专利名称：Gpr50作为bace1抑制剂的应用及其在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学领域，特别涉及GPR50作为BACEl抑制剂的应用及其在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。
背景技术：
阿尔茨海默病(Alzheimer ‘s Disease, AD)是一种以进行性记忆缺失和认知障碍为主要临床病征的神经退行性疾病。由β淀粉样蛋白(β-amyloid, Αβ )形成的淀粉样蛋白斑和tau蛋白磷酸化形成的神经纤维缠结(Neurofibrillar Tangles, NFTs)是AD的两大病理特征。Αβ在AD的病理发展中发挥着重要的作用。它可以诱导细胞凋亡、增加氧化应激、诱导神经炎症，从而导致神经毒性。另外，Αβ可以导致神经树突棘丢失、抑制长时程增强(Long-Term Potentiation, LTP),从而抑制神经突触可塑性。因此，阻断A β的产生及其神经毒性是AD治疗的一个重要策略。 Aβ是由β淀粉样前体蛋白(Amyloid Precursor Protein, APP)经不同的分泌酶(secretases)酶切水解产生的。APP经β -分泌酶酶切产生胞外段sAPP β和β-CTF(C-terminal Fragment, CTF)。sAPP被释放出来,跨膜的β-CTF进一步被Y-分泌酶酶切产生Αβ。因此，阻断β-分泌酶和Y-分泌酶的酶切，从而降低A β的产生，是治疗AD的一个重要方案。然而，Y-分泌酶除了酶切APP外，还参与多种蛋白的水解酶切过程如notch，Erb4等。阻断Y -分泌酶有可能会导致细胞正常的功能障碍。BACEl是具有跨膜结构的新型天冬氨酸蛋白酶。研究发现，BACEl如果不是酶切APP唯一的β -分泌酶，也是最重要的一个。在BACEl基因敲除小鼠与过表达APP的转基因小鼠杂交的小鼠脑内，Αβ的产生、Αβ诱导的病理特征及学习记忆能力的损害都有很大的改善。所以，BACEl是AD治疗药物研发中的一个重要的靶标。然而，由于BACEl的酶活性位点比较大，一般较大的小分子化合物才能抑制其活性。然而，血脑屏障往往对分子量比较大的小分子化合物的通透性比较差。这严重限制了直接以BACEl为靶点的药物的研发。因此，寻找和探索抑制BACEl活性的蛋白及机制，为治疗AD提供新的、更为可行的靶标，具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供GPR50作为BACEl抑制剂的应用及其在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。GPR50能够与BACEl结合，抑制BACEl的活性，降低BACEl的表达，从而抑制A β 40、A β 42的产生。GPR50可以用于制备治疗阿尔茨海默病的药物。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案本发明提供了 GPR50作为BACEl抑制剂的应用。G蛋白偶联受体(G-Protein Coupled Receptor, GPCR)在药物研发中占有很大的比重。这类受体具有特异的信号通路，在药物筛选中具有很大优势。目前在市场上的药物中，有40%的药物是针对GPCR的。GPR50，属于GPCR家族，在大脑海马和皮层均有表达。研究发现，在AD病人的脑区内，GPR50阳性信号增加。本发明发现，GPR50能够与BACEl结合，抑制BACEl的活性，降低BACEl的表达，从而抑制A β 40、A β 42的产生。因此，GPR50可以用于制备治疗阿尔茨海默病的药物。基于上述原因，本发明还提供了 GPR50在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。在本发明提供的实施例中，药物为化学药物或生物制剂。本发明还提供了一种治疗阿尔茨海默病的药物，包括GPR50及药学上可接受的辅料。
作为优选，本发明提供的治疗阿尔茨海默病的药物为口服制剂或注射剂。作为优选，本发明提供的治疗阿尔茨海默病的药物，口服制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂、糖浆剂。作为优选，本发明提供的治疗阿尔茨海默病的药物，注射剂为注射用粉针剂或注射液。本发明提供GPR50作为BACEl抑制剂的应用及其在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。GPR50能够与BACEl结合，抑制BACEl的活性，降低BACEl的表达，从而抑制Αβ40、Αβ42的产生。GPR50可以用于制备治疗阿尔茨海默病的药物。
图I示GPR50在神经元上表达,而不在星形胶质细胞细胞上表达图；图I (a)至图I (d)示在原代培养的小鼠胚胎期18天的神经元上，利用抗GPR50见图I (b)，抗MAP2 (神经元的标志蛋白)见图I (a)进行免疫荧光双染。结果显示，GPR50在神经元上表达见图I
(c);图I (e)至图I (I)示在原代培养的小鼠胚胎期18天星形胶质细胞上，利用抗GPR50见图I (f)、图I (j)、抗GFAP (星形胶质细胞标志蛋白)见图I (e)、图I (i)抗体进行免疫双染；结果显示，GPR50不在星形胶质细胞上表达见图I (h)、图I (I);图2示GPR50在APP/PS1转基因小鼠脑内异常表达；图2 (a)至图2 (d)示在7月龄的APP/PS1转基因小鼠脑切片上，利用抗A β见图2(&)、抗6 1 50抗体见图2(b)进行免疫荧光双染；结果显示，GPR50在β-淀粉样沉淀周围异常表达见图2 (d);图2 (e)示利用RT-PCR，分析比较7月龄的APP/PS1转基因小鼠及其同月龄的野生型小鼠海马GPR50mRNA的水平，其中GAPDH为内参；结果显示，APP/PS1转基因小鼠海马GPR50mRNA的水平明显低于野生型小鼠；图3示GPR50与APP结合；图3 (a)至图3 (h)示GPR50与APP有共定位，其中图3 Ca)至图3 Cd)示在HEK293-APP (稳定表达APP的HEK293细胞系)上，转染GPR50-FLAG质粒，48小时以后，利用抗FLAG见图3 (a)和抗APP抗体见图3 (b)进行免疫荧光双染；DAPI示染细胞核见图3 (c);结果显示，GPR50与APP在HEK293细胞上有共定位见图3 Cd)；图3 (e)至图3 (h)示在原代培养的小鼠胚胎期18天的皮层海马神经元上，利用抗GPR50见图3 (f)、抗APP抗体见图3 (e)进行免疫荧光双染，结果显示，GPR50与APP原代培养的神经元上有共定位见图3 (h);图3 (i)示在HEK293-APP上，转染GPR50-FLAG质粒48小时以后，利用抗APP抗体进行免疫沉淀，利用抗GPR50、抗APP抗体进行检测，结果显示，GPR50与APP结合；IP :免疫沉淀；IB :免疫印迹；图3 (j)示在HEK293-APP上，转染GPR50-FLAG质粒48小时以后，利用抗GPR50抗体进行免疫沉淀，利用抗GPR50、抗APP抗体进行检测，结果显示，GPR50与APP结合；IP :免疫沉淀；IB :免疫印迹；图4示GPR50降低Αβ的产生；其中图4(a)至图4(b)在ΗΕΚ293-ΑΡΡ，转染GPR50质粒48小时以后，收集上清，利用ELISA检测Αβ40、Αβ42的量。空载体(vector)作为对照；结果显示，转染GPR50后，细胞上清中产生的Αβ40、Αβ42的量明显少于转染空载体组；图4 (c)示在ΗΕΚ293-ΑΡΡ，转染不同量GPR50质粒48小时以后，收集上清，利用ELISA检测A β 42的量，相应量的vector作为对照，将转染vector组的A β 42标准化为100% ;结果显示，随着GPR50质粒量的增加，上清中Aβ 42的量也减少，说明GPR50对Αβ产生的抑制作用具有剂量依赖性；图4 (d)示在HEK293-APP转染GPR50质粒48小时以后，对细胞进行MTT检测；结果显示，转染GPR50不影响细胞活力。**:ρ〈0·01 ;*** :ρ〈0· 001 ；图5示GPR50增加APP蛋白的量，并抑制APP酶切；其中图5(a)在ΗΕΚ293-ΑΡΡ上转染GPR50质粒48小时以后，利用western-blot，检测APP的表达量及APP被β或α -分泌酶酶切后的产物CTFs的量，转染空载体(vector)作为对照，GPR50+ Y示在转染GPR50质粒的同时加入Y-分泌酶抑制剂，Y-tubulin为内参；图5 (b)、图5 (c)将APP与CTFs相 对于γ-tubulin的量进行统计分析；结果显示，转染GPR50后，APP的表达量明显增加见图
5(b)，而CTFs的量则显著下降见图5 (c);图5 (d)在HEK293-APP上，转染GPR50质粒48小时以后，利用RT-PCR检测APPmRNA的水平，GAPDH为内参；图5 (e)、图5 (f)将APP与GPR50的mRNA的水平相对于GAPDH进行统计学分析；结果显示，GPR50对APPmRNA的水平没有显著影响。其中#示p〈0. 01，示p〈0. 001 ;图5 (g)示在HEK293-APP上转染GPR50质粒48小时以后，利用western-blot，检测APP被β或α-分泌酶酶切后的产物β-CTF、a -CTF的量；转染空载体(vector)作为对照，GPR50+ Y示在转染GPR50质粒的同时加入Y -分泌酶抑制剂，Y-tubulin为内参;结果显示，GPR50可以降低β -CTF的产生；图6示GPR50与BACEl有共定位；其中图6 (a)至图6 (d)在HEK293细胞上共转染BACEl-HA和GPR50-FLAG质粒48小时后，利用抗HA见图6 (b)和抗FLAG见图6 Ca)的抗体进行免疫荧光双染，DAPI染细胞核见图6 (C)，结果显示，二者有共定位见图6 (d);图
6(e)至图6 (h)在原代培养的小鼠胚胎期18天的皮层海马神经元上，利用抗BACEl见图6 (e)、抗GPR50抗体见图6 (f)进行免疫荧光双染，结果显示，二者有共定位见图6 (h)；图7示GPR50与BACEl结合；其中图7 (a)至图7 (b)在HEK293细胞上共转染BACEl-HA和GPR50-N1质粒48小时后，分别利用抗GPR50见图7(a)、抗HA的抗体进行免疫沉淀见图7 (b)，利用抗HA、抗GPR50进行检测，结果显示，GPR50与BACEl结合，GPR50-N1示在EGFP-Nl载体里表达GPR50 ;图7 (c)至图7 (d)在HEK293细胞上共转染BACEl-HA和GPR50-FLAG质粒48小时后，分别利用抗FLAG见图7 (C)、抗HA的抗体见图7 (d)进行免疫沉淀，利用抗HA、抗FLAG进行检测，结果显示，GPR50与BACEl结合；图8示GPR50影响BACEl活性及蛋白表达水平；其中图8 (a)在HEK293细胞上转染GPR50后48小时，利用β -分泌酶活性试剂盒检测BACEl的活性，结果显示，GPR50显著抑制BACEl活性；图8 (b)在HEK293细胞上转染图中所示量的GPR50-FLAG，BACEl-HA后，利用抗HA抗体检测BACEl的蛋白水平见图8(b)，并对其相对于Y -tubulin的量进行统计分析见图8 (C)，结果显示，GPR50显著降低BACEl的蛋白水平，且这种抑制具有剂量依赖性见图8 (b)、图8 (c);图8 (d)和图8 (e)在HEK293-APP细胞上转染转染GPR50后48小时，利用RT-PCR检测BACEl的mRNA水平见图8 Cd),并对其相对于GAPDH的量进行统计学分析见图8 Ce),结果显示，GPR50并不影响BACEl的mRNA水平。
具体实施例方式本发明公开了 GPR50作为BACEl抑制剂的应用及其在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和 应用本发明技术。本发明提供的GPR50作为BACEl抑制剂的应用及其在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明实施例IGPR50在神经元，而不在星形胶质细胞上表达本发明利用抗GPR5O (sc-50590, Santa cruz)、抗 MAP2 (M1406，Sigma)的抗体在分离培养的小鼠胚胎期18天的皮层海马神经元上，进行免疫荧光双染，如图I (a)至图I
(d)所示。MAP2为神经元的标志性蛋白。结果显示，GPR50在神经元上表达。利用抗GPR50(sc-50590, Santa cruz))、抗GFAP (ab7779, abeam)的抗体在分离培养的小鼠胚胎期18天的星形胶质细胞上，进行免疫突光双染，如图I (e)至图I (I)所示。GFAP为星形胶质细胞的标志性蛋白。结果显示，GPR50不在星形胶质细胞上表达。GPR50在APP/PS1小鼠脑内异常表达以往研究发现，GPR50在AD病人脑内表达异常。APP/PS1小鼠(B6C3_Tg(APPswe，PSENldE9) 85Dbo/J, Stock#004462, Jackson Laboratory)过表达在 swedish 位点突变的人APP和突变的PSl。该小鼠在7个月的时候脑内会出现β -淀粉样沉淀，是研究AD常用的小鼠模型。利用抗 Αβ (SIG-39300, Covance)和抗 GPR50 抗体(Μ28Ζ1-20Α，US Biological),在7月龄的APP/PS1小鼠的脑片上进行免疫荧光双染，结果显示，GPR50分布在β -淀粉样沉淀周围，如图2 (a)至图2 (d)箭头所示。利用RT-PCR，检测7月龄的APP/PS1小鼠海马及其同龄野生型小鼠海马的GPR50的表达量，结果显示，与野生型小鼠比较，APP/PS1小鼠海马内GPR50的表达显著减少，如图2(e)。这些结果显示，GPR50可能参与AD的病理发展。GPR50与APP结合，并显著降低Αβ的产生Αβ是由APP经水解酶切产生的。为了检测GPR50是否与APP有结合，我们首先在稳定表达APP的细胞系，HEK-APP上，转染GPR50-FLAG，并利用抗FLAG的抗体(F3165，Sigma)和抗APP的抗体(A8717，Sigma)进行免疫荧光双染，如图3 (a)所示。结果显示，GPR50与APP有共定位。为了进一步证明这个结果，我们分离培养了胚胎期18天小鼠的海马皮层神经元，利用抗GPR50 (sc-50590, Santa cruz)与APP的抗体(A8717，Sigma)进行染色，发现GPR50与APP的确有共定位见图3 (a)至图3 (d)。我们进一步进行免疫共沉淀实验，以分析GPR50是否与APP结合。将GPR50质粒转染到HEK-APP48小时后，利用抗APP抗体(A8717，Sigma)进行免疫沉淀，利用抗GPR50抗体(sc-50590，Santa cruz )进行检测。APP抗体可以成功地将GPR50沉淀下来见图3 (i)。反之，亦然，见图3 (j)。这些结果说明，GPR50与APP结合。为了进一步分析GPR50对Αβ产生的影响，将GPR50质粒转染到HEK-APP细胞48小时后，收集上清，利用ELISA试剂盒(ΚΗΒ3481/3441，Invitrogen)对上清中的Αβ40、42的产量进行分析。结果发现，与空载体相比，转染GPR50后，细胞上清中A β 40、A β 42的量显著减少，如图4 (a)至图4 (b)所示。说明，GPR50对Αβ的产生具有抑制作用。而且，这种抑制作用具有剂量依赖性，如图4 (c)所示。细胞活力亦影响细胞产生Αβ的量。为了排除GPR50是通过影响细胞活力影响Aβ的产生，我们对转染GPR50后的ΗΕΚ-293细胞进行了 MTT检测(Μ2128，Sigma)，结果显示，GPR50并不影响细胞活力，如图4 (d)所示。APP蛋白的表达量影响Αβ的产生。为了分析，GPR50对Αβ产生的抑制作用是否是由调节APP的表达量导致的。我们在HEK-APP细胞上转染GPR50以后，检测APP蛋白的表达量。结果显示，GPR50显著增加了 APP蛋白的水平，如图5 (a)、图5 (b)所示。而CTFs，α-或β-分泌酶酶切APP的产物，却明显减少，如图5 (a)、图5 (c)所示。然而，GPR50却不影响APPmRNA水平，如图5 (d)至图5 (f)所示。进一步对CTFs的结果进行分析，发现转 染GPR50后，β-CTF明显降低，如图5 (g)所示。这些结果显示，GPR50抑制APP被β-分泌酶的酶切过程。BACEl是具有跨膜结构的新型天冬氨酸蛋白酶。研究发现，BACEl如果不是酶切APP唯一的β -分泌酶，也是最重要的一个。在BACEl基因敲除小鼠与过表达APP的转基因小鼠杂交的小鼠脑内，Αβ的产生、Αβ诱导的病理特征及学习记忆能力的损害都有很大的改善。GPR50抑制APP被β-分泌酶的酶切过程。为了分析GPR50是否影响BACE1，我们在ΗΕΚ293细胞上转染GPR50-FLAG和BACE-HA，免疫荧光染色结果显示，GPR50与BACE不仅在细胞膜上有共定位，GPR50和BACEl —样，在细胞内呈聚集状，并有共定位，如图6 (a)至图6 Cd)所示。在原代培养的皮层和海马神经元上，GPR50与BACEl不仅在细胞膜上有共定位，亦在细胞内有聚集，如图6 (e)至图6 (h)箭头示。为了进一步检测二者是否有结合，将GPR50或GPR50-FLAG与BACE-HA的质粒共转染到HEK293细胞里，分别用抗GPR50或FLAG抗体和HA抗体进行免疫共沉淀实验，如图7 (a)至图7 (d)所示。结果显示，GPR50与BACE有结合。我们进一步发现，与空载体相比，在HEK293细胞上转染GPR50后，β -分泌酶的活性明显下降，如图8 (a)所示。GPR50抑制BACEl蛋白的表达，这种抑制作用呈剂量依赖性，如图8 (b)、图8 (c)所示。然而，GPR50对BACElmRNA水平没有显著影响，如图8 (d)至图8 (f)所示。这些结果显示，GPR50通过下调BACEl蛋白的表达，抑制Aβ的产生。实施例2GPR50用于制备治疗阿尔茨海默病的片剂取GPR50添加常规辅料，采用常规方法制得片剂。实施例3GPR50用于制备治疗阿尔茨海默病的胶囊剂取GPR50添加常规辅料，采用常规方法制得胶囊剂。实施例4GPR50用于制备治疗阿尔茨海默病的丸剂取GPR50添加常规辅料，采用常规方法制得丸剂。实施例5GPR50用于制备治疗阿尔茨海默病的颗粒剂
取GPR50添加常规辅料，采用常规方法制得颗粒剂。实施例6GPR50用于制备治疗阿尔茨海默病的汤剂取GPR50添加常规辅料，采用常规方法制得汤剂。实施例7GPR50用于制备治疗阿尔茨海默病的膏剂取GPR50添加常规辅料，采用常规方法制得膏剂。实施例8GPR50用于制备治疗阿尔茨海默病的露剂取GPR50添加常规辅料，采用常规方法制得露剂。实施例9GPR50用于制备治疗阿尔茨海默病的口服液剂取GPR50添加常规辅料，采用常规方法制得口服液剂。 实施例10GPR50用于制备治疗阿尔茨海默病的滴丸剂取GPR50添加常规辅料，采用常规方法制得滴丸剂。实施例11GPR50用于制备治疗阿尔茨海默病的糖浆剂取GPR50添加常规辅料，采用常规方法制得糖浆剂。实施例12GPR50用于制备治疗阿尔茨海默病的注射用粉针剂取GPR50添加常规辅料，采用常规方法制得注射用粉针剂。实施例13GPR50用于制备治疗阿尔茨海默病的注射液取GPR50添加常规辅料，采用常规方法制得注射液。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.GPR50作为BACEl抑制剂的应用。
2.GPR50在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物为化学药物或生物制剂。
4.一种治疗阿尔茨海默病的药物，其特征在于，包括GPR50及药学上可接受的辅料。
5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述药物为口服制剂或注射剂。
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述口服制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒齐 、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂、糖浆剂。
7.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述注射剂为注射用粉针剂或注射液。
全文摘要
本发明涉及医学领域，特别涉及GPR50作为BACE1抑制剂的应用及其在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。GPR50能够与BACE1结合，抑制BACE1的活性，降低BACE1的表达，从而抑制Aβ40、Aβ42的产生。GPR50可以用于制备治疗阿尔茨海默病的药物。
文档编号A61K38/17GK102764427SQ20121026820
公开日2012年11月7日 申请日期2012年7月30日 优先权日2012年7月30日
发明者刘春风, 肖志成, 马全红 申请人:苏州大学