专利名称：一氧化碳释放分子在制备抑制凝血活化疾病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明专利涉及ー氧化碳释放分子在凝血系统方面的新用途，具体的说，涉及一种早期应用ー氧化碳释放分子治疗脓毒症时凝血系统的过度活化的方法。
背景技术：
脓毒症是严重创伤、休克及感染后常见的并发症，即便在基础与临床医学研究及重症监护手段高度发展的现代，临床治疗仍然收效甚微，死亡率居高不下！统计表明，全世界超过10%的死亡患者与脓毒症密切相关。在脓毒症复杂的发病机制中，凝血系统紊乱是病死率増加的ー个重要原因。凝血系统的异常在脓毒症的发 生、发展过程中具有重要作用。脓毒症时由于细胞因子瀑布样释放，激活凝血系统，同时纤溶系统及生理性的抗凝系统受到不同程度的抑制，血液处于高凝状态，微血管内微血栓广泛形成，微循环障碍，进一步发展可导致脓毒性休克、MODS。脓毒症时凝血活化和炎症反应之间存在明显的交叉反应，脓毒症时机体的大量凝血因子被激活，凝血系统活化，使其功能紊乱，并促进炎症反应的进ー步发展，后者亦可引起前者的活化，两者相互影响，共同促进脓毒症的恶化。目前认为脓毒症早期以TNF-a增高、凝血和纤溶激活为特征。脓毒症时产生的多种促炎症因子如TNF-a、IL-1及IL-6等可引起并加重高凝。细胞因子增高后可见凝血酶生成的标志物和纤维蛋白原转变为纤维蛋白的标志物显著升高，提示凝血酶生成増加，凝血系统经细胞因子介导而活化。反之，凝血酶、因子Xa、纤维蛋白等凝血因子又可通过刺激单核细胞、内皮细胞释放TNF-a、IL-I及IL-6等促进炎症反应发生。因此，凝血活化与细胞因子形成相互促进的循环，在研究脓毒症的病理生理及治疗时，必须高度重视凝血系统紊乱问题和抗凝策略。血小板活化是凝血系统激活过程中的重要事件，在脓毒症的早期阶段，即可发生血小板激活和聚集。血小板在脓毒症所致的多器官功能障碍综合综中扮演了重要角色，在脓毒症的发生、发展和转归中具有重要作用。血小板活化包括3个方面黏附、聚集和释放，三者相互促进。研究表明，血小板參与脓毒症时血管的痉挛、血栓形成、栓塞的发生和缺血后组织的迟发性损害等各个环节。血小板膜糖蛋白在这些过程中起着极其重要的作用。主要的血小板膜糖蛋白GP II b/IIIa(即⑶41/⑶61)、⑶62p等介导了上述病理过程。造血系细胞特异蛋白-I (HSl)是血小板受刺激后活化过程中的一个关键信号分子，上述血小板重要的膜糖蛋白的活化信号均经HSl而得以传导。因此，研究ー种能抑制膜糖蛋白的表达，或者阻断HSl信号传导，进而抑制血小板的激活，弱化凝血系统的活化的方法对抑制脓毒症的发生发展具有重要作用。一氧化碳(CO)常温常压下是ー种双原子、小分子的气态物质，由于ー氧化碳可与机体内血红蛋白结合生成碳氧血红蛋白(ffico)，使得血液运输氧的能力发生障碍，高浓度时还可与还原性细胞色素氧化酶的两价铁结合，抑制组织呼吸，故CO在以往被认为是有毒气体，对CO的研究仅局限于它的生物学毒性。近年来，大量的研究证实ー氧化碳(CO)与一氧化氮(NO)相类似，也是ー种重要的气体细胞信使分子，在细胞功能和通讯的调节カー面发挥信号转导的重要作用。到1990年代初，Snyder等提出至少在ー种类型的神经细胞内，CO将不仅仅是副产物且作为CGMP的调节分子，它将和NO —样激活生物信号。Snyder等研究证明，cGMP在中枢神经系统的嗅觉信号传导中起了重要的作用，而这种作用可被HO的抑制剂阻断，从而提出了 CO的分子信号作用。既往常采用“吸入CO”作为外源性CO的来源，发现弊端较多，装置复杂，吸入浓度较难控制和維持，难以在实验需要时追加剂量，易导致高HbCO(—氧化碳血红蛋白)血症等。外源性一氧化碳释放分子(Carbon monoxide-releasing molecules,CORMs)是近年来新合成的一种ー氧化碳复合物，可以通过适当溶剂溶解后持续释放CO，发挥生理作用，在一定生理剂量时并不提高动物体内HbCO的浓度。该ー氧化碳复合物的制备方法和理化性能參数,在Motterlini R等所著文献(Curr. Pharm. 2003; 9:2525 - 39)中有详细的报道，该ー氧化碳复合物通常可用于制备缓释的ー氧化碳。我们的前期研究证明，外源性一氧化碳对脓毒血症时炎性介质 和细胞因子的释放具有有效的抑制作用，可有效保护细胞、維持器官功能。如能够将所述的ー氧化碳释放分子用于抑制脓毒症时凝血系统过度活化反应中，将为研究开发凝血系统紊乱问题和抗凝策略开辟新的途径。
发明内容
本发明的目的是提供ー氧化碳释放分子在制备抑制凝血活化疾病药物中的应用，以满足临床应用的需要。将所述ー氧化碳释放分子溶解在溶剂中，然后将其置于细胞培养液或生物体内，以可以持续性释放CO，作为ー种外源性CO供体；通过体内动物试验和体外细胞实验发现，所述外源性一氧化碳能够明显降低脓毒症时凝血因子FIB、D-D的表达；同时降低血浆中血小板膜糖蛋白⑶61、⑶62p的表达，从而下调了血小板粘附和聚集功能，同时抑止脓毒症小鼠血小板HSl的磷酸化水平，最終抑制了脓毒症凝血系统的过度活化。因此，所述的外源性ー氧化碳释放分子C0RM-2，可以用于制备治疗脓毒症时凝血系统的过度活化疾病的药物；本研究即采用小鼠盲肠结扎和穿孔术(CLP)脓毒症模型，将所述的外源性ー氧化碳释放分子2 (C0RM-2)作为ー种抑制脓毒症时凝血系统过度活化的药物，由医师决定，进行早期干预，进行试验，发现ー氧化碳释放分子对脓毒症时凝血系统的调节作用。采用所述的ー氧化碳释放分子在抑制脓毒症时凝血系统的过度活化疾病吋，使用C0RM-2,剂量为8mg/kg ;使用方法如下5. 125mg C0RM-2溶于250 u I DMSO中，获得40mM的C0RM-2溶液，根据8. 0mg/kg的剂量，取上述母液8 加入152 U I生理盐水中，配置成160 u I C0RM-2溶液，在小鼠CLP术后立即尾静脉注射。采用所述的ー氧化碳释放分子抑制脓毒症时凝血系统的过度活化疾病时，其浓度控制相对容易且正确，长期使用时追加方便，能够满足临床应用的需要。
图I为C0RM-2对CLP小鼠血浆中血小板膜糖蛋白⑶61水平的影响。图2为C0RM-2对CLP小鼠血浆中血小板膜糖蛋白⑶62p水平的影响。
图3为C0RM-2对CLP小鼠血浆中血小板膜糖蛋白⑶41水平的影响。图4为C0RM-2对CLP小鼠血液中凝血因子FIB水平的影响。图5为C0RM-2对CLP小鼠血液中凝血因子D-D含量的影响。图6为C0RM-2对CLP小鼠血小板粘附功能的影响。图7为C0RM-2对CLP小鼠血小板聚集功能的影响。图8为C0RM-2对CLP小鼠血小板HSl蛋白磷酸化的影响。图9为C0RM-2对CLP小鼠不同时间血小板HSl蛋白 磷酸化的影响。图10为C0RM-2对人血小板凝血酶刺激后HSl蛋白磷酸化的影响。
具体实施例方式实施例I外源性ー氧化碳释放分子(CO-RMs)对脓毒症时血小板膜糖蛋白以及血小板活化的抑制作用试验方法I CLP动物模型6-8周大小的C57BL/6小鼠，体重20±2g，均为雄性。予以2%异氟烷吸入麻醉小鼠，腹壁中线偏下方行1-1. 5cm切ロ，寻找到盲肠，在盲肠全长的1/2处运用3-0的线进行结扎，小心勿引起肠梗阻，勿破坏回肠动脉。运用20号针在盲肠壁进行単独的穿孔，轻轻挤压盲肠，使得穿孔位置有少量的肠内容物溢出，以确保完全穿孔，密切注意保持小肠和大肠之间的连续性。CLP后在肠道不同部位检查小鼠并未显示有肠梗阻的存在。然后将盲肠放回至腹腔内，外科缝合切ロ。假手术组小鼠进行麻酔和腹中线剖腹手木，将盲肠由腹部取出再放回腹腔，外科缝合伤ロ。伤ロ立即腹腔注射Iml生理盐水抗休克，保持室温22°C，单笼饲养，自由进食，足量饮水，切ロ涂以碘酊抗感染。2实验分组2. I按不同时段分组C57BL/6小鼠60只(6-8周大小)，体重20±2g，均为雄性。随机均分到三个时间段里，每时间段再分3个组6 小时组A 组SHAM 组(n = 5)；B 组CLP 组(n = 5);C 组CLP+C0RM-2 (n = 5)，C0RM-2 8mg/kg ；12 小时组A 组SHAM 组(n = 5)；B 组CLP 组(n = 5);C 组CLP+C0RM-2 (n = 5)，C0RM-2 8mg/kg ；24 小时组A 组SHAM 组(n = 5)；B 组CLP 组(n = 5);C 组CLP+C0RM-2 (n = 5)，C0RM-2 8mg/kg ；2. 2用药途径与剂量各时间段A组在开腹找到盲肠后不予结扎，放回腹腔后关腹，余与B组处理相同；C组以DMSO溶解C0RM-2配制成40M母液，给药浓度8mg/kg，即每只小鼠在CLP模型制成后，立即取40M母液8iil，配以生理盐水152iU，尾静脉注射160 ill CORM-2稀释液。3检测指标3. I血小板膜糖蛋白CD41、CD61、CD62-p水平检测流式细胞仪分析PRP中血小板膜糖蛋白⑶41、⑶61、⑶62-p水平，具体方法如下(I)姆只小鼠PRP分装于6支BD试管,姆管50 U I ;(2)将羊抗鼠CD41、CD61、CD62-p及IgG对照各10 U I分别加入对应的6支BD试
管中；(3)各BD试管置于微型涡旋混合器上混匀0. 5s后，室温、 避光20min ；(4)各BD试管中加2ml生理盐水，润旋混合器上混勻0. 5s后，1500r/min, 5min离心,弃上清；(5)各BD试管中加250 U I生理盐水，488nm氩离子激光灯下FCM检测荧光标记阳性的血小板百分数。3. 2CLP小鼠血中凝血因子纤维蛋白原(FIB)、D ニ聚体(D-D)水平检测小鼠在各时间段后用大剂量异氟烷麻醉满意后，用3. 8%柠檬酸钠润过的注射器通过心脏穿刺取血至少1ml，用3. 8%柠檬酸钠(1:9)抗凝后装于EP管中，即刻全自动凝血分析仪检测全血中凝血因子FIB、D-D水平。3. 3血小板粘附功能(PAdT)、血小板聚集功能(PAgT)检测小鼠在各时间段后用大剂量异氟烷麻醉满意后，用3. 8%柠檬酸钠润过的注射器通过心脏穿刺取血至少1ml，用3. 8%柠檬酸钠(1:9)抗凝后装于EP管中，即刻进行血小板粘附功能(PAdT)、血小板聚集功能(PAgT)检测。玻球法检测血小板粘附功能(I)取静脉血4. 5ml，置于含有0. 109mol/L枸櫞酸钠溶液0. 5ml的离心管(ニ甲基ニ氯硅烷处理过)中轻轻混匀。(2)立即以注射器(ニ甲基ニ氯硅烷处理过)取血标本I. 5ml置于球形瓶中，将球形瓶固定于转动装置，3rpm, 15min。(3)再用2个注射器分别从离心管中(接触前)和球形瓶(接触后)取血I. 0ml，置于2个大试管(ニ甲基ニ氯硅烷处理过)中，然后各加入0. 109mol/L枸櫞酸钠溶液19ml，以塑料膜盖试管ロ，轻轻倾倒3次，混匀，即刻送检。(4)用全自动血细胞分析仪检测血小板数。(5)每ー标本测定2次，取平均值。
(6)计算 血小板粘附率％ =接触前二歷辱座土■数X100%
接触前血小板数全血电阻法检测血小板聚集功能(I)将血小板聚集仪用连接器(link)与电脑连接，并选择电阻法。(2)将带有磁棒的反应杯插入育温孔,育温IOmin,设置磁棒旋转速度1200rpm。(3)加入0. 5ml抗凝血和0. 5ml生理盐水到育温好的反应杯中混合，再放到检测位温育5分钟。(4)温育时间到把电极插入反应杯，电极连到聚集仪上。
(5)在Aggregoment菜单内选择Run test,输入有关标本信息,选择电阻法后点击0K，出现运行曲线。(6)使用Impedence Zero Knob重新设置曲线的基线在0%,按Calibraten钮，使聚集曲线的电阻増加为标准20ohm，同时旋转Gain按纽使聚集曲线位于50%位置后，松开旋钮，那么姆50个小格为20ohm。此即为在程序里面设置Gain为20/5的原因。(7)加入聚集试剂ADPlOul，(无尘吸水纸擦拭枪头，加时枪头一定贴着杯壁插到底打出去，而且不要放开迅速抬起，此过程一定注意不要触碰电极)，让曲线运行6-9分钟至其比较平稳时在Aggregoment菜单内选择Stop test。(8)在Edit菜单中选择set start time and stop time之后选择预编辑的通道，然后在图形中用光标点住左边线左键点住拖动此线到开始 加试剂的位置，之后光标点住右边线同样拖动至曲线开始趋于平稳的位置，最后Done —下。(9)在Edit菜单中选择comput，确认时间后便可计算出聚集率和坡度(坡度代表单位时间内聚集率的变化)。(10)得到的结果可以通过File菜单中的Save进行保存。(11)检测完毕后将电极取出，先用次氯酸钠洗液洗，再用生理盐水冲洗，并用无尘吸水纸擦干，放入下一标本中。4统计学处理数据用X土s差表示，各组间均数的比较采用t检验。P <0.05为有统计学差异。差异显著性检验采用SPSS13. 0统计软件。结果如下I C0RM-2对CLP小鼠血浆中血小板膜糖蛋白⑶61水平的影响图Ia和图Ib显示CLP组小鼠全血中CD61的含量在6h组中较假手术组明显增加(P〈0. 01)，12h、24h组的亦是如此(P〈0. 05);在各时间段中CLP+C0RM-2组表达同样低于CLP组(P〈0. 05)。2 C0RM-2对CLP小鼠血浆中血小板膜糖蛋白⑶62p水平的影响图2示各时间段中CLP组小鼠全血中⑶62p的含量较假手术组明显增加(P〈0. 01)；02+CLP+C0RM-2 组表达明显低于 CLP 组(P〈0. 05)。3 C0RM-2对CLP小鼠血浆中血小板膜糖蛋白⑶41水平的影响图3示各时间段中各组间小鼠血浆中⑶41的水平无明显变化。(P > 0. 05)。4 C0RM-2对CLP小鼠血液中凝血因子FIB水平的影响图4示6h时间段各组间无显著性差异；12h、24h时间段CLP组小鼠全血中FIB的含量较假手术组明显增加(P < 0.01), CLP+C0RM-2组表达明显低于CLP组(P < 0. 01)。5C0RM-2对CLP小鼠血液中凝血因子D-D含量的影响图5示6h、12h时间段CLP组小鼠全血中D-D的含量较假手术组明显增加(P〈0. 01)，CLP+C0RM-2组表达明显低于CLP组(P〈0. 01) ;24h组各组间虽有变化趋势，但无统计学意义(P>0. 05)。6 C0RM-2对CLP小鼠血小板粘附功能的影响图6示6h、12h、24h各时间段CLP组小鼠血小板粘附率较假手术组明显増加(P< 0. 01)，CLP+C0RM-2 组情况明显低于 CLP 组(P < 0. 01)。
7 C0RM-2对CLP小鼠血小板聚集功能的影响图7a示24h时间段CLP组小鼠血小板聚集后电阻值较假手术组明显增加(P〈0. 01)，CLP+C0RM-2 组情况明显低于 CLP 组(P〈0. 01)。图7示各组小鼠血小板聚集率变化a.各组血小板电阻值，*与对照组比较，P〈0. 01 ；#与CLP组比较，P〈0. 05。b. 24h时间点CLP组小鼠血小板聚集增加导致电阻曲线下降幅度最大，斜率最大，CORM干预组曲线变化较CLP组明显平滑，聚集率降低；C0RM2为外源性ー氧化碳释放分子2。实施例2外源性ー氧化碳释放分子(CO-RMs)对脓毒症时血 小板HSl磷酸化的影响脓毒症时凝血系统的过度激活促进了脓毒症的发展，进ー步发展为脓毒症休克，血小板在此复杂的相互作用过程中起着非常重要的作用，主要体现在血小板过度活化，发生大量的粘附与聚集，导致病理性血栓形成。主要的血小板膜糖蛋白GP II b/IIIa(即⑶41/⑶61)、⑶62p等介导了上述病理过程。造血系细胞特异蛋白-I (HSl)是血小板受刺激后活化过程中的一个关键信号分子，上述血小板重要的膜糖蛋白的活化信号均经HSl而得以传导。因此，抑制膜糖蛋白的表达，或者阻断HSl信号传导，进而抑制血小板的激活，弱化凝血系统的活化对抑制脓毒症的发生发展具有重要作用。试验方法I动物模型与分组120只雄性BALB/c小鼠(江苏大学实验动物中心)，6 8周龄，体质量(20±2) g，于普通实验室适应性饲养I周。按照随机数字表法将小鼠分为对照组30只、CLP组30只、CLP + iC0RM-2 组 30 只、CLP + C0RM-2 组 30 只，每组均设 6h、12h、24h 三个时间点。CLP组小鼠吸入异氟烷麻酔后行CLP ；CLP + C0RM-2组小鼠同CLP组处理后，立即经尾静脉注射C0RM-2 (8. Omg/kg)。CLP + iCORM-2组小鼠除注射无活性的C0RM-2タト，处理同CLP +C0RM-2 组。2蛋白质印迹法(Western blot)检测总HSl和p_HSl按本实验室常规方法，收集24h组各组小鼠血小板经裂解后冰浴静置lh，然后4°C、14000r/min (离心半径为6. 0cm)离心25min，提取各组胞质蛋白，采用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度(mg/mL),-80°C保存。姆个样品取50 y g总蛋白，电泳后电转移至PVDF膜，90V低温条件下电转移2h，封闭后分别加入兔抗HSl单克隆抗体，兔抗p_HSl多克隆抗体，抗体均I : 500稀释，4°C过夜。PBST漂洗4次后，加入HRP耦联的山羊抗兔IgG(l 5000稀释)，4°C孵育过夜。PBST漂洗4次后，用ECL试剂盒显色，蛋白条带用图像分析系统分析，数据以均数土标准差表示。3免疫沉淀分析(I)每I毫升预处理的蛋白溶液加50微升正常兔血清或IgG，冰上孵育2小时；(2)将蛋白A微球悬浮于洗脱缓冲液中，搅拌后IOOOOg离心，弃洗液，置于冰上；(3)将蛋白溶液与蛋白A微球混合，冰上30分钟，4000g3分钟。小心将上清移至另一管中(増加蛋白A的浓度，彻底去除用于预处理的非特异性抗体)；(4)预处理的蛋白溶液置于适当数量的I. 5毫升的管中(0. 5/管)，加入抗血清I U I作为起始用量(滴定抗体量范围0. 5-5 u I)，冰上孵育2小时；
(5)加入100 Ul蛋白A微球(10%的悬液)，4度摇动I小吋，10000gl5秒，收集微球；(6)将0. 5倍体积的PH3. 5的甘氨酸-盐酸洗脱液与沉淀复合物颠倒混匀15分钟，离心收集上清，重复2-3次；(7)各管，SDS-PAGE 鉴定组份。4统计学处理数据用x±s表示，各组间均数的比较采用t检验。P〈0. 05为有统计学差异。差异显著性检验采用SPSS 13. 0统计软件。 结果如下I C0RM-2对CLP小鼠血小板HSl蛋白磷酸化的影响图8示CLP组、CLP+iCORM组小鼠血小板磷酸化HSl蛋白相对表达量(0. 85±0. 18，0. 93±0. 16)较正常对照组(0. 40±0. 07)增加(P〈0. 01) ；CLP+C0RM-2 组小鼠血小板磷酸化HSl蛋白相对表达量(0.38±0.09)下降(P〈0.05)。(图中I.正常对照组、2. CLP组、3. CLP+iC0RM-2组、4. CLP+C0RM-2组；C0RM2为外源性ー氧化碳释放分子2，iC0RM-2 为无活性 C0RM-2)2 C0RM-2对CLP小鼠不同时间血小板HSl蛋白磷酸化的影响图9示脓毒症(CLP)小鼠模型并用CORM-2 (8mg/kg)干预，按不同时间点收集血小板。抗HSl抗体免疫沉淀后采用抗磷酸化Tyr抗体行Western blot检测。等量免疫沉淀样本采用抗HSl抗体行Western blot检测。结果显示，C0RM-2能明显抑止脓毒症小鼠血小板HSl的磷酸化水平。3 C0RM-2对人血小板凝血酶刺激后HSl蛋白磷酸化的影响图10示人血小板凝血酶刺激并用CORM-2 (IO-IOOiiM)干预3min，抗HSl抗体免疫沉淀后采用抗磷酸化Tyr行Western blot检测。等量免疫沉淀样本采用抗HSl抗体行Western blot检测。结果显示，CORM-2能明显抑止HSl的磷酸化水平。
权利要求
1.一氧化碳释放分子在制备抑制凝血活化疾病药物中的应用。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，使用C0RM-2，剂量为8mg/kg。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，使用方法如下5.125mg C0RM-2溶于.250 μ I DMSO中，获得40mM的C0RM-2溶液，根据8. Omg/kg的剂量，取上述母液8 μ I加入.152 μ I生理盐水中，配置成160 μ I C0RM-2溶液，静脉注射。
全文摘要
本发明公开了一氧化碳释放分子在制备抑制凝血活化疾病药物中的应用。通过体内动物试验和体外细胞实验发现，所述外源性一氧化碳能够明显降低脓毒症时凝血因子FIB、D-D的表达；同时降低血浆中血小板膜糖蛋白CD61、CD62p的表达，从而下调了血小板粘附和聚集功能，同时抑止脓毒症小鼠血小板HS1的磷酸化水平，最终抑制了脓毒症凝血系统的过度活化。采用所述的一氧化碳释放分子抑制脓毒症时凝血系统的过度活化疾病时，其浓度控制相对容易且正确，长期使用时追加方便，能够满足临床应用的需要。
文档编号A61P7/00GK102813925SQ201210268100
公开日2012年12月12日 申请日期2012年7月30日 优先权日2012年7月30日
发明者孙炳伟, 孙艳, 王旭 申请人:江苏大学附属医院