专利名称：一种提高细菌对血清敏感性的物质的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种能提高细菌对血清敏感性的小分子物质-甘氨酸。
背景技术：
细菌进入机体后，机体通过特异性免疫和非特异性免疫来清除。特异性免疫主要是通过血液中抗体来清除，非特异性免疫主要是通过补体系统和吞噬细胞来清除。补体系统溶菌是目前已知的清除进入机体血液和粘膜中细菌的主要方式之一，此作用依赖或不依赖抗体的辅助。补体是存在于人或脊椎动物血清与组织液中的一组经活化后具有酶活性的蛋白质，包括30多种可溶性蛋白和膜结合蛋白。其广泛参与机体微生物防御反应以及免疫调节，也可介导免疫病理的损伤性反应，是体内具有重要生物学作用的效应系统和效应放大系统。然而，许多病原菌具有明显的血清抗性，即能够抵抗补体的溶菌作用，是病原菌的重要病原特征之一。近一个世纪的研究表明，细菌抵抗血清补体溶菌主要归于脂多糖(LPS)和膜(外膜)蛋白。细菌通过减少膜(外膜)蛋白与补体的结合以及灭活已经与膜(夕卜膜)蛋白结合了的补体而表现血清抗性。由此，消除病原菌血清抗性是防治病原菌感染的重要手段，但迄今为止尚未见有关通过抑制病原菌血清抗性以提高血清杀菌目的的研究报道。因此，发现新的能增加补体对细菌溶解的物质，对防治病原菌的危害，保障人们身体健康具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于 提供一种小分子物质在提高细菌对血清敏感性方面的应用。作为一种提高细菌对血清敏感性的小分子代谢物，本发明通过这些小分子物质可达到抑制病原菌的目的。本发明所述的小分子物质，属于氨基酸或其衍生物。更具体的说，所述的氨基酸可以是甘氨酸，苏氨酸，丝氨酸。优选地，所述的氨基酸为甘氨酸(Glycine，Gly/甘氨酸)。由此，发明公开并保护了氨基酸或氨基酸衍生物在制备提高血清或血浆或全血杀菌作用药物方面的应用，所述的氨基酸为甘氨酸，苏氨酸或丝氨酸。同时，发明公开并保护了氨基酸或氨基酸衍生物在制备注射用杀菌剂方面的应用，氨基酸。同时，发明公开并保护了氨基酸与血清联用在制备杀菌药物方面的应用，或氨基酸衍生物，与血清或血浆或全血联用在制备杀菌药物方面的应用；所述的氨基酸为甘氨酸，苏氨酸或丝氨酸。优选地，所述的氨基酸为甘氨酸。所述的甘氨酸的代谢产物和甘氨酸衍生物，如谷胱甘肽、5，10 -亚甲基四氢叶酸、H-蛋白-氨甲基二氢脂赖氨酸、Nl-( 5-磷酸-D-核糖基)甘氨酰胺、L-2-氨基-3-氧代丁酸、L-半胱氨。发明同时保护了一种杀菌药物组合物，其特征在于含有氨基酸和血清/血浆/全血，所述的氨基酸为甘氨酸，苏氨酸或丝氨酸。优选地，所述的血清和甘氨酸的比例以重量计为1:3000。所述的细菌包括革兰氏阴性菌和阳性菌。优选的，所述的细菌为革兰氏阴性和阳性病原菌。更优选地，所述的细菌为金黄色葡萄球菌、迟钝爱德华菌、B链球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌或弧菌。优选地，所述的血清或血浆或全血来源于哺乳动物、鱼类或禽类。本发明同时公开并保护了一种杀菌方法，该方法包括:将氨基酸和血清/血浆/全血联用，或氨基酸衍生物和血清/血浆/全血联用；所述的氨基酸为甘氨酸，苏氨酸或丝氨酸。优选地，所述的方法包括:将甘氨酸和血清以重量计为1:3000的比例混合，用于杀灭革兰氏阴性菌或阳性菌；杀菌所用时间为0.Γ24小时。更优选地，本发明所采用的氨基酸为甘氨酸。本发明通过代谢组学的方法，对用人血清处理的大肠埃希菌的所有小分子代谢物进行分析，发现甘氨酸在耐人血清的大肠埃希菌中含量明显下`降，提示其可以作为提高对血清敏感性的小分子代谢物质。本发明通过固定人血清量添加不同浓度的甘氨酸、固定甘氨酸浓添加不同体积的人血清，以及固定人血清和甘氨酸在不同作用时间的三种情况下，研究甘氨酸添加对血清杀菌作用的影响。结果发现，仅添加甘氨酸的对照组对大肠杆菌生长没有影响，而在人血清中加入甘氨酸后，血清的杀菌能力增加，且其能力随甘氨酸和血清浓度的增加而增强。同时，在一定范围内，随作用时间延长而作用增加。此外，以血浆代替血清也获得同样效果，但采用灭活补体的血清或血浆则无任何效果。本发明通过对革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌以及革兰氏阴性菌的大肠杆菌、迟钝爱德华菌、绿脓杆菌、弧菌等多种细菌的杀菌实验，结果证明添加甘氨酸能提高所有细菌对人血清的敏感性。本发明通过采用小鼠、兔、猪、鸡、家鸽、对虾和鱼等不同进化层次物种动物血清/血浆与甘氨酸合用对其主要病原菌的杀菌作用，发现甘氨酸能提高不同动物血清对其主要病原菌的杀菌能力。本发明进一步进行了小鼠体内实验，发现添加甘氨酸后，小鼠不仅对模式大肠杆菌而且对具有完全血清抗性的临床分离病原性菌株也表现明显提高的清除能力，说明甘氨酸可以在体内和全血状态下起作用。综上所述，在血清中添加甘氨酸能够明显提高细菌对血清的敏感性，为血清抗性病原菌感染的治疗提供了一种崭新的技术方法。由此，发明公开并保护了甘氨酸在提高细菌对血清敏感性方面的应用。其可用于制备药物或杀菌剂，进一步增强细菌对血清的敏感性。同时，发明公开并保护了一种提高细菌对血清敏感性的方法，其特征在于采用甘氨酸作为一种提高血清杀菌作用的药物。
所述的细菌包括但不限于为金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、迟钝爱德华菌、绿脓杆菌、大肠杆菌或弧菌。因为这些细菌是常见人类和养殖动物致病菌，其中金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌为革兰氏阳性菌，大肠埃希氏菌、绿脓杆菌、迟钝爱德华菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌为革兰氏阴性菌。这些细菌为常见的病原菌，且常见其血清抗性菌株，同时大肠埃希氏菌是研究细菌血清抗性的模式菌，故这些细菌为血清抗性的较好代表菌。应用上述方法来提高细菌对血清的敏感性时，甘氨酸的使用浓度为0.05-lg/公斤体重/天。通过本发明所公开的内容，还可制备出一种新的杀菌剂，该杀菌剂含有甘氨酸；或者一种提高血清对细菌杀菌作用的制剂，其主要成分为甘氨酸。
图1为耐血清大肠埃希氏菌GC-MS的独立成分分析(A)、数据聚类分析(B)及代谢物含量分析(C)。图2为甘氨酸对提高细菌对血清敏感性的结果。A为不同浓度甘氨酸、B为不同体积血清，C为不同时间。图3为甘氨酸可提高多种细菌对血清敏感性的结果。A为生存率，B为提高倍数。图4为甘氨酸提高不同动物血清/血浆对其主要病原菌杀菌能力的结果。A为虾和鱼血清对溶藻弧菌杀菌的结果，B为鸡和家鸽血浆对大肠杆菌杀菌的结果，C为小鼠、兔和猪血浆对大肠杆菌杀菌的结果。图5为甘氨酸提高小鼠对体内细菌清除的结果。A和B依次为小鼠注射或不注射甘氨酸血液中细菌数量和生存率。图6为甘氨酸提高 小鼠对大肠埃希菌的清除的结果。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1
甘氨酸是大肠埃希菌抵抗血清杀菌作用的生物标记物
1.试验样本的准备:从LB平板上挑取大肠埃希菌起始株(focAericAia coli K12BW25113)单菌落接种于5毫升LB培养基中，37°C 200rpm振荡培养16小时。按I:100(v/V)的比例接种于200毫升培养基中，37°C振荡培养至0D600值为1.0，4°C 8000rpm离心10分钟收集菌体，并用0.85%生理盐水洗涤菌体I次。2.GC-MS样品的制备和数据处理
GC-MS样品制备:向准备好的样本中分别加入100微升人血清(抽取健康人血液，自然凝固，离心上清即为血清)，重悬菌体后置于37°C 200rpm振荡培养I小时，对照组为生理盐水。4°C 8000rpm离心5分钟收菌，去除残余血清或生理盐水。用生理盐水重悬菌体，使0D600都为1.0，各取I毫升加入冷甲醇(Sigma)(包含5微升0.1毫克/毫升核糖纯(Sigma)作为分析的内标)。在IOW强度设置下超声3分钟使细胞破碎，4°C 12000rpm离心10分钟，取500微升上清转移至新的1.5毫升离心管并进行真空干燥(LABC0NC0)。干燥后的样品用于GC/MS分析。每个样本生物学重复3次。GC-MS分析:样本首先通过甲基化保护羧基，即通过与40微升包含20毫克/毫升甲氧胺盐酸盐的吡啶在37°C反应90分钟，然后加入80微升N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA，Sigma-Aldrich)在37°C反应30分钟使酸性质子衍生化。I微升衍生化过的样本注入30米X 250微米内径X0.25微米DBS-MS柱，采用不分流进样和DSQ IICThermoScientific)进行分析。GC烘箱的初始温度在85°C维持5分钟，接着以15°C /min的速率提高到330°C，再维持5分钟。I毫升/分钟氦气作为载气流量。MS操作在m/z 50-600范围内进行。数据处理:谱卷积和校准使用AMDIS的和内标进行。所有样本执行保留时间(RT)校正，然后RT作为参考，对剩余谱进行查询，组装生成一个包含所有样品中每个代谢物丰度信息的文件。使用NIST MS search 2.0软件，将GC-MS谱中代谢物与National Instituteof Standards and Technology (NIST)数据库进行比对,从而获得鉴定。导出的数据矩阵使用总峰面积进行校正。使用保留时间和m/z区配结果赋予每个样本中每个物质标准化过的峰强度，生产的文件用于进一步的统计学分析。3.数据分析。通过GC-MS进行鉴定生理盐水对照组与用100微升人血清和I毫升人血清处理后的大肠埃希菌代谢产物，通过代谢物的热图和等级聚类分析，发现3个重复样品各自聚在一起且血清处理组聚在一起(图1A)。进一步独立成分分析，发现ICOl可很好的解释人血清的效应(图1B)，通过对所有代 谢产物分析，发现甘氨酸(Glycine)在人血清处理样品中明显下降(图1C)，提示甘氨酸可能是大肠埃希菌抵抗血清杀菌作用的生物靶标物质。实施例2
甘氨酸可提高大肠埃希菌对血清的敏感性
为了解甘氨酸是否有助于血清的杀菌作用，分别进行了在同样含量人血清中添加不同浓度的甘氨酸、在不同体积的人血清中添加相同浓度的甘氨酸，以及在不同作用时间等三种情况下的试验研究。1.甘氨酸促进血清杀菌作用具有浓度梯度效应
按照实例1.1制备实验用细菌样本，添加甘氨酸使其终浓度分别0、5、10、30、50和IOOmM, 370C 200rpm振荡培养I小时后，再添加100微升人血清处理，同时以生理盐水为对照。2小时离心收菌，用I毫升生理盐水重悬菌体，用LB固体平板进行活菌计数。存活率计算公式为:加入不同浓度甘氨酸处理后活菌数/生理盐水对照处理后活菌数X 100%。图2A为在人血清中加入不同浓度甘氨酸后，大肠埃希菌的生存率。从这个结果可以看出，加入5mM甘氨酸后，血清对大肠埃希菌的杀菌作用提高了 1.36倍，随着加入甘氨酸浓度的提高，杀菌作用逐渐增强，IOOmM提高幅度最大，可达约86倍。2.甘氨酸促进血清杀菌作用随血清体积增大而效果加强
取制备好的细菌样本，先添加IOOmM甘氨酸，37°C 200rpm振荡培养I小时，然后分别添加0、20、40、60、80和100微升人血清，同时以不添加甘氨酸只添加不同体积人血清为对照。37°C 200rpm振荡培养2小时后离心收菌，用I毫升生理盐水将菌体重悬后，用平板进行活菌计数。存活率计算公式为:加入不同体积人血清和甘氨酸处理后活菌数/只加人血清处理活菌数X100%。计数结果(图2B)说明，当添加了甘氨酸后，血清对大肠埃希菌的杀菌作用都比不添加甘氨酸有提高，随着添加血清量的增加，杀菌作用显著增加，当添加100微升人血清时，可增加86倍。3.甘氨酸促进血清杀菌作用具有时间效应
将制备好的细菌样本分成4组:添加IOOmM甘氨酸组、100微升人血清组、100微升人血清和IOOmM甘氨酸组、生理盐水对照组，37°C 200rpm振荡培养，分别在0.5、1、2、3和4小时离心收菌，用I毫升生理盐水将菌体重悬，用LB固体平板进行活菌计数。存活率计算公式为:加入血清和/或甘氨酸处理后不同时间活菌数/加生理盐水对照组不同时间活菌数X 100%。图2C为3个实验组在不同时间的生存率，从图可见，只加入甘氨酸没有杀菌效果，当只加入血清时会有一定的杀菌效果，而当在血清中加入甘氨酸后，杀菌效果明显增强，在0.5小时后增加了 2倍，I小时猛增到77倍，4小时高达120倍。综上所述，甘氨酸本身对于大肠杆菌生长没有影响；血清本身对细菌有一定的杀菌作用，而在人血清中加入甘氨酸后，血清的杀菌能力显著增加，且其杀菌能力随甘氨酸浓度的增强而增强；在添加甘氨酸后，随人血清量的增加而杀菌率增加。实施例3
甘氨酸提高细菌包括革兰氏阴性菌和阳性菌对血清的敏感性
按照实例1.1方法培养多种细菌(大肠杆菌K12 BW25113，大肠杆菌Y17临床菌，乙型溶血性链球菌，溶藻弧菌，副溶血弧菌，绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌)，分别收集3毫升0D600为1.0的每种细菌。然后分别分为4组:添加100微升生理盐水对照组、100-150mM甘氨酸组、125-175微升人血清组和125-175微升人血清加100-150mM甘氨酸组。不同种类细菌最佳杀菌作用加入的血清量和甘氨酸略有不同。37°C 200rpm振荡培养4小时后离心收菌，用I毫升生理盐水将菌体重悬，测定OD值(0D600nm)。图3A为每种菌在三种处理后的OD值，图3B为每种细菌在血清处理和血清中加入甘氨酸处理后的杀菌倍数比较。从图可以看出，血清对不同细菌的杀菌效果是不一样的，对大肠杆菌K12 BW25113、乙型溶血性链球菌和绿脓杆菌具有一定的杀菌作用，而对其他几种细菌反而有促进生长作用；但是在添加甘氨酸后，血清对所有细菌均具有显著杀菌作用，其增强杀菌作用都在I倍以上，最高可达4.13倍。实施例4
甘氨酸提高不同进化层次物种血清/血浆对其主要病原菌的杀菌效果按照实例1.1方法培养多种细菌(大肠杆菌K12 BW25113，大肠杆菌Y17临床菌，溶藻弧菌，副溶血弧菌，绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌)，分别收集3毫升0D600为1.0的每种细菌，然后分别分为2组:添加100微升不同动物血清/血浆组和100微升不同动物血清/血浆加IOOmM甘氨酸组。同时以添加IOOmM甘氨酸为对照。37°C 200rpm振荡培养，4小时后离心收菌，用I毫升生理盐水将菌体重悬，测定OD值(0D600nm)。图4为不同进化层次动物的主要病原菌在血清/血浆处理和血清/血浆中加入甘氨酸处理后的OD值。从图可以看出，虽然不同进化层次动物的血清/血浆对其主要病原菌有一定的杀菌作用，但在添加甘氨酸后，血清/血浆对细菌的杀菌作用显著增强，其杀菌作用增加最低的为1.5倍，最高的可高达近10倍，这些结果表明甘氨酸可以明显提高不同进化动物的血清/血浆对其主要病原菌的杀菌作用。实施例5 甘氨酸可以提高小鼠对大肠埃希菌的清除作用将6周龄小鼠共15只(购买于中山大学东校区实验动物中心)随机分为3组，生理盐水对照组和2种浓度(3.25和6.5毫克/只)的甘氨酸给药处理组。采用静脉注射给药的方式，按照3.25和6.5毫克甘氨酸/次/只，两次给药时间间隔12小时，连续给药6次；停药12小时后静脉分别注射大肠埃希菌K12 BW25113和大肠埃希菌Y17 (临床分离菌株)，齐IJ量为I X IO6个细菌/只的细菌，48小时后小鼠尾静脉取血，梯度稀释后平板计数，检测细菌被清除情况。图5A和B是小鼠血清中注射2种甘氨酸浓度后细菌数量和体内细菌生存率。从此结果可以看出，当给小鼠注射甘氨酸后，小鼠体内细菌数量明显减少。对于大肠杆菌K12 BW25113来说，注射3.25毫克时清除率为89.32%，6.5毫克时清除率达到96.85%。对于大肠杆菌Y17临床菌来说，注射3.25毫克时清除率为32.95%，6.5毫克时清除率达到52.53%。这些结果表明甘氨酸提高了血清对细菌的清除作用，而且随着加入量的增加，清除作用加强。实施例6
苏氨酸可提高大肠埃希菌对血清的敏感性
将制备好的细菌样本分成4组:添加IOOmM苏氨酸组、100微升人血清组、100微升人血清和IOOmM苏甘氨酸组、生理盐水对照组，37°C 200rpm振荡培养，在2小时离心收菌，用I毫升生理盐水将菌体重悬，测定OD值(0D600)。存活率计算公式为:加入血清和/或苏氨酸处理后OD值/加生理盐水对照组OD值X 100%。图6为3个实验组在不同时间的存活率，从图可见，只加入苏氨酸没有杀菌效果，当只加入血清时会有一定的杀菌效果，而当在血清中加入苏氨酸时，杀菌效果 明显增增加了 1.5倍。
权利要求
1.基酸或其衍生物在制备提高血清或血浆或全血杀菌作用药物方面的应用，所述的氨基酸为甘氨酸，苏氨酸或丝氨酸。
2.基酸或其衍生物在制备注射用杀菌剂方面的应用，所述的氨基酸为甘氨酸，苏氨酸或丝氨酸。
3.基酸或其衍生物，与血清或血浆或全血联用在制备杀菌药物方面的应用，所述的氨基酸为甘氨酸，苏氨酸或丝氨酸。
4.一种杀菌药物组合物，其特征在于含有氨基酸和血清/血浆/全血，所述的氨基酸为甘氨酸，苏氨酸或丝氨酸。
5.按权利要求4所述的组合物，其特征在于所述的血清和甘氨酸的比例以重量计为1:1-3000。
6.按权利要求1-4任一所述的应用或组合物，其特征在于所述的细菌为革兰氏染色阴性或阳性的病原菌；所述的氨基酸为甘氨酸。
7.按权利要求5任一所述的应用，其特征在于所述的细菌为金黄色葡萄球菌、迟钝爱德华菌、溶血性链球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌或弧菌。
8.按权利要求1、3或4任一所述的应用或组合物，其特征在于所述的血清或血浆或全血来源于哺乳动物、鱼类或禽类。
9.一种杀菌方法，其特征在于:将氨基酸和血清/血浆/全血联用，或氨基酸衍生物和血清/血浆/全血联用，所述的氨基酸为甘氨酸，苏氨酸或丝氨酸。
10.按权利要求9所述的杀菌方法，其特征在于:将血清和氨基酸以重量计1:1-3000的比例混合，用于杀灭革兰氏阴性菌或阳性菌；杀菌所用时间为0.Γ24小时。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种小分子代谢物甘氨酸(Glycine)。该小分子能够提高细菌包括革兰氏阳性和阴性菌对血清的敏感性，而且该作用在不同动物对于其主要病原菌都有效。本发明所提供的小分子代谢物，可作为药物提高血清的杀菌作用。
文档编号A61K31/198GK103083291SQ201210589250
公开日2013年5月8日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者彭宣宪, 李惠, 程志学, 郭昌 申请人:中山大学