证明在兔模型中是成功的，但由于移植细胞存活力的损失和在缺损部位固定软骨细胞的困难，治愈率是有限的。为克服与外科步骤相关的困难和找到保持软骨细胞于缺损部位不在关节腔内外流的方法，已经研究了新的作为支架的不同生物材料载体方法，细胞被接种到所述支架上。理想的支架将是生物相容的、生物可吸收的或可塑的，并且提供促进新组织生长的骨架。它们还应该显示与关节软骨功能相容的材料和机械性能。各种生物材料，自然产生的例如基于胶原的生物材料；1和II型胶原或胶原/葡萄糖胺聚糖(GAG)复合物和合成的例如聚こ醇酸(PGA)和聚乳酸(PLLA)，或它们的复合混合物，PLGA (聚D，L-乳酸-こ醇酸共聚物)，已经被弓I入作为软骨修复的潜在的细胞载体物质。它们在体外和体内实验中都显示了，软骨特异的细胞外基质(ECM)组分例如II型胶原和GAG在调节软骨细胞表现型的表达和支持软骨形成中起到了关键的作用。壳聚糖是几丁质的碱性去こ酰化产品，是去こ酰程度和分子量不同的聚-D-葡糖胺单元的族。许多研究者建议壳聚糖可能被考虑作为用于结缔组织修复的结构生物材料，因为其结构类似于在细胞外基质中发现的GAG。壳聚糖和某些它的降解产品可以用于关节液体组分的合成，例如软骨素、硫酸软骨素、硫酸肤质素、硫酸角质素和透明质酸(HA)。这些物质是软骨营养所必需的。事实上，壳聚糖是聚阳离子的，其结构类似于透明质酸，所述透明质酸是关节软骨细胞外基质的重要分子，对软骨组织工程具有特别的重要性。最近已经评论了基于壳聚糖的间质在透明软骨的组织工程中的用途。Lahiji et al. (2000)报道了，在壳聚糖薄膜上培养的软骨细胞保持了分化表现型并表达软骨特异的细胞外基质蛋白质例如I I型胶原和硫酸蛋白多糖。壳聚糖用于强化新软骨形成的研究已经掲示了，当生长在壳聚糖薄膜上时，壳聚糖具有促进软骨细胞表现型维持和软骨特异细胞外基质组分生物合成的能力(Lahiji et al. 2000) 0壳聚糖还表现为强化骨祖细胞分化和加强骨形成。透明质酸在许多生物进程中起重要作用，例如组织水合作用、在细胞外基质中的蛋白多糖(PG)机化和细胞分化。它还是健康关节软骨的组成部分。Patti et al. (2001)报道了透明质酸在体外改善基质粘附能力和人软骨细胞的增生活性。透明质酸还在关节炎早期改善临床功能(Patti et al. ,2001)。更进一歩，对于结缔组织细胞和间充质干细胞，成纤维细胞生长因子(FGF)是强促细胞分裂剂(J.Cell Biol. 100,477-485，1985)。在细胞扩充期间，成纤维细胞生长因子抑制F肌动蛋白结构的形成，以维持关节软骨细胞的软骨形成潜力。(Exp. Cell Res. 253,681-688，1999)。并且，成纤维细胞生长因子已知在许多有丝分裂中维持间充质干细胞的多方矣分化(multifamily differentiation)。
发明概要首先，本发明的发明人已经研究了获得自助软骨的软骨细胞是否可以用作组织エ程人工软骨的细胞源。并且，他们已经研究了解决问题的方法，所述问题为由于在传代期间的去分化，软骨细胞趋于失去软骨细胞表现型。更进一歩，他们还继续评价了接种肋软骨细胞的基于壳聚糖的支架是否可以被用于关节软骨再生。结果，他们发现获得自助软骨的软骨细胞与获得自关节软骨的软骨细胞相比，更适合作为软骨修复的供体细胞源。并且，通过在分化可诱导培养基中将它们再分化成为期望的细胞他们发现在传代期间去分化的软骨细胞显示间充质干细胞性质，以证实它们用作细胞治疗剂以及人工软骨的能力。另外，本发明人证实加载软骨细胞的基于壳聚糖的支架，当被移植到关节缺损时，显示了有效的关节再生，以实现本发明。因此，本发明的目地是提供一种包含间充质干细胞样去分化细胞的人工软骨及其 制备方法，所述去分化细胞通过传代肋软骨细胞获得。


图I显示关节软骨细胞(AC)和肋软骨细胞(CC)体外细胞扩充能力的比较。图2和3显示关节软骨细胞和肋软骨细胞在各自的传代中的形态变异和II型胶原的表达。图4显示在P7的肋软骨细胞形态学，图5和6显示I、II型胶原和平滑肌肌动蛋白(SMA)抗体的表达。图7显示在达尔伯克改良伊格尔培养基-胎牛血清(DMEM-FBS)、间质干细胞生长培养基(MSCGM)和间质干细胞生长培养基-成纤维细胞生长因子(MSCGM-FGF)中的细胞扩充率。图8和9分别显示在DMEM-FBS、MSCGM和MSCGM-FGF中培养的细胞的I型胶原、II型胶原和平滑肌肌动蛋白抗体表达。图10显示番红精-O对葡萄糖胺聚糖染色的結果，以确认在DMEM-FBS、MSCGM和MSCGM-FGF中细胞培养物分化为软骨细胞的情況。图11显示P7肋软骨细胞在软骨分化培养基中以团块形式，再分化为软骨的結果。图12显示番红精-O对葡萄糖胺聚糖染色的結果，以证实分化为软骨细胞。图13显示作为成骨分化初始标记物的细胞中的碱性磷酸酶的表达，所述细胞被诱导以分化为成骨细胞，图14显示作为成骨细胞分化标记物的茜红染色的結果。图15显示油红O对细胞中脂类小滴染色的結果，所述细胞被诱导分化为脂肪细胞。图16显示通过肋软骨细胞加载的基于壳聚糖的支架来修复关节软骨缺损的方法。图17为通过MTT分析显示在胶原-葡萄糖胺聚糖海绵(COL-GAG)、壳聚糖海绵(CS)和透明质酸包被的壳聚糖海绵(CS-HA)中软骨细胞生长率的比较。图18显示前胶原I型C-肽(PIP)和GAG的测量結果。
图19显示苏木精和伊红(H & E)染色后的细胞形态。图20显示通过番红精-O染色和固绿染色显示葡萄糖胺聚糖的累积量。图21和22分别显示对I型胶原和II型胶原免 疫染色的結果。图23显示关节软骨缺损的修复组织的总体外观。图24到26显示光学显微镜下关节软骨缺损的修复组织。图27显示对在关节软骨缺损的修复组织中葡萄糖胺聚糖分布，用番红精-O染色的結果。图28显示对关节软骨缺损的修复组织中的I型和II型胶原，用免疫染色的結果。图29是人工软骨的目视图片，所述人工软骨来自于在软骨形成培养基中加载于基于壳聚糖的支架上的间充质干细胞样去分化的细胞。图30显示对在软骨形成培养基中再分化的软骨细胞内的葡萄糖胺聚糖，用番红精-O染色的結果。图31是兔关节软骨缺损在移植间充质干细胞样去分化的加载于基于壳聚糖的支架上的细胞6周后的目视图片。

发明内容
第一，本发明涉及ー种包含间充质干细胞样去分化细胞的人工软骨，所述去分化细胞通过传代肋软骨细胞获得。优选，肋软骨细胞在MSCGM中传代，特别是，包含成纤维细胞生长因子(FGF)的MSCGM更有利于细胞扩充及分化为软骨。第二、本发明涉及ー种包含再分化软骨细胞的人工软骨，所述再分化软骨细胞通过在软骨形成培养基中培养间充质干细胞样去分化细胞获得。在ー个具体方案中，间充质干细胞样去分化细胞是在软骨形成培养基中聚集培养的。第三，本发明涉及ー种人工软骨，其中软骨细胞被加载到基于壳聚糖的支架上。所述基于壳聚糖的支架优选选自壳聚糖海绵；包含转化生长因子-β (TGF-β)的壳聚糖海绵；透明质酸(HA)包衣的壳聚糖海绵；硫酸软骨素包衣的壳聚糖海绵和壳聚糖-胶原复合海绵。更优选，基于壳聚糖的支架是透明质酸包衣的壳聚糖海绵或透明质酸包衣的壳聚糖-胶原复合海绵。第四，本发明涉及一种制备人工软骨的方法，包括传代肋软骨细胞以获得间充质干细胞样去分化细胞的步骤。在ー个具体方案中，将肋软骨细胞在MSCGM或包含成纤维细胞生长因子的MSCGM中传代。在另ー个具体方案中，通过传代肋软骨细胞获得的间充质干细胞样去分化细胞通过在软骨形成培养基中培养来再分化，优选通过在软骨形成培养基中聚集培养。在另ー个具体方案中，该方法包括加载间充质干细胞样去分化细胞到基于壳聚糖的支架的步骤。第五，本发明涉及ー种包含间充质干细胞样去分化细胞的细胞治疗剂，所述去分化细胞通过传代肋软骨细胞获得。在ー个具体方案中，该细胞治疗剂包含再分化软骨细胞，所述再分化软骨细胞通过在软骨形成培养基中培养间充质干细胞样去分化细胞获得。在另ー个具体方案中，该细胞治疗剂包含成骨细胞，所述成骨细胞通过在成骨培养基中培养间充质干细胞样去分化细胞获得。在另ー个具体方案中，该细胞治疗剂包含脂肪细胞，所述脂肪细胞通过在脂肪形成培养基中培养间充质干细胞样去分化细胞获得。
下面，本发明被更详细的解释。在自体关节软骨细胞移植中对于关节软骨修复的主要技术限制是不在膝关节承受重量的供体软骨具有低的细胞生长量，和按照在体外细胞扩充期间的软骨细胞去分化，难以获得合适数量的软骨细胞用于覆盖软骨缺损。另外，自体关节软骨细胞移植应用的成功受到患者年龄和供体部位有限的限制。因此，在本发明中，首次评估肋软骨是否可以用作自体关节软骨细胞移植的供体细胞源，所述肋软骨在其存在期间保持较长的生长量而且在体内有较大的供体组织。首先，基于原始细胞产量、细胞扩充率和去分化，评价分离自助软骨的软骨细胞是否可以用作组织工程关节软骨的潜在细胞源。特别的，在本发明中，将获得自助软骨的软骨细胞的原始细胞产量和在单层培养中的细胞扩充率与从关节软骨获得的软骨细胞进行比较。另外，通过细胞形态和II型胶原的表达来评估体外细胞培养期间的去分化率。结果，肋软骨的原始细胞产量是关节软骨的2. 6倍。在体外细胞培养期间，肋软骨细胞(CC)与关节软骨细胞(AC)相比生长更快，而且细胞扩充至P4的速度大约是关节软骨 的3倍。在连续培养期间，关节软骨细胞和肋软骨细胞包逐渐地失去它们的软骨细胞表现型，相反转变为成纤维细胞样细胞，而且II型胶原的表达減少。肋软骨细胞与关节软骨细胞相比它们原始表现型丢失得更快。比较相同的传代数，肋软骨细胞与关节软骨细胞相比去分化更快。由来自相同兔的关节软骨细胞和肋软骨细胞的比较代表的首次培养的结果显示肋软骨能用作骨关节炎修复的潜在细胞源，所述第一培养物的结果具有按照体外细胞扩充传代的去分化和生长分布图。在进ー步研究中，本发明人证实通过传代肋软骨获得的去分化细胞具有间充质干细胞的性质。间充质干细胞是软骨形成祖细胞，意味着可以作为用于修复骨软骨缺损的潜在细胞源。因此，在本发明中，首先公开了获得自助软骨细胞的间充质干细胞样去分化细胞是软骨形成祖细胞，所述软骨形成祖细胞能被用于骨软骨缺损的修复。根据本发明的间充质干细胞样去分化细胞能分化为成骨细胞和脂肪细胞以及软骨细胞。因此，在本发明中，术语“间充质干细胞样去分化细胞”指通过传代去分化的和具有分化为软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞等等的潜能的细胞，如间充质干细胞。也就是说，这个术语指多能细胞。在进ー步的研究中，本发明人公开当肋软骨细胞特别是在包含成纤维细胞生长因子的MSCGM中传代时，细胞扩充率是显著的，向软骨细胞的分化是优秀的。可以预料，如果向其中添加成纤维细胞生长因子，包含DMEM的正常细胞培养基可以具有相同的結果。此外，在本发明中，作为用于加载软骨细胞的支架，基于壳聚糖的支架，特别是海绵形态的透明质酸包衣的壳聚糖支架被用于评价被加载到透明质酸包衣的壳聚糖复合支架上的培养自体肋软骨细胞，在修复动物模型中承受重量位置的全层关节软骨缺损的作用。兔膝模型已经被广泛应用于软骨修复的评估，4至6个月龄的兔髌骨凹槽中全层3mm直径的软骨缺损在6至8周之内自然痊愈。因此，需要这个时期掲示表面上愈合软骨的大多数退化故障。在如下的设计动物模型试验中(4_直径骨软骨的缺损)，可以表明，根据本发明在基于壳聚糖的支架内的自体肋软骨细胞非常有效的修复了在承受重量位点的全层关节软骨缺损。
以下，本发明将參考下述实施例被更详细的描述，但本发明的范围将不会被解释为借此以任何方式限制。
具体实施例方式实施例实施例I :评价肋软骨细胞是否可以作为修复关节软骨的供体细胞源材料和方法软骨细胞的分离从3至4个月大的新西兰白兔中获得关节软骨和肋软骨，然后称重。为了采集肋软骨，动物被通过静脉注射甲苯噻嗪盐酸盐(2mg/kg体重,Rompun,Bayer,Korea)和氯胺酮盐酸盐(6-10mg/kg体重，ketalar, Yuhan Co. , Korea)的混合物麻酔。将胸部附近的皮肤刮净，用酒精清洗，并用聚维酮碘溶液备皮。打开右胸的背侧，暴露第9和第10肋软骨，在移除软的粘附组织之后，称重肋软骨。这些软骨被切碎为1-2_3的块，并在D-PBS (Dulbecco' s 磷酸盐缓冲盐水；Jeil Biotech services Inc. , Taegu, Korea)中漂洗3次。漂洗后，将切碎的软骨在多酶鸡尾酒溶液37°C和5% CO2条件下消化整夜，所述多酶鸡尾酒溶液包括胶原酶D(2mg/ml,Roche Diagnostic GmbH,Germany),透明质酸酶(lmg/ml,Roche),和脱氧核糖核酸酶(O. 75mg/ml, Roche)。将所述溶液通过53 μ m的尼龙网孔,分离的细胞用补充有10%胎牛血清(FBS ；Hyclone technologies, U. S. A.)和I %青霉素/链霉素/两性霉素B鸡尾酒(Gibco)的DMEM(Dulbecco' s Modified Eagle Medium ;Gibco Life Technologies,Grand Island, NY, U. S. A.)洗涤2次，活细胞在血球计上基于锥虫蓝排除法计数。细胞以5 X IO5细胞/IOOmm直径平皿的细胞密度接种，每隔一天更换培养基，每次更换时添加新配制的50 μ g/ml的L-抗坏血酸(Sigma, St. Louis, MO, U. S. A.)。汇合的原生细胞传代培养直到P4。MTT 分析将各自传代的关节软骨细胞和肋软骨细胞以I X IO5细胞每孔的细胞密度种植到6孔培养平板上培养5天。细胞的生长根据MTT分析测定(Mosman T. Rapid colormetricassay for cellular growth and survival， application to proliferation andcytotoxicity assays, J. Immunol. Methods 1983 ；65 :55-63) 为了以光密度(0. D.)校准细胞数目，在I到8X105细胞范围内绘制标准曲线，将光密度被转化为细胞数目。II型胶原的免疫荧光染色对于免疫荧光染色，将各自传代的软骨细胞铺板在盖玻片上，培养2天，用3.7%福尔马林磷酸盐缓冲盐水固定10分钟，并用O. 2% Triton X-100磷酸盐缓冲盐水透化。用20%正常山羊血清培养透化细胞以阻断非特异性反应并以单克隆抗II型胶原抗体(monoclonal anti-mouse antibody ；Chemicon Internationa丄 Inc. , Temecula, CA,U.S.A.)作为初级抗体。以标记了异硫氰酸荧光素(FITC)的山羊抗鼠IgG结合物(VectorLab.，Burlingame, CA，U. S. A.)作为第二抗体，盖玻片用4'，6 ニ脒基-2-苯吲哚(DAPI ；I g/ml ；Sigma Chemical Co.，St. Louis, MO, U. S. A.)培养 5 分钟用于核染色。细胞在突光显微镜下观察(Olympus Optical Co. , Japan)。统计用不配对t检验进行统计分析，以确定各试验中的变量是否具有显著性差异(P<O. 05)。结果分离自关节软骨和肋软骨的软骨细胞的原始细胞产量和细胞扩充率的比较为了寻找成人体内适合自体软骨细胞移植的供体部位，对分离自关节软骨和肋软骨的软骨细胞产量进行比较(表I)。表I.分离自关节软骨和肋软骨的软骨细胞原始细胞产量的比较
权利要求
1.ー种人工软骨，包含通过肋软骨细胞传代获得的间充质干细胞(MSC)样去分化细胞。
2.如权利要求I所述的人工软骨，其中所述间充质干细胞样去分化细胞是通过在MSCGM或包含成纤维细胞生长因子(FGF)的MSCGM中传代肋软骨细胞获得的。
3.如权利要求I或2所述的人工软骨，其包含通过在软骨形成培养基中培养所述间充质干细胞样去分化细胞获得的再分化软骨细胞。
4.如权利要求3所述的人工软骨，其中所述再分化软骨细胞通过在软骨形成培养基中聚集培养所述间充质干细胞样去分化细胞获得。
5.如权利要求3所述的人工软骨，其中所述软骨细胞被加载到基于壳聚糖的支架上。
6.如权利要求5所述的人工软骨，其中所述基于壳聚糖的支架选自壳聚糖海绵；包含转化生长因子-β (TGF-β)的壳聚糖海绵；透明质酸(HA)包衣的壳聚糖海绵；硫酸软骨素包衣的壳聚糖海绵；和壳聚糖胶原复合海绵。
7.ー种用于制备人工软骨的方法，包括传代肋软骨细胞以获得间充质干细胞样去分化细胞的步骤。
8.如权利要求7所述的方法，其中将所述肋软骨细胞在MSCGM或包含成纤维细胞生长因子的MSCGM中传代。
9.如权利要求7或8所述的方法，其包含在软骨形成培养基中培养所述间充质干细胞样去分化细胞以获得再分化软骨细胞的步骤。
10.如权利要求9所述的方法，其包含在软骨形成培养基中聚集培养所述间充质干细胞样去分化细胞以获得再分化软骨细胞的步骤。
11.如权利要求7或8所述的方法，其包含加载所述间充质干细胞样去分化细胞到基于壳聚糖的支架上的步骤。
12.—种细胞治疗剂，包含通过传代肋软骨细胞获得的间充质干细胞样去分化细胞。
13.如权利要求12所述的细胞治疗剂，其包含通过在软骨形成培养基中培养所述间充质干细胞样去分化细胞获得的再分化软骨细胞。
14.如权利要求12所述的细胞治疗剂，其包含通过在成骨培养基中培养所述间充质干细胞样去分化细胞获得的成骨细胞。
15.如权利要求12所述的细胞治疗剂，其包含通过在脂肪形成培养基中培养所述间充质干细胞样去分化细胞获得的脂肪细胞。
全文摘要
本发明涉及一种包含间充质干细胞(MSC)样去分化细胞的人工软骨及其制备方法，所述去分化细胞通过传代培养肋软骨细胞获得。
文档编号A61L27/38GK102688524SQ20121014561
公开日2012年9月26日 申请日期2006年10月31日 优先权日2005年10月31日
发明者孙英淑, 李定宣, 李殷坰, 李珍妍 申请人:庆熙大学校产学协力团, 株式会社现代组织工学, 韩国原子力医学院