鸦胆子油乳治疗子宫内膜异位囊肿的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了囊内穿刺注入鸦胆子油乳治疗子宫内膜异位囊肿的方法。本发明的试验结果表明，鸦胆子治疗子宫内膜异位囊肿是可行的，鸦胆子油乳能抑制子宫内膜组织中VEGF、COX-2的表达，上调caspase-3的表达，促进异位内膜细胞的凋亡。超声介入硬化剂治疗子宫内膜异位囊肿，鸦胆子油乳与无水酒精比较，鸦胆子油乳毒副作用小、安全性高，其可促使胶原纤维合成，解决了无水酒精易外渗，使患者疼痛短期加重的缺点，且鸦胆子油乳具有清热解毒作用，可预防或减轻盆腔粘连。因此在介入治疗子宫内膜异位囊肿的研究中，本发明具有较高的应用价值。
【专利说明】鸦胆子油乳治疗子宫内膜异位囊肿的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及中药鸦胆子，及其囊内给药治疗子宫内膜异位囊肿模型大鼠的可能性实验，本发明还涉及该中药囊内注射给药的方法，属于妇科疾病的中药治疗领域。
【背景技术】
[0002]子宫内膜组织出现在子宫体以外部位时称为子宫内膜异位症(endometriosis，EMT)。内异症虽为良性病变，但具有类似恶性肿瘤远处转移和种植生长能力。异位内膜最常见的种植部位是盆腔脏器和腹膜，其中以侵犯卵巢者最常见，卵巢内的异位内膜可因反复出血而形成单个或多个囊肿，称为卵巢子宫内膜异位囊肿(ovarian endometrial cyst,0EC)。子宫内膜异位囊肿属于中医癥瘕的范畴。
[0003]西医卵巢子宫内膜异位囊肿的治疗目前主要包括药物治疗和手术治疗两大类。药物治疗主要用于轻、中度的卵巢子宫内膜异位囊肿患者以及重度卵巢子宫内膜异位囊肿患者的手术前准备及手术后的巩固治疗，其只能缓解卵巢子宫内膜异位囊肿引起的疼痛，在一定程度上缩小病灶，延缓术后的复发，但对不孕患者的生育能力似乎无明显改善。手术治疗是治疗卵巢子宫内膜异位囊肿最有效的方法，可切除病灶、分离粘连、阻断盆腔痛觉传导通路、重建正常的盆腔解剖结构、恢复盆腔环境、缓解或消除症状，促进生育。适用于药物治疗后症状无缓解、局部病变加剧或生育功能未能恢复者；卵巢子宫内膜异位囊肿直径>5cm且迫切希望生育者。但手术创伤大，恢复慢，费用高，保留生育手术复发性高，根治性手术会出现更年期表现等。
[0004]目前超声介入硬化剂治疗子宫内膜异位囊肿正逐渐受到重视，可以在很大程度上避免药物治疗和手术治疗中的诸多不利因素。但目前巧囊的囊内治疗药物较单一，治疗卵巢囊肿所用的硬化剂国内大多采用无水酒精。酒精治疗囊肿的疗效肯定，临床应用较广泛。但同时超声介入无水酒精治疗子宫内膜异位囊肿存在以下缺点:如过敏反应、脸红、醉态等；局部刺激性较强，治疗前需先注入I %利多卡因表面麻醉囊壁，否则患者将难以忍受；注入无水酒精后短期内可使囊液急性渗出，患者短期内症状会加重；而且对酒精过敏者也不能采用此种介入疗法。因此超声介入硬化剂治疗子宫内膜异位囊肿的方法也有待改进。
【发明内容】
[0005]本发明首先所要解决的技术问题是改进现有超声介入硬化剂治疗子宫内膜异位囊肿的不足，提供囊内穿刺注入鸦胆子油乳治疗子宫内膜异位囊肿的实验研究方法及结果O
[0006]本发明所要解决的上述技术问题是通过以下技术方案来实现的:
[0007]本发明鸦胆子的选择是基于国内学者近年对其研究的结果。鸦胆子(Bruceajavanica)为苦木科植物鸦胆子的干燥成熟果实，含生物碱、有机酸、鸦胆子油、甙类及酚性物。其功能清热解毒、止痢截疟、腐蚀赘疣、软坚散结。鉴于发明人对子宫内膜异位囊肿发病机理的研究及其治疗原则的研究，同时依据发明人多年临床经验和药理学研究成果，筛选出鸦胆子。鸦胆子的活血化瘀之功能也符合从瘀血论治癥瘕之思想。并且大量动物实验及临床证实:鸦胆子油乳为细胞周期非特异性抗癌药，鸦胆子油乳可吸附在肿瘤细胞表面，破坏细胞结构，使细胞变性、坏死、使囊壁粘连，以治疗肿瘤。故本研究假设鸦胆子油乳可以代替无水酒精，通过卵巢子宫内膜异位囊肿囊内穿刺注入鸦胆子油乳，会使药物更接近病灶，不仅达到治疗子宫内膜异位囊肿的目的，同时副作用低、患者易于接受，进一步为中医药治疗卵巢子宫内膜异位囊肿提供理论依据。
[0008]本发明所用到的鸦胆子油乳可直接购得，其规格符合国家中药材标准。
[0009]本发明的实验动物:清洁级健康雌性SD大鼠40只，未交配生育，体重180+10g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。动物以颗粒饲料喂养，饲料及垫料由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。
[0010]本发明实验动物模型的选择与建立:卵巢子宫内膜异位囊肿至今为止病因病机尚不明确，因此动物模型的建立对本病的研究及治疗有着十分重要的作用，早在20世纪20年代，就有学者成功的将自体子宫内膜移植到家兔的腹腔，为子宫内膜异位囊肿的实验动物学研究奠定了基础。但家兔并不适合作为子宫内膜异位囊肿的动物模型，因其与人类生理不同，无月经周期，无自发性排卵。近年来许多动物都被应用于子宫内膜异位囊肿模型的建立，如大鼠、小鼠、猕猴等。
[0011]除人类外只有非人灵长类动物有周期性月经，是最为理想的子宫内膜异位囊肿动物模型，如猕猴、狒狒等。但此类动物价格昂贵、数量有限、观察周期长、饲养条件高，因此限制了其在科研领域的应用。小鼠体型小巧，繁殖能力强，免疫缺陷小鼠对异体病灶种植研究有着十分重要的意义，但小鼠因体型小，难以耐受多次手术及采血，免疫缺陷小鼠饲养条件高，也限制了其应用。大鼠性成熟早，动情周期频发，繁殖周期短，生命力强，价格低易于造模，因此可用于子宫内膜异位囊肿对妊娠、排卵、粘连形成及自身免疫等方面的影响，药物对子宫内膜异位囊肿的作用等，因此子宫内膜异位囊肿的动物实验研究多用大鼠作为实验动物模型。
[0012]本发明通过外科自体移植法复制大鼠子宫内膜异位囊肿动物模型，此种方法模拟了异位病灶侵袭生长的特征。理论上大鼠在动情期子宫充血水肿、内膜增厚，此时进行造模将提高动物模型的成功率。但需连续通过阴道涂片观察大鼠生理周期，并分批手术，导致后续给药、观察、取材等不同步，并延长实验周期。因此在造模前给予雌激素，将使非动情期的造模成功率与动情期差异减小。
[0013]本实验中分子指标的选择:抗调亡蛋白Livin和促调亡蛋白Smac在细胞调亡中存在着相互拮抗和相互调节的关系。
[0014]发明的具体实验实施方式
[0015]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0016]发明的具体实验实施步骤
[0017]1.动物模型制备方法
[0018]采用外科自体移植的方法:术前三日给予腹腔注射苯甲酸雌二醇0.lml/kg/d。术前禁食12小时，用1%戊巴比妥(40mg/kg)腹腔麻醉，腹部备皮，常规消毒铺巾以保持手术中的无菌条件，腹中线耻骨联合上Icm处做纵行切口，切口约2-3cm，钝镊找到并分离出大鼠右侧子宫，在右侧子宫靠近输卵管处及两侧子宫交接处分别结扎两端，剪下中间的一段子宫，迅速置于盛有生理盐水的培养皿中，沿系膜部位剪开管状子宫，分离子宫内膜与肌层，切割成6mmX6mm大小的子宫片两片。然后分别将两片子宫片粘膜层正对于右侧腹壁，用无损伤缝线缝四角分别固定于右腹壁上下两侧，固定位置尽量远离腹部切口，以减少粘连并防止再次开腹时损伤种植的异位内膜。逐层连续缝合腹部切口，常规关腹。注意观察大鼠的呼吸、心跳，待其自然苏醒。术后腹腔注射庆大霉素(0.2ml/天)3天预防感染。术后第2天开始腹腔注射苯甲酸雌二醇0.lmg/(kg.d)，每日一次共3次，以促进异位内膜生长。
[0019]2.模型鉴定、分组及给药方法
[0020] 按照随机数字表法将40只SD大鼠按照随机数字表法分为空白组、模型组，鸦胆子油乳组和无水酒精组各10只，除空白组外，其余各组大鼠雌二醇腹腔给药3天后，采用外科自体移植术复制建立大鼠子宫内膜异位囊肿的动物模型，造模5周后每组随机抽取I只动情期大鼠开腹观察组织形态及病理学改变，若见移植子宫内膜外观隆起，体积增大，形成内有透明或淡黄色液体积聚并有血管形成的透明小囊泡，HE染色观察组学病理学可见子宫内膜上皮细胞、腺体及内膜间质，并可见核下空泡分泌活动及脱落现象，则证实造模成功。
[0021]空白组不给予任何干预；模型对照组造模成功后不给予任何治疗；鸦胆子油乳组造模术后5周择动情期第二次剖腹，穿刺放出巧囊内液体后囊腔内注射同体积鸦胆子油乳；无水酒精组造模术后5周择动情期第二次剖腹，穿刺放出巧囊内液体后囊腔内注射同体积无水酒精。各组在给药前均将右腹壁异位病灶及盆腔周围组织情况拍照保存。
[0022]3.取材方法
[0023]各组给药3周后择动情期，经眼静脉取血，血液经离心后取血清分装，于-80°C冰箱内保存待用。而后脊椎脱白法处死，将右腹壁异位病灶及周围组织外观拍照保存。然后切取异位病灶，空白对照组切取右侧正常子宫组织，将组织放置于10%福尔马林溶液中充分固定，常规脱水、石蜡包埋、切片，以备组织形态学检查及免疫组化检测。
[0024]4.阴道涂片观察大鼠动情期方法
[0025]将无菌小棉签用生理盐水浸润后轻柔的旋转插入大鼠阴道内，并在阴道内沿同一方向轻轻转动几次后取出，涂于干净的载玻片上，自然风干后用瑞氏染料染色，光学显微镜下观察，大鼠性周期各阶段阴道涂片特点如下:
[0026]发情前期:阴道分泌物中大部分为膨大椭圆形扁平上皮细胞。此期约持续17-21小时，当日下午出现排卵前促性腺激素高峰，从傍晚到深夜，此期结束。
[0027]发情期:膨大的上皮细胞核消失，成为无核角化细胞或见少量上皮细胞，镜下好象许多落叶堆叠在一起。在情前期过渡到发情时(即深夜)发生排卵，此时大鼠的发情行为达高峰，此期约持续9-15小时。
[0028]发情后期:阴道分泌物中大部分是白细胞，混有少量角化上皮细胞，此期约持续10-14小时。
[0029]静止期:阴道分泌物中大部分是白细胞，偶尔可见较小的有核扁平上皮细胞。此期约持续60-70小时。[0030]实验观察指标及方法
[0031]I。囊泡体积及腹腔内粘连情况
[0032]观察给药前后囊泡体积变化，用游标卡尺测量异位囊肿长宽高，根据体积公式V (mm3)=长(mm) X宽(mm) X高(mm),比较治疗前后各组间差异。并注意囊肿与周围组织及盆腔内其他组织的粘连情况。
[0033]2.HE染色观察组织病理学改变
[0034]病理切片:取各组异位内膜组织、空白组子宫组织，用10%福尔马林溶液充分固定，常规脱水、石蜡包埋、切片、HE染色、光学显微镜下观察。
[0035]3.免疫组化检测组织中Livin及Smac的表达
[0036]评定标准=Livin和Smac主要表达于腺体细胞的细胞质，显微镜下观察阳性细胞可见细胞质呈棕黄色。在低倍显微镜下观察组织切片5个视野，根据染色强度做出每张切片的分级:无着色为阴性(_);呈淡黄色为弱阳性(+);呈黄色为阳性(++);呈强阳性为棕黄色(+++)。每张组织切片皆由两位病理医生分别观察后计分。
[0037]4.酶联免疫法检测CA125及前列腺素F2 a含量
[0038]结果判定:在酶标仪450nm波长处读OD值，以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线(见图表1)，根据样品的OD值由标准曲线查出各大鼠的CA-125及PGF2 a相应的浓度(见图1)。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1:CA125及PGF2 a的标准曲线。以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，各大鼠的CA-125及PGF2 a相应的浓度变化情况。
[0040]图2:治疗后各组血清CA125和PGF2 a的含量情况:模型组PGF2 a水平高于空白组，鸦胆子油乳组、无水酒精组与模型组比较有显著性差异，但均未能降至正常空白组水平，鸦胆子油乳组与无水酒精组组间无显著性差异。
[0041]图3:透明或暗紫色异位病灶，上下各一或单一囊肿。异位造模成功后，于动情期剖腹探查结果。可见外观可见透明或暗紫色囊泡，囊内有清亮或暗红色的液体积聚，质软，表面被结缔组织覆盖并伴有血管生成。
[0042]图4:治疗后异位病灶明显缩小，D组与周围组织粘连严重。治疗后异位病灶明显缩小，所有异位囊肿与周围组织均有不同程度的粘连，鸦胆子油乳组粘连明显轻，边界清楚，仅2只与周围组织粘连；无水酒精组(D组)粘连十分严重，需要钝性分离才能分清异位病灶边界。
[0043]图5:各组组织病理学观察(HEX400)。各组的组织病理学观察结果。空白对照组(A组):正常子宫内膜病理:子宫内膜腺上皮呈柱状，形态规则，细胞排列紧密整齐，分泌细胞核大且居中，内膜腺体较丰富，腺腔大。模型对照组(B组):异位子宫内膜粘膜腺上皮细胞明显增生，呈柱状或低柱状，间质细胞变小且稀疏，腺体较稀少，分泌细胞排列较规则。鸦胆子油乳组(C组):异位内膜组织腺体数量极少甚或消失，腺腔小，内膜粘膜表面被覆为立方上皮或单层扁平上皮，内膜变薄，部分异位内膜完全萎缩或退化。无水酒精组(D组):异位内膜表面呈矮立方上皮，内膜极薄，腺体减少或消失，囊肿消失标本未发现异位内膜组织。[0044]图6:Livin在各组中的表达(LivinX400)。Livin蛋白在各组中的表达情况
[0045]图7:Smac在各组中的表达(SmacX400)。Smac白在各组中的表达情况实验结果
[0046]实验结果
[0047]1.模型建立情况
[0048]造模后5周除空白组外，其余各组大鼠根据阴道分泌物涂片观察动情周期，每组随机抽取I只动情期大鼠开腹见囊泡形成，并取囊泡组织脱水、包埋、切片、染色后于光镜下观察，组织中可见子宫内膜上皮细胞、腺体及间质生长并伴有分泌活动。证实异位造模成功后，鸦胆子油乳组、无水酒精组均于动情期剖腹探查，除无水酒精组一只未见明显囊泡外，其余各鼠于腹壁上均可见大小约(5X5X5)mm左右囊肿，上下各一，或单一囊肿形成(见表一)，外观可见透明或暗紫色囊泡，囊内有清亮或暗红色的液体积聚，质软，表面被结缔组织覆盖并伴有血管生成(见图3-图4)。各组间无显著性差异(P > 0.05)。造模过程中除无水酒精组因麻醉意外死一只外，其余各组大鼠均存活。
[0049]表1各组造 模差异性比较
[0050]
【权利要求】
1.鸦胆子油乳在制备治疗囊肿的药物中的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述囊肿为子宫内膜异位囊肿。
3.权利要求1或2所述的用途，其中所述药物使囊肿缩小甚至消失。
4.鸦胆子油乳在制备减轻盆腔粘连的药物中的用途。
5.权利要求4的用途，其中所述盆腔粘连为子宫内膜异位囊肿所致。
6.鸦胆子油乳在制备促进细胞凋亡的药物中的用途。
7.权利要求6的用途，其中所述促进细胞凋亡是指促进子宫内膜异位患者的异位内膜细胞凋亡。
8.权利要求7的用途，其中所述促进异位内膜细胞凋亡是通过抑制子宫内膜异位囊肿模型大鼠异位内膜中Livin的表达、增加Snac的表达而实现的。
9.鸦胆子油乳在制备治疗卵巢子宫内膜异位囊肿的药物中的用途。
10.权利要求9的用 途，其中所述鸦胆子油乳是以Livin和Smac为靶点治疗卵巢子宫内膜异位囊肿的。
【文档编号】A61K36/185GK103565853SQ201210257847
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年7月25日 优先权日:2012年7月25日
【发明者】韩凤娟, 吴效科, 孔赛 申请人:韩凤娟, 吴效科, 孔赛