专利名称：一种聚乙二醇同神经生长因子结合物的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物化学领域，更具体地，本发明涉及聚乙二醇同神经生长因子结合物的制备方法。
背景技术：
20世纪80年代初以来，蛋白质类药物已成为国际医药市场上最重要的药物种类之一。在临床上，蛋白质类药物既有作用位点专一、疗效明确的优点，也有多项缺点，如在胃肠道内极易被蛋白酶水解，一般仅限注射给药；血浆半衰期较短，需反复多次注射；抗原性较强，易引起过敏等不良反应；溶解度不高等。结果，病人体内的蛋白质很难达到有效治疗的血液水平。
这些问题可通过将蛋白质同聚合物(如聚乙二醇，PEG)结合来克服。1977年Davis首次采用PEG修饰牛血清白蛋白。通过修饰后，他发现不仅蛋白的免疫原性成功减少，而且半衰期大大延长。同年，Abuchowski等首先应用PEG修饰药物蛋白，结果修饰后的蛋白质疗效优于未修饰的原型药物。进一步的研究表明，蛋白质经聚乙二醇化修饰后还可以改善许多其它方面的性质，如增加蛋白质对酶的稳定性、延长蛋白质在血浆中的半衰期、增加在水中的溶解度等。神经生长因子(NGF)是1951年是由诺贝尔生理学和医学奖获得者R. Levi-Montalcini 和 S. Cohen 在小鼠肉瘤细胞内发现的(Levi-Montacini, 1987; Cohenet al.，1954)。它是神经营养因子家族中发现最早、最典型、研究最多的一员。它参与到周围神经系统的感觉神经元和交感神经元，及中枢神经元的存活和调节的进程中，并且可以逆转，停止或减缓老年痴呆症引起的萎缩症的进程。目前市面上的神经生长因子药物均是以其活性单位β亚基形式存在，其给药方式为肌肉注射。除了与其他蛋白类药物一样具有易被蛋白酶水解，血浆半衰期不长等缺点，还有注射后局部疼痛的副作用。故目前需要寻找一种将聚乙二醇与神经生长因子有效结合起来的方法，以使神经生长因子仍然具有活性，提高其在体内半衰期，减少给药频率，减少患者病痛。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单易行的将神经生长因子(NGF)与PEG结合形成结合物的方法。为实现上述目的，提供以下具体技术方案结合将神经生长因子与聚乙二醇溶解在pH为4 - 10的缓冲溶液中，两者物质的量比例为1:10，室温下搅拌24小时；缓冲溶液为PBS、MES、Pyridine溶液。纯化并回收，得到聚乙二醇同神经生长因子结合物；得到的聚乙二醇同神经生长因子结合物可保存在_20°C下O. 05M, pH=7. O的PBS缓冲液中贮存。所述纯化可采用常规方法，优选地，比如采用高效液相色谱法或凝胶电泳法。本发明还包括浓缩回收蛋白质步骤的技术方案。
本发明所述的缓冲溶液pH可以为7 - 10。本发明所述的缓冲溶液pH可以为5-7。当pH可以为5-7时，所述方法中结合时，还可以添加还原剂；优选的，还原剂为NaBCNH3。本发明根据所形成的不同的结合物，采用不同的缓冲溶液pH范围值。本发明所述聚乙二醇可以是mPEG-SVA，mPEG-AD, mPEG-HZ形式。本发明涉及通式I、II的具有生物活性的神经生长因子结合物。
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数到NGF中可及氨基或羧基的数目。式I中的-NH-基团由NGF分子中可及的氨基衍生而来的，这一点是不言而喻的。式II中的-C (=0)-基团由NGF分子中可及的羧基衍生而来的，这一点是不言而喻的。按照本发明，通式I和II的NGF结合物可如下制得使末端被活化的连接基团取代的活化PEG与NGF中的一个或多个氨基或羧基反应。按照本发明，通过使用活化的PEG试剂制备结合物，在蛋白质(如神经生长因子(NGF))的游离氨基或羧基和PEG之间形成了一个连键，使所得的结合物保持了蛋白质的至少一部分生物活性，但免疫原性降低。另外，通过使用活化的PEG而在本发明结合物中形成的连接基团，使所得的蛋白质结合物不易在体内水解断开。为了避免有关PEG分子中单元数的任何疑问，PEG聚合物用分子量来表征。因为PEG化合物通常由平均分子量定义而不是由它们所含的自重复单元数定义。不同分子量的PEG活化物可由本领域已知的方法制得或由供应商处购得。所使用的PEG活化物同含一个以上游离氨基或羧基的NGF反应时，可能得到NGF同PEG试剂混合物的不同反应产物的混合物。这些反应产物是由于PEG试剂同一个或更多个游离氨基或羧基反应而形成的。这可由通式I和II中的m表示。例如，当NGF含有三个游离氨基或羧基时，活化的PEG试剂可同其中的一个、二个或所有三个游离氨基或羧基反应。这种情形下，混合物包含所有三种情况下所形成的结合反应产物。由于这个混合物中的不同结合反应产物依m值的不同而具有大不相同的分子量，这些反应产物可用传统方法如色谱法分离。分离的结合反应产物可用与筛选NGF同样的方法筛选有生物活性的结合反应产物，从而确定结合反应产物是否仍保持了用未形成结合物的NGF的一部分生物活性。活化的PEG试剂首先同NGF中包含的游离氨基或羧基之一发生反应。通过控制试剂如NGF的浓度和反应条件，按照胺缩合的标准方法，可控制蛋白质中包含的游离氨基或羧基的聚乙二醇化程度。在包含一个或更多个游离氨基或羧基的蛋白质中，若有一个游离氨基或羧基比其他氨基或羧基活泼，可选择反应条件使蛋白质同活化的PEG化合物反应以形成m为I的通式I或II化合物。形成蛋白质的氨基酸中所含的其它游离氨基或羧基可通过延长缩合反应时间或利用其它更剧烈的反应条件进一步同PEG反应。式IA的结合物可如下制备
权利要求
1.一种聚乙二醇同神经生长因子结合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤结合将神经生长因子与聚乙二醇溶解在pH为4 一 10的缓冲溶液中，两者物质的量比例为1:10，室温下搅拌24小时； 纯化并回收，得到聚乙二醇同神经生长因子结合物。
2.权利要求I的方法，其特征在于，还包括浓缩回收步骤。
3.权利要求I或2的方法，其特征在于，所述得到的聚乙二 醇同神经生长因子结合物可保存在_20°C下O. 05M, pH=7. O的PBS缓冲液中贮存； 任选地，所述的缓冲溶液为PBS、MES、Pyridine溶液。
4.权利要求I或2的方法，其特征在于，所述的缓冲溶液pH为7- 10。
5.权利要求I或2的方法，其特征在于，所述的缓冲溶液pH为5— 7。
6.权利要求5的方法，其特征在于，结合时，还可以添加还原剂；优选的，还原剂为NaBCNH3O
7.权利要求I或2的方法，其特征在于，所述纯化采用常规方法，优选地，采用高效液相色谱法或凝胶电泳法；任选地，所述神经生长因子可以从天然来源、组织培养、重组DNA技术或化学合成得到； 任选地，所述聚乙二醇可以是mPEG-SVA，mPEG_AD、mPEG-HZ形式。
8.权利要求I一 7任一所述方法制备所得到的聚乙二醇同神经生长因子结合物。
9.一种组合物，包括权利要求8的聚乙二醇同神经生长因子结合物。
10.权利要求8的聚乙二醇同神经生长因子结合物或权利要求9的组合物在制备医药上的用途。
全文摘要
本发明涉及一种聚乙二醇-神经生长因子的制备方法，具体包括结合将神经生长因子与聚乙二醇溶解在pH为4－10的缓冲溶液中，两者物质的量比例为1:10，室温下搅拌24小时；纯化并回收，得到聚乙二醇同神经生长因子结合物；还包括浓缩回收的蛋白质。还包括按照所述方法制备得到的聚乙二醇同神经生长因子结合物，及含聚乙二醇同神经生长因子结合物的组合物。还保护聚乙二醇同神经生长因子结合物在制备医药上的用途。该方法简单易行，将神经生长因子与聚乙二醇相结合后，仍然保持了神经生长因子的活性，且可以提高神经生长因子在体内半衰期，减少给药频率，减少病患痛苦。
文档编号A61K47/48GK102964442SQ20121046925
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月19日 优先权日2012年11月19日
发明者任宏伟, 林昳, 陈星 , 陈胜亮 申请人:厦门北大之路生物工程有限公司