专利名称：生物打印技术制备的组织工程神经移植物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医学和生物医学工程领域，具体涉及一种基于生物打印技术的组织工程神经移植物及其制备方法。
背景技术：
现实社会中交通事故、工伤事故、运动意外、地震、战争及临床手术等事件均会造成周围神经损伤，临床上但当中长距离的神经缺损不能依靠端对端的缝合来弥补神经缺失时，就不得不依靠移植物来桥接修复。目前临床上自体神经移植仍然是治疗这类疾病最好的方法。因为供移植用的自体神经来源有限、产生新的创伤、组织结构和尺寸难以相匹配和移植供区长期失神经支配等原因，导致自体神经移植应用的很大局限性。近年来，基于生命科学与工程学的原理和技术发展起来的组织工程学为构建神经移植替代品提供了一条新的出路。采用组织工程技术修复神经损伤的研究主要集中在设计和构建新的组织工程神经桥接装置，目前这类桥接物通常是单独采用生物材料，通过将其加工成管状结构的神经引导通道，为神经的再生提供适当的空间和引导作用。传统人工神经移植物多采用注模方法制备，或采用静电纺技术与生物打印技术相结合的方法生产纳米纤维的人工移植材料。中国专利公开号CN101829361A公开了一种用于组织修复的纳米仿生材料及其制备方法，所述纳米仿生材料包括纳米仿生支架和附着于其上的水溶胶，水溶胶内包覆有一种或几种营养因子和/或细胞。其所述制备方法包括制备电纺溶液和含有营养因子和/或细胞的水溶胶溶液；用静电纺丝制得纳米仿生支架；用喷墨打印机将含有营养因子和/或细胞的水溶胶溶液打印到纳米仿生支架上等步骤。
喷墨打印技术是将墨滴喷射到接受体形成图像或文字的非接触性打印技术，它不仅应用于办公喷墨打印机，而且被成功的运用于医学与生物医学工程中，形成了生物打印技术。生物打印能按预定计划精确定位，生物打印的纸片理论上设计为一种在体内可降解的生物纸片；生物打印的墨水理论上设计为特质的细胞溶液或有生物活性的营养因子溶液。将这种特制溶液喷射到可生物降解的生物纸片上。打印后再将纸片按一定顺序堆叠。 使用生物打印技术，可以将细胞或/和营养因子精确的结合到预定部位。
随着该技术的研究不断深入，研究表明喷墨打印技术适用于打印细胞、生物支架材料和细胞活性因子，其在器官打印中的应用也日益受到关注，这为组织工程在构建纤维组织和器官中的成功运用带来了新的希望。
中国专利公开号CN1589913公开了一种用于修复周围神经缺损的组织工程化周围神经，使用神经胶质细胞或向神经胶质细胞分化的干细胞作为种子细胞，采用生物可降解材料构成的神经导管，同时应用复合有神经营养因子的控制释放微球，并含有细胞外基质。由于神经干细胞研究起步较晚，目前建立的神经干细胞系绝大多数来源于鼠，而鼠与人之间存在明显的种属差异，利若用自体细胞，由于神经干细胞和神经胶质细胞位于中枢神经系统，取材难度非常大。
骨髓干细胞是存在于骨髓中的多能干细胞，包括造血干细胞和间充质干细胞两4类。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs)是骨髓内造血干细胞以外的非造血干细胞，是造血微环境的重要组成部分。近年来的研究表明MSCs具有全能干细胞的特点，有报道MSCs可跨胚层分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、神经细胞、雪旺氏细胞，并表达神经组织细胞表型蛋白如NGF、MAP-2、CNPase, GFAP, 0X-42及 SlOO等相关因子，以改善神经再生过程中的微环境。近年来研究显示，MSCs在体内、外可诱导分化为雪旺氏样细胞，并可促进周围神经损伤的修复。研究发现，将MSCs植入硅胶管内， 可以促进大鼠及犬坐骨神经再生。
雪旺氏细胞的主要功能之一是形成髓鞘。髓鞘是脊椎动物神经系统内围绕神经轴突高度特化的膜性结构，生理功能主要是促使钠离子顺利通过、传导神经冲动和防止神经冲动扩散的绝缘作用。髓鞘再生，使轴突重新获得包绕是恢复轴突生理功能的前提。同时， 雪旺氏细胞还具有分泌神经营养因子如NGF、BDNF CNTF、FGF，产生细胞外基质CEM和细胞黏附分子CAM等功能，为支持和引导轴突再生，轴突再生提供良好的环境。
神经营养因子(NTF)是一组超出普通维持生存所必须的基本营养物质以外的、对神经细胞起特殊营养作用的多肽分子。研究表明神经营养因子在胚胎发育、细胞分化、创伤愈合、免疫调节及肿瘤发生等方面都发挥着重要的生物学调节作用。各种NTF因子在单独发挥作用的同时，还通过相互促进和协同作用产生放大效应，使它们在体内发挥出更大的生物学活性。这些神经营养因子包括神经生长因子(NGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、神经营养素_3 (NT-3)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素-4 (NT-4)、胶质细胞源性神经营养因子(⑶NF)等。
现有研究表明，在神经缺损修复中需要生物微环境如神经营养因子等物质的作用，这提示人工神经移植物上含有一定浓度的神经营养因子，将能够提高缺损神经的修复效果，尤其是对长距离、粗大神经缺损。有文献公开了应用壳聚糖神经导引管作为神经再生室桥接大鼠坐骨神经缺损，结果表明壳聚糖神经导引管为大鼠坐骨神经再生提供一个良好的再生微环境，再生坐骨神经功能恢复良好(于炎冰等，壳聚糖导管桥接周围神经缺损的实验研究，中华神经外科杂志，2000，Vol. 16，No. 6，P375-378)。中国专利99123745. 5公开了一种用于神经修复的导管，主要由壳聚糖、明胶、戊二醛、醋酸、氢氧化钠、多聚赖氨酸组成。但是作为交联剂的戊二醛具有一定的毒性。随着人工神经移植物材料研究的逐渐成熟和完善，在材料上固定神经生长因子这方面的研究逐步成为神经再生领域的一个研究热点。中国专利01136314. 2，公开了一种引导和促进神经有效再生的脱乙酰度为15-45%的甲壳质生物套管，该套管管壁上还可以进一步包括O. 3%-3%的海藻盐和5-10%的促神经生长因子药物。但是该法制得的套管缺乏丰富的能提供神经轴突攀附生长的管道。中国专利 20041009259. 9公开了一种由壳聚糖外管壁和具有轴向多通道的生物来源填充基质组成的神经组织工程管状支架，该支架具有7 50的轴向通道，通道内径为200 500 μ m,各通道间具有相互连通的微孔。但该法需要将多根一定直径的不锈钢针平行贯穿固定在壳聚糖管内，步骤繁琐，神经导管抗拉强度有限。
中国专利公开号CN102309782A公开了一种基于活细胞的复杂三维微通道多孔支架的制备方法，先制备水凝胶单体浓度不同的两份水凝胶溶液，再制备水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液，将两份混合液装入细胞打印机的两套不同的注射器中，然后再培养皿表面打印混合液，直至形成所需三维结构的载细胞水凝胶支架。5发明内容
本发明的目的在于提供一种基于生物打印技术的组织工程神经移植物及其制备方法，所述组织工程神经移植物是由可降解聚合物材料通过生物打印制得，包括外管和管内纳米纤维支架。所述制备方法是精确模拟不同神经的三维空间结构，利用生物打印技术，通过调整喷墨打印机的喷嘴的大小、数量、喷嘴到底层的距离、增压器脉冲频率和编制特定打印的控制程序，用喷墨打印机将聚合物材料溶液三维打印成的神经移植物。
本发明的另一目的在于提供一种支架内部或者表面和外管内外表面还包覆有营养因子和/或细胞的组织工程神经移植物及其制备方法，将上述通过生物打印技术制备得到的神经移植物浸泡在含有细胞和/或营养因子的培养液中，使神经移植物支架内部或者表面和外管内外表面包覆有一种或几种细胞和/或营养因子，或者，利用生物打印技术，通过设计相应的控制软件和调整喷墨打印机的喷嘴的大小、数量、喷嘴到粉末层的距离、喷头移动速度和层间隔的时间，用喷墨打印机将聚合物材料溶液和细胞和/或营养因子的水溶胶溶液三维打印成型。
本发明的具体技术方案如下一种基于生物打印技术制备的组织工程神经移植物，包括外管和管内纳米纤维支架， 所述外管直径壁厚为O. 所述管内纳米纤维支架的直径为O. Imm,支架的根数为5-30根，支架在管内均匀分布。
上述的神经移植物支架内部或者表面和外管内外表面还可以包覆有营养因子和/ 或细胞，所述细胞包括来源于自体或异体，为雪旺细胞、成纤维细胞、骨髓间充质干细胞、脐带血干细胞、皮肤干细胞中的一种或几种组合，包覆在所述外管和管内纳米纤维支架表面的细胞密度为I X IO6-I XioVml ;所述营养因子为碱性成纤维生长因子(bFGF)、脑源神经营养因子(BDNF)、神经营养因子3 ( NT-3 )、胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )中的一种或几种，营养因子在神经移植物支架材料上的量为I μ g/g-10mg/g。
上述的神经移植物外管和管内纳米纤维支架为可降解聚合物材料，优选聚乳酸、 聚乙醇酸、胶原、明胶、壳聚糖、海藻酸钠、丝素蛋白、角蛋白中的一种或者其中几种混合物。
本发明还提供了一种上述的组织工程神经移植物的制备方法，包括以下步骤(O制备含有神经移植物材料的溶液置于打印机墨盒中；(2)调整打印机喷嘴针头直径为2-200μ m，针头数量为4-16个，喷嘴到底层的距离为 10-50mm,增压器脉冲频率l_50v ;优选打印机喷嘴针头直径为50-100 μ m,针头数量为9个， 喷嘴到底层的距离为10-25mm，增压器脉冲频率10_15v ；(3)通过精确模拟不同神经的形状及三维空间结构，利用生物打印技术，按照神经的实际形态需求进行高真度仿真打印，使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内均匀分布的纳米纤维支架。
本发明还提供了一种上述的组织工程神经移植物的制备方法，包括以下步骤(1)制备含有神经移植物材料的溶液、细胞和/或营养因子溶液，分别置于独立的墨盒中；(2)调整与装有神经移植物材料墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为2-200μ m，针头数量为2-10个，喷嘴到底层的距离为10-50mm，增压器脉冲频率l_50v ；6调整与装有细胞和/或营养因子的墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为50-200 μ m，针头数量为2-6个，喷嘴到底层的距离为10-50mm，增压器脉冲频率l_50v ；(3)精确模拟不同神经的形状和三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及细胞和/或营养因子包覆形态，编制一定的打印程序，打印机预设三维模型，使用步骤(2) 参数进行打印，形成外管和管内均匀分布的纳米纤维支架，支架内部或者表面和外管内外表面包覆有一种或几种细胞和/或营养因子。
本发明还提供了一种上述的组织工程神经移植物的制备方法，包括以下步骤(O制备含有神经移植物材料的溶液置于墨盒中；(2)调整打印机喷嘴针头直径为2-200μ m，针头数量为4-16个，喷嘴到底层的距离为 10-50_，增压器脉冲频率l-50v ；(3)精确模拟不同神经的形状和三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及细胞和/或营养因子包覆形态，编制一定的打印程序，打印机预设三维模型，使用步骤(2) 参数进行打印，形成外管和管内均匀分布的纳米纤维支架。
(4)将步骤(3)制备得到的神经移植物浸泡在含有细胞和/或营养因子的培养液中，使神经移植物支架内部或者表面和外管内外表面包覆有一种或几种细胞和/或营养因子。
上述的制备方法中神经移植物材料为可降解聚合物材料，优选聚乳酸、聚乙醇酸、 胶原、明胶、壳聚糖、海藻酸钠、丝素蛋白、角蛋白中的一种或者其中几种混合物；可降解聚合物材料溶液溶剂选自醋酸，草酸，苯甲酸，柠檬酸中的一种或几种任意比例的水溶液。
上述的制备方法中的细胞包括来源于自体或异体，为雪旺细胞、成纤维细胞、骨髓间充质干细胞、脐带血干细胞、皮肤干细胞中的一种或几种组合。
上述的制备方法中营养因子为碱性成纤维生长因子(bFGF)、脑源神经营养因子 (BDNF)、神经营养因子3 ( NT-3 )、胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )中的一种或几种。
上述的组织工程神经移植物用于周围神经缺损和脊髓损伤。
所述喷墨打印机优选改装的惠普打印机55C喷墨打印机，改装方法参考美国专利 US7051654，采用墨盒型号为HP51626A目前尚无文献报道利用生物打印技术直接制备组织工程移植物，本发明具有前瞻性和开创性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果(I)本发明利用生物打印技术，可根据患者缺损神经的结构和大小，设计模型尺寸和结构，精确打印得到组织工程神经移植物用于周围神经缺损和脊髓损伤的治疗。
(2)本发明的神经移植物所用可降解的聚合物材料为对人体无毒无害，不会带来免疫排斥、病毒传播、疾病传染的诸多风险。
(3)本发明的神经移植物根据神经修复过程自动安全降解，降解产物被人体完全吸收，避免了免疫组织反应。
(4)本发明使用的生物打印技术简单易行，成本较低，生产过程安全可控。
(5)本发明采用种子细胞相对于现有技术中采用的神经干细胞和神经胶质细胞而言，骨髓间充质干细胞具有自我更新、高度增殖等干细胞特点，并具有分化为雪旺氏细胞的潜能，骨髓间充质干细胞和雪旺氏细胞来源丰富，取材方便，容易分离纯化，而且为同种同体细胞来源，无免疫排斥反应， 更适于作为良好的种子细胞，用于构建组织工程化神经，特别是用于对粗大神经干长距离的缺损和陈旧性周围神经缺损的修复。此外，骨髓间充质干细胞和雪旺氏细胞具有分泌表达神经营养因子的功能，与现有技术相比，采用本发明所述的组织工程神经移植物无需再附加外源的神经营养因子就能够提高缺损神经的修复效果， 其制备工艺与现有技术相比也更简便。
(6)由于营养因子为活性蛋白或肽类，很容易受到环境影响而失去活性，本发明利用生物打印技术即时将营养因子包覆于神经移植物外管和内管纳米纤维支架表面，或在打印神经移植物后浸泡于营养因子溶液中，直接用于手术，这能够更好的保证营养因子的活性。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例I(1)配制3%聚乳酸的苯甲酸溶液50ml(苯甲酸溶液浓度为O. lmol/L)装于型号为 HP51626A的墨盒中；(2)调整打印机喷嘴针头直径为2μ m，针头数量为4个，喷嘴到底层的距离为10mm，增压器脉冲频率Iv ；(3)精确模拟不同神经的三维空间结构，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型， 设计组织工程神经移植物的形状外管直径1mm，壁厚为O. 5mm，管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内均匀分布的纳米纤维支架。
或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径5mm，壁厚为O. 8mm，管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架。
或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径9mm，壁厚为1mm，管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架。
按照上述制备方法，可分别得到外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5 根，纤维支架在管内均匀分布的聚乳酸组织工程神经移植物。
或者,外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布的聚乳酸组织工程神经移植物。
或者外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布的聚乳酸组织工程神经移植物。
实施例2(1)配制5%海藻酸钠的柠檬酸溶液50ml(柠檬酸溶液浓度为O. 05mol/L)装于型号为 HP51626A的墨盒中；(2)调整打印机喷嘴针头直径为100μ m，针头数量为16个，喷嘴到底层的距离为25mm， 增压器脉冲频率15v ；(3)精确模拟不同神经的三维空间结构，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型， 设计组织工程神经移植物的形状外管直径1mm，壁厚为O. 5mm，管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架。
或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状为外管直径5mm，壁厚为O. 8mm，管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架。
或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状为外管直径9mm，壁厚为1mm，管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架。
按照上述制备方法，可分别得到外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5 根，纤维支架在管内均匀分布的海藻酸钠组织工程神经移植物。
或者，外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布的海藻酸钠组织工程神经移植物。
或者外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纳米纤维支架在管内均匀分布的海藻酸钠组织工程神经移植物。
实施例3(1)配制5%壳聚糖的醋酸溶液50ml(醋酸溶液浓度为O. lmol/L)装于型号为HP51626A 的墨盒中；(2)调整打印机喷嘴针头直径为50μ m,针头数量为9个，喷嘴到底层的距离为40mm，增压器脉冲频率IOv ；(3)精确模拟不同神经的三维空间结构，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型， 设计组织工程神经移植物的形状外管直径1mm，壁厚为O. 5mm，管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架。
或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径5mm，壁厚为O. 8mm，管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架。
或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状为外管直径9mm，壁厚为1mm，管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架。
按照上述制备方法，可分别得到外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5 根，纤维支架在管内均匀分布的壳聚糖组织工程神经移植物。
或者，外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布的壳聚糖组织工程神经移植物。
或者外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支 架在管内均匀分布的壳聚糖组织工程神经移植物。
实施例4(1)配制5%丝素蛋白的醋酸溶液50ml(醋酸溶液浓度为O. lmol/L)装于型号为 HP51626A的墨盒中；(2)调整打印机喷嘴针头直径为200μ m,针头数量为16个，喷嘴到底层的距离为50mm， 增压器脉冲频率50v ；(3)精确模拟不同神经的三维空间结构，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型， 设计组织工程神经移植物的形状外管直径1mm，壁厚为O. 5mm，管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架。
或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径5mm，壁厚为O. 8mm，管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架。
或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状为外管直径9mm，壁厚为1mm，管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架。
按照上述制备方法，可分别得到外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5 根，纤维支架在管内均匀分布的丝素蛋白组织工程神经移植物。
或者,外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布的丝素蛋白组织工程神经移植物。
或者外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布的丝素蛋白组织工程神经移植物。
实施例5成纤维细胞的制备取怀孕12. 5-14. 5d母鼠，取出胎鼠，用无菌眼科剪刀或刀片将鼠胚躯干剪成Imm3以下的碎块，加入胰酶消化，离心，弃上清，加入培养液吹打，分装到T75中，置37°C，5%C02，饱和湿度培养箱培养。3-7天后以1:3-1 :6传代。一般传到第三代时杂细胞减少。小鼠胚胎成纤维细胞为梭状。用培养液悬浮细胞，使细胞密度是I X106-lX108/ml。实施例6自体骨髓间充质干细胞(MSCs)溶液的制备(一)细胞分离
抽取受试者骨髓约40ml，肝素抗凝，注意尽量避免凝块形成，将骨髓在超净台内转移到2支50ml无菌离心管内，分别用PBS等比稀释并混匀，吸取FIC0LL10_20ml/管X 4管，倾斜离心管，将骨髓悬液分别沿壁缓慢加到FICOLL表面，使之形成清晰的分界面，220C，1350转/分，离心30分钟，平稳取出离心管，于超净台中将中间白膜层吸出，至于无菌离心管中，加入PBS至40ml混匀，1500转/分，离心5分钟，弃上清，加入MESENCULT培养液IOml，吹打均匀，取细胞悬液20 μ I于EP管中，再加入白细胞稀释液ISOul稀释，于振荡器混匀，取20 μ I加到细胞计数板上，计数四象限细胞总数的均数X IO-E6为总细胞数。按2-5 X IOE5/皿将细胞接种到培养皿中，并加入新鲜培养液，使终体积达7-8ml，放入孵箱。以后每3天换液一次，每次半量换液，直到细胞生长达到培养皿底部的70-80%传代。传代后的细胞3-4天半量换液I次，细胞生长面积达培养皿底部80-90%需再传代
在细胞传代过程中直接收集MSCs或收集解冻后经过洗涤的MSCs，加入含20%白蛋白的生理盐水制成细胞悬液备用。使细胞密度是I X IO6-I X 108/ml。MSCs用于辅助治疗前需进行流式细胞仪鉴定细胞类型；染色体检测排除二倍体变异；输注前行病原学检测；细胞悬液皮试。实施例7雪旺氏细胞溶液的制备
取10只新生2 3d的SD大鼠双侧坐骨神经，剥除神经外膜，剪成约Icm3大小的碎块，用O. 03%胶原酶和O. 25%胰蛋白酶按1:2对神经碎块消化12min，加入少量含10%胎牛血清的DMED培养基小心吹打细胞及组织块，再植于培养皿中培养。用S-100免疫组化染色鉴定雪旺细胞，结合Hoechst3342染色计算其纯度，在显微镜下确定细胞数量。用培养液悬浮细胞，使细胞密度是I X IO6-I X IOVml。实施例8脐带血干细胞的制备
无菌采集产科健康足月产妇(均知情同意)的脐血，清洁状态下迅速采集脐血与采血袋中，CPDA抗凝，送至百级层流实验室，应用人骨髓、脐带血干细胞/祖细胞体外分离纯化试剂盒体外分离纯化脐血干细胞，留取IO6细胞做流式细胞检测。药用生理盐水洗涤3次后，用生理盐水重悬细胞制备成干细胞悬液，使细胞密度是I X IO6-I X 108/ml。实施例9皮肤干细胞的制备
取无菌手术获得的包皮皮片。用加有I X 103U/mL青霉素不含钙镁的PBS冲洗3次，剪除皮下组织，并剪成2mmX4mm皮条。浸泡于2. 5g/LDispaseII,置于4°C过夜。次日，用眼科镊撕取表皮皮片，D-HankJ S液冲洗3次，用眼科显微剪将其剪成ImnTlmm碎片，加入
2.5g /L胰酶，37°C消化5-10min，用滴管吹打使细胞脱落。加入上皮细胞培养液中止消化，200目细胞筛过滤得细胞悬液，收集细胞悬浮液，置于离心管内，以1500r/min离心5min，获得消化下来的皮肤上皮细胞。将其以IX 106/mL接种于IV型胶原(lOOyg/mL)铺底的培养瓶，于体积分数5% C0237°C细胞培养箱待细胞贴壁2h后，去除未贴壁细胞，加入新的上皮细胞培养液，培养l-2d换液I次。取1-2代细胞作为种子细胞。
实施例10
将实施例I打印得到的神经移植物浸泡在含有成纤维细胞的培养液中，使其外管和管
11内纳米纤维支架内外表面吸附有细胞，细胞密度为lX108/ml。按照上述制备方法，可分别得到
外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有细胞密度为lX108/ml的成纤维细胞聚乳酸组织工程神经移植物。或者,外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有细胞密度为IXlO8Ail的成纤维细胞聚乳酸组织工程神经移植物。或者外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有细胞密度为IXlOVml的成纤维细胞聚乳酸组织工程神经移植物。实施例11
将实施例2打印得到的神经移植物浸泡在含有自体骨髓间充质干细胞(MSCs)的培养液中，使其外管和管内纳米纤维支架内外表面吸附有细胞，细胞密度为I X 106/ml。按照上述制备方法，可分别得到
外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有细胞密度为IXlO6Ail的自体骨髓间充质干细胞海藻酸钠组织工程神经移植物。或者,外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有细胞密度为IXlO6Ail的自体骨髓间充质干细胞海藻酸钠组织工程神经移植物。或者外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有细胞密度为IXlO6Ail的自体骨髓间充质干细胞海藻酸钠组织工程神经移植物。实施例12
将实施例3打印得到的神经移植物浸泡在含有雪旺氏细胞的培养液中，使其外管和管内纳米纤维支架内外表面吸附有细胞，细胞密度为lX108/ml。按照上述制备方法，可分别得到
外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有细胞密度为IXlO8Ail的雪旺氏细胞壳聚糖组织工程神经移植物。或者,外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有细胞密度为IXlO8Ail的雪旺氏细胞壳聚糖组织工程神经移植物。或者外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有细胞密度为IXlOVml的雪旺氏细胞壳聚糖组织工程神经移植物。实施例13
将实施例4打印得到的神经移植物浸泡在含有脐带血干细胞的培养液中，使其外管和
12管内纳米纤维支架内外表面吸附有脐带血干细胞，细胞密度是I X 107/ml。按照上述制备方法，可分别得到
外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有细胞密度是IXlOVml的脐带血干细胞的丝素蛋白组织工程神经移植物。或者,外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有细胞密度是IXlOVml的脐带血干细胞的丝素蛋白组织工程神经移植物。或者外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有细胞密度是IXlOVml的脐带血干细胞的丝素蛋白组织工程神经移植物。实施例14
(1)配制3%聚乳酸的苯甲酸溶液50ml(苯甲酸溶液浓度为O. lmol/L)装于型号为HP51626A的墨盒中；
(2)调整与装有聚乳酸墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为2μ m，针头数量为2个，喷嘴到底层的距离为10mm，增压器脉冲频率Iv ；
调整与装有成纤维细胞的墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为50 μ m，针头数量为2个，喷嘴到底层的距离为10mm，增压器脉冲频率Iv ；
(3)精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及细胞包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有成纤维细胞，细胞密度为I X 108/ml。或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及细胞包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有成纤维细胞，细胞密度为I X 108/ml。或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及细胞包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有成纤维细胞，细胞密度为I X 108/ml。按照上述制备方法，可分别得到
外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有细胞密度为lX108/ml的成纤维细胞聚乳酸组织工程神经移植物。或者,外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有细胞密度为IXlO8Ail的成纤维细胞聚乳酸组织工程神经移植物。或者外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有细胞密度为IXlOVml的成纤维细胞聚乳酸组织工程神经移植物。实施例15
(1)配制5%海藻酸钠的柠檬酸溶液50ml(柠檬酸溶液浓度为O. 05mol/L)装于型号为HP51626A的墨盒中；
(2)调整与装有海藻酸钠墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为100μ m，针头数量为10个，喷嘴到底层的距离为25mm，增压器脉冲频率15v ；
调整与装有自体骨髓间充质干细胞的墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为100 μ m，针头数量为6个，喷嘴到底层的距离为25mm，增压器脉冲频率15v ；
(3)精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及细胞包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径Imm,壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根,纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有自体骨髓间充质干细胞，细胞密度为I X 106/ml。或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及细胞包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有自体骨髓间充质干细胞，细胞密度为I X 106/ml。或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及细胞包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有自体骨髓间充质干细胞，细胞密度为I X 106/ml。按照上述制备方法，可分别得到
外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有细胞密度为IXlO6Ail的自体骨髓间充质干细胞海藻酸钠组织工程神经移植物。或者,外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有细胞密度为IXlO6Ail的自体骨髓间充质干细胞海藻酸钠组织工程神经移植物。或者外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有细胞密度为IXlO6Ail的自体骨髓间充质干细胞海藻酸钠组织工程神经移植物。实施例16
(I)配制5%壳聚糖的醋酸溶液50ml (醋酸溶液浓度为O. lmol/L)装于型号为HP51626A的墨盒中；(2)调整与装有壳聚糖墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为50μ m，针头数量为6个，喷嘴到底层的距离为40mm，增压器脉冲频率IOv ;调整与装有雪旺细胞的墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为150 μ m，针头数量为3个，喷嘴到底层的距离为40mm，增压器脉冲频率IOv ；
(3)精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及细胞包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径Imm,壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根,纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有雪旺细胞，细胞密度为lX108/ml。或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及细胞包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有雪旺细胞，细胞密度为I X 108/ml。或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及细胞包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有雪旺细胞，细胞密度为I X 108/ml。按照上述制备方法，可分别得到
外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有细胞密度为IXlO8Ail的雪旺氏细胞壳聚糖组织工程神经移植物。或者,外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有细胞密度为IXlO8Ail的雪旺氏细胞壳聚糖组织工程神经移植物。或者外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有细胞密度为IXlOVml的雪旺氏细胞壳聚糖组织工程神经移植物。实施例17
(1)配制5%丝素蛋白的醋酸溶液50ml(醋酸溶液浓度为O. lmol/L)装于型号为HP51626A的墨盒中；
(2)调整与装有丝素蛋白墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为200μ m，针头数量为8个，喷嘴到底层的距离为50mm，增压器脉冲频率50v ;调整与装有脐带血干细胞墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为200 μ m,针头数量为4个，喷嘴到底层的距离为50mm，增压器脉冲频率50v ；
(3)精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及组织包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状:外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根,纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有脐带血干细胞，细胞密度是I X IOVml。或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及 组织包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有脐带血干细胞，细胞密度是I X IOVml。或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及组织包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有脐带血干细胞，细胞密度是I X IOVml。按照上述制备方法，可分别得到
外管直径lmrn，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有细胞密度是IXlOVml的脐带血干细胞的丝素蛋白组织工程神经移植物。或者,外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有细胞密度是IXlOVml的脐带血干细胞的丝素蛋白组织工程神经移植物。或者外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有细胞密度是IXlOVml的脐带血干细胞的丝素蛋白组织工程神经移植物。实施例18
(1)配制3%聚乳酸的苯甲酸溶液50ml(苯甲酸溶液浓度为O. lmol/L)装于型号为HP51626A的墨盒中；
(2)调整与装有聚乳酸墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为2μ m，针头数量为2个，喷嘴到底层的距离为10mm，增压器脉冲频率Iv ；
调整与装有碱性成纤维生长因子(bFGF)的墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为50 μ m，针头数量为2个，喷嘴到底层的距离为10mm，增压器脉冲频率Iv ；
(3)精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及营养因子包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有碱性成纤维生长因子(bFGF)，碱性成纤维生长因子因子在神经移植物支架材料上的量为I μ g/g。或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及营养因子包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有碱性成纤维生长因子(bFGF)，碱性成纤维生长因子因子在神经移植物支架材料上的量为I μ g/g。或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及营养因子包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有碱性成纤维生长因子(bFGF)，碱性成纤维生长因子因子在神经移植物支架材料上的量为I μ g/g ο按照上述制备方法，可分别得到
外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有碱性成纤维生长因子(bFGF)的聚乳酸组织工程神经移植物。碱性成纤维生长因子在神经移植物支架材料上的量为I μ g/g。或者,外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有碱性成纤维生长因子(bFGF)的聚乳酸组织工程神经移植物。碱性成纤维生长因子在神经移植物支架材料上的量为Iug/g°或者外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有碱性成纤维生长因子(bFGF)的聚乳酸组织工程神经移植物。碱性成纤维生长因子在神经移植物支架材料上的量为I μ g/g。实施例19
(1)配制5%海藻酸钠的柠檬酸溶液50ml(柠檬酸溶液浓度为O. 05mol/L)装于型号为HP51626A的墨盒中；
(2)调整与装有海藻酸钠墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为100μ m，针头数量为10个，喷嘴到底层的距离为25mm，增压器脉冲频率15v ；
调整与装有神经营养因子3 ( NT-3 )的墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为100 μ m，针头数量为6个，喷嘴到底层的距离为25mm，增压器脉冲频率15v ；
(3)精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及营养因子包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有神经营养因子3 ( NT-3 )，神经营养因子3在神经移植物支架材料上的量为 500 μ g/gο或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及营养因子包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有神经营养因子3( NT-3 )，神经营养因子3在神经移植物支架材料上的量为500 μ g/g。或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及营养因子包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有神经营养因子3( NT-3 )，神经营养因子3在神经移植物支架材料上的量为500 μ g/g ο按照上述制备方法，可分别得到
外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有神经营养因子3 ( NT-3 )的海藻酸钠组织工程神经移植物，神经营养因子3在神经移植物支架材料上的量为500 μ g/g。或者,外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有神经营养因子3 ( NT-3 )的海藻酸钠组织工程神经移植物，神经营养因子3在神经移植物支架材料上的量为500 μ g/g。或者外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有神经营养因子3 ( NT-3 )的海藻酸钠组织工程神经移植物，神经营养因子3在神经移植物支架材料上的量为500 μ g/g。实施例20
(1)配制5%壳聚糖的醋酸溶液50ml(醋酸溶液浓度为O. lmol/L)装于型号为HP51626A的墨盒中；
(2)调整与装有壳聚糖墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为50μ m，针头数量为6个，喷嘴到底层的距离为40mm，增压器脉冲频率IOv ；
调整与装有脑源神经营养因子(BDNF)的墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为150 μ m，针头数量为3个，喷嘴到底层的距离为40mm，增压器脉冲频率IOv ；
(3)精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及营养因子包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有脑源神经营养因子(BDNF)，脑源神经营养因子(BDNF)在神经移植物支架材料上的量为lmg/g。或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及营养因子包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有脑源神经营养因子(BDNF)，脑源神经营养因子(BDNF)在神经移植物支架材料上的量为lmg/g。或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及营养因子包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有脑源神经营养因子(BDNF)，脑源神经营养因子(BDNF)在神经移植
18物支架材料上的量为lmg/g。按照上述制备方法，可分别得到
外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有脑源神经营养因子(BDNF)的壳聚糖组织工程神经移植物，脑源神经营养因子(BDNF)在神经移植物支架材料上的量为lmg/g。或者,外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有脑源神经营养因子(BDNF)的壳聚糖组织工程神经移植物，脑源神经营养因子(BDNF)在神经移植物支架材料上的量为lmg/g。或者外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有脑源神经营养因子(BDNF)的壳聚糖组织工程神经移植物，脑源神经营养因子(BDNF)在神经移植物支架材料上的量为lmg/g。实施例21
(1)配制5%丝素蛋白的醋酸溶液50ml(醋酸溶液浓度为O. lmol/L)装于型号为HP51626A的墨盒中；
(2)调整与装有丝素蛋白墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为200μ m，针头数量为8个，喷嘴到底层的距离为50mm，增压器脉冲频率50v ；
调整与装有胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为200 μ m,针头数量为4个，喷嘴到底层的距离为50mm，增压器脉冲频率50v ；
(3)精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及营养因子包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )，胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )在神经移植物支架材料上的量为10mg/g。或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及营养因子包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有胶质细胞源神经营养因子(GDNF )，胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )在神经移植物支架材料上的量为10mg/g。或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及营养因子包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )，胶质细胞源神经营养因子(⑶NF)在神经移植物支架材料上的量为10mg/g。按照上述制备方法，可分别得到
外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5CN 102908207 A
书
明
说
17/23 页
根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有胶质细胞源神经营养因子(GDNF )的丝素蛋白组织工程神经移植物，胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )在神经移植物支架材料上的量为 10mg/g ο或者,外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )的丝素蛋白组织工程神经移植物，胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )在神经移植物支架材料上的量为10mg/g。或者外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有胶质细胞源神经营养因子(GDNF )的丝素蛋白组织工程神经移植物，胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )在神经移植物支架材料上的量为10mg/g。实施例22
将实施例I打印得到的移植物浸泡在含有碱性成纤维生长因子(bFGF)溶液中，使其外管和管内纳米纤维支架内外表面吸附有碱性成纤维生长因子(bFGF)，碱性成纤维生长因子(bFGF)在神经移植物支架材料上的量为I μ g/g。按照上述制备方法，可分别得到
外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有碱性成纤维生长因子(bFGF)的聚乳酸组织工程神经移植物。碱性成纤维生长因子在神经移植物支架材料上的量为I μ g/g。或者,外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有碱性成纤维生长因子(bFGF)的聚乳酸组织工程神经移植物。碱性成纤维生长因子在神经移植物支架材料上的量为Iug/g°或者外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有碱性成纤维生长因子(bFGF)的聚乳酸组织工程神经移植物。碱性成纤维生长因子在神经移植物支架材料上的量为I μ g/g。实施例23
将实施例2打印得到的移植物浸泡在含有神经营养因子3 ( NT-3 )的溶液中，使其外管和管内纳米纤维支架内外表面吸附有神经营养因子3 ( NT-3 )，神经营养因子3( NT-3)在神经移植物支架材料上的量为500 μ g/g。按照上述制备方法，可分别得到
外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有神经营养因子3 ( NT-3 )的海藻酸钠组织工程神经移植物，神经营养因子3在神经移植物支架材料上的量为500 μ g/g。或者,外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有神经营养因子3 ( NT-3 )的海藻酸钠组织工程神经移植物，神经营养因子3在神经移植物支架材料上的量为500 μ g/g。或者外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有神经营养因子3 ( NT-3 )的海藻酸
20钠组织工程神经移植物，神经营养因子3在神经移植物支架材料上的量为500 μ g/g。实施例24
将实施例3打印得到的移植物浸泡在含有脑源神经营养因子(BDNF)溶液中，使其外管和管内纳米纤维支架内外表面吸附有脑源神经营养因子(BDNF)，脑源神经营养因子(BDNF)在神经移植物支架材料上的量为lmg/g。按照上述制备方法，可分别得到
外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有脑源神经营养因子(BDNF)的壳聚糖组织工程神经移植物，脑源神经营养因子(BDNF)在神经移植物支架材料上的量为lmg/g。或者,外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有脑源神经营养因子(BDNF)的壳聚糖组织工程神经移植物，脑源神经营养因子(BDNF)在神经移植物支架材料上的量为lmg/g。或者外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有脑源神经营养因子(BDNF)的壳聚糖组织工程神经移植物，脑源神经营养因子(BDNF)在神经移植物支架材料上的量为lmg/g。实施例25
将实施例4打印得到的移植物浸泡在含有胶质细胞源神经营养因子(GDNF )溶液中，使其外管和管内纳米纤维支架内外表面吸附有胶质细胞源神经营养因子(GDNF )，胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )在神经移植物支架材料上的量为10mg/g。按照上述制备方法，可分别得到
外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有胶质细胞源神经营养因子(GDNF )的丝素蛋白组织工程神经移植物，胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )在神经移植物支架材料上的量为 10mg/g ο或者,外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )的丝素蛋白组织工程神经移植物，胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )在神经移植物支架材料上的量为10mg/g。或者外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有胶质细胞源神经营养因子(GDNF )的丝素蛋白组织工程神经移植物，胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )在神经移植物支架材料上的量为10mg/g。实施例26
(1)配制3%聚乳酸的苯甲酸溶液50ml(苯甲酸溶液浓度为O. lmol/L)装于型号为HP51626A的墨盒中；
(2)调整与装有聚乳酸墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为2μ m，针头数量为2个，喷嘴到底层的距离为10mm，增压器脉冲频率Iv ；
调整与装有成纤维细胞的墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为50 μ m，针头数量为2个，
21喷嘴到底层的距离为10mm，增压器脉冲频率Iv ；
调整与装有碱性成纤维生长因子(bFGF)的墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为50 μ m，针头数量为2个，喷嘴到底层的距离为10mm，增压器脉冲频率Iv ；
(3)精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及细胞和营养因子包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有成纤维细胞，细胞密度为I X 108/ml，和碱性成纤维生长因子(bFGF)，碱性成纤维生长因子在神经移植物支架材料上的量为I μ g/g。或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及细胞和营养因子包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1_。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有成纤维细胞，细胞密度为I X 108/ml，和碱性成纤维生长因子(bFGF)，碱性成纤维生长因子在神经移植物支架材料上的量为I μ g/g。或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及细胞和营养因子包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1_。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有成纤维细胞，细胞密度为I X 108/ml，和碱性成纤维生长因子(bFGF)，碱性成纤维生长因子因子在神经移植物支架材料上的量为I μ g/g。按照上述制备方法，可分别得到
外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆成纤维细胞，细胞密度为I X 108/ml，和碱性成纤维生长因子(bFGF)，碱性成纤维生长因子在神经移植物支架材料上的量为I μ g/g的聚乳酸组织工程神经移植物。或者,外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆成纤维细胞，细胞密度为IXlO8/ml，和碱性成纤维生长因子(bFGF)，碱性成纤维生长因子在神经移植物支架材料上的量为I μ g/g的聚乳酸组织工程神经移植物。或者外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆成纤维细胞，细胞密度为I X 108/ml，和碱性成纤维生长因子(bFGF)，碱性成纤维生长因子在神经移植物支架材料上的量为I μ g/g的聚乳酸组织工程神经移植物。实施例27
(1)配制5%海藻酸钠的柠檬酸溶液50ml(柠檬酸溶液浓度为O. 05mol/L)装于型号为HP51626A的墨盒中；
(2)调整与装有海藻酸钠墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为100μ m，针头数量为10个，喷嘴到底层的距离为25mm，增压器脉冲频率15v ；调整与装有自体骨髓间充质干细胞的墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为100 μ m，针头数量为6个，喷嘴到底层的距离为25mm，增压器脉冲频率15v ；
调整与装有神经营养因子3 ( NT-3 )的墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为100 μ m，针头数量为6个，喷嘴到底层的距离为25mm，增压器脉冲频率15v ；
(3)精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及细胞和营养因子包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有自体骨髓间充质干细胞，细胞密度为I X 106/ml，和神经营养因子3(NT-3 )，神经营养因子3在神经移植物支架材料上的量为500 μ g/g。或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及细胞和营养因子包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1_。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有自体骨髓间充质干细胞，细胞密度为I X 106/ml，和神经营养因子3 ( NT-3 )，神经营养因子3在神经移植物支架材料上的量为500 μ g/g。或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及细胞和营养因子包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1_。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有自体骨髓间充质干细胞，细胞密度为I X 106/ml，和神经营养因子3 ( NT-3 )，神经营养因子3在神经移植物支架材料上的量为500 μ g/g。按照上述制备方法，可分别得到
外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有有自体骨髓间充质干细胞，细胞密度为lX106/ml，和神经营养因子3 ( NT-3 )，神经营养因子3在神经移植物支架材料上的量为500 μ g/g的的海藻酸钠组织工程神经移植物。或者,外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有有自体骨髓间充质干细胞，细胞密度为lX106/ml，和神经营养因子3 ( NT-3 )，神经营养因子3在神经移植物支架材料上的量为500 μ g/g的的海藻酸钠组织工程神经移植物。或者,外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有有自体骨髓间充质干细胞，细胞密度为lX106/ml，和神经营养因子3 ( NT-3 )，神经营养因子3在神经移植物支架材料上的量为500 μ g/g的的海藻酸钠组织工程神经移植物。实施例28
(1)配制5%壳聚糖的醋酸溶液50ml(醋酸溶液浓度为O. lmol/L)装于型号为HP51626A的墨盒中；
(2)调整与装有壳聚糖墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为50μ m，针头数量为6个，喷
23嘴到底层的距离为40mm，增压器脉冲频率IOv ；
调整与装有雪旺细胞的墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为150 μ m，针头数量为3个，喷嘴到底层的距离为40mm，增压器脉冲频率IOv ；
调整与装有脑源神经营养因子(BDNF)的墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为150 μ m，针头数量为3个，喷嘴到底层的距离为40mm，增压器脉冲频率IOv ；
(3)精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及细胞和营养因子包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有雪旺细胞，细胞密度为I X 108/ml，和脑源神经营养因子(BDNF)，脑源神经营养因子(BDNF)在神经移植物支架材料上的量为lmg/g。或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及细胞和营养因子包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1_。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有雪旺细胞，细胞密度为lX108/ml，和脑源神经营养因子(BDNF)，脑源神经营养因子(BDNF)在神经移植物支架材料上的量为lmg/g。或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及细胞和营养因子包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有雪旺细胞，细胞密度为I X 108/ml，和脑源神经营养因子(BDNF)，脑源神经营养因子(BDNF)在神经移植物支架材料上的量为lmg/g。按照上述制备方法，可分别得到
外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有雪旺细胞，细胞密度为I X 108/ml，和脑源神经营养因子(BDNF)，脑源神经营养因子(BDNF)在神经移植物支架材料上的量为lmg/g的壳聚糖组织工程神经移植物。或者,外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有雪旺细胞，细胞密度为IXlO8/ml，和脑源神经营养因子(BDNF)，脑源神经营养因子(BDNF)在神经移植物支架材料上的量为lmg/g的壳聚糖组织工程神经移植物。或者外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有雪旺细胞，细胞密度为I X 108/ml，和脑源神经营养因子(BDNF)，脑源神经营养因子(BDNF)在神经移植物支架材料上的量为lmg/g的壳聚糖组织工程神经移植物。实施例29
(I)配制5%丝素蛋白的醋酸溶液50ml (醋酸溶液浓度为O. lmol/L)装于型号为HP51626A的墨盒中；(2)调整与装有丝素蛋白墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为200μ m，针头数量为8个，喷嘴到底层的距离为50mm，增压器脉冲频率50v ；
调整与装有脐带血干细胞墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为200 μ m，针头数量为4 个，喷嘴到底层的距离为50mm，增压器脉冲频率50v ；
调整与装有胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为200 μ m,针头数量为4个，喷嘴到底层的距离为50mm，增压器脉冲频率50v ；
(3)精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及细胞和营养因子包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有脐带血干细胞和胶质细胞源神经营养因子(GDNF )，细胞密度是lXlOVml，胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )在神经移植物支架材料上的量为10mg/g。或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及细胞和营养因子包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1_。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有脐带血干细胞和胶质细胞源神经营养因子(GDNF )，细胞密度是I X 107/ml，胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )在神经移植物支架材料上的量为10mg/g 。或者，精确模拟不同神经的三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及细胞和营养因子包覆形态，编制相应的控制程序，打印机预设三维模型，设计组织工程神经移植物的形状外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布。使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内纳米纤维支架，支架表面包覆有脐带血干细胞和胶质细胞源神经营养因子(GDNF )，细胞密度是I X 107/ml，胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )在神经移植物支架材料上的量为IOmg/
g O按照上述制备方法，可分别得到
外管直径1mm，壁厚为O. 5mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为5根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有脐带血干细胞和胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )，细胞密度是1父107/1111，胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )在神经移植物支架材料上的量为10mg/g的丝素蛋白组织工程神经移植物。或者，夕卜管直径5mm,壁厚为O. 8mm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为15根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有脐带血干细胞和胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )，细胞密度是1父107/1111，胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )在神经移植物支架材料上的量为10mg/g的丝素蛋白组织工程神经移植物。或者外管直径9mm,壁厚为Imm,管内纳米纤维支架的直径为O. 1mm。纤维支架的根数为30根，纤维支架在管内均匀分布，支架表面包覆有脐带血干细胞和胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )，细胞密度是1父107/1111，胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )在神经移植物支架材料上的量为10mg/g的丝素蛋白组织工程神经移植物。
实施例30
将实施例I打印得到的移植物浸泡在含有碱性成纤维生长因子(bFGF)溶液中，使其外管和管内纳米纤维支架内外表面吸附有碱性成纤维生长因子(bFGF)，碱性成纤维生长因子(bFGF)在神经移植物支架材料上的量为I μ g/g,随后再将含有碱性成纤维生长因子(bFGF)的神经移植物浸泡在含有成纤维细胞的培养液中，使其外管和管内纳米纤维支架内外表面吸附有细胞，细胞密度为I X 108/ml。实施例31
将实施例2打印得到的移植物浸泡在含有神经营养因子3 ( NT-3 )的溶液中，使其外管和管内纳米纤维支架内外表面吸附有神经营养因子3 ( NT-3 )，神经营养因子3( NT-3)在神经移植物支架材料上的量为500 μ g/g。随后再将含有神经营养因子3 ( NT-3 )的神经移植物浸泡在含有自体骨髓间充质干细胞(MSCs)的培养液中，使其外管和管内纳米纤维支架内外表面吸附有细胞，细胞密度为I X 106/ml。实施例32
将实施例3打印得到的移植物浸泡在含有脑源神经营养因子(BDNF)溶液中，使其外管和管内纳米纤维支架内外表面吸附有脑源神经营养因子(BDNF)，脑源神经营养因子(BDNF)在神经移植物支架材料上的量为lmg/g。随后再将含有脑源神经营养因子(BDNF)的神经移植物浸泡在含有雪旺氏细胞的培养液中，使其外管和管内纳米纤维支架内外表面吸附有细胞，细胞密度为I X 108/ml。实施例33
将实施例4打印得到的移植物浸泡在含有胶质细胞源神经营养因子(GDNF )溶液中，使其外管和管内纳米纤维支架内外表面吸附有胶质细胞源神经营养因子(GDNF )，胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )在神经移植物支架材料上的量为10mg/g。随后再将含有胶质细胞源神经营养因子(GDNF )的神经移植物浸泡在含有脐带血干细胞的培养液中，使其外管和管内纳米纤维支架内外表面吸附有脐带血干细胞，细胞密度是I X 107/ml。
权利要求
1.一种基于生物打印技术制备的组织工程神经移植物，其特征在于包括外管和管内纳米纤维支架，所述外管直径l_9mm，壁厚为O. 5_lmm，所述管内纳米纤维支架的直径为 O. Imm,支架的根数为5-30根,支架在管内均勻分布。
2.如权利要求I所述的神经移植物，其特征在于所述支架内部或者表面和外管内外表面还包覆有营养因子和/或细胞。
3.如权利要求2所述的神经移植物，其特征在于所述细胞包括来源于自体或异体，为雪旺细胞、成纤维细胞、骨髓间充质干细胞、脐带血干细胞、皮肤干细胞中的一种或几种组入口 ο
4.如权利要求3所述的神经移植物，其特征在于所述包覆在所述外管和管内纤维支架表面的细胞密度为I X IO6-I X IOVml。
5.如权利要求2所述的神经移植物，其特征在于所述营养因子为神经生长因子(NGF)、 碱性成纤维生长因子(bFGF)、脑源神经营养因子(BDNF)、神经营养因子3( NT-3 )、胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )中的一种或几种。
6.如权利要求5所述的组织工程神经移植物，其特征在于所述营养因子在神经移植物支架材料上的量为I μ g/g-10mg/g。
7.如权利要求1-6任一项所述的神经移植物，其特征在于所述外管和管内纳米纤维支架为可降解聚合物材料。
8.如权利要求7所述的神经移植物，其特征在于所述可降解聚合物材料为聚乳酸、聚乙醇酸、胶原、明胶、壳聚糖、海藻酸钠、丝素蛋白、角蛋白中的一种或者其中几种混合物。
9.一种如权利要求I所述的组织工程神经移植物的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)制备含有神经移植物材料的溶液置于打印机墨盒中；(2)调整打印机喷嘴针头直径为2-200μ m，针头数量为4-16个，喷嘴到底层的距离为 10-50_，增压器脉冲频率l-50v ；(3)通过精确模拟不同神经的形状及三维空间结构，利用生物打印技术，按照神经的实际形态需求进行高真度仿真打印，使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内均匀分布的纤维支架。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于所述打印机喷嘴针头直径为 50-100 μ m，针头数量为9个，喷嘴到底层的距离为10-25mm，增压器脉冲频率10_15v。
11.一种如权利要求2所述的组织工程神经移植物的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)制备含有神经移植物材料的溶液、细胞和/或营养因子溶液，分别置于独立的墨盒中；(2)调整与装有神经移植物材料墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为2-200μ m，针头数量为2-10个，喷嘴到底层的距离为10-50mm，增压器脉冲频率l_50v ；调整与装有细胞和/或营养因子的墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为50-200 μ m，针头数量为2-6个，喷嘴到底层的距离为10-50mm，增压器脉冲频率l_50v ；(3)精确模拟不同神经的形状和三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及细胞和/或营养因子包覆形态，编制一定的打印程序，打印机预设三维模型，使用步骤(2)参数进行打印，形成外管和管内均匀分布的纤维支架，支架内部或者表面和外管内外表面包覆有一种或几种细胞和/或营养因子。
12.—种如权利要求2所述的组织工程神经移植物的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)制备含有神经移植物材料的溶液置于墨盒中；(2)调整打印机喷嘴针头直径为2-200μ m,针头数量为4-16个，喷嘴到底层的距离为 10-50_，增压器脉冲频率l-50v ；(3)精确模拟不同神经的形状和三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及细胞和/或营养因子包覆形态，编制一定的打印程序，打印机预设三维模型，使用步骤(2) 参数进行打印，形成外管和管内均匀分布的纤维支架；(4)将步骤(3)制备得到的神经移植物浸泡在含有细胞和/或营养因子的培养液中，使神经移植物支架内部或者表面和外管内外表面包覆有一种或几种细胞和/或营养因子。
13.如权利要求9-12任一项所述的制备方法，其特征在于所述神经移植物材料为可降解聚合物材料。
14.如权利要求13所述的制备方法，其特征在于所述可降解聚合物材料为聚乳酸、聚乙醇酸、胶原、明胶、壳聚糖、海藻酸钠、丝素蛋白、角蛋白中的一种或者其中几种混合物。
15.如权利要求13所述的制备方法，其特征在于所述可降解聚合物材料溶液溶剂选自醋酸，草酸，苯甲酸，柠檬酸中的一种或几种任意比例的水溶液。
16.如权利要求11或12所述的制备方法，其特征在于所述细胞包括来源于自体或异体，为雪旺细胞、成纤维细胞、骨髓间充质干细胞、脐带血干细胞或者皮肤干细胞中的一种或几种组合。
17.如权利要求11或12所述的制备方法，其特征在于所述营养因子为神经生长因子 (NGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、脑源神经营养因子(BDNF)、神经营养因子3 ( NT-3 )、 胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )中的一种或几种。
全文摘要
本发明提供了一种基于生物打印技术的组织工程神经移植物及其制备方法，所述组织工程神经移植物包括外管和管内纤维支架，内外表面可包覆营养因子和/或细胞。利用生物打印技术，按照神经的实际形态需求进行高真度仿真打印，通过调整喷墨打印机的喷嘴的大小、数量、喷嘴到底层的距离、增压器脉冲频率和编制特定打印的控制程序，用喷墨打印机将聚合物材料溶液三维打印成特定的神经移植物，用于周围神经缺损和脊髓损伤的治疗。
文档编号A61L27/18GK102908207SQ20121042172
公开日2013年2月6日 申请日期2012年10月30日 优先权日2012年10月30日
发明者杨宇民, 顾晓松, 丁斐, 赵亚红 申请人:南通大学