恢复和重建肠道微生物群的合生素组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及合生素组合物，其包含益生菌细菌菌株和益生素物质，当其组合时呈现协同作用。所述合生素组合物在抗生素相关腹泻(AAD)和/或胃肠道病原体所致其它肠道感染及其复发后刺激固有微生物群落恢复和重建体内肠道样状况，以及预防所述疾病。
【专利说明】恢复和重建肠道微生物群的合生素组合物
[0001]发明【技术领域】
[0002]本发明涉及合生素(synbiotic)组合物，其包含益生菌细菌菌株和益生素物质，当它们组合时展示协同行为。所述协同组合物刺激固有微生物群落(indigenousmicroflora)在抗生素相关腹泻(AAD)和/或由胃肠道病原体导致的其它肠道疾病及其复发之后恢复和重建体内肠道样条件，以及预防所述疾病。
[0003]发明背景
[0004] 肠道微生物群(miCTobiota)组成了真正的“体外器官”，其具有对于身体内在代谢和各种免疫功能的重要作用。这个“器官”履行独特消化功能，所述功能不能由无细菌动物的胃肠道(GI)简单完成。但是，GI和微生物群形成在细菌物种和宿主之间的复杂代谢沟通(cross talk)。
[0005]正常情况下肠粘膜层保护上皮免于被病原体侵袭和建群，并且作为其中上皮产生的抗微生物因子及正常肠道微生物群的菌株一起建群的基质。这个粘膜层组成缓冲区，其实现微生物群的腔室分区并且建立交流通道用于通过细菌菌株和肠道上皮之间的沟通以交换分子(Sansonetti, Mucosal Immunol, 2011，4:8-14)。
[0006]人类和动物医药中增加的抗生素应用现今导致肠道中抗生素抗性菌株的严重增加，这些菌株例如耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococci) (MRSA和MRSE)、产超广谱β-内酰胺酶肠杆菌科(Enterobacteriaceae) (ESBL)、万古霉素抗性肠球菌(Enterococcus spp) (VRE)、克拉霉素抗性幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、万古霉素抗性艰难梭菌(Clostridum difficile)(⑶)、喹诺酮抗性空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)及假丝酵母(Candida)物种的各种菌株。
[0007]⑶在固有正常肠道菌群中数量小，但是破坏固有人类肠道微生物菌群的广谱抗生素如克林霉素、头孢菌素和氟喹诺酮会导致产生毒素的CD的肠道过度生长，杀死粘膜中的肠细胞，并且引起腹泻，其严重情况下导致具有高死亡率的假膜性结肠炎。流行性CD菌株NAP1/027比目前分离的医院菌株产生实质上更多的毒素A和毒素B，并且是高度毒性的。
[0008]肠道微生物群是复杂的生态系统，与宿主共生。肠道双歧杆菌(Bif)物种具有非常大量的基因以代谢结肠中的碳水化合物，而乳杆菌是小肠中的主要乳酸细菌(LAB)。
[0009]益生素发酵产生短链脂肪酸(SCFA)，如乙酸、丁酸和乳酸，其降低结肠局部pH。此外，益生素和食物纤维帮助LAB和双歧杆菌增殖以产生高细胞密度及通过产生杀细菌物质、抗氧化剂、降低粘膜炎症、维持结肠粘膜完整性及促进强宿主抗炎症应答而预防上文所述肠道病原体生长。竞争排斥是对抗入侵的病原体的抗微生物防御作用的另一模式。
[0010]目前使用益生菌和益生素的术语通常是涉及互补合生素概念，其中益生菌的选择基于宿主所需的特定的有益作用，选择益生素刺激固有微生物群落的生长。然而，本发明使用新的协同概念的方法，其中选择益生素刺激对宿主具有特定有益作用的益生菌的生长。其也可以增加有益的宿主GI微生物群水平，但是主要目标是摄入的益生菌的生长。共培养刺激组合物中的对益生寡糖及人肠道中其它不可消化的碳水化合物利用不良的其它成分。
[0011]发明概述[0012]本发明第一方面涉及合生素组合物，其包含选自乳杆菌(Lactobacillus)属和双歧杆菌(Bifidobacteria)属的至少两种细菌菌株,及一或多种益生素物质,特征在于:
[0013]-所述细菌菌株中的至少一种能降解淀粉；及
[0014]-至少一种益生素物质是淀粉。
[0015]有利地，所述能降解淀粉的细菌菌株属于双歧杆菌属，或者属于短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)物种如 Bif LUlOo
[0016]有利地，所述淀粉是抗性淀粉(RS)和/或可溶淀粉(SS)。
[0017]有利地，所述细菌菌株之一是非淀粉降解菌株，或者属于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)物种如 LAB LU33。
[0018]有利地，所述合生素组合物包含至少Bif LU10，及菌株LAB LU23、LAB LU28、LABLU33、BIF LU29和/或BIF LU30中的一或多种，或者包含至少Bif LUlO和LAB LU33，或者包含至少 BIF LUlO、LAB LU33 和 BIF LU30，或者包含至少 BIF LUlO、LAB LU33、BIF LU30和 LAB LU28。
[0019]有利地，所述一或多种细菌菌株在其产生期间已经暴露于酸、胆汁和/或粘蛋白，由此暴露于酸包括在细菌菌株生长期间使培养液的PH降低至pH2-5，优选降低至PH2.5-4.5，更优选降低至pH3-4，持续15-150分钟，优选持续20-140分钟，更优选持续30-130分钟，更优选持续40-120分钟，而暴露于胆汁包括使细菌菌株在存在0.1-2.5%(重量/体积)、优选0.5-2%、更优选1.0-1.5%牛磺胆酸钠或者1-10% (体积/体积)、优选2-7%、更优选3-5%猪胆汁的条件下生长2-8小时，优选2.5-7小时，更优选3_6小时，而暴露于粘蛋白包括使细菌菌株在存在0.01-1%(体积/体积)、优选0.03-0.7%、更优选0.05-0.5%粘蛋白的条件下生长2-8小时，优选 2.5-7小时，更优选3-6小时。
[0020]有利地，所述合生素组合物进一步包含属于由二糖、寡糖和/或多糖组成的组的益生素物质，其中所述二糖是乳果糖，所述寡糖来自由寡聚果糖(F0S)、寡聚半乳糖(G0S)、寡聚木糖(XOS)、壳聚糖寡糖(chioses)、异麦芽糖寡糖(MOS)、阿拉伯树胶、大豆寡糖和果胶寡糖组成的组，所述多糖来自由果胶、木聚糖、菊粉、壳聚糖和/或β -葡聚糖组成的组。
[0021]有利地，所述合生素组合物进一步包含属于由寡聚半乳糖(GOS)、寡聚木糖(XOS)、异麦芽糖寡糖(MOS)、寡聚果糖(FOS)和/或乳果糖组成的组的益生素物质。
[0022]有利地，所述合生素组合物进一步包含寡聚半乳糖(GOS)和/或异麦芽糖寡糖(IMOS)。
[0023]上述合生素组合物有利地用于对象的肠道粘膜建群，及预防、治疗、减轻对象中抗生素相关腹泻(AAD)和/或胃肠道病原体所致感染的症状和/或预防其复发。
[0024]所述抗生素相关腹湾(AAD)是由艰难梭菌(Clostridium difficile)引起的。
[0025]所述胃肠道病原体所致感染是由沙门氏菌属(Salmonel Ia)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、产超广谱 β -内酸胺酶(Extended Spectrum Beta Lactamaseproducing, ESBL)大肠杆菌引起的。
[0026]有利地，所述对象是哺乳动物，如属于由人、非人灵长类动物、牛、绵羊、猪、山羊和马、狗、猫、啮齿动物和豚鼠组成的组的哺乳动物。优选所述对象是人。
[0027]上述合生素组合物可用于制备药物，所述药物用于在对象肠粘膜建群以预防、治疗、减轻抗生素相关腹泻(AAD)和/或胃肠道病原体所致感染的症状及预防其复发。[0028]上述合生素组合物可用于制备用于治疗患有抗生素相关腹泻(AAD)和/或胃肠道病原体所致感染的对象的药物。
[0029]上述合生素组合物可用于在对象肠粘膜建群的方法中，所述方法包括给有需要的对象施用有效剂量的所述合生素组合物的步骤。
[0030]上述合生素组合物可用于治疗对象的抗生素相关腹泻(AAD)和/或胃肠道病原体所致感染的方法中，所述方法包括给有需要的对象施用有效剂量的所述合生素组合物的步骤。
[0031]定义
[0032]本发明中使用的术语遵循微生物学和生物化学领域技术人员接受的标准定义。如下文列出的少数例外在本发明范围内进一步定义。
[0033]如本文所用，术语“ 二糖”是当两个单糖经历缩合反应形成的碳水化合物，所述缩合反应包括仅从官能团中消除小分子，如水。
[0034]如本文所用，术语“寡糖”是指含有少数目(通常2-10个)糖(单糖)的糖聚合物。
[0035]如本文所用，术语“多糖”是聚合的碳水化合物结构，由重复单元(单糖或二糖)通过糖苷键结合在一起而形成。这些结构通常是线性的，但是可含有不同程度的分支。
[0036]如本文所用，术语“淀粉”是由通过糖苷键结合在一起的大量葡萄糖单元组成的碳水化合物。该多糖由所有绿色植物作为能量贮存产生。其由两种类型分子组成:线性和螺旋直链淀粉及分支的支链淀粉。根据植物不同，淀粉通常含有20-25%直链淀粉和75-80%支链淀粉。术语淀粉包括但不限于可溶淀粉(SS)、抗性淀粉(RS)，来自谷物(水稻、小麦和玉米)、根类蔬菜(马铃薯和木薯)、橡子、竹芋、秘鲁胡萝卜、香蕉、大麦、面包果、荞麦、美人蕉、可乐果、katakur1、野葛、暗绿叶黄体芋、小米、燕麦、oca、波利尼西亚竹芋、西米、高粱、甘薯、黑麦、芋头、栗子、荸荠和山药、豆类如蚕豆、小扁豆、绿豆、豌豆及鹰嘴豆。
[0037]如本文所用，术语“益生菌(probiotics) ”是指当以足够量消耗时赋予健康益处的细菌。
[0038]如本文所用，术语“益生素(prebiotics) ”是指不可消化的食物成分物质，其以有益于健康的方式刺激消化系统中细菌的生长和/或活性。
[0039]如本文所用，术语“合生素(synbiotics) ”是指以协同作用形式组合益生菌和益生素的营养补剂或药物。合生素组合物刺激组合物中存在的及固有微生物群落中的益生菌菌株的生长，在体内呈现出协同作用。
[0040]如本文所用，术语“对象”是指任何活的生物体如动物或人，其需要治疗或者易感于涉及不需要的或不希望的微生物的病症，例如需要特别治疗具有如下文定义的不需要的胃肠道病原体。术语对象包括但不限于人，非人灵长类动物和猴物种，农场动物如猪、山羊和马，驯养哺乳动物如狗和猫，实验室动物包括啮齿类动物如小鼠、大鼠和豚鼠。该术语不指示特定年龄或性别。因此，成年和新生对象，无论雄性或雌性，均可包含在内。在优选的实施方案中，所述对象是哺乳动物，包括人和非人哺乳动物。在最优选的实施方案中，所述对象是人。如本文所用，术语“致病性”是指具有导致疾病的能力的物质或条件。
[0041]如本文所用，术语“胃肠道病原体”或“肠病原体”包括对胃肠道(从食管至直肠)具有致病性的微生物。其包括肠细菌(enterobacteria)、肠球菌(enterococci)、棒杆菌(corynebacteria)、鸟分枝杆菌副结核菌亚种(Mycobacterium avium subspeciesparatuberculosis)、Brachyspira hyodysenteriae、细胞内散沫花属(Lawsoniaintracellularis)、弯曲菌属(campylobacter)、梭状芽孢杆菌。胃肠道致病菌可包括沙门氏菌属、志贺氏菌属、葡萄球菌属、空肠弯曲菌、梭状芽胞杆菌属、大肠杆菌、耶尔森氏菌属(Yersinia)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)等。
[0042]如本文所用，术语“细菌素”或“细菌素样物质”是由细菌产生的蛋白质毒素，抑制相似或密切相关的细菌菌株的生长。
[0043]如本文所用，术语“治疗”包括尝试预防、补救、减轻对象健康问题及预防其复发，通常是在诊断之后进行。
[0044]附图简述
[0045]图1是胃肠道样转运模拟器(GITS)的算法。
[0046]图2是在胃肠道样转运模拟(GITS)期间通过qPCR确定的细菌计数。
[0047]图3是在小鼠模型中用合生素、益生菌和益生素混合物预防⑶I的实验设计。
[0048]图4是一组内所有动物的集合的盲肠内容物的盲肠计数。
[0049]图5是动物盲肠组织的组织病理学图。
[0050]图6是合生素组和对照组中盲肠LAB和双歧杆菌的qPCR结果。
[0051]发明详述
[0052]本发明涉及合生素组合物`，其包含乳杆菌(LAB)和/或双歧杆菌(Bif)属的至少两种益生菌菌株，以及一或多种益生素物质。所述组合物中存在的至少一种细菌菌株应具有降解淀粉的能力，并且至少一种益生素物质应是淀粉。所述细菌菌株应具有附着于肠道及抑制由艰难梭菌产生的毒素A和B的能力，但是不抑制彼此生长。此外，所述组合物中存在的至少一或多种益生素物质应增强益生菌菌株的生长，但是不增强胃肠道病原体的生长。本发明的合生素组合物有利地用于在对象的肠道粘膜建群，以预防、治疗、减轻抗生素相关腹泻(AAD)和/或由胃肠道病原体所致感染的症状，及预防其复发。
[0053]在目前的研究中，针对其有益性质如附着于肠粘膜层、抗艰难梭菌(CD)和/或其它肠道病原体的抗微生物活性、降解益生素物质及产生抗氧化剂等，已经筛选和表征了超过75种不同的乳杆菌和双歧杆菌益生菌菌株。令人惊奇地，结果是这些性质是非常菌株特异性的，并不是对于一个属的所有菌株均是普遍的。
[0054]乳杆菌属于包含超过100种不同乳杆菌物种的一组(微需氧的)细菌，其在生长期间产生乳酸。它们组成正常阴道菌群和新生儿肠道菌群的主要部分，但是也组成成人正常菌群的一部分。乳杆菌能在低PH生长，且耐受生长培养基中>20%胆汁。乳酸的产生使其环境变为酸性，这样抑制一些有害菌的生长。嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、植物乳杆菌(L.plantarium)、干酪乳杆菌(L.casei)、畐Ij干酪乳杆菌(L.paracasei)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、双叉乳杆菌(L.bifidus)和保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)是乳杆菌属的一些重要物种,其可用于本发明组合物中。
[0055]双歧杆菌属于厌氧菌类群，其在新生儿肠道中建群，随着年龄增加而逐渐降低。在生长期间其发挥有益作用，包括调节肠道微生物内稳态、抑制病原体和有害菌建群和/或感染肠粘膜、调节局部和全身免疫应答、阻抑微生物群内促致癌(pro-carcinogenic)酶活性、产生维生素、及将许多饮食化合物生物转化为生物活性分子。长双歧杆菌(B.1ongum)、短双歧杆菌(B.breve)、动物双歧杆菌(B.animalis)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)、婴儿双歧杆菌(B.1nfantis)是双歧杆菌属举例的物种，其可用于本发明组合物中。
[0056]在最初的筛选后,基于如上述有益性质从超过75种益生菌菌株中最终选择6种菌株(即LAB LU28，LAB LU33，Bif LU10,Bif LU29和Bif LU30)。之后对选择的菌株针对其在彼此存在的条件下-即共培养期间-的存活和增殖能力以及呈现抗微生物活性(AMA)进行检测。所有选择的乳杆菌和双歧杆菌在共培养期间均存活良好，且不产生针对彼此的细菌素样物质。
[0057]对选择的菌株针对在彼此共培养时对益生素如寡聚半乳糖(GOS)、寡聚木糖(XOS)、异麦芽糖寡糖(IMOS)、寡聚果糖(FOS)、乳果糖、阿拉伯树胶、β-葡聚糖、木聚糖、果胶、菊粉和/或可溶的及抗性淀粉的利用也进行了研究。选择的益生菌菌株的共培养根据其在不同的益生素组合中的益生素降解能力刺激特定的细菌菌株生长。令人惊奇地，非淀粉降解菌株与淀粉降解菌株在存在淀粉作为唯一可利用益生素物质的条件下的共培养，刺激非淀粉降解菌株的生长。这种组合物抗⑶及其它肠道病原体的AMA被保持。这表明交叉喂养(cross-feeding)的新概念,证实本发明组合物的菌株之间呈现的协同作用。当开发最佳组合物用于在对象肠粘膜建群以预防、治疗、减轻抗生素相关腹泻(AAD)和/或胃肠道病原体所致感染的症状及预防其复发中使用这个概念。
[0058]来自两或更多种所选择的菌株与不同组合的益生素共培养的无细胞上清(CFS)呈现出抗病原体ESBL大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、艰难梭菌2167和NAP1/027的ΑΜΑ。令人惊奇地，当CFS提取物稀释直至1:500时仍保持抗一些病原体及稀释1:10时抗其它病原体的ΑΜΑ，该活性显著高于单独培养生长的菌株的活性。这明确示出选择的菌株呈现出彼此协同作用，导致对抗病原体的较高ΑΜΑ。此外，选择的菌株与CD的混合物的共培养降低CD的生长，由CD对毒素A和B的产生由于选择的益生菌的存在而被强烈抑制。
[0059]在所述组合物中，有利但非必需地要求一或多种细菌菌株在细菌菌株的生产期间已经暴露于酸、胆汁和/或粘蛋白。酸和/或胆汁暴露诱导细菌中应激反应，其增强在通过胃肠道转运期间的存活能力及在肠道粘膜层建群的能力，在此其产生抗微生物活性(AMA)使得所述菌株发挥有益作用。
[0060]暴露于酸包括使培养液的pH降低，其中一或多种细菌菌株在MRS培养基中在PH2-5、优选ρΗ2.5-4.5、更优选ρΗ3_4条件下生长15-150分钟、优选20-140分钟、更优选30-130分钟、更优选40-120分钟。暴露于胆汁可包括在细菌菌株生产期间在培养液中加入0.1-2.5%(重量/体积)、优选0.5-2%、更优选1.0-1.5%牛磺胆酸钠或者1-10%(体积/体积)、优选2-7%、更优选3-10%猪胆汁，持续2-8小时、优选2.5-7小时、更优选3_6小时。暴露于粘蛋白包括在细菌菌株生产期间使细菌菌株在存在0.01-1%(体积/体积)、优选0.03-0.7%、更优选0.05-0.5%粘蛋白条件下生长2_8小时、优选2.5-7小时、更优选3_6小时。
[0061] 通常将细菌在对于生长“正好”最佳的培养基中培养。在生长期间暴露于酸、胆汁或者粘蛋白对于细菌是应激刺激。作为防御反应，应激基因被诱导，其随之诱导热激蛋白(HSP)及其它应激蛋白产生，由此使得细菌更强壮(robust)。暴露于酸和胆汁应激模拟胃肠道的条件。选择的菌株与益生素的组合物的稳定性、强壮性和协同作用在胃肠道模拟器(GITS)模型以及在体内小鼠模型中证实。[0062]基于共培养、共喂养、抗CD和肠道病原体的ΑΜΑ、毒素抑制活性、耐受暴露于酸、胆汁和/或粘蛋白的能力以及体外模拟(GITS模型)和体内小鼠模型，选择本发明组合物的最佳成分。本发明的组合物包含乳杆菌(LAB)和/或双歧杆菌(Bif)的至少两种益生菌菌株及一或多种益生素物质。此外，所述组合物中存在的至少一种细菌菌株具有降解淀粉的能力，并且至少一种益生素物质是淀粉。[0063]有利地，能降解淀粉的细菌菌株属于双歧杆菌属，如短双歧杆菌物种或者更特别是Bif LUlO菌株。本发明的淀粉降解菌株能降解淀粉如可溶淀粉(即在肠道中可降解的淀粉)，和/或抗性淀粉(即在肠道中不可降解的淀粉)。有利地，本发明的合生素组合物进一步包含非淀粉降解菌株，其是副干酪乳杆菌物种如LAB LU33。
[0064]因此，本发明的有利的组合物包含至少Bif LU10，和菌株LAB LU23、LAB LU28、LABLU33、BIF LU29和/或BIF LU30中的一或多种。另一有利的组合物包含至少Bif LUlO和LAB LU33，或者包含至少BIF LUlO、LAB LU33和BIF LU30。再一有利的组合物包含至少BIFLU10、LAB LU33、BIF LU30和LAB LU28。所述组合物的益处在下文论述。
[0065]本发明的合生素组合物除了淀粉之外还可进一步包含益生素物质，包括二糖，寡糖和/或多糖。所述二糖可以是乳果糖。所述寡糖可以是寡聚果糖(F0S)、寡聚半乳糖(GOS)、寡聚木糖(XOS)、壳聚糖寡糖(chioses)、异麦芽糖寡糖(MOS)、阿拉伯树胶、大豆和果胶寡糖。所述多糖可以是果胶、木聚糖、菊粉、壳聚糖、阿拉伯木聚糖和/或β -葡聚糖。
[0066]优选地，除了淀粉之外的至少一或多种进一步的益生素物质是寡聚半乳糖(GOS)、寡聚木糖(XOS)、异麦芽糖寡糖(MOS)、寡聚果糖(FOS)和/或乳果糖。
[0067]因此，本发明的组合物可例如包含如上述两或更多种细菌菌株，淀粉及一或多种进一步的益生素物质，包括寡聚半乳糖(GOS)、寡聚木糖(XOS)、异麦芽糖寡糖(IMOS)、寡聚果糖(FOS)和/或乳果糖。
[0068]本发明的组合物可有利地用于在对象的肠粘膜建群。如本文所用，术语“对象”是指需要治疗或者易感于涉及不想要的或不希望的胃肠道微生物感染的病症，例如需要特别治疗具有如上述不想要的病原性胃肠道感染。在优选的实施方案中，所述对象是哺乳动物，包括人和非人哺乳动物。当所述对象是人时其应用特别有益处。
[0069]在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物用于预防、治疗、减轻艰难梭菌相关腹泻(CDAD)和/或胃肠道(GI)病原体所致感染的症状和/或预防其复发。如本文所用，术语“胃肠道病原体”是指可以在对象中导致感染的病毒、寄生虫和细菌，例如当所述对象是哺乳动物如人时。胃肠道致病性细菌可包括沙门氏菌属、志贺氏菌属、葡萄球菌属、空肠弯曲菌、梭状芽胞杆菌属、大肠杆菌、耶尔森氏菌属、霍乱弧菌及其它菌属细菌。
[0070]有利地，所述组合物可用于预防、治疗、减轻由不同毒力和核糖体分型(ribotype)的艰难梭菌菌株引起的抗生素相关腹泻(AAD)的症状，和/或预防其复发。艰难梭菌是梭状芽胞杆菌属的一种厌氧种，其以较低计数组成正常肠道菌群的一部分。艰难梭菌是抗生素相关腹泻(AAD)的最严重的致病菌，可导致假膜性结肠炎，这是一种结肠的严重感染，通常由于抗生素对正常肠道菌群的摧毁。在生长期间，艰难梭菌产生及分泌毒力因子，例如毒素A和B。毒素A对于所有细胞均是毒性的，而毒素B对于肠细胞是毒性的，其损害该细胞并诱导分泌(腹泻)。本发明的组合物可用于预防、治疗、减轻由选自核糖体分型CD NAP1/027、CD1939、CD2167、CD1958、CD2165、CD2166、CD2168、CD027 和 CD1551 的艰难梭菌菌株引起的抗生素相关腹泻(AAD)的症状，及预防其复发。
[0071] 本发明另一方面提供了上述组合物在制备药物中的应用，所述药物用于在对象肠粘膜建群，并用于预防、治疗、减轻所述对象中抗生素相关腹泻(AAD)和/或胃肠道病原体感染的症状及预防其复发。
[0072]本发明另一方面提供了上述组合物在制备用于治疗患有抗生素相关腹泻(AAD)和/或胃肠道病原体感染的对象的药物中的应用。
[0073]本发明另一方面提供了上述组合物在制备用于预防抗生素相关腹泻(AAD)和/或胃肠道病原体导致感染的复发的药物中的应用。
[0074]本发明组合物中的益生素物质和益生菌菌株可以通过标准方法在任何纯度水平分离，纯化可以通过本领域技术人员已知的常规方式实现，如蒸馏、再结晶和层析。
[0075]用于本发明组合物中的培养的细菌细胞可通过使用任何方法从培养液中分离，包括但不限于离心、过滤或倾析。分离自发酵培养液的细胞任选用水、盐水(0.9%NaCl)或者用任何合适的缓冲液洗涤。获得的湿细胞物质可以通过任何合适方法干燥，优选通过冻干法。
[0076]本发明组合物中的益生素物质和益生菌可以单独施用或者与药物学可接受的载体或稀释剂一起施用，这种施用可以单一剂量或多剂量进行。
[0077]在本发明的组合物中，益生素成分以基于所述组合物总重量的5%_99%、优选30%_95%、更优选50%_90%的量(重量)存在。相应地，益生菌成分以基于所述组合物总重量的1%-15%、优选5%-10%的量(重量)存在。如果存在，补足所述合生素组合物100%量的部分由另外的物质如佐剂和/或赋形剂或者适当的添加剂/载体组成。
[0078]在药物组合物(例如片剂)中,本发明的组合物组成基于所述药物组合物总重量的40-70%，剩余部分是药物学可接受的佐剂和/或赋形剂。
[0079]在食物组合物(例如奶酪或巧克力)中，所述合生素组合物组成所述食物组合物总重量的1-15%。
[0080]在优选的实施方案中，所述合生素组合物含有的细菌菌株的量相对于所述合生素组合物重量为 IxlO8 至 lxl013CFU/g，优选 IxlO9 至 lxlOnCFU/g。
[0081]组合物可例如是片剂、丸剂囊剂、小瓶、硬胶囊或软胶囊、水性或油性悬浮液、水性或油性溶液、乳状液、粉末、颗粒、糖浆、酏剂、锭剂、可重建的粉末、液体制备物、霜剂、含片、硬糖、喷雾剂、乳霜、膏剂、胶状物、凝胶、糊剂、注射溶液、液体气雾剂、干粉配制物、HFA气雾剂或者有机酸或无机酸加成盐。
[0082]本发明的组合物可以是适于通过口服或者通过吸入或吹入(如经鼻、气管、支气管)途径施用的形式。
[0083]对于口服、口腔或舌下粘膜施用，本发明的益生素和益生菌可以与多种赋形剂组合。口服施用的液体组合物可以是例如乳状液、糖浆或酏剂形式，或者可以是干燥产物形式，在使用之前用水或其它合适载体重建。其它合适的充填剂、结合剂、崩解剂、润滑剂及其它赋形剂为本领域技术人员熟知。
[0084]本发明还涉及上文定义的组合物，其中所述组合物是食物组合物、食物补充剂、营养食品组合物、药物组合物和动物饲料的至少之一或一部分。
[0085]本发明另一方面提供了在对象中在肠粘膜建群及预防、治疗、减轻抗生素相关腹泻(AAD)和/或胃肠道病原体所致感染的症状以及预防其复发的方法，所述方法包括给有需要的对象施用有效剂量的上述组合物的步骤。根据治疗的病症和患者以及施用途径的不同，所述组合物可以不同剂量施用。在一个优选的实施方案中，所述组合物含有IxlO7至IxIO13CFU/剂和细菌菌株，优选IxlO9至IxIO11CFU/剂和细菌菌株。
[0086]通过实验例证本发明的有利之处。然而，下文所述实验只是举例说明本发明，不应限制本发明。本发明权利要求书范围内的其它方案、应用、目的和功能应为本领域技术人员显而易见。
[0087]选择本发明组合物的菌株的原理
[0088]从使用的菌株库中选择最有希望的菌株的主要选择标准是对抗肠道病原体包括艰难梭菌的抗微生物活性(AMA)，及附着于肠壁的能力，其通过刚果红结合(CRB)和盐聚集试验(SAT)测量。接下来的标准是对至少一种或一种以上的益生素物质的发酵。所测试的菌株的筛选结果在表1中示出。
[0089]细胞表面疏水性(CSH)是微生物在肠道内结合及相互作用以及在粘膜层中与病原体抗争的重要性质。CSH基于如下所述CRB和SAT测定确定。CRB是通过将经洗涤的细胞与刚果红(于PBS中100 μ g/ml) 一起保温10分钟，随后离心(9，OOOgX 30分钟)而进行。通过测量在480nm的吸光度上清中剩余的刚果红确定。在磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2，0.015M)中的刚果红用作对照。CRB表示为结合的刚果红的百分比。因此结果越接近于100则细胞表面疏水性越高。CSH通过盐聚集试验(SAT)确定。10微升在PBS中的经洗涤的细胞悬液在玻片上与范围为0.02M至4M的各种摩尔浓度的10微升pH6.8硫酸铵混合。一分钟后观察聚集。SAT结果表示为菌株聚集的最低盐浓度(M)。聚集所需盐浓度越低意味着细胞表面疏水性越高。
[0090]潜在益生菌株的AMA使用如下微滴定平板(MTP)针对肠道病原体ESBL大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、`鼠伤寒沙门氏菌和4种不同艰难梭菌而确定:通过离心(3，20(^，20111丨11，4。0从在]\--(06 Man Rogosa Sharpe)和 MRSC (含有 0.05% (w/v)盐酸L-半胱氨酸的MRS)培养液中生长的乳杆菌和双歧杆菌24小时培养物收获无细胞上清培养物(CFS)滤液，所述上清用0.2微米过滤器过滤。为确定AMA，将CFS加到MTP。在灭菌脑心浸液(BHI)肉汤中制备不同稀释液(1:1，1:10，1:100和1:500)。将100微升上清加入到微滴定孔中并且在37°C无氧保温过夜，用Anoxomat i培养系统(MART，The Netherlands)平衡。肠道病原体细胞在Fructose Fastidious琼脂平板上无氧生长24小时。细胞用PBS洗2次，重悬于无菌PBS中。在BHI肉汤中制备A62tl=0.02的10微升肠道病原体细胞，并加入到过夜预还原的MTP中。在48小时(CD病原体)/24小时(其它病原体)后用平板分析仪在OD62tl测量生长，结果表示为相对于无CFS对照孔中的生长而计算的肠道病原体生长抑制百分比。
[0091]
/ODt X100、
CDli K 抑制白'分比=loo —
[0092]ODt和Odc代表在LAB或者双歧杆菌的CFS存在和不存在下的⑶生长。类似地，确定乳杆菌和双歧杆菌共培养提取物针对CD的ΑΜΑ。相同公式用于所有肠道病原体。[0093]潜在益生菌株降解益生素的能力的初步筛选如下进行:乳杆菌和双歧杆菌菌株最初在MRS/MRSC琼脂上微有氧和无氧条件下在37°C生长。每种菌株的单菌落然后作为小块涂布在用于乳杆菌的不含葡萄糖并且具有1%(重量/体积)益生素(寡聚果糖(F0S)、寡聚木糖(XOS)、寡聚半乳糖(GOS)、菊粉(inulin)、可溶性淀粉(SS)、抗性淀粉(RS)、果胶、异麦芽糖寡糖(MOS)、乳果糖)的基础MRS琼脂或者用于双歧杆菌的补加0.05% (w/v)盐酸L-半胱氨酸琼脂的具有1%(重量/体积)益生素(FOS, FOS (Orafti)，XOS, G0S,菊粉，SS, RS,果胶，頂OS，乳果糖)作为主要碳源的际蛋白胨酵母膏(PY)琼脂，具有每升30mg溴甲酚紫，在微有氧(乳杆菌)或者无氧条件(双歧杆菌)下在37°C保温48小时。各种LAB和双歧杆菌对FOS、FOS (Orafti)、XOS、G0S、菊粉、SS、RS和果胶的降解能力可见于表1 (见脚注)。
[0094]表1.刚果红结合、盐聚集试验、AMA及益生素降解的筛选结果
[0095]缩写如下:-H-高活性一≤70%抑制，中等一41-69%抑制，低≤40%抑制，nd—未确定；Vw+-非常弱；2+强阳性；3+非常强阳性。基于表1提供的实验结果，选择表2的益生菌株进行进一步实验。[0096]
【权利要求】
1.合生素组合物，其包含选自乳杆菌(Lactobacillus)属和双歧杆菌(Bifidobacteria)属的至少两种细菌菌株,及一或多种益生素物质,特征在于: -所述细菌菌株中的至少一种能降解淀粉；及 -至少一种益生素物质是淀粉。
2.权利要求1的合生素组合物，其中所述能降解淀粉的细菌菌株属于双歧杆菌属。
3.权利要求1的合生素组合物，其中所述能降解淀粉的细菌菌株是短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)物种。
4.权利要求1的合生素组合物，其中所述能降解淀粉的细菌菌株是BifLU10。
5.权利要求1的合生素组合物，其中所述淀粉是抗性淀粉(RS)和/或可溶淀粉(SS)。
6.权利要求1-5任一项的合生素组合物，其中所述细菌菌株之一是非淀粉降解菌株。
7.权利要求6的合生素组合物，其中所述非淀粉降解细菌菌株是副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)物种。
8.权利要求6的合生素组合物，其中所述非淀粉降解细菌菌株是LABLU33。
9.权利要求1-8任一项的合生素组合物，其包含至少BifLU10，及包含菌株LAB LU23、LAB LU28、LAB LU33、BIF LU29 和 / 或 BIF LU30 中的一或多种。
10.权利要求9的合生素组合物，其包含至少BifLUlO和LAB LU33。
11.权利要求9的合生素组合物，其包含至少BIFLU10、LAB LU33和BIF LU30。
12.权利要求9的合生素组合物，其包含至少BIFLUlO, LAB LU33、BIF LU30和LABLU28。
13.权利要求1-12任一项的合生素组合物，其中所述一或多种细菌菌株在其生产期间已经暴露于酸、胆汁和/或粘蛋白。
14.权利要求13的合生素组合物，其中所述暴露于酸包括在所述细菌菌株生长期间使培养液的pH降低至pH2-5、优选降低至pH2.5-4.5、更优选降低至pH3-4，持续15-150分钟、优选20-140分钟、更优选30-130分钟、更优选40-120分钟。
15.权利要求13的合生素组合物，其中所述暴露于胆汁包括使所述细菌菌株在存在0.1-2.5%(重量/体积)、优选0.5-2%、更优选1.0-1.5%牛磺胆酸钠或者1-10%(体积/体积)、优选2-7%、更优选3-5%猪胆汁的条件下生长2-8小时、优选2.5-7小时、更优选3-6小时。
16.权利要求13的合生素组合物，其中所述暴露于粘蛋白包括使所述细菌菌株在存在0.01-1%(体积/体积)、优选0.03-0.7%、更优选0.05-0.5%粘蛋白的条件下生长2-8小时、优选2.5-7小时、更优选3-6小时。
17.权利要求1-16任一项的合生素组合物，其进一步包含属于由二糖、寡糖和/或多糖组成的的组的益生素物质。
18.权利要求17的合生素组合物，其中所述二糖是乳果糖。
19.权利要求17的合生素组合物，其中所述寡糖来自由寡聚果糖(F0S)、寡聚半乳糖(GOS)、寡聚木糖(XOS)、壳聚糖寡糖、异麦芽糖寡糖(MOS)、阿拉伯树胶、大豆-寡糖和果胶-寡糖组成的组。
20.权利要求17的合生素组合物，其中所述多糖来自由果胶、木聚糖、菊粉、壳聚糖和/或β-葡聚糖组成的组。
21.权利要求17的合生素组合物，其进一步包含属于由寡聚半乳糖(GOS)、寡聚木糖(XOS)、异麦芽糖寡糖(MOS)、寡聚果糖(FOS)和/或乳果糖组成的组的益生素物质。
22.权利要求17的合生素组合物，其进一步包含寡聚半乳糖(GOS)和/或异麦芽糖寡糖(IMOS)。
23.权利要求1-22任一项的合生素组合物，其用于在对象肠粘膜中建群。
24.权利要求1-22任一项的合生素组合物，其用于预防、治疗、减轻对象中抗生素相关腹泻(AAD)和/或胃肠道病原体所致感染的症状，和/或预防抗生素相关腹泻和/或胃肠道病原体所致感染的复发。
25.权利要求24的合生素组合物，其中所述抗生素相关腹泻(AAD)由艰难梭菌(Clostridium difficile)引起。
26.权利要求24的合生素组合物，其中所述胃肠道病原体所致感染是由沙门氏菌(Salmonella)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、产超广谱β_内酰胺酶(ESBL)大肠杆菌导致。
27.权利要求23-26的合生素组合物，其中所述对象是哺乳动物。
28.权利要求27的合生素组合物，其中所述哺乳动物属于由人、非人灵长类动物、牛、绵羊、猪、山羊和马、狗、猫、啮齿动物和豚鼠组成的组。
29.权利要求23-26的合生素组合物，其中所述对象是人。
30.权利要求1-22任一项的合生素组合物在制备药物中的应用，所述药物用于在对象肠粘膜建群，以预防、治疗、减轻抗生素相关腹泻(AAD)和/或胃肠道病原体感染的症状，及预防抗生素相关腹泻和/或胃肠 道病原体感染的复发。
31.权利要求1-22任一项的合生素组合物在制备药物中的应用，所述药物用于治疗患有抗生素相关腹泻(AAD)和/或胃肠道病原体所致感染的对象。
32.在对象肠粘膜建群的方法，所述方法包括给有需要的对象施用有效剂量的权利要求1-22任一项的合生素组合物的步骤。
33.一种治疗患有抗生素相关腹泻和/或胃肠道病原体所致感染的对象的方法，所述方法包括给有需要的对象施用有效剂量的权利要求1-22任一项的合生素组合物的步骤。
【文档编号】A61P1/00GK103491969SQ201280009395
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2012年2月9日 优先权日:2011年2月9日
【发明者】T·瓦德斯特伦, A·荣, P·安巴南, K·K·孔德普迪 申请人:拉维沃公司