专利名称：一种重组猪流行性腹泻病毒乳酸乳球菌、其构建方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种重组猪流行性腹泻病毒乳酸乳球菌、其构建方法及应用。
背景技术：
猪流行性腹湾(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹湾病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus, PEDV)引起的以腹湾、呕吐和脱水为特征的猪肠道传染病(Bi et al.2012; Pan etal.2012; Song and Park 2012)。从 2010 年以来，猪流行性腹泻病开始在全国流行，导致仔猪腹泻，甚至死亡，给养猪业造成了严重的损失(毛雅元2010)。目前，传统的猪流行性腹泻疫苗已经不能完全控制疫情的传播和发生。在此情况下，研制新型的猪流行性腹泻疫苗非常必要。PEDV纤突(spike，S )糖蛋白携带主要的B淋巴细胞抗原表位，是诱导机体产生中和抗体和提供免疫保护作用的主要结构蛋白(Duarte and Laude 1994;Chang etal.2002)。实践证明，肠道黏膜免疫所产生的分泌型抗体(slgA)是抵抗PEDV感染的有效抗体。其中，PEDV S糖蛋白中COE基因被证明是主要的抗原保护性基因(Kang et al.2005)。乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)是一种易通过黏膜吸收的常在菌，适量的乳酸菌对维持肠道菌群平衡具有积极意义。NIZO公司近年来开发了乳酸乳球菌载体表达系统，在该载体上表达的外源基因很容易通过黏膜吸收，另外，该载体为食品级，不含有任何抗生素基因或其他有害成分(de Ruyter et al.1997;Hernandez et al.2007;Chen etal.2011)。利用该表达系统研制的疫苗，不仅具有良好的免疫效果，而且具有易吸收、无副作用的特点。
发明内容
根据目前国内外关于猪流行性腹泻病毒防治研究的现状和疫苗研制的最新进展，本发明提出一种采取目前NIZO公司提供的最新乳酸乳球菌表达载体PNZ8149 (含有乳糖基因)来装载PEDV的免疫保护性抗原S(COE)基因，并转化入缺失乳糖表达基因的乳酸乳球菌，构建重组菌，该重组菌的筛选不需要抗生素，也不含有任何对宿主细胞有害的生物因素，属于生物安全级的载体。然后将构建的重组菌免疫原接种小鼠，测定其体重增长、抗体产生及细胞免疫应答等情况，以衡量疫苗的免疫效果，本发明在猪流行性腹泻病毒乳酸菌载体疫苗方面有广阔的应用前景。本发明的技术方案如下=RT-PCR扩增获得猪流行性腹泻病毒(PEDV)主要保护性抗原COE基因序列，并将其克隆测序。根据测序结果和表达载体特点，设计表达引物，扩增PEDVC0E编码序列，并将其连接至乳酸乳球菌表达载体PNZ8149，电转化入乳酸乳球菌NZ3900细胞内。重组菌以Ing/mL乳链菌肽(Nisin)诱导,通过SDS-PAGE和Western blot分析，PEDV主要S蛋白获得了表达。表达的重组菌经不同免疫方式接种4周龄小鼠，一周后采血应用ELISA方法检测血清中的PEDV抗体及IFN- Y，评价PEDV乳酸菌疫苗刺激产生的体液免疫与细胞免疫。同时，在免疫前后测定小鼠体重，评价疫苗对小鼠生长发育的影响。结果显示各免疫组对小鼠体重增加没有负影响，且略有增加；免疫后，10倍稀释口服组小鼠刺激产生的PEDV抗体最高，同时该组刺激产生的血清中IFN-Y也最高。该PEDV乳酸菌载体口服疫苗能够刺激小鼠产生体液免疫和一定的细胞免疫。本发明的技术方案及意义:PEDV感染具有明显的肠道嗜性。肠道黏膜表面SlgA含量的高低直接决定疾病的发生和严重程度[2 7]。本发明成功地克隆了 PEDV主要保护性抗原基因C0EN，通过序列比较分析，这株PEDV主要S基因核苷酸序列同已发表的Brl/87株PEDV相应序列同源性达到99.44%，说明该基因序列比较保守，可以作为PEDV基因工程疫苗的候选基因。Tae-Jin将PEDV Brl/87株中和抗原基因(K-COE)在烟草中表达，动物试验证实有良好的抗原性(Kang et al.2005)。本发明针对PED免疫特点，在试验设计上以阻断肠道传染性疾病病原感染的第一道防线为目的，利用安全无毒的乳酸菌表达系统在肠道黏膜上粘附、定植和表达及传递抗原物质，因而抗原物质对黏膜的免疫刺激作用更接近于病毒的自然感染途径。因此，所产生的黏膜免疫保护效果将更为理想。本发明成功地克隆了 PEDV的主要保护性抗原基因，构建了 PEDV主要S蛋白乳酸乳球菌表达载体系统，表达了 PEDV主要S蛋白约20kDa的目的蛋白，ffester-blot试验表明，所表达的外源蛋白能够与PEDV免疫血清发生反应，表明重组S蛋白与PEDV天然抗原一样具有相同的反应原性。目前关于防治猪流行性腹泻的疫苗还仅限于传统的灭活疫苗，虽然对猪流行性腹泻的传播有一定的防治作用，但对于人类和动物而言，灭活疫苗中所含有的氢氧化铝佐剂等都会对宿主细胞造成一定的损害。本发明构建了 PEDV乳酸菌疫苗，该疫苗采用乳酸乳球菌表达载体来装载PEDV的免疫保护性抗原S(COE)基因，并转化入缺失乳糖表达基因的乳酸乳球菌，构建重组菌，该重组菌的`筛选不需要抗生素，也不含有任何对宿主细胞有害的因素，属于生物安全级的疫苗(Zamri et al.2012)。而且，乳酸菌能适应肠道环境，是肠道内的一种常在菌。乳酸菌易于通过肠道吸收，有利于产生黏膜免疫，这正好符合PEDV通过肠道感染并刺激产生黏膜免疫的特点(de Arriba et al.2002;Bermudez-Humaran etal.2011)。理论上推测，通过口服这种疫苗产生的免疫效果要好于其他途径，因此本发明设计了口服与注射两种途径。为了验证作为口服疫苗，乳酸菌在肠道内是否越多越好，是否会影响其他菌群的平衡，进而影响动物的生长发育等问题，为此，在本发明又设计了不同稀释倍数的乳酸菌口服免疫小鼠，从生长发育及刺激产生的抗体等多个方面考察该乳酸菌疫苗的免疫效果。通过测定免疫前后各组小鼠的体重，并比较各组小鼠的体重增长变化，发现各组间体重增长差异不显著，对照组与2倍稀释口服组、10倍稀释口服组小鼠的平均体重增长一致，只是10倍稀释注射组和100倍稀释注射组小鼠的平均体重增略高于其他组，但组间差异不显著。整体结果显示，口服乳酸菌疫苗不会影响小鼠的生长发育。免疫后，经过ELISA检测PEDV的特异性抗体，发现免疫组小鼠产生的PEDV抗体均显著高于对照组(P < 0.05)，而且口服组小鼠的抗体水平均高于注射组，其中10倍稀释口服组产生的抗体水平最高。该结果说明，该PEDV乳酸菌载体疫苗确实能够刺激产生PEDV特异性抗体，而且通过口服即黏膜吸收比注射即皮下吸收更容易产生高水平的抗体。因此，通过进一步证实，乳酸菌载体疫苗确实更适宜于口服免疫，而且能够刺激产生体液免疫。为全面评价PEDV乳酸菌载体疫苗的免疫效果，本发明又设计了检测PEDV乳酸菌载体疫苗细胞免疫的试验。IFN-Y是细胞免疫后由CD8+T细胞分泌的一种细胞因子，可以抵抗或杀死被感染的靶细胞。所以，血清中IFN-Y的水平可以在一定程度上代表细胞免疫的水平。通过ELISA方法检测了各组小鼠血清中IFN-Y的水平，发现10倍稀释口服组血清中IFN-Y水平最高，其次为5倍稀释口服组，10倍稀释注射组，100倍稀释注射组，对照组和2倍稀释口服组。其中，2倍稀释口服组刺激产生的IFN-Y水平最低。一方面说明，该PEDV乳酸菌载体疫苗不仅能够刺激机体产生体液免疫，而且还能刺激产生一定的细胞免疫；另一方面说明，该细胞免疫在各处理组之间差异并不明显，也就是说，PEDV乳酸菌能够刺激产生体液免疫和细胞免疫，但细胞免疫不是主要的免疫方式。2倍稀释口服组刺激产生的IFN-Y要低于对照组，可能的原因是免疫剂量太大，造成了一定程度的免疫耐受，反而不利于细胞的乳酸菌载体疫苗分解释放的蛋白或多肽的吞曬作用(Adel-Patient etal.2005;Takiishi et al.2012)。本发明通过下述技术方案实现的:本发明的一方面在于:一种重组猪流行性腹泻病毒乳酸乳球菌的方法，其包括步骤有:①利用引物序列SEQ ID N0.f 2，对猪流行性腹泻病毒主要保护性抗原COE基因序列进行扩增，将扩增后的产物，连接至pMD 18-T载体中；②以步骤①获得的重组载体为模板，利用引物序列SEQ ID N0.3 4进行PCR扩增，将PCR产物经Nco I与Sac I酶切 、凝胶回收纯化后与经相同酶切、纯化后的载体pNZ8149连接；③将步骤②获得的重组质粒电转化入乳酸乳球菌NZ3900细胞内获得阳性重组菌。对于本发明的上述技术方案中，具体较优的条件下:所述的步骤①中，基因序列扩增条件为:94°C预变性5min，94°C变性lmin，54°C退火lmin，72°C延伸lmin，共30个循环。对于本发明的上述技术方案中，具体较优的条件下:所述的步骤②是指，用引物SEQ IDN0.3/4扩增含有COE的编码区片段，PCR产物经Nco I与Sac I酶切、凝胶回收纯化后与经相同酶切、纯化后的载体PNZ8149连接。本发明的另一方面在于:利用上述技术方案所述的方法构建的重组猪流行性腹泻病毒乳酸乳球菌。本发明的另一方面在于:利用上述技术方案所制备的重组猪流行性腹泻病毒乳酸乳球菌表达PEDV特异性抗体的方法，其包括步骤有:将所述方法获得的阳性重组菌，接种于L-SGM17B培养基中，30°C培养过夜，取过夜培养产物以1: 25比例接种于L-SGM17B培养基中，30°C培养至OD6tltl达到0.4^0.6 ;用Ing/mL的乳链杆菌肽诱导2 3h。本发明的另一方面在于:利用上述技术方案所述的方法表达的PEDV特异性抗体在制备重组猪流行性腹泻病毒疫苗药物中的应用。对于上文所述的技术方案，本领域的技术人员可以根据公知常识进行等效的替换，在任何不偏离本发明技术方案的情况下所作出的修饰、增减或等效手段的替换，则都应包括在本发明所述范围之内。
图1RT-PCR产物电泳结果，其中，M:DNA Marker (DL2000) ;1:RT_PCR产物，约 530bp图2重组质粒pMD 18-T-C0E的PCR和酶切鉴定，其中，M: DNA Marker (500 15000) ; I:pMD 18-T-C0E 的 PCR 产物；2:pMD 18-T-C0E 经 Hind III酶切。图3PCR 产物电泳结果，其中，M:DNA Marker (500 15000) ;1:PCR 产物。图4重组质粒pNZ8149-C0E经Nco I和Sac I酶切和PCR鉴定。图5表达产物的SDS-PAGE分析。图6表达产物的Western bl ot分析。图7小鼠体重增长比较。图8ELISA 检测 PEDV 抗体。图9小鼠血清中IFN- Y的含量测定。
具体实施例方式下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中所述方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述原料均可从商业途径获得。1.质粒和菌株大肠杆菌JM109由本实验室保存，pMD 18-T载体购自大连宝生物公司；乳酸乳球菌表面表达载体PNZ8149及乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ3900购买自荷兰NIZO研究所。2试剂:乳链菌肽(Nisin)购自Sigma公司，ELISA检测试剂盒由哈尔滨兽医研究所冯力研究员本发明提供，小鼠IFN- Y购自凯基生物公司(江苏，南京)，其它生化试剂均为国产分析纯产品。3实验动物:20日龄的Balb/c小鼠(SPF级，大连医科大学实验动物中心)4引物:参考PEDV/AF353511基因序列，利用引物设计软件Oligo 6.0设计一对引物 SEQID N0.1/2，设计一对表达引物 SEQ ID N0.3/4, SEQ ID N0.3/4 分别含有Nco I 与 SacI酶切位点。引物由TaKaRa公司合成。上游引物SEQ ID N0.1:5' -GCCAACTCAAGTGTTCTCAG-3'，下游引物SEQ ID N0.2:5' -GAGTCATAAAAGAAACGTCCG-3'。上游引物SEQ ID N0.3:5' -TCACCATGGTTGCTTTTGACCTTGACGATG-3;，下游引物SEQ ID N0.4:5' -AGTGAGCTCTTAAGAAACGTCCGTGACACC-3'实施例1.
1.PEDV S基因主要保护性抗原基因COE的扩增感染PEDV病猪肠组织样品:于吉林德惠农家养猪场，以无菌方法采取病死猪肠组织获得。将感染PEDV病猪肠组织剪碎，加2mL灭菌生理盐水，在玻璃匀浆器中研磨，3000rpm离心5min,取上清100 μ L加入1.5mL Eppendorf管，再加入ImL Trizol提取总RNA, 200 μ L氯仿，剧烈摇匀20s，静置2min, 4°C 12000rpm离心IOmin,取上清，加入500 μ L异丙醇，混勻，室温静置5min,4°C 12000rpm离心IOmin,弃上清,沉淀用ImL 75%的乙醇洗漆两次，7500rpm离心5min,弃上清,沉淀在干燥器干燥至乙醇全部挥发完，加入20 μ L无RNA酶的水溶解，即为总RNA。提取的总RNA用反转录试剂盒(M-MLV，RNase H-,宝生物工程(大连)有限公司)反转录成cDNA，然后以引物SEQ ID N0.1/2扩增包括PEDV主要保护性抗原基因在内的531个核苷酸，反应体系为50uL，扩增条件为:94°C预变性5min，94°C变性lmin, 54°C退火lmin, 72°C延伸lmin，共30个循环。取5uLPCR产物，用1%琼脂糖凝胶电泳观察。经检测发现获得约530bp核苷酸片断，大小与预期结果相符，见图1M:DNAMarker (DL2000) ;1: RT-PCR 产物，约 530bp。2.PEDV S基因主要保护性抗原基因COE的克隆及鉴定用DNA 回收试剂盒 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (宝生物公司)回收目的片段，将纯化后的PCR产物与Takara pMD 18_T vector连接，并转化入大肠杆菌JM109，Hind III酶切和PCR筛选阳性质粒。阳性质粒送TaKaRa公司测序。序列经Gentyx9.0(SoftwareDevelopment c0.，Ltd)进行编辑，DNAMAN Version5.2.2 (Lynnon Biosoft)进行同源序列分析。最终获得pMD 18-T-C0E重组质粒。结果:对重组质粒进行PCR鉴定，得到大小约530bp的目的片断。用Hind III酶切，可得到大约 3200bp 的条带，见图 2，M:DNA Marker (500 15000) ; I:pMD 18-T-C0E 的 PCR产物；2:pMD 18-T-C0E经Hind III酶切。将重组质粒命名为pMD 18-T-C0E。序列测定结果如SEQ ID N0.5，利用DNAMAN对测定的核苷酸序列进行比较分析，结果核苷酸序列同PEDVBrl/87株相应序列同源性达到99.44%。3.PEDV COE基因乳酸乳球菌表达载体的构建及转化以获得的pMD 18-T-C0E重组质粒为模板，用引物SEQ ID N0.3/4扩增含有COE的编码区片段。PCR产物经Nco I与Sac I酶切、凝胶回收纯化后与经相同酶切、纯化后的载体pNZ8149连接。将连接产物与电转化感受态细胞NZ3900混匀后，转入2mm的预冷电转化杯(Bio-Rad 公司)中，以 Transformation Apparatus 617BR1 03149 电击。电击参数为:电压2kV，时间为4.5ms,电击后加入ImL预冷的L-SGM17B恢复培养基(M17液体培养基加入0.5M蔗糖、2.5%甘氨酸、0.5%乳糖、20mmol/L氯化镁和2mmol/L氯化钙)，将菌液转移至1.5mL离心管中，冰上静置5min，30°C培养2h，取适量菌液涂布于Elliker培养基(20g/L胰蛋白胨、5g/L酵母浸出物、4g/L氯化钠、1.5g/L醋酸钠、0.5g/L抗坏血酸、15g/L琼脂、
0.5%乳糖和0.004%溴甲酚紫)，30°C培养24h。挑取黄色单个菌落，接种于L-SGMl7B培养基中，30°C培养过夜后，按Anderson等(Anderson and McKay 1983)方法从乳酸乳球菌中提取质粒PNZ8149-C0E。对重组质粒进行酶切、PCR鉴定及序列测定分析。结果:以pMD 18-T-C0E质粒为模板，用引物SEQ ID N0.3/4扩增得到约500bp的目的片段 COE (见图 3，M:DNA Marker (500 15000) ;1:PCR 产物)。
对重组质粒pNZ8149-C0E进行PCR鉴定，得到大小约500bp的目的片断，进行NcoI与SacI酶切鉴定得到与预期结果相一致的约500bp插入片段(见图4)。分析表明，PEDVCOE基因片段已插入到表达载体质粒pNZ8149的酶切位点Nco I与Sac I之间，获得的阳性重组菌命名为PNZ8149-C0E-NZ3900菌株。测序序列信息如SEQ ID N0.6。实施例2 PEDV COE基因在乳酸乳球菌中的诱导表达
将阳性重组菌及空质粒对照菌pNZ8149/NZ3900，接种于L-SGM17B培养基中，30°C培养过夜后，取过夜培养物以1: 25比例接种于5mL培养基中，30°C培养至OD6c 达到
0.4^0.6。用Ing/mL的乳链杆菌肽(Nisin)诱导2 3h。终止培养后分别取出ImL样品，以12000r/min离心3min,用200 μ L PBS洗漆菌体沉淀，加入100 μ L 10mg/mL的溶菌酶，37°C水浴30min,沸水浴5min灭活溶菌酶，12000r/min离心3min,弃上清,加入凝胶加样缓冲液(含DTT)，充分混匀，煮沸101^11，120001'/1^11离心31^11，取上清101^上样，以蛋白质标准分子量为参考，12%SDS-PAGE进行电泳分析 结果见图5表达产物的SDS-PAGE分析，对重组的pNZ8149_C0ENZ3900菌株和PNZ8149/NZ3900空质粒菌进行诱导，表达产物分子量约20kDa，与预期的结果相符。实施例3表达产物鉴定1.表达产物的Western-blot鉴定SDS-PAGE结束后，用DYCE-40D转印装置，将凝胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，0.5 ImA/cm2转印lh。转印结束后，猪源抗PEDV高免血清IgG作为第一抗体，HRP标记的兔抗猪IgG作为第二抗体，联苯胺为底物进行蛋白印迹分析。通过Western-blot检测表明(见图6表达产物的Western blot分析)，杂交条带与表达条带的大小一致，约20kDa，表明重组蛋白可与PEDV血清反应，与预期的结果相符。2.免疫接种将诱导后的PEDV重组乳酸菌在显微镜下计数，调整细胞数为I X IO9个/mL，然后用灭菌的PBS做不同倍数稀释。试验小鼠分为6组，每组5只，分别为空白对照组，2倍稀释口服组，5倍稀释口服组，10倍稀释口服组，10倍稀释注射组和100倍稀释注射组。口服组每次空腹饮水免疫小鼠30mL，每只平均约6mL ；间隔I周加强免疫，共免疫3次；注射组每只小鼠每次皮下注射0.2mL,间隔一周进行加强免疫，共免疫3次。3.体重检测各组小鼠免疫前即第五周称量I次，免疫后第八周再称量I次。比较各组小鼠体重增长情况。免疫前后，共进行了 2次体重测定，见图7小鼠体重增长比较，结果显示各组之间体重增长的差异不显著，其中10倍稀释注射组和100倍稀释注射组平均体重略高于对照组和其他试验组，但统计学显示组间差异不显著。其余对照组、2倍稀释口服组和10倍稀释口服组体重增长均等同于对照组。图7、中，横坐标显示为:对照组不做任何处理；2倍稀释口服组是对菌液进行两倍稀释；5倍稀释口服组是对菌液5倍稀释；10倍稀释口服组是对菌液10倍稀释；10倍稀释注射是对菌液10倍稀释；100倍稀释注射是对菌液100倍稀释。4.PEDV特异性抗体检测最后一次免疫后2周后对各组小鼠采血，分离血清，每组小鼠血清等比例混和，作为检测样品，然后用PEDV ELISA检测试剂盒进行检测，比较各组小鼠产生PEDV特异性抗体情况，以衡量疫苗刺激产生的体液免疫情况。测定时，每个样品测定时进行3个重复。经过连续3次免疫，然后第8周末采集各组小鼠血清进行酶联免疫吸附实验，在波长492nm下测定最后取得了较为理想的结果，见图8ELISA检测PEDV抗体，通过对结果分析，口服组的PEDV抗体明显的高于注射组，其中10倍稀释口服组小鼠刺激产生的抗体最高，其次为2倍稀释口服组，整体来说，口服组小鼠的抗体水平均均显著高于注射组(P< 0.05)。5.血清中IFN-Y的检测同采血分离血清,每组小鼠血清等比例混和后,按照Mouse IFN-Y ELISA kit操作说明检测每组小鼠血清中IFN-Y含量，以衡量乳酸菌疫苗细胞免疫的效果。每个样品测定时进行3个重复。统计学分析采用单侧的T检验，当P〈0.05时认为差异显著。小鼠IFN-Y测定及数据分析:根据标准曲线，计算出各组小鼠血清中IFN-Y的含量，见图9小鼠血清中IFN- Y的含量测定，结果显示5倍稀释口服组和10倍稀释口服组小鼠血清中IFN- Y整体水平不仅高于对照组，同时也高于注射组，与ELISA检测PEDV特异性抗体中的结果基本一致，而2倍稀 释口服组的抗体含量较少，并低于对照组。
序列表
<110>大连大学
<120>一种 组猪流行性腹涔病毐乳酸乳球菌、其构建方法及应用
<130>2012
<160>6
<170>PatentIn version 3.3
<210>
<211>20
<212>DNA<213>人丄合成
<400〉I
&ucaactcaa gtgttctcag0 O`<210> 2<211> 21<212〉DNA<213>人工合成`<400> 2
gagtcataaa agaaacgtcc g21
<210> 3<211> 30<212> DNA<213> 人工合成<400> 3
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<210>4
<211>30<212〉DNA<213>人:1:合成
<400>4
agtgagclcl iaagaaacg1.ccgtgacacc30
权利要求
1.一种重组猪流行性腹泻病毒乳酸乳球菌的构建方法，其特征在于，包括步骤有: ①利用引 物序列SEQID N0.广2，对猪流行性腹泻病毒主要保护性抗原COE基因序列进行扩增，将扩增后的产物，连接至PMD 18-T载体中； ②以步骤①获得的重组载体为模板，利用引物序列SEQID N0.3 4进行PCR扩增，将PCR产物经Nco I与Sac I酶切、凝胶回收纯化后与经相同酶切、纯化后的载体pNZ8149连接； ③将步骤②获得的重组质粒电转化入乳酸乳球菌NZ3900细胞内获得阳性重组菌。
2.根据权利要求1所述的重组猪流行性腹泻病毒乳酸乳球菌的构建方法，其特征在于，所述的步骤①中，基因序列扩增条件为:94°C预变性5min，94°C变性lmin，54°C退火lmin, 72°C延伸lmin,共30个循环。
3.根据权利要求1所述的重组猪流行性腹泻病毒乳酸乳球菌的构建方法，其特征在于，所述的步骤②是指，用引物SEQ ID N0.3/4扩增含有COE的编码区片段，PCR产物经NcoI与Sac I酶切、凝胶回收纯化后与经相同酶切、纯化后的载体PNZ8149连接。
4.如权利要求1所述的方法构建的重组猪流行性腹泻病毒乳酸乳球菌。
5.一种重组猪流行性腹泻病毒乳酸乳球菌表达PEDV特异性抗体的方法，其特征在于，包括步骤有:将权利要求1方法获得的阳性重组菌，接种于L-SGM17B培养基中，30°C培养过夜，取过夜培养产物以1: 25比例接种于L-SGM17B培养基中，30°C培养至0D600达到0.4 0.6 ;用Lng/mL的乳链杆菌肽诱导2 3h。
6.如权利要求5所述的方法表达的PEDV特异性抗体在制备重组猪流行性腹泻病毒疫苗药物中的应用。
全文摘要
本发明公开一种重组猪流行性腹泻病毒乳酸乳球菌、其构建方法及应用，其制备步骤包括RT-PCR扩增获得猪流行性腹泻病毒(PEDV)主要保护性抗原COE基因序列，并将其克隆测序。根据测序结果和表达载体特点，设计表达引物，扩增PEDV COE编码序列，并将其连接至乳酸乳球菌表达载体pNZ8149，电转化入乳酸乳球菌NZ3900细胞内从而获得重组菌。将重组菌以1ng/mL乳链菌肽(Nisin)诱导，通过SDS-PAGE和Western blot分析，PEDV主要S蛋白获得了表达。表达的重组PEDV乳酸菌载体口服疫苗能够刺激小鼠产生体液免疫和一定的细胞免疫，在制备猪流行性腹泻病毒疫苗等药物中具有广泛的应用前景。
文档编号A61K39/42GK103074291SQ20121055720
公开日2013年5月1日 申请日期2012年12月20日 优先权日2012年12月20日
发明者高凤山 申请人:大连大学