专利名称：鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于动物用病毒性疾病活疫苗制造领域，尤其是涉及一种鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂及其制备方法和应用。
背景技术：
鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis, DVH)是由鸭病毒性肝炎病毒(DuckHepatitis Virus, DHV ;属小核糖核酸病毒)引起的小鸭的一种急性传染病，对小鸭具有高度致死性。严重影响养鸭业的发展。临床上已报道有多种病毒可引起小鸭病毒性肝炎。已确定有小RNA病毒科I型鸭病毒性肝炎病毒、新血清型鸭病毒性肝炎病毒和I型鸭病毒性肝炎病毒变异株，以及星状病毒科的2型、3型鸭病毒性肝炎病毒等。我国自1980年在北京分离到本病毒并确定为血清I型鸭病毒性肝炎病毒以来，该病在全国各地均有不同程 度的流行。1950年，Levine和Fabricant首次在美国长岛发现本病,并通过鸡胚分离到鸭病毒性肝炎病毒。以后各国均有本病流行的报道。我国于1963年由上海畜牧兽医研究所黄均健首次报道；北京大学王平、潘文石等在北京地区某鸭场分离到了鸭病毒性肝炎病毒。证实北京地区有本病发生。以后发现全国各地都有本病发生。本病主要危害I 3周龄的雏鸭，因此防治方法主要针对雏鸭。具体方法大体上可以为两大类，即雏鸭的被动免疫方法和主动免疫方法。雏鸭的被动免疫方法主要包括对雏鸭注射康复鸭血清、高免母鸭或母鸡的蛋黄匀浆；及用DHV免疫种鸭，使后代雏鸭获得蛋传抗体。雏鸭的主动免疫方法就是用各种DHV疫苗(鸡胚化弱毒、细胞毒、强毒灭活苗和弱毒灭活苗等)接种雏鸭，使其自身产生抗体，以达到防治DVH的目的。而无论是用以上方法免疫种鸭还是雏鸭，均很难在雏鸭10日龄之前产生足够效价的抗体，因此雏鸭在1-10日龄爆发鸭病毒性肝炎死亡率非常高且难以控制。弱毒活疫苗是预防畜禽传染病的主要疫苗之一，而目前国内没有一例鸭病毒性肝炎活疫苗问世。究其原因主要有(1)自然分离得到的鸭病毒性肝炎强毒株在人工复制病例中，不能稳定致死5日龄以上的雏鸭，要分离到够稳定致死7-8日龄雏鸭的鸭病毒性肝炎强毒非常困难。而没有强毒对照，就没有办法进行疫苗的后续研发工作；(2)获得I株免疫原性良好、毒力稳定，且疫苗免疫后抗体产生快，能够保护10日龄以内雏鸭的鸭病毒性肝炎致弱疫苗毒株也比较困难，研究发现该病毒致弱后往往免疫原性不佳或易发生毒力反强。此外，在疫苗保护剂方面，国内疫苗企业常用的疫苗保护剂主要是乳糖，牛奶，明胶等，组方简单，保护性差。如果在2°C 8°C条件下，保存期只有3 6个月，大多需要在-15°C以下保存。而国内传统的动物用疫苗保护剂的研制相对滞后，使疫苗的长期保存和长途运输受到很大限制，加上基层防疫部门缺乏必要的冷冻和冷藏设施，容易造成疫苗因保存不当而失效，导致疫苗免疫失败而造成疫病流行。所以，耐热保护剂的研究非常急需，发达国家在二十世纪八十年代就已开始进行耐热保护剂的研究，目前已经基本采用耐热冻干保护剂生产冻干疫苗，但由于保护剂的研究和应用属于专利资料，处于保密状况中。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种克服国产疫苗保存工艺落后现状，提高疫苗质量以及市场竞争力的鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂及其制备方法和应用。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现鸭病毒性肝炎病毒活疫苗用耐热保护剂，包括以下组分及重量百分比含量明胶3 8%、山梨醇5 10%、
尿素I 3%、脂肪酸盐0.5 2%、维生素CI 3%、谷氨酸单钠I 3%、磷酸氢二钾I 2%、磷酸二氢钾0.52%、双蒸水余量。鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂的制备方法，包括以下步骤(I)将明胶、山梨醇按上述配比溶于双蒸水中，控制温度为108 121°C高压灭菌15 30min ；(2)将尿素、脂肪酸盐、维生素C、谷氨酸单钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾按上述配比溶于双蒸水中，用0.22pm的滤膜除菌，然后其与步骤(I)中制备得到的组分1: (I 1.2)混合，配制成耐热保护剂。步骤⑴与步骤⑵中配制溶液按(I 1. 2) I混合，制备成耐热保护剂。鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂的应用，将制备得到的鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂和鸭病毒性肝炎病毒培养液按重量比为1: (I 1. 2)混合得到混合液，然后进行冻干处理，包括以下步骤将分装好的混合液装入冻干机箱体内，在2 3h内缓慢降温至-45 °C，在此温度下维持5 6h，开始抽真空至10_4Pa，然后开始升温，14 16h内升至_20°C，之后以2 5°C /h的速度升温至20°C，维持5 6h后加塞出箱即可。所述的冻干处理的全部时间为42 46h。所述的鸭病毒性肝炎活疫苗所用病毒包括I型鸭病毒性肝炎病毒、2型鸭病毒性肝炎病毒、3型鸭病毒性肝炎病毒或新型鸭病毒性肝炎病毒。与现有技术相比，本发明具有以下优点(I)本发明为鸭病毒性肝炎弱毒疫苗的研制提供了很好的资源，另外克服国产疫苗保存工艺落后现状，提高疫苗质量以及市场竞争力，发明了鸭病毒性肝炎活疫苗耐热型的制备保存工艺，在2 8°C条件下可以保存24个月，疫苗效价均保持在每头份彡 IO6 0EID500(2)本发明与以往家禽活疫苗耐热保护剂相比有很大的区别，鸭病毒性肝炎病毒属小RNA病毒，无脂蛋白包膜，一般不耐受冷冻干燥。本研发明的目的是解决无脂蛋白病毒耐受冷冻干燥的问题。山梨醇、尿素、脂肪酸盐等配方为主的保护剂，保护机理可能主要有以下几个方面组份山梨醇上的羟基能替代部分结构水，与病毒蛋白外壳中羰基或氨基结合，且能形成玻璃样结晶颗粒，可以有效保持病毒外壳的空间构型，保持病毒活性。离子强度改变可保护蛋白外壳，防止离子强度过高使蛋白质容易聚集，减弱羟基形成分子氢键的作用。加入尿素、脂肪酸盐和相关化合物(主要是模拟细菌芽胞中的吡啶二羧酸钙，提高疫苗耐热性，抵抗各种酶的破坏作用)，有类似于脂蛋白包膜的作用，防止病毒在加热过程中核衣壳蛋白构型变化，以抵抗热灭活作用。(3)本发明在耐热保护剂组份中去除牛血清白蛋白、胰蛋白胨的热源蛋白质，主要是考虑到降低雏鸭免疫时的热源应激(免疫副反应)，避免雏鸭因免疫应激而死亡。因为，本发明所使用的产品鸭病毒性肝炎弱毒活疫苗主要使用在出生I日龄的雏鸭上，雏鸭免疫机能和环境抵抗力很弱的情况下接受热源蛋白质刺激，容易产生强烈的免疫应激，从而出现死亡现象。
图1为实施例2的冻干曲线。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。前期的准备工作I型鸭病毒性肝炎制苗病毒液的获得(I) I型鸭病毒性肝炎病毒的分离将采集的病鸭的肝脏在灭菌的乳钵内充分研磨，用灭菌生理盐水制成1: 5悬液，冻融3次，3000r/min离心，15min,取上清液，加2000IU/mL青、链霉素，37°C作用60min。取9 10日龄SPF鸡胚20枚，分为2组，每组10枚，第I组为试验组，经尿囊腔途径接种病料，0. 2mL/胚；第2组为对照组，经尿囊腔途径接种无菌生理盐水，0. 2mL/胚。接种后继续孵化，每日照蛋2次，收获24 144h死亡胚尿囊液，冷冻保存、备用，观察胚体及内脏病变。按常规方法对分离毒进行检测和鉴定。(2) I型鸭病毒性肝炎病毒的传代致弱将分离毒株经9日SPF龄鸡胚尿囊腔接种，0. 2mL/枚，连续传代，进行I型鸭病毒性肝炎病毒鸡胚致弱毒培育，选择48 96小时死亡的鸡胚，置4°C冰箱放置24小时，无菌操作，取出卵黄以外的全胚，用组织捣碎机制成匀浆，加入双抗。分装，置_70°C冰箱贮存备用。(3) I型鸭病毒性肝炎病毒致弱毒株的检测取第25、35、45、55、65、67、71、76、81、86、91、96、101 代次鸡胚组织毒，分别进行病
毒毒价(ELD5tl),稳定性(毒力返强)，免疫原性，免疫产生期以及安全性等检测。结果表明从67代起，病毒毒力稳定在IO6 tlELD5tl, 71 86代的病毒液毒力非常稳定(在本动物体内连续传10代均未出现毒力返强)，且具有非常好的免疫原性，免疫后3天即可产生中和抗体，免疫后5天抗体达到最高峰值且可维持至少6周。选取第71代弱毒作为生产疫苗的原始种毒，选取72 76代作为生产疫苗的基础种毒，用于生产安全有效的I型鸭病毒性肝炎活疫苗。
二 . 3型鸭病毒性肝炎制苗病毒液的获得(I) 3型鸭病毒性肝炎病毒的分离将采集的病鸭的肝脏在灭菌的乳钵内充分研磨，用灭菌生理盐水制成1: 5悬液，冻融3次，3000r/min离心，15min,取上清液，加2000IU/mL青、链霉素，37°C作用60min。取9 10日龄SPF鸡胚20枚，分为2组，每组10枚，第I组为试验组，经尿囊腔途径接种病料，0. 2mL/胚；第2组为对照组，经尿囊腔途径接种无菌生理盐水，0. 2mL/胚。接种后继续孵化，每日照蛋2次，收获24 144h死亡胚尿囊液，冷冻保存、备用，观察胚体及内脏病变。按常规方法对分离毒进行检测和鉴定。(2) 3型鸭病毒性肝炎病毒的传代致 弱将分离毒株经9日SPF龄鸡胚尿囊腔接种，0. 2mL/枚，连续传代，进行I型鸭病毒性肝炎病毒鸡胚致弱毒培育，选择48 96小时死亡的鸡胚，置4°C冰箱放置24小时，无菌操作，取出卵黄以外的全胚，用组织捣碎机制成匀浆，加入双抗。分装，置_70°C冰箱贮存备用。(3) 3型鸭病毒性肝炎病毒致弱毒株的检测取第25、35、45、55、65、67、71、76、81、86代次鸡胚组织毒，分别进行病毒毒价(ELD5tl),稳定性(毒力返强)，免疫原性，免疫产生期以及安全性等检测。结果表明从45代起，病毒毒力稳定在106_°ELD5Q，55 71代的病毒液毒力非常稳定(在本动物体内连续传10代均未出现毒力返强)，且具有非常好的免疫原性，免疫后3天即可产生中和抗体，免疫后5天抗体达到最高峰值且可维持至少6周。选取第55代弱毒作为生产疫苗的原始种毒，选取56 60代作为生产疫苗的基础种毒，用于生产安全有效的3型鸭病毒性肝炎活疫苗。实施例1I型鸭病毒性肝炎活疫苗耐热型保存工艺(I)将明胶5%、山梨醇10%按上述配比溶于双蒸水中，控制温度为108 121°C高压灭菌30min ;将尿素2%、维生素Cl %、谷氨酸单钠3%、磷酸氢二钾2%、磷酸二氢钾0.52%按上述配比溶于双蒸水中，用0.22pm的滤膜除菌，然后其与步骤(I)中制备得到的组分按1:1混合，配制成耐热保护剂。(2) I型鸭病毒性肝炎病毒经过培养后，进行无菌检验和病毒含量的测定，将合格的病毒液和配制好的冻干保护剂1:1混合后，充分摇匀，定量分装后立即进行冷冻干燥。(3)将分装好的疫苗装入冻干机箱体内，在3小时内缓慢降温至_45°C，在此温度下维持6个小时后，开始抽真空至10_4帕后，在开始升温，7小时内升至_20°C，之后以每小时2°C的速度升温至20°C，维持6小时加塞出箱。冻干全程为42个小时。实施例2I型鸭病毒性肝炎活疫苗耐热型保存工艺(I)将明胶5%、山梨醇10%按上述配比溶于双蒸水中，控制温度为108 121°C高压灭菌30min ;将尿素2 %、脂肪酸盐I %、维生素Cl %、谷氨酸单钠3 %、磷酸氢二钾2 %、磷酸二氢钾0. 52%按上述配比溶于双蒸水中，用0. 22 y m的滤膜除菌，然后其与步骤(I)中制备得到的组分按1:1混合，配制成耐热保护剂。(2) I型鸭病毒性肝炎病毒经过培养后，进行无菌检验和病毒含量的测定，将合格的病毒液和配制好的冻干保护剂1:1混合后，充分摇匀，定量分装后立即进行冷冻干燥。
(3)将分装好的疫苗装入冻干机箱体内，在2小时内缓慢降温至-45°C，在此温度下维持8个小时后，抽真空至10_4帕，开始升温，8小时内升至-20°C，之后以每小时2°C的速度升温至20°C，维持8小时加塞出箱。冻干全程为46个小时。冻干产品的测试将不同实施案例冻干的产品，置于100°C、37°C、2 8°C条件下保存，不同时间取样，测定病毒含量及其物理性状，结果见表1、2、3。表I冻干制品置于100°C间接煮沸10分钟后的物理性状和滴度的测定结果
权利要求
1.鸭病毒性肝炎病毒活疫苗用耐热保护剂，其特征在于，该保护剂包括以下组分及重量百分比含量 明胶3 8%、 山梨醇5 10%、 尿素I 3%、 脂肪酸盐O. 5 2%、 维生素CI 3%、 谷氨酸单钠I 3%、 磷酸氢二钾I 2%、 磷酸二氢钾0.52%、 灭菌双蒸水余量。
2.根据权利要求1所述的鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 (1)将明胶、山梨醇按上述配比溶于双蒸水中，控制温度为108 121°C高压灭菌15 30min ； (2)将尿素、脂肪酸盐、维生素C、谷氨酸单钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾按上述配比溶于双蒸水中，用O. 22μπι的滤膜除菌，然后其与步骤(I)中制备得到的组分混合，配制成耐热保护剂。
3.根据权利要求2所述的鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂的制备方法，其特征在于，步骤(I)与步骤(2)中配制溶液按(I 1. 2) I混合，制备成耐热保护剂。
4.如权利要求1所述的鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂的应用，其特征在于，将制备得到的鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂和鸭病毒性肝炎病毒培养液按重量比为I (I 1. 2)混合得到混合液，然后进行冻干处理，包括以下步骤将分装好的混合液装入冻干机箱体内，在2 3h内缓慢降温至-45°C，在此温度下维持5 6h，开始抽真空至10_4Pa，然后开始升温，14 16h内升至_20°C，之后以2 5°C /h的速度升温至20°C，维持5 6h后加塞出箱即可。
5.根据权利要求4所述的鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂的应用，其特征在于，所述的冻干处理的全部时间为42 46h。
6.根据权利要求4所述的鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂的应用，所述的鸭病毒性肝炎活疫苗所用病毒包括I型鸭病毒性肝炎病毒、2型鸭病毒性肝炎病毒、3型鸭病毒性肝炎病毒或新型鸭病毒性肝炎病毒。
全文摘要
本发明涉及鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂及其制备方法和应用，将冻干保护剂基质按一定的比例混合、配制，将保护剂分别进行无菌处理，对可以进行高压灭菌的保护剂组份溶于双蒸水中，108～121℃灭菌15～30分钟；将不耐高压灭菌的保护剂组份按配比溶于双蒸水中用0.22μm的滤膜除菌，再将两者混合成为耐热保护剂，然后将该耐热保护剂和鸭病毒性肝炎病毒液进行1∶1～1.2混合，采用相应的冻干曲线冻干，与现有技术相比，本发明为鸭病毒性肝炎弱毒活疫苗的研制提供了很好的资源，克服国产疫苗保存工艺落后现状，在2～8℃条件下保存24个月，疫苗效价均保持在每羽份≥106.0EID50。
文档编号A61K47/42GK103007289SQ201210448030
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月9日 优先权日2012年11月9日
发明者苏敬良, 赖 志, 漆世华, 高俊锋, 胡彦斌, 孙庆歌, 马晶晶 申请人:上海创宏生物科技有限公司