专利名称：一种抗人源多药耐药蛋白Fab抗体及其制备方法
一种抗人源多药耐药蛋白Fab抗体及其制备方法技术领域
本发明属于Fab抗体及其制备领域,特别涉及一种抗多药耐药蛋白Fab抗体及其制备方法。
背景技术：
肿瘤细胞的多药耐药性(mult1-drug resistance, MDR)多为获得性耐药，即在治疗前对药物敏感，治疗后对药物耐受。多药耐药性是指不仅对使用药物产生耐受，而且对其他多种结构和作用机制完全不同的药物产生交叉耐受。肿瘤细胞产生多药耐药性的最主要原因是瘤细胞膜过量表达一种ATP依赖性外排性泵，以减少化疗药物在细胞内部的积累。这种ATP依赖性外排性泵属于ABC(ATP-binding cassette)转运蛋白超家族,主要包括以下几种(I)肿瘤多药耐药蛋白Ι/P-糖蛋白即为P-gp (Mult1-Drug Resistancel/ P-glycoprotein, MDRl/P-gp)也称为 ABCBl (ATP-binding cassette BI)，它是 1976 年 Juliano等在耐药的中国仓鼠卵巢癌细胞中发现的，随后Roninson等获得人耐药KB癌细胞株的MDRl基因序列[1]，P-gp也是现在引起肿瘤多药耐药性最常见的原因。(2)多药耐药相关蛋白(3)乳癌耐药蛋白(Breast cancer resistance protein, BCRP) (4)肺耐药相关蛋白(Lung resistance related protein, LRP)。
P-gp是引起肿瘤细胞多药耐药性的最主要原因，由多药耐药蛋白基因 I (mult1-drug resistancel,mdrl)编码为两个完全相同的单体组成,每个单体含有一个七次跨膜疏水区和一个ATP结合区，两个单体组合成一个能量依赖性泵位于细胞膜上。P-gp 在分解ATP供给能量的同时，可以将肿瘤细胞内部的亲脂性化学药物排到细胞外，因此一些亲脂性药物可以竞争性抑制P-gp外排化疗药物的功能。P-gp诱导的多药耐药肿瘤中同时检测到高水平的蛋白激酶C(Protein Kinase C，PKC)，PKC主要通过磷酸化P_gp药物结合位点的丝氨酸而增强其外排化疗药物的功能。
第一代P-gp抑制剂为亲脂性化合物，如维拉帕米、奎尼丁、环孢素A等，可作为 P-gp底物，与化疗药物竞争性或非竞争性结合P-gp，从而减少化疗药物外排。但是当它们的应用剂量达到抑制P-gp功能时有很强的毒副作用，这也限制了它们的临床应用。接着第二代P-gp抑制剂出现，如PSC-833 (环孢素D衍生物)和Biricodar,它们与P-gp的亲和力更强，并且没有免疫抑制副作用；但是它们缺乏特异性，同样抑制正常组织P-gp功能，而且还抑制细胞色素P450 3A的功能进而影响药物代谢，因此它们的研发也受到限制。于是以tariquidar、0C144-093、zosuquidar、elacridar为代表的第三代P-gp抑制药物应运而生，它们对P-gp亲和力高，而且对依赖细胞色素P450 3A的药物代谢影响很小，然而它们在达到抑制P-gp功能剂量时，仍有一定的细胞毒性，目前tariquidar、zosuquidar等第三代 P-gp抑制药物还处于临床试验阶段。
临床肿瘤出现多 药耐药性多与P-gp有关，它已成为肿瘤化疗的最主要障碍之一。 通过竞争性或非竞争性抑制P-gp功能，或者直接降低P-gp的表达是逆转肿瘤多药耐药性的主要手段，随着分子生物学技术的飞速发展，制备一种更特异的逆转肿瘤多药耐药性的药物，在保证化疗药物抑制肿瘤组织生长的同时对机体正常生理代谢的影响降到最低成为可能。单克隆抗体用于抑制肿瘤多药耐药性有很多优点如可以特异性的结合P-gp抗原表位，不会影响细胞色素P450 3A依赖的药物代谢，小分子人源抗体在逆转肿瘤多药耐药中， 既不会引起机体变态性免疫反应，又因为分子量小在体内代谢快，对正常组织细胞影响小， 有助于耐药瘤细胞的化疗等。但是，到目前为之还没有抗P-gp单克隆抗体作为抑制肿瘤多药耐药的药物。
噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的基因序列插入到噬菌体结构基因的适当位置，并与结构基因融合表达于噬菌体外膜表面。现在噬菌体展示系统有多种，如丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、Τ4噬菌体展示系统等。
丝状噬菌体展示系统有很多种，Μ13丝状噬菌体展示系统为其中一种，Μ13丝状噬菌体展示系统中的Μ13噬菌体呈长丝状，直径6. 5nm，长约900nm，内含单链DNA基因组 (6，407个核苷酸)，被一层长圆柱状核衣壳保护着，长圆柱状核衣壳主要由gp8蛋白组成， 噬菌体的两端为约3 5拷贝的gp3、gp6、gp7、gp9组成。M13噬菌体为温和型噬菌体，感染万.coli XLl-blue菌后，细菌生长缓慢，但不会导致细菌裂解，噬菌体以出芽的方式从宿主细胞中释放。M13噬菌体展示系统也主要有2类(I)外源蛋白与主要核衣壳蛋白gp8融合表达，(2)外源蛋白与gp3蛋白融合表达。外源蛋白与gp8融合表达可以获得高拷贝的外源蛋白，对外源蛋白起了放大作用，但过量的外源蛋白可能阻碍噬菌体再次侵染宿主菌，反而不利于淘选鉴定；外源蛋白与gp3蛋白融合表达，每个噬菌体携带有3 5拷贝的外源蛋白，对噬菌体结构影响较小，有利于应用到淘选鉴定中，获得相对高亲和力的抗体或受体。
噬菌体展示技术是一种将基因型和表型统一起来的基因工程技术，即淘选获得目的蛋白的同时可得到该蛋白的基因序列。现在M13噬菌体展示技术系统须包括以下三个要素携带噬菌体结构蛋白基因(最常用gp3)的噬菌粒载体、辅助M13噬菌体、带F性菌毛 E. coli。首先将目的基因片段克隆到噬菌粒载体上，并转化进带F性菌毛的疋coli宿主中；然后辅助M13噬菌体通过其一端由gp3、gp6、gp7组成的配体结构与宿主菌F性菌毛结合，逐渐将其基因组释放到宿主菌中；噬菌体在宿主菌内复制，同时噬菌粒载体也表达与外源蛋白融合的噬菌体结构蛋白，噬菌体核衣壳便错误地将噬菌粒载体包装进去，这种错误包装的噬菌体可以再次感染疋宿主菌，但不能再次扩增出新的噬菌体。通过对释放出的噬菌粒反复的“亲和-洗脱-扩增”过程，最终获得表达目的蛋白的基因克隆，即完成表型与基因型的统一。
现在M13噬菌体展示技术在淘选特异性的单克隆抗体得到广泛的应用，近年来利用噬菌体展示技术已经成功制备了各种单链抗体、Fab抗体以及完整IgG抗体。噬菌体展示技术在制备淘选单克隆抗体方面相对于杂交瘤技术具有以下优点容易实现高通量淘选、 可以制备小分子量亚单位单克隆抗体、获得的抗体克隆株更容易长期保存、易于实现大量生产等，因此噬菌体展示技术在单克隆抗体淘选和制备中引起重大变革。在构建M13噬菌体抗体库过程中最常用到pComb3载体及XLl-blue宿主菌，pComb3载体具有氨节青霉素抗性并且含有两个克隆位点位于gp3基因上游的IgG重链克隆位点和单独的轻链克隆位点； XLl-blue宿主菌具有四环素抗性，本身具有F性菌毛，可被M13噬菌体感染。
M13噬菌体 展示技术操作简便，常用于分子生物学研究中，它不仅可以进行高通量的抗体淘选，在研究蛋白质之间相互作用方面也有独到的优势，并且在以后研究药物作用靶点、疾病的分子病理机制等方面将发挥越来越重要的作用。
通过竞争性或非竞争性抑制P-gp功能，或者直接降低P-gp的表达是逆转肿瘤多药耐药性的主要手段，随着分子生物学技术的飞速发展，利用M13噬菌体展示技术制备一种更特异的逆转肿瘤多药耐药性的药物，在保证化疗药物抑制肿瘤组织生长的同时对机体正常生理代谢的影响降到最低成为可能。发明内容
本发明的目的是提供一种利用M13噬菌体展示技术获得特异性抗人P-gp跨膜区 (氨基酸784 968)的Fab抗体克隆，及其制备方法。本发明为监测因P_gp引起的肿瘤多药耐药的发生、研究P-gp跨膜区(氨基酸784 968)的功能以及制备抑制肿瘤多药耐药的抗体药物提供可能。
本发明为人P-gp跨膜区氨基酸784 968的Fab抗体蛋白(以下简称为PFab29 抗体)，其轻链的基因序列具有SEQ ID No.1的序列，其轻链基因编码的氨基酸序列具有SEQ ID No. 2的序列,其重链的基因序列具有SEQ ID No. 3的序列,其重链基因编码的氣基酸序列具有SEQ ID No. 4的序列。
本发明PFab29抗体的制备方法如下(I)提取多药耐药人大肠癌组织总RNA并反转录为cDNA，设计引物，序列如下
权利要求
1.一种抗人源多药耐药蛋白Fab抗体，其特征在于基因全序列见序列表SEQ ID No. 1,3。
2.如权利要求1所述的序列，其特征在于轻链基因的序列全长为635bp，序列见序列表 SEQ ID No.1。
3.如权利要求2所述的序列，其特征在于轻链基因所编码的多肽为211个氨基酸，见序列表 SEQ ID No. 2。
4.如权利要求1所述的序列，其特征在于重链基因的序列全长为696bp，序列见序列表 SEQ ID No. 3。
5.如权利要求4所述的序列，其特征在于重链链基因所编码的多肽为232个氨基酸， 见序列表SEQ ID No. 4ο
6.—种权利要求1所述的抗人源多药耐药蛋白Fab抗体的制备方法如下(1)提取多药耐药人大肠癌组织总RNA并反转录为cDNA，设计引物，序列如下Sense primer CCGGAATTCCTCACCAAGCGGCTCCGAT ；Ant1-sense primer CCGCTCGAGGAGTTTATGTGCCACCAAGTAG ；上游(5'端)引物引入EcoR I酶切位点，下游(3'端)引物引入Xho I酶切位点，合成引物，利用设计引物PCR扩增目的基因片段JfpET28a(+)载体和P_gp784_968目的基因分别进行Xho I和EcoR I双酶切，然后凝胶回收并定量；(2)pET28a(+)载体与P_gp784_968目的基因连接，热激转化BL21(DE3)感受态细胞涂布 LB/Kan (卡那霉素)平板，培养，提取质粒，然后进行Xho1、EcoR I双酶切鉴定，选择酶切结果阳性的克隆，测序，见序列表SEQ ID No. 5的序列；(3)取鉴定正确的阳性克隆P_gp784_968菌液，于LB/Kan液体培养基中培养，加入IPTG诱导表达，纯化，得P_gP784-968蛋白，见序列表SEQ ID No. 6的序列，备用；(4)另取多药耐药性大肠癌病理组织，免疫小鼠，利用酶联免疫吸附法(ELISA)测定抗体滴度抗体滴度大于1:512，提取总RNA并在PCR仪上进行逆转录为cDNA ；以cDNA为模板， PCR法扩增引物，进行PCR，设计17条重链上游引物和5条重链下游引物及20条轻链上游引物及2条轻链下游引物，序列见SEQ ID No. 7-50，其中重链Y引物引入Xho I酶切位点3'引物引入Spe I酶切位点，轻链5'引物引入Sac I酶切位点，3'引物引入Xba I酶切位点；(5)将载体pComb3质粒与重链Fd段扩增产物分别进行Xho1、Spe I双酶切并连接， 连接产物热激转化XLl-blue感受态细胞，得到重链Fd-pComb3库质粒，将轻链扩增产物与 T载体连接，将连接产物热激转化TOPlO感受态细胞，得到轻链T-L库质粒，重链Fd-pComb3 库质粒与轻链T-L库质粒分别进行Xba1、Sac I双酶切，连接，连接产物热激转化至 XLl-blue感受态细胞，得到Fab抗体库；(6)取Fab抗体库，加入噬菌体VCSM13，振荡培养，得到Fab噬菌体抗体库，备用；(7)用纯化后的P_gp784-968蛋白包被ELISA板，对Fab噬菌体抗体库进行淘选，经过五轮淘选后，提取阳性克隆质粒，分别进行Xba I ,Sac I和Xho I ,Spe I双酶切鉴定，得酶切鉴定后的Fab抗体克隆株；(8)取酶切鉴定后的Fab抗体克隆株，Fab抗体克隆株加入IPTG诱导表达，将表达产物分别以高表达P-gp的大肠癌组织匀浆液以及原核表达的P_gP784-968肽段为抗原行Elisa检测，两项检测一致、读值最高的克隆再行westernblot鉴定；提取双重鉴定均为阳性的克隆株质粒，Spel/Nhel双酶切后连接，重新转热激转化XLl-blue感受态细胞，获得鼠源抗人大肠癌P_gP784-968的Fab抗体克隆株PFab29，测序所表达的抗体为IgG2a亚型，见序列SEQ IDNo. 1，3。
7.权利要求1所述的抗人源多药耐药蛋白Fab抗体在制备抑制肿瘤多药耐药药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种抗人源多药耐药蛋白Fab抗体及其制备方法，属于抗体及其制备领域；本发明为取多药耐药性大肠癌病理组织总RNA并逆转录为cDNA，利用本实验室设计的特异性引物扩增出P-gp跨膜区(氨基酸784～968)基因片段，克隆至pET28a(+)载体并转化E.coliBL21(DE3)，IPTG，30℃诱导表达，表达产物经镍离子亲和层析柱纯化后WesternBlot鉴定。将纯化的P-gp784-968蛋白作为抗原，对利用17条重链上游引物和5条重链下游引物；20条轻链上游引物及2条轻链下游引物，用原核表达的P-gp784-968肽段对pComb3载体的P-gpFab抗体库进行五轮淘选，最终淘选所获得的克隆进行双酶切鉴定及IPTG诱导表达，表达产物通过ELISA及WesternBlot鉴定后获得阳性克隆菌株，并测序，得PFab29。本发明为制备抑制肿瘤多药耐药的药物提供可能。
文档编号A61K39/395GK103044547SQ20121037925
公开日2013年4月17日 申请日期2012年10月9日 优先权日2012年10月9日
发明者张学梅, 张海玉, 王清, 李俊 申请人:大连大学