专利名称：一株栅藻及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域,尤其涉及一种栅藻ENN32 (Scenedesmus sp.)及其应用。
技术背景
随着世界化石燃料储备量的逐步耗竭，二氧化碳排放量的不断增加以及全球气候的日益趋暖，人类的生存和发展状况已经面临前所未有的挑战。因此，世界各国都在积极寻找能够替代石油产品的可再生能源，其中，生物柴油就是一种重要的生物能源，然而，常见的油料作物例如玉米和大豆等培育周期较长，占用农田较多，会产生“与人争粮，与粮争地” 问题，从而导致“解决了能源危机，却出现粮食危机”的尴尬结果。
微藻是一类在陆地、海洋分布广泛，营养丰富，生长周期短，光合利用度高的以光合自养产生能量的低等植物，是自然界起源最早、分布最广、种类和数量最大的生物质资源。在一定条件下许多微藻能够在细胞中大量积累储藏性三酰甘油(微藻油)(类似于植物油)，其最高含量可达到细胞干重的50%以上。与高等陆生油料作物相比，微藻的单位面积油产量是油料植物油产量的数十倍，经过生物冶炼可以生产生物柴油等多种生物燃料， 被认为是最有可能最有潜力成为石油替代品的生物质资源。
除了油产量非常高之外，微藻还富含蛋白质、脂肪、碳水化合物、各种氨基酸、维生素、抗生素、高不饱和脂肪酸以及其它多种生物活性物质，因此，在保健食品、医药和饲料等领域也同样具有很好的开发前景，例如，用于食料和医药业(人和动物的营养补充物维生素、蛋白质、脂肪酸、多糖等)；提取化工产业如化妆品、精细化工产品等；作为能源产生沼气、燃料；用于饵料和饲料业(鱼虾、甲壳动物等水产动物的饵料(CN1742570)、家禽饲料等)；农业上作为土壤调节剂、肥料等。
此外，微藻的环境适应能力非常强，对营养的要求也很简单，可在各种严苛环境下生长。例如,微藻可通过光合作用吸收污水中的硝酸盐、亚硝酸盐、铵盐、磷酸盐等无机盐的氮磷合成氨基酸、蛋白质、磷脂等有机物，形成微藻细胞，从而降低水体中的氮磷含量，因此微藻可用于去除污水中的氮磷。微藻还可利用工业废气中的CO2，减少CO2的排放。因此微藻在无论是工业环境保护方面还是城市环境保护方面也都有很好的应用前景。还有一些微藻可以生长在高盐、高碱环境的水体中，可充分利用滩涂、盐碱地、沙漠等不适宜进行耕种的土地进行大规模培养，也可利用海水、盐碱水、工业废水等非农用水进行培养，被誉为可循环的“绿色油田”，因此发展微藻培养及其相关工业也非常适合土地尤其是耕地资源相对紧缺的我国。
目前国内外都积极开展了对于微藻的开发尤其是其在生物能源应用方面的开发， 这其中以对小球藻的研究居多。CN101460609公开了一种新的小球藻属(CHL0RELLA)物种及其应用CN101565675公开了一种小球藻及其培养方法和它在生物柴油生产中的应用； CN101824386公开了一株小球藻，及其在生产微藻油脂和固定CO2中的应用；CN102093955 公开了一株小球藻及其在利用污水培养与生物柴油转化体系中的应用；CN102229889公开了一株小球藻及其培养方法和在CO2的固定，废水的净化，油脂、蛋白质、色素、淀粉、多糖、核酸等生物质的生产应用。此外，对于微藻应用的相关研究也在进行当中，CN101767893公开了一种利用微藻深度处理污水耦合生产生物油的装置及方法。可以说微藻在能源以及环境领域中的大规模应用已经指日可待。
栅藻是淡水中常见的浮游微藻，极喜在营养丰富的静水中繁殖。许多种类对有机污染物具有较强的耐性，在水质评价中可作为指示生物，并且在水体自净和污水净化中有一定作用，是有机污水氧化塘生物相中的优势种类。它可与细菌同时附着在水中有机物碎片和其他水生植物体上，形成胶质层，吸附有机物。栅藻进行光合作用时，一方面产生氧气供细菌分解有机质的需要，另一方面还可直接利用有机质作为碳源和氮源，使水中有机物迅速降解，从而净化水体。栅藻细胞内含有丰富的蛋白质和维生素，是鱼类很好的饲料，如利用有机污水氧化塘养鱼，可获高产。大量繁殖的藻体也可作家禽的饲料。目前国内外对于栅藻的开发还不是很多，CN101565674公开了一株低营养栅藻及其在污水深度处理中的应用，该栅藻藻株可在低营养环境中生长，因此可将二级出水中的氮磷去除到很低水平； CN102083957公开了一种具有高效去除二氧化碳特征性的凸头状栅藻原变种微藻及其用途，尤其是二氧化碳固定率高的凸头状栅藻原变种微藻及其用途；CN102250773公开了一株栅藻及其培养方法和在CO2的固定，废水的净化，油脂、蛋白质、色素、淀粉、多糖、核酸等生物质的生产等领域中的应用；季祥、王金荣等人(一株斜生栅藻的筛选及生长条件的优化[J]。水产科技情报，2010:37 ￠))获得了一株含油相对较高、长势较好的藻种栅藻藻株。
尽管微藻具有非常良好的能源、环境保护甚至医药等开发前景，并且相关的研究工作也已经逐渐展开，但是目前已知的微藻，尤其是栅藻，含油量通常在40%以下、对CO2的处理能力、极端环境耐受等方面的性能上还普遍偏低。因此需要性能更好，更适于工业应用的栅藻。发明内容
本发明的目的在于提供一种对环境适应能力强，油脂含量高，对CO2的处理能力强的更加适于工业应用的栅藻。
为达此目的，本发明采用以下技术方案
在第一方面,本发明提供了一种栅藻ENN32 (Scenedesmus sp.),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2012年07月13日，保藏号为 CGMCC No. 6346。
本发明提供的栅藻ENN32中脂肪酸在藻粉中的含量可以大于40%干重，优选地大于50%干重，更优选地为51% 60%干重。
本发明提供的栅藻ENN32的耐受温度可以为_10°C至44°C，优选地(TC至40°C，更优选地10°C至35°C，还更优选地20°C至30°C，最优选地25°C。
本发明提供的栅藻ENN32可以在(rC、ΓC、2°C、3°C、4°C、5°C、6°C、7°C、8°C、9°C、 10 0C > 110C >12 0C > 13 0C、14 °C、15 °C、16 °C、17 °C、18 °C、19 °C、20 °C、21 °C >22 °C >23 °C >24 °C、 25°C、26°C、27t、28t、29t、3(rC、3rC、32t、33t、34t、35t、36t、37t、38t、39t或 40°C下生长。
在第二方面，本发明提供了如第一方面所述的栅藻ENN32的培养方法，所述方法包括将栅藻藻株ENN32绿色细胞接种在BGll培养基中，其中光照强度50-500 μ mol/m2. s,优选 100-450 μ mol/m2. S、更优选 150-400 μ mol/m2. S、还更优选 200-350 μ mol/m2. S、最优选 250-300 μ mol/m2· s，pH 值 6-10、优选 7_9，更优选 7. 5-8. 5，最优选 8，温度 10_40°C，优选 15-35°C、更优选 20-30°C、最优选 25°C。
在本发明的栅藻ENN32的培养方法中，光照强度可以为50 μ mol/m2· s、80 μ mol/ m2. s> 100 μ mol/m2. s> 120 μ mol/m2. s> 150 μ mol/m2. s、180 μ mol/m2· s>200 μ mol/m2. s、 220 μ mol/m2. s、250 μ mol/m2. s、280 μ mol/m2. s、300 μ mol/m2. s、320 μ mol/m2. s、350 μ mol/ m2. s、380 μ mol/m2. s、400 μ mol/m2. s、420 μ mol/m2. s、450 μ mol/m2. s、480 μ mol/m2. s 或 500 μ mol/m2. s ;pH值可以为 6、6· 5、7、7· 2、7· 5、7· 8、8、8. 2、8· 5、8· 8、9、9· 5 或 10 ;温度可以为 10Ul>12U3U4U5oC>16oC>17oC>18oC>19oC>20oC>2rC>22oC>23oC>24oC>25oC>26°C> 27。。、28。。、29。。、30。。、31。。、32。。、33。。、34。。或 35。。。
在第三方面，本发明提供的栅藻ENN32含有虾青素、β-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质和角黄素。
本发明提供了如第一方面所述的栅藻ΕΝΝ32在脂肪酸生产中的应用，优选地，所述脂肪酸是豆蘧酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、十八碳四烯酸、 α -亚麻酸、Y -亚麻酸、花生酸和/或山嵛酸。
在第四方面，本发明提供了如第一方面所述的栅藻ΕΝΝ32在生物燃料生产中的应用，优选地，所述生物燃料是生物柴油或生物乙醇。
在第五方面，本发明提供了如第一方面所述的栅藻ΕΝΝ32在环境保护中的应用， 优选地所述环境保护为污水处理或CO2减排，所述污水处理包括污水的脱氮、除磷、有机物降解和/或重金属离子吸附。
在第六方面，本发明提供了如第一方面所述的栅藻ΕΝΝ32在豆蘧酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、十八碳四烯酸、α-亚麻酸、Y-亚麻酸、花生酸、 山嵛酸、虾青素、胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质和/或角黄素的药物的制备中的用途。
在第七方面，本发明提供了如第一方面所述的栅藻ΕΝΝ32在包含豆蘧酸、棕榈酸、 棕榈油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、十八碳四烯酸、α-亚麻酸、Y-亚麻酸、花生酸、山嵛酸、虾青素、胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质和/或角黄素的食品、保健品、饲料和/或水产品饵料生产中的用途。
在第八方面，本发明提供了如第一方面所述的栅藻ΕΝΝ32在包含豆蘧酸、棕榈酸、 棕榈油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、十八碳四烯酸、α-亚麻酸、Y-亚麻酸、花生酸、山嵛酸、虾青素、胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质和/或角黄素的化妆品或色素生产中的应用。
在本发明中，BGll培养基为本领域中最常用的藻类培养基，其具体组分见下文。
本发明的有益技术效果为
I、本藻种生长速度快，CO2利用率高，且细胞沉降性好，便于收集，适宜于高密度养殖，适合产业化推广
2、本藻种油脂积累快，含油量高，适合用来生产生物柴油
3、本藻种能有效去除水中的氮，适宜用于废水处理
4、本藻种本藻种温度耐受范围广泛，适合全年养殖。
图I是本发明的栅藻ENN32在显微镜下的镜检图片。图2显示本发明的栅藻ENN32的ITS部分序列及5. 8S序列在GenBank数据库中比对的结果。
进行BLAST
图3是采用邻位相连(Neighbor-joining)算法构建的栅藻ENN32的系统发育进
化树。
图4是本发明的栅藻ENN32的室内培养生长曲线
图5是本发明的栅藻ENN32在高温条件下的生长曲线。图6是本发明的栅藻ENN32在低温条件下的生长曲线
图7是本发明的栅藻ENN32中所含色素的色谱图。图8是表示本发明的栅藻ENN32中各色素的含量的柱形图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式
来进一步说明本发明的技术方案。
实施例I筛选栅藻藻株
取无菌水稀释后的从内蒙古乌兰察布地区取的土样，加入BGll培养基进行富集培养，在400倍显微镜观察后，大约细胞浓度为800—1200个/ml，用毛细管取大约Iul的藻液，接种于48孔装有BGll培养基的培养板中，在25°C、光照强度为50umol/m2. s情况下进行培养，当达到一定细胞浓度时，显微镜观察，选择只有单藻株的孔，稀释至细胞浓度为 1000-3000个/ml后铺平板，得到单藻株。
实施例2鉴定藻种及其在进化树上的分类
藻株鉴定采取形态鉴定和分子鉴定相结合的方法。
I.形状鉴定(见图I):对上述分离出来的藻株ENN32在1000倍显微镜进行观察，藻体为单细胞形态存在，细胞壁平滑，单细胞呈椭圆形。细胞长径8-10 μ m,短径 6-8 μ m0色素体周生，片状，具蛋白核一枚，无性繁殖产生似亲孢子。检索《中国淡水藻类一系统、分类及生态》，发现此藻在形态上分类相同的为绿藻门(ChlOTophyta)、绿藻纲(Chlorophyceae)、绿球藻目(Chlorococcales)、棚藻科(Scenedesmaceae)、棚藻属 (Scenedesmus)。
2.分子鉴定
A，从分离的ENN32扩增其ITS及18S部分核苷酸序列
用CTAB法提取培养4天的ENN32藻基因组DNA。取一定量的细胞，研磨处理后加入适量CTAB缓冲液，匀浆，加入等体积的酚氯仿抽提，等体积异丙醇沉淀，75 %乙醇洗涤后溶于一定体积灭菌双蒸水中，紫外分光光度计检测其浓度和纯度。
ITS序列扩增采用真核生物ITS扩增通用引物(引物合成由上海生工生物工程公司合成)。
引物I 5’ GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3’ (SEQ ID NO: I)
引物2 5，GCATATCAATAAGCGGAGGA 3，(SEQ ID NO:2)
取I μ I总DNA为模板。扩增条件如下94°C变性5min，然后94°C 40s, 56°C 40s， 72°C 2min 30个循环，最后72°C IOmin0 I. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测其扩增产物，PCR扩6增获得约750bp片断。序列如下(下划线部分为引物序列)
GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGGTTTTCCCCCCGCTTATTGATATGCTTAA
GTTCAGCGGGTAGCCTTGCCTGAGCTCAGGTCGAAAGTTTAGACATACCAT
AGGTATGTTCCTGCTTGGCTCCTAGCAAGATCCACAAGCAACAACTTCGTG
TAGTCGGCAGAAGCCGGTGCTACCTATCCAGTTGAAGCCCATACGGGTCC
TTGCTTAAGCCTCTGCACTTCAGCCAACCCAATCCGCAGTAAAGCAGATTG
GGGAAGCCAGATCCACCCCAATGGCCAGCTAGAGAAGCCGACACACCCA
ACAAGTTGGGAGGGGTGAGGGTGTAAACCGACGCTGAGGCAGACATGCT
CTTGCCCGAAGGCTCGAGCGCAATATGCGTTCAAAGATTCGATGGTTCACG
GAATTCTGCAATTCACACTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGTTG
CGAGAGCCAAGATATCCGTTGTTGAGAGTTGTCTTTGGTTAAGATTGCCAG
TTACTAGCAATCACAACTTCAGAGTTTAGTTTTAACAGTGGTTAGCACTGG
TGTATAGTCATGCCAAGGCGCCACTGAGCAGGCAGCAATGCCCACCCAGC
TGTGAGATGCGAGCGGGTTTTAAGCCGAACGCCCCACTGGCAAGCCAAGG
CACGGAACGTTGAGGTTCACATTGTGGTTTTAATAATTCAATGATCCCTCCG
CAGGTTCACCTACGGAGACCTTGTTTACGACTTTTACTTTCCATTCCTCCGC
TTATTGATATGC(SEQ ID NO:3)。
B，所克隆的核苷酸序列同源性搜索
将获得的ENN32的ITS部分序列及5. 8S序列登录GenBank数据库进行BLAST比对，结果显示与 ACCESSION 号为 DQ417571. I 的 Scenedesmus sp. Isolate pic 6/16T-1W 的 18S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2sequence 具有较高的相似性达91%，覆盖率92% (图2)。
C，根据上述序列作出进化树，见图3。
利用NCBI数据库中的BLAST工具对藻株ENN32的ITS部分序列进行序列相似性分析。选取部分同源序列和该藻株的ITS部分序列利用ClustaLx软件包进行序列同源进化比对，形成一个多重序列匹配排列矩阵。然后，运用Mega4. O软件，采用邻位相连 (Neighbor-joining)算法，自展数据集bootstraps值为1000构建系统发育进化树(见图 3)。
根据形态和ITS blast的结果，限定ENN32为栅藻属(Scenedesmus)。发明人已将所述藻株于2012年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，简称CGMCC)，其保藏号为CGMCC No. 6346。
实施例3ENN32栅藻的室内养殖及油脂积累
将处在对数生长期的栅藻藻株ENN 32绿色游动细胞接种在配制好的BGll培养基(配方见表I)中，使细胞密度达到OD75tl为0. 2-0. 8之间。培养过程光照强度控制在 50-500umol/m2. s，在培养期内，通过向培养液中通入I. 5_2%的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的PH值调节在7-9之间，温度调控在15-35°C范围内。培养所使用的反应器为 40_内径、长度600_的柱式反应器。培养过程中，定时取样测定干重，结果见图4。培养进行到第16天，藻液颜色变黄时，将藻液收集，通过离心或自然沉降的方法获得藻泥，将藻泥在进行真空冷冻干燥。
表IBGll培养基配方
权利要求
1.一种栅藻ENN32 (Scenedesmus sp.),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2012年07月13日，保藏编号为CGMCC No. 6346。
2.根据权利要求I所述的栅藻ENN32，其特征在于，所述栅藻ENN32中脂肪酸的重量百分比含量为大于40%干重，优选地大于50%干重，更优选地为51% 60%干重。
3.根据权利要求I所述的栅藻ENN32，其特征在于，所述栅藻ENN32的耐受温度为0°C至40°C，优选地10°C至35°C，更优选地20°C至30°C，最优选地25°C。
4.根据权利要求I所述的栅藻ENN32，其特征在于，所述栅藻ENN32含有虾青素、β-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质和角黄素。
5.如权利要求I至4中任一项所述的栅藻ΕΝΝ32的培养方法，所述方法包括将栅藻藻株ΕΝΝ32绿色细胞接种在BGll培养基中，其中光照强度50-500 μ mol/m2. s,优选100-450 μ mol/m2. S、更优选 150-400 μ mol/m2. s、还更优选 200-350 μ mol/m2. S、最优选250-300 μ mol/m2. s，pH 值 7-9、优选 7. 5-8. 5，更优选 8，温度 15-35°C、优选 20_30°C、更优选 25°C。
6.如权利要求I至4中任一项所述的栅藻ENN32在脂肪酸生产中的应用，优选地，所述脂肪酸是豆蘧酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳ニ烯酸、十八碳四烯酸、α -亚麻酸、Y -亚麻酸、花生酸和/或山嵛酸。
7.如权利要求I至4中任一项所述的栅藻ΕΝΝ32在生物燃料生产中的应用，优选地，所述生物燃料是生物柴油或生物こ醇。
8.如权利要求I至4中任一项所述的栅藻ΕΝΝ32在环境保护中的应用，优选地所述环境保护为污水处理或CO2减排，所述污水处理包括污水的脱氮、除磷、有机物降解和/或重金属离子吸附。
9.如权利要求I至4中任一项所述的栅藻ΕΝΝ32在制备包含豆蓮酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳ニ烯酸、十八碳四烯酸、α-亚麻酸、Y-亚麻酸、花生酸、山嵛酸、虾青素、胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质和/或角黄素的药物中的应用。
10.如权利要求I至4中任一项所述的栅藻ΕΝΝ32在包含豆蓮酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳ニ烯酸、十八碳四烯酸、α-亚麻酸、Y-亚麻酸、花生酸、山嵛酸、虾青素、胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质和/或角黄素的食品、保健品、饲料、水产品饵料、化妆品和/或色素生产中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种栅藻(Scenedesmus sp.)及其应用，本发明的栅藻具有生长速度快、油脂积累快、含油量高、能够有效去除水中的含氮化合物等优点，并且含有适合部分有益的色素，可用于生物柴油、食品、保健品、饲料、水产品饵料、药物以及化妆品的生产。
文档编号A61K36/05GK102978114SQ20121034208
公开日2013年3月20日 申请日期2012年9月14日 优先权日2012年9月14日
发明者罗少敬, 邓平, 张晓楠, 吴洪, 王冰 申请人:新奥科技发展有限公司