专利名称：物理改性后的眼镜蛇蛇毒在制备治疗免疫衰老和相关疾病药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于药物新用途技术领域，具体涉及一种物理改性后的眼镜蛇蛇毒在制备治疗免疫衰老和相关疾病药物中的用途。
背景技术：
蛇毒是由蛇的毒腺分泌的多种组分构成的复杂混合物。新鲜毒液呈蛋清样粘稠液体，具有特殊的腥味。不同蛇种毒液色泽各异，中华眼镜蛇蛇毒呈淡黄色。蛇毒的干物质中90%以上是蛋白质，是其毒性和其生物学活性的主要成分。中华眼镜蛇蛇毒成分主要有眼镜蛇蛇毒因子(I%-2%)、心脏毒素(又名细胞毒素40%-50%)、神经毒素(10%)等其它类蛋白质。祖国传统医学认为眼镜蛇及其毒性成分可通经络，祛风湿，并具有强身健体之功效。早在二十世纪初，人们就开始应用蛇毒来缓解恶性肿瘤疼痛、神经痛和关节痛，随后出现一系列关于蛇毒有类似吗啡样镇痛作用的报道。随着研究的不断深入，现在，蛇毒及其制品已应用于临床，除了镇痛作用外，研究发现在抗风湿、抗肿瘤以及在神经系统疾病治疗方面都有很好的疗效。近年来又先后发现了蛇毒可以影响实验动物的免疫功能。
发明内容
本发明目的在于提供一种眼镜蛇蛇毒在制备治疗免疫衰老和相关疾病药物中的应用，提供了一种治疗因免疫衰老所引起的多器官组织损害性病变的新思路、新方法。为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是一种眼镜蛇蛇毒在制备治疗免疫衰老和免疫衰老相关疾病药物中的应用。优选的，所述物理改性后的眼镜蛇蛇毒是将天然眼镜蛇蛇毒用去离子水溶解后加热变性得到的，加热变性时控制加热温度在100±5°C，加热时间为5min lOmin。优选的，所述天然眼镜蛇蛇毒选自中华眼镜蛇蛇毒或泰国眼镜蛇蛇毒。优选的，所述免疫衰老和相关疾病包括具有炎性病变或器官组织结构损伤的疾病。优选的，所述物理改性后的眼镜蛇蛇毒的给药剂型选自口腔速溶药膜、口服液、胶囊、涂剂、巴布剂、喷雾剂和注射剂。优选的，所述药物为物理改性后的眼镜蛇蛇毒与其他药物活性成分组成的复方制剂或物理改性后的眼镜蛇蛇毒与药用辅料形成的单方制剂。优选的，所述复方制剂为物理改性后的眼镜蛇蛇毒、未经改性的天然眼镜蛇毒与药用辅料混合形成。本发明目的是提供改性中华眼镜蛇蛇毒在制备治疗免疫衰老引起或相关的以多器官组织炎性病变和结构损伤为主要病变特征的疾病药物中的用途。本发明技术方案中天然眼镜蛇蛇毒物理改性方法是将眼镜蛇蛇毒用去离子水溶解后加热变性，加热温度在100°C左右，加热时间为5min IOmin后得到的。本发明中天然眼镜蛇蛇毒为眼镜蛇 总毒，将其物理改性后可用于制备治疗与免疫衰老相关与以多器官组织炎性病变和结构损伤为主要病征疾病的药物。优选的，所述的眼镜蛇蛇毒为中华眼镜蛇总蛇毒。根据成份和药效的相同性，所述天然眼镜蛇蛇毒可以是泰国眼镜蛇蛇毒和其它眼镜蛇蛇毒。本发明经动物实验证实物理改性后的中华眼镜蛇总毒在药学上有效量(如小鼠10-3000 μ g/kg)范围内能有效减轻因免疫衰老与相关疾病中全身多种器官组织病变，具体作用包括减轻免疫器官脾脏、淋巴、胸腺的衰退、细胞损伤和结构异常，还能减轻心肌、肝脏，肺脏、肾脏及皮肤炎性病变和结构损伤，光镜下可见正常衰老对象的器官组织内部有结构异常，细胞破损、变性甚至死亡等病态表现，而经物理改性后的中华眼镜蛇总毒治疗后上述表现皆有不同程度改善。从上可知，物理改性后的中华眼镜蛇总毒治疗不仅不影响衰老机体正常的生化功能而且可使异常生化功能转向正常发展，而且能改善衰老相关的学习记忆能力下降，耐力素质降低等现象，具有用量小、安全、可口服、可注射、可透过口鼻粘膜和皮肤给药等优点。本发明通过中华眼镜蛇总毒经物理方法处理达到减毒增效目的，物理处理后的眼镜蛇毒能够治疗免疫衰老相关的心肌和肝脏，肺脏、脾脏、淋巴、胸腺、肾脏及皮肤炎性病变和损伤，其疗效超过未经处理的眼镜蛇毒或纯化的神经毒素(Cobratoxin)。所述药物包括口服液、口腔速溶药膜、胶囊、涂剂、巴布剂、喷雾剂和注射剂等，所述药物还包括各种单方和复方制剂。中华眼镜蛇蛇毒在临床上已用于治疗风湿和缓解恶性肿瘤疼痛、神经痛和关节痛等，但都用纯化的神经毒素、多种蛇毒的混合制剂或眼镜蛇毒和其它中药的复方制剂。鉴于中华眼镜蛇毒毒性比较大，蛇毒中的药用成分主要是蛋白质，其结构和生物活性可以被理化因素改变。蛇毒在用过氧化氢处理后，二硫键被打开，其毒性大大降低，但是镇痛作用也几乎消失，提示生物学活性被破坏。而蛋白质加热后可发生可逆性变性，变性后空间结构发生了改变，或部分大分子蛋白质因加热部分分解为小分子量蛋白质。小鼠试验证明这种加热变性之后的蛇毒毒性明显减少，而药效增加。
经长期研究，本发明人发现加热变性的中华眼镜蛇蛇毒能有效减轻因免疫衰老引起的全身多种器官组织病变，具体作用包括减轻心肌和肝脏，肺脏、脾脏、淋巴、胸腺、肾脏及皮肤炎性病变和结构损伤，光镜下可见正常衰老对象的器官组织内部有结构异常，细胞破损、变性甚至死亡等病态表现，而经蛇毒治疗后上述表现皆有不同程度改善。提示对免疫衰老相关的感染性疾病以及所伴有的器官组织损伤有很好的治疗作用。这一发现，将对免疫衰老和相关疾病的研究和药物开发产生重大的影响，并有临床实用价值，为中华眼镜蛇蛇毒开辟临床新的用途。所述的眼镜蛇总毒是在用去离子水溶解的情况下，加热温度为100°C左右(100±5°C)，时间在5min IOmin后得到的。相对于现有技术中的方案，本发明的优点是采用经物理改性的中华眼镜蛇总毒，毒性低而药效高。中华眼镜蛇蛇毒能减轻免疫衰老和相关疾病中多器官组织炎性病变程度，并且最终使其转向正常水平发展。炎性病变多发在肝脏、肺脏、肾脏，而且很显然中华眼镜蛇毒能够减轻肝脏、肺脏、肾脏的炎性病变程度，并使之向正常结构恢复。中华眼镜蛇蛇毒不仅能减轻免疫衰老和相关疾病中多器官组织结构损伤并能逐渐恢复其正常结构和功能。具体作用包括减轻脾脏、淋巴、胸腺、心肌、肝脏，肺脏、肾脏及皮肤的结构损伤以及恢复以上器官组织正常的结构与功能。中华眼镜蛇蛇毒能减缓免疫衰老和相关疾病中多器官组织的异常脏器体重变化。间接反应减轻器官组织损伤程度甚至可能使其恢复至正常结构。中华眼镜蛇蛇毒不仅对免疫衰老和相关疾病原有的仍正常生理生化功能无影响，甚至能够使免疫衰老致多器官组织异常生理生化功能向正常水平发展恢复。中华眼镜蛇蛇毒能够使免疫衰老相关的下降的学习记忆功能呈现不同程度的上升趋势。中华眼镜蛇蛇毒能够使免疫衰老相关的减弱的抗疲劳能力既耐力素质呈现不同程度增强趋势。中华眼镜蛇蛇毒不仅能够使免疫衰老和相关疾病中皮肤毛发异常恢复到正常水平，甚至能优越于正常水平。即毛发生长的浓密黑亮等程度皆显著优于正常毛发水平。中华眼镜蛇蛇毒用量少，从10 3000 μ g/kg都有很好的治疗免疫衰老和相关疾病的作用，经换算人用剂量约为I 1000 μ g/kg。本发明公开了中华眼镜蛇蛇毒在制备治疗免疫衰老和相关疾病药物中的用途。本发明发现改性中华眼镜蛇总毒在(10-3000 μ g/kg)范围内能有效减轻与免疫衰老相关的全身多种器官组织病变，具体作用包括减轻心肌和肝脏，肺脏、脾脏、淋巴、胸腺、肾脏及皮肤炎性病变和结构损伤，光镜下可见正 常衰老对象的器官组织内部有结构异常，细胞破损、变性甚至死亡等病态表现，而经蛇毒治疗后上述表现皆有不同程度改善。蛇毒治疗不仅不影响衰老机体正常的生化功能而且可使异常生化功能转向正常发展。改善免疫衰老相关的学习记忆能力下降，耐力素质降低等现象。具有用量小、安全、可口服、可注射、可透过口鼻粘膜和皮肤给药等优点。
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述图1为中华眼镜蛇蛇毒对免疫衰老和相关疾病中的肾，肺及肝炎的影响(病理)；图2为中华眼镜蛇蛇毒对免疫衰老和相关疾病中多器官组织结构损伤的影响(病理)；图3为中华眼镜蛇蛇毒对免疫衰老和相关疾病中多器官异常脏器系数的影响；图4为中华眼镜蛇蛇毒对免疫衰老和相关疾病中生化指标检测的影响；图5为中华眼镜蛇蛇毒对免疫衰老和相关疾病中血常规影响；图6为中华眼镜蛇蛇毒对免疫衰老相关的下降的的学习记忆能力影响(Y迷宫)；图7为中华眼镜蛇蛇毒对免疫衰老相关下降的耐力素质的影响(小鼠转轮式疲劳仪)。
具体实施例方式以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体实验的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。实施例物理处理后的中华眼镜蛇毒的动物药效学实验将C57BL/6小鼠(n=45)，雌性，体重16_18g，随机分为3组(每组15只)生理盐水对照组，中华眼镜蛇蛇毒加热(30 μ g/kg)，中华眼镜蛇蛇毒加热(100 μ g/kg)。灌胃给药为期一年，给药剂量在10-3000 μ g/kg, 一天一次。中华眼镜蛇蛇毒为2011年购买自中国江西省鹰潭市余江县彩虹养蛇场。将天然眼镜蛇蛇毒用去离子水溶解后加热变性得到的，力口热变性时控制加热温度在100±5°C，加热时间为5min IOmin得到物理改性后的中华眼镜
蛇蛇毒。正常C57BL/6小鼠体内I gG在20月龄前缓慢增加，IgG2b为高值，IgGl为低值。随着C57BL/6小鼠年龄的增长，机体随增龄而老化，器官功能衰退，免疫功能异常，疾病的发生机会增多。实验结果如下图1为中华眼镜蛇蛇毒对该鼠的肾，肺及肝炎的影响(X 400 )。首先可见正常衰老鼠的肾脏，肺脏和肝脏都发生了较严重的炎症，相同点是大量淋巴细胞浸润主要在三个脏器的血管周围，有部分正常衰老鼠还可以看到其肾脏内血管肿胀，变形，周围有组织细胞损伤，坏死。肺和肝也都是发生了血管极其周围炎性浸润且为弥漫性，且围绕血管一圈附近有组织细胞损伤，坏死，胞核消失，有细胞碎片。而给药之后的三种脏器却只有轻微局部炎症甚至无炎症发生。具体的，图1A中正常衰老C57BL/6小鼠(对照)存在严重的肾脏内血管及其周围炎症，肾小球数量严重减少；图1B中用蛇毒(30μ g/kg)灌胃小鼠则基本无炎症反应，但肾小球数量偏少；图1C中用蛇毒(100 μ g/kg)灌胃小鼠同样基本无炎症反应，肾小球数量基本正常；图1D中正常衰老C57BL/6小鼠(对照)不仅可见严重的肺脏炎症，还有血管和肺泡结构破坏，肺泡壁和肺泡间隔增厚；图1E中用蛇毒(30μ g/kg)灌胃小鼠则基本无肺内炎症反应；图1F中用蛇毒(100μ g/kg)灌胃小鼠同样基本无炎症反应，偶有轻度肺泡间隔充血；图1G中正常衰老C57BL/6小鼠( 对照)可见严重的血管极其周围炎症，肝门静脉於血，肝细胞结构损坏甚至死亡等；图1H中用蛇毒(30μ g/kg)灌胃小鼠基本无肝内炎症反应，轻度肝细胞变性或损坏；图1I中用蛇毒(100 μ g/kg)灌胃小鼠同样基本无肝脏炎症反应。图2为八种脏器病理图(X400)。首先看心脏病理结果图，正常对照的心肌纤维由于断裂，消失，出现了大量心肌纤维裂隙而且裂隙显著大于任一给药组(无或只出现少量心肌纤维裂隙)，甚至蛇毒组(100 μ g/kg)已基本恢复至正常心肌。对照组的心肌纤维中大面积出现了淡灰色异物组织，有的甚至出现在心外膜间隙，使心外膜增厚。再看肺脏病理结果，该肺脏除血管壁极其周围炎性浸润，周围组织细胞坏死外，还可见肺泡壁和肺间隔增厚，影响到肺泡功能，表现为机体呼吸功能障碍。同样蛇毒给药组的心脏和肺脏病理形态表现都大大优于对照组，其中的较大剂量组更佳，接近于正常组织。图2A中正常衰老C57BL/6小鼠(对照)可见心肌纤维出现较大裂隙；图2B中用蛇毒(30 μ g/kg)灌胃小鼠心肌纤维裂隙减少，基本趋向于正常；图2C中用蛇毒(100μ g/kg)灌胃小鼠心肌纤维裂隙更少，结构基本正常；图2D中正常衰老C57BL/6小鼠(对照)存在严重的肺脏炎症反应，肺泡壁和肺泡间隔增厚，且有间隔充血水肿；图2E中用蛇毒(30μ g/kg)灌胃小鼠肺泡极其周围结构基本正常，偶有局部轻度肺淤血；图2F中用蛇毒(100g/kg)灌胃小鼠肺脏结构基本正常。图2G气中的肝脏病理结果显示，对照的肝有较严重的病态病理表现(X400)。图中可见肝脏除炎症外肝门静脉周围的肝细胞多数已变性，损伤甚至死亡，光镜下可见细胞核固缩有的甚至消失，胞质肿胀，已无正常结构。脾脏和淋巴与胸腺病理结果也表明，正常对照鼠的免疫器官都发生了严重的病变，首先是脾脏的紅髓和白髓界限已不清楚，而且脾脏被膜下周围一圈白髓内的淋巴细胞绝大多数发生了变性，坏死，胞核变小甚至消失，有很多细胞碎片存在，明显出现大量巨噬细胞。图2G中正常衰老C57BL/6小鼠(对照)肝脏血管极其周围炎症而且有肝细胞空泡状脂肪变性，损坏甚至死亡；图2H中用蛇毒(30μ g/kg)灌胃小鼠肝脏细胞肿胀现象有所改善，呈现较多肝细胞，胞核比对照有增大，肝血窦等结构也基本正常；图21中用蛇毒(100 μ g/kg)灌胃小鼠肝脏结构基本正常；图2J中正常衰老C57BL/6小鼠(对照)被膜结构损坏，白髓内淋巴细胞大量死亡，巨噬细胞大量存在吞噬死亡细胞，紅髓白髓界限模糊，脾脏正常结构消失；图2K中用蛇毒(30μ g/kg)灌胃小鼠脾脏结构基本正常，出现了动脉周围淋巴鞘；图2L中用蛇毒(100 μ g/kg)灌胃小鼠脾脏结构基本正常，出现了生发中心，紅髓白髓界限清晰。同时图2Μ 的淋巴结和胸腺病理结果(X400)表明，正常衰老鼠的淋巴结皮质和髓质界限不清，被膜变薄甚至结构破坏，小梁，淋巴窦等结构近乎消失，甚至被膜下附近一圈淋巴细胞多数变性，损伤甚至坏死，细胞体积增大，胞核变小甚至消失，有细胞碎片大量存在及吞噬细胞碎片的巨噬细胞数量异常增加。本实验中正常衰老小鼠的胸腺内皮质增力口，髓质萎缩，几乎无髓质。图2Μ中正常衰老C57BL/6小鼠(对照)淋巴结被膜结构破坏，小梁及淋巴窦结构消失，皮质髓质界限不清，且皮质内大量淋巴细胞死亡，结构破坏，大量巨噬细胞出现吞噬死亡细胞；图2Ν中用蛇毒(30μ g/kg)灌胃小鼠淋巴结结构基本正常，皮质髓质界限清晰，小梁，淋巴窦结构出现；图20中用蛇毒(100 μ g/kg)灌胃小鼠淋巴结皮质髓质界限清晰，有小梁，淋巴窦等结构；图2P中正常衰老C57BL/6小鼠(对照)胸腺皮质内淋巴细胞过度增生；图2Q中用蛇毒(30 μ g/kg)灌胃小鼠胸腺皮质内淋巴细胞过度增生现象有所改善，髓质面积开始扩大；图2R中用蛇毒(100μ g/kg)灌胃小鼠的胸腺皮质和髓质结构基本正常。最后观察图2S Z中肾脏和皮肤病理结果(X400)。从肾脏病理可看出正常衰老鼠的肾脏结构严重破坏。肾小球数量急剧减少，视野内只有少数肾小球，肾小球体积异常，结构破坏，提示有大量肾小球在处死前期已损伤，变性甚至消失。肾小管结构异常，管壁增厚，管腔狭窄，管壁细胞胞核固缩，胞体色淡，有变性甚至死亡现象(细胞碎片出现)，而给药组则呈剂量依赖性的表现出较好的肾脏结构。主要可观察到肾脏的肾小球数量和大小逐渐向正常水平恢复甚至有多数结构已`基本正常；肾小管，血管等极其周围也无炎症发生且结构正常。重点是皮肤病理结果，实验中发现正常衰老对象的皮肤内毛囊与皮脂腺等结构皆异常。图中对照鼠皮肤的毛囊周围腺泡内的细胞胞体极大，胞核固缩，有的甚至没有胞核，全部为胞质(大量小脂滴)。正常情况下，腺细胞体积小，数量多，只有少数属成熟期(渐变大最终裂解释放皮脂)，给药组的毛囊结构较为正常，附属皮脂腺，腺泡少，其内变大成熟的腺细胞亦少，甚至没有。而对照小鼠毛囊附属腺泡不仅数量多且有大量成熟的腺细胞；同时皮脂分泌过旺，其内有些成分对皮肤的毒性作用过强等，导致最终的中毒、枯萎、脱落。特别的是相比于对照鼠，给药鼠皮肤组织成分少皮层薄，此属老龄化正常病理表现。对照皮肤内因大量腺泡，腺细胞的存在成为主体结构，以致视野内尽是皮脂腺，脂肪细胞相比之下则因占有面积不多而不易在同一视野内观察到，甚至因很难观察到而被忽略。图2S中正常衰老C57BL/6小鼠(对照)肾小球数量严重减少，肾小管结构异常，管壁增厚，管腔狭窄，管壁细胞有变性死亡现象；图2T中正常衰老C57BL/6小鼠(对照)存在严重的炎症反应，肾小球和肾小管结构严重破坏，肾间质充血；图2U中用蛇毒(30 μ g/kg)灌胃小鼠肾小球略有增大但结构基本正常，肾小管管壁轻度增厚，绝多数肾小管管壁细胞状态良好；图2V中用蛇毒(100 μ g/kg)灌胃小鼠的肾小球和肾小管结构基本正常；图2W中正常衰老C57BL/6小鼠(对照)毛囊周围皮脂腺过度增生；图2X中正常衰老C57BL/6小鼠(对照)毛囊周围皮脂腺过度增生压迫毛囊，毛囊结构异常；图Ti中用蛇毒(30 μ g/kg)灌胃小鼠毛囊结构基本正常，只是总体皮层较薄；图22中用蛇毒(100μ g/kg)灌胃小鼠毛囊结构基本正常，皮层同样较薄。图3为中华眼镜蛇蛇毒对免疫衰老相关的器官脏器指数的影响。因胸腺皮质适应性增生所以胸腺质量在正常衰老小鼠内是增加的，但是经蛇毒治疗的小鼠其心肌，肝脏，脾脏，淋巴结，肺脏，肾脏，脑等器官的损伤都减轻或恢复至正常水平，没有细胞的坏死或结构的损伤和或消失所以这些脏器的体重是相对大于正常衰老对照鼠，只有胸腺因适应性增生，经治疗后恢复至正常的结构，即皮质髓质界限分明，被膜，胸腺小体等结构都出现，皮质不再异常增生，故胸腺脏器指数是下降的。图3中A，B，C，D，E，F，G图中，*表示与对照组(正常衰老C57BL/6组)比较，p〈0. 05，μ表示与对照组比较，p〈0. 01，表示与对照组比较，ρ〈0· 001。在给予中华眼镜蛇蛇毒约Ilw时，各组小鼠之间皮肤毛发开始出现明显差异。对照组毛发变稀，在头面部、肩胛间、背部发现有脱毛现象，皮肤松弛，肌肉较无力，随增龄而加重；相比之下，给蛇毒治疗的两组的黑色毛发依然状态良好，甚至比该鼠原先的黑色更有光泽，皮肤弹性也是明显优于正常衰老对照组。接着在给药19w时，正常衰老对象其脱毛现象愈加严重，脱毛部位面积显著增加，但各个脱毛部位始终独立存在并未有连接现象，既中间仍然有正常皮肤毛发；同时两组蛇毒给药组间也出现了差异，蛇毒(30μ g/kg)组虽然皮肤毛发总体评估仍优于对照组但有少数动物开始出现脱毛现象；蛇毒(100 μ g/kg)组则非常好的保持着其黑亮浓密的毛发健康生长，未见一例有脱毛等任意病态表现。随着蛇毒的继续给予，在给药34周时，蛇毒的两个治疗组间情况又再次出现了反转。首先，作为对照的正常衰老对象原先脱毛部位不再有扩大，既不再脱毛当然也并无毛发再生现象，该鼠在此时的特征表现是毛发颜色开始变化，出现大量灰白色糠秕状鳞屑一类似头皮屑，在全身皮肤上散在存在，尤其在脱毛区域更为集中存在，毛发干燥。同时小鼠体重较给药组偏小显著，瘦弱，活动量少，肌肉无力等。而两组给药组在这些方面比对照有明显优势，总体显得年轻活跃。重点是两组间的脱毛现象在此时出现了反转。小剂量蛇毒给药组在此阶段已基本恢复原先的正常毛发状态，且毛发颜色黑亮，目测似乎比之前更浓密，活动也良好；只有个别未完全恢复，但其脱毛部位范围明显在缩小，表面呈黑点状(新生毛发初始状态)，也就是该组小鼠的脱毛状态经蛇毒治疗后已经得到了很好的改善，基本恢复健康皮肤毛发和精神状态。而大剂量组却少数开始出现脱毛现象，但是毛发上不存在白色鳞屑，日后更发现有明显的脱毛部位炎症反应。该组状态较小剂量组差，但仍优于正常衰老对照，至少其毛发颜色黑亮，活动正常。在给药12个月后处死小鼠，摘眼球取血，室温静置数小时，待看到EP管界面有明显分层即有少量血清自然析出后，将血清在4°C，4000r/mi η离心10分钟，将分离所得血清送医院作血液生化和血常规检查，所得结果见图4及图5。在图4与图5的各个复图中，*表示与对照组(正常衰老C57BL/6组)比较，ρ〈0· 05, **表示与对照组比较，ρ〈0· 01, ***表示与对照组比较，Ρ〈0. 001。图4为中华眼镜蛇蛇毒对免 疫衰老和相关疾病中生化指标检测的影响，由图中可以看出中华眼镜蛇蛇毒不仅对免疫衰老相关的正常生化功能无显著影响(主要包括ALT、AST，血清钠等)，甚至能够使免疫衰老所致多器官组织异常生化功能(主要是白蛋白、球蛋白、A/G、血肌酐、血尿素氮，血钾等)向正常水平发展恢复。因该正常衰老小鼠易产生免疫耐受，血清免疫球蛋白产量低，即球蛋白总量低，经蛇毒治疗后可使球蛋白总量增加，白蛋白下降，这也提示了蛇毒的确可能通过增加免疫球蛋白的量来达到治疗作用，既解除该机体免疫耐受作用，逐渐恢复正常免疫应答，从而有球蛋白增加的生化结果，与前后推断相呼应。图5为中华眼镜蛇蛇毒对免疫衰老与相关疾病中的血常规的影响。实验中正常衰老对象白细胞计数偏低，其中尤以淋巴细胞计数偏低为主要原因，这与免疫衰老导致免疫功能缺陷紧密相关，经过蛇毒治疗后，这两项指标逐渐向正常恢复，以小剂量蛇毒治疗得到的效果更为显著,见图5中的A和B。各组小鼠的日常活动的敏捷性，活跃度等及身体健康状况也有明显不同。给药组在鼠笼内活动频繁而对照组相对较安静；对照鼠在气候变化(特别是潮湿阴冷天气)时易得感冒，而给药组身体素质相对较好。试验采用了 Y迷宫实验来研究各组小鼠间的空间识别记忆能力差异。用小鼠转轮式疲劳仪研究各组小鼠间抗疲劳即耐力素质水平的差异。图6为中华眼镜蛇蛇毒对免疫衰老相关的下降的学习记忆能力的影响。本实验中采用的是Y迷宫电刺激测试。具体方法每只小鼠先在迷宫中适应3-5min，然后开始正式实验。每次电击延时为3-5s，一般5s，直到小鼠的训练过程中连续9次正确反应即为学会。在实验前三天，每天训练每只小鼠20次，即固定训练次数法，记录小鼠每天的正确次数，正确次数越多，说明学习能力越强。约3-4天绝大多数小鼠可达到学会标准，可淘汰个别过度活跃或过度迟钝的类型。前期学习过程可根据各组小鼠学习天数或每日正确反应率统计后进行初步评价，结果见图6 (A与B).接着进行记忆保持能力的检测，以正确反应次数占总检测次数的百分比表示记忆保持能力(正确反应的次数/总检测次数X 100%)，此值越高说明记忆力越好。检测时间点分别是在学习阶段之后的连续三天，第一周，第三周，第九周。结果见图6 (C与D)。由图6 我们可得到如下结论用蛇毒治疗的两组小鼠的学习记忆能力皆显著优于正常衰老对照鼠，具体表现为蛇毒治疗组学习的前三天的每日错误次数较少，正确反应率较高(相比于正常衰老对象)，而且差异显著。三组小鼠在学习的第四日统一达到了学会标准，故此，从此日开始进行了记忆保持能力检测实验。得到的结果仍是蛇毒治疗组的记忆保持能力要显著高于正常衰老对照组，可从图中的每日错误次数和正确反应率得到该结论。图6在A，B，C，D四图中，*表示与对照组(正常衰老C57BL/6组)比较，ρ〈0· 05, **表示与对照组比较，ρ〈0· 01,林*表示与对照组比较，ρ〈0· 001。图7为中华眼镜蛇蛇毒对运动耐力下降的影响。实验中采用的仪器是YLS-10B小鼠转轮式疲劳仪。实验如下将实验时间恒定在较统一的时间段下午一点到三点，前后都不可进行实验。一天可进行两次实验。每次在各组随机选取5只小鼠进通道奔跑，三组共15只小鼠，同时，各小鼠奔跑的通道也是随机选择的，以避免通道差异可能会产生的一些干扰作用。第一轮结束后擦洗仪器，待仪器干净干燥后可对各组余下的共15只小鼠进行实验。结束后如需重复实验，则设定在最近一次实验结束的第三天之后，由图7我们得到结论给予蛇毒治疗后，该小鼠的抗疲劳能力即耐力素质显著高于正常衰老对照组，不论是进行了总测试时间是35. 5分钟或是60分钟，蛇毒的两个治疗组小鼠的平均奔跑时间和奔跑距离都多于对照组，且差异显著。图7Α，B中，*表示与对照组(正常衰老C57BL/6组)比较ρ〈0. 05，#表示与对照组比较，p〈0. 01,***表示与对照组比较，ρ〈0. 001。各组C57BL/6鼠进行Y迷宫和小鼠转轮式疲劳仪实验时，已发生了不同程度的脂溢性脱毛。本实验综合多器官组织病理学观察结果及器官重量，生化指标，以及学习记忆能力和运动耐力测试，得出如下结论眼镜蛇蛇毒能够有效减轻因免疫衰老与相关疾病的全身多种器官组织病变，具体作用包括减轻脾脏、淋巴和胸腺这些免疫器官的衰老性结构改变，还能改善心肌、肝脏，肺脏、肾脏及皮肤炎性病变和结构损伤。蛇毒治疗能升高白细胞和淋巴细胞计数，降低白球比例。改善学习记忆和提高运动耐受能力。由此可以认为蛇毒通过减轻机体免疫衰老程度而最终起到了一定抗炎和减缓机体衰老的作用。综上所述，经试验证实，物理改性后的中华眼镜蛇毒口服给药能减轻免疫衰老和相关疾病中多器官组织炎性病变程度，且最终使其向正常水平恢复。物理改性后的中华眼镜蛇蛇毒口服给药能减轻免疫衰老和相关疾病中的多器官组织结构损伤并逐渐恢复其正常结构和功能。具体作用包括减轻脾脏、淋巴、胸腺，以及心肌、肝脏，肺脏、肾脏和皮肤的结构损伤以及恢复以上器官组织正常的结构与功能。因炎性病变多发在肝脏、肺脏、肾脏，所以较明显的是中华眼镜蛇毒能够减轻肝脏、肺脏、肾脏的炎性病变程度。物理改性后的中华眼镜蛇蛇毒口服给药能减缓免疫衰老和相关疾病中多器官组织的异常脏器系数变化。间接反应减轻器官组织损伤程度。物理改性后的中华眼镜蛇蛇毒口服给药不仅对免疫衰老和相关疾病中的正常血液生化功能无影响，甚至能使器官组织异常血液生化功能向正常水平发展恢复。物理改性后的中华眼镜蛇蛇毒口服给药能使衰老相关的下降的学习记忆功能不同程度地恢复到正常水平。物理改性后的中华眼镜蛇蛇毒口服给药能使衰老相关的降低的耐力水平不同程度地恢复到正常水平。物理改性后的中华眼镜蛇蛇毒口服给药不仅能够使衰老相关疾病中异常皮肤毛发恢复到正常水平，甚至能优越于正常水平。即毛发生长的浓密黑亮等程度皆显著优于正常毛发水平。上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种物理改性后的眼镜蛇蛇毒在制备治疗免疫衰老和免疫衰老相关疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述物理改性后的眼镜蛇蛇毒是将天然眼镜蛇蛇毒用去离子水溶解后加热变性得到的，加热变性时控制加热温度在100±5°C，加热时间为5min IOmin。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述天然眼镜蛇蛇毒选自中华眼镜蛇蛇毒或泰国眼镜蛇蛇毒。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述免疫衰老相关疾病包括具有炎性病变或器官组织结构损伤的疾病。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述物理改性后的眼镜蛇蛇毒的给药剂型选自口腔速溶药膜、口服液、胶囊、涂剂、巴布剂、喷雾剂和注射剂。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物为物理改性后的眼镜蛇蛇毒与其他药物活性成分组成的复方制剂或物理改性后的眼镜蛇蛇毒与药用辅料形成的单方制剂。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述复方制剂为物理改性后的眼镜蛇蛇毒、未经改性的天然眼镜蛇毒与药用辅料混合形成。
全文摘要
本发明公开了一种眼镜蛇蛇毒在制备治疗免疫衰老和相关疾病药物中的应用。本发明经动物实验证实物理改性后的中华眼镜蛇总毒在(10-3000μg/kg)范围内能有效减轻因免疫衰老引起的全身多种器官组织病变，具体作用包括减轻心肌、肝脏、肺脏、脾脏、淋巴、胸腺、肾脏及皮肤炎性病变和结构损伤，光镜下可见正常衰老小鼠的免疫器官及其它组织内部有结构异常，细胞损伤、变性甚至死亡等病态表现，而经蛇毒治疗后免疫器官的退变明显减轻，各主要脏器的结构皆有不同程度改善。蛇毒治疗不仅不影响衰老机体正常的生化功能而且可使异常生化功能转向正常发展。改善衰老引起的学习记忆能力下降，运动耐力降低等现象。具有用量小、安全、可口服、可注射、可透过口鼻粘膜和皮肤给药等优点。
文档编号A61P39/06GK103040873SQ20121039312
公开日2013年4月17日 申请日期2012年10月17日 优先权日2012年10月17日
发明者秦正红, 祝佳丽 申请人:苏州人本药业有限公司