通过围产期母体施用减少和预防子代过敏的副干酪乳杆菌ncc2461(st11)的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种益生菌：副干酪乳杆菌NCC2461，即ST11，其用于通过施用于待产女性和／或哺乳母体和其子代，以减少或预防子代形成过敏性免疫反应。在分娩之前将日剂量的ST11施用于妊娠女性至少两周，并且在分娩之后将日剂量的ST11施用于哺乳母体或直接或经由母体乳汁施用于新生婴儿至少两个月。由此减少婴儿对过敏原的免疫反应，产生“减弱的”过敏反应。由此可在子代中预防过敏，包括特应性。
【专利说明】通过围产期母体施用减少和预防子代过敏的副干酪乳杆菌
NCC2461(ST11)
发明领域
[0001]本发明涉及能够调节婴儿对过敏原的免疫反应的益生菌的围产期施用。
[0002]发明背景
[0003]过敏性疾病的发病率在近数十年内迅速增加。因为至今全世界三分之一以上人群均患有过敏，所以其已被认为是工业化国家的新型流行病。尚未充分了解过敏性疾病稳定增加的原因。宿主的遗传背景为主要因素，并且近来发现的基因已显示与呼吸性过敏 / 哮喘和皮肤症状有关[Holloway, J.W.等人，(2010) ；Geneticsof Allergic Disease,J.A.C.1.,125:S81-94]。环境因素如生活方式、污染、家庭规模减小以及由于卫生情况改良而使得在生命早期阶段对免疫系统的微生物刺激减少似乎也起重要作用。
[0004]儿童期、尤其儿童早期且尤其针对食品过敏原的过敏性致敏至关重要且最受关注，因为已显示“过敏性表型”或“特应性”的发生促进随后对其它过敏原的不良反应。因此，儿童期的过敏可能为以后生命中产生多种过敏的过敏性级联反应(通常称为“特应性历程(The Atopic March)”的情况)的第一步。例如，已证明，在人类群组中，在生命早期持续有食品过敏的儿童在儿童期后期形成过敏性鼻炎(枯草热)或哮喘的风险显著增加(QsthlfHli> E.等人，(2008) ；Phenotypes of food hypersensitivity and developmentof allergic diseases during the first8years of life, Clinical and ExperimentalAllergy, 38 (8):1325-1332)。因此，预防食品过敏发作或减弱其严重程度对于使“特应性历程”减速可能尤为关键。在该上下文中，对儿童期和婴儿期过敏事件的管理以及此外对过敏的预防最为重要。
[0005]可以以不同程度实现对过敏`的预防:
[0006]“初级预防”为预防或降低患者对过敏原的致敏风险的作用，其特征在于不存在过敏原特异性IgE抗体或其含量降低。预防或减少致敏将使得再次暴露于同一过敏原时不存在过敏性症状或症状减轻。本发明涉及过敏的初级预防。
[0007]“次级预防”为调节过敏症状(即已对一种或若干种过敏原致敏的患者在该患者再次暴露于所述过敏原时过敏反应的发生或强度)的作用。通过调节过敏症状的发生或强度(次级预防)，使与过敏有关的对过敏患者生活质量的负面影响降至最低。
[0008]鉴于存在这些不同的过敏预防概念，可假设鉴于其固有作用机制，一些化合物可作用于这些特定预防等级中的仅一者或两者。例如，一些化合物仅可降低特定过敏原致敏的风险(初级预防)，而其它化合物仅可对次级预防起作用且降低过敏性反应的严重程度。其它化合物可能能影响致敏与症状二者，并因此在促进初级和次级预防方面有效。
[0009]食品过敏原为婴儿在其生命早期遇到的第一过敏原之一:通常，未接受全母乳哺育的婴儿可能会遇到牛乳蛋白。乳蛋白的确为婴儿期最常观测到的食品过敏原因之一，之后为鸡蛋和小麦蛋白。一般而言，食品过敏在婴儿和年幼儿童中可表现为皮肤症状(皮疹、湿疹、其它症状)和胃肠症状(腹部痉挛；疼痛，尤其腹部疼痛；呕吐)。其它致敏作用和过敏事件也可在婴儿/年幼儿童暴露于新食品如谷类、蔬菜、水果、坚果或鱼以及空气传播过敏原如花粉时出现。
[0010]在儿童和成人中，空气传播过敏原如花粉、室内尘螨和动物皮屑也是过敏的主要原因。已知桦树花粉过敏人群在摄取若干类植物源性食品之后通常呈现过敏症状[vieths, S., Scheurer, S.和 Ballmer-Weber, B.(2002) ；Current Understanding ofCross-Reactivity of Food Allergens and Pollen， Annals of the New York Academyof Sciences，964 ;47-68.]。这些反应的大部分是由桦树花粉中存在的四种不同的交叉反应性蛋白结构引起的。与Bet V I即主要桦树花粉过敏原共享抗原决定基的蛋白存在于若干树种的花粉以及水果和蔬菜如苹果、核果、芹菜、胡萝卜、坚果和大豆中。在Vieths等人的研究中显示，所研究的对桦树花粉过敏的患者中有大约70%在消耗来自这些群组的食品之后可经历症状。因此，对空气传播过敏原如桦树花粉的过敏发生也直接与食品过敏表现(称为口部症候群中的交叉反应性)有关。
[0011]胃肠微生物群(microbiota)和免疫系统
[0012]共生胃肠微生物对于肠相关淋巴组织和相关免疫系统的形成构成最早且最实质的刺激。
[0013]来自流行病学研究的可靠证据证明，西方式生活条件、例如减少消耗发酵食品、大量使用抗生素和其它药物以及卫生条件改善与过敏性疾病的增加有关。因此所谓的“卫生假设”表明在儿童期早期缺少暴露于微生物刺激为与此趋势相关的主要因素[Von Mutius,E.(2007) ；Allergies, Infections and the hygiene hypothesis-The epidemiologicalevidence, Immunobiology,212(6) ;433_9]。
[0014]实际上，流行病学研究已经证明:过敏性疾病发生与胃肠微生物群紊乱之间的关联。例如，已报导在西方社会中，与健康儿童相比，特应性体质儿童体内通常有较少乳杆菌或双歧杆菌集落[Suzuki, S.，Shimojo, N.，Taiiri, Y.，Kumemura, Μ.，Kohno, Y.(2007)；Differences in the composition of intestinal Bifidobacterium species and thedevelopment of allergic diseases in infants in rural Japan, Clin Exp Allergy ；37 ;506_511 ；Ouwehand, A.C.,` Isolauri, E., He, F., Hashimoto, H., Benno, Y., Salminen,S.(2001) !Differences in Bifidobacterium flora composition in allergic andhealthy infants.J.Allergy Clin.Tmmunol.108 ;144_145 ；Kalliomaki,M.,Salminen, S.,Arivilommi, H., Kero, P., Koskinen, P.和 Isolauri, E.(2001) ；Probiotics in primaryprevention of atopic disease:a randomised placebo-controlled trial, Lancet357:1076-9]。
[0015]有趣的是，响应于婴儿喂食，肠微生物群的组成存在明确差异。母乳哺育婴儿的粪便微生物群包括可观的双歧杆菌(bifidobacteria)群体和一些乳杆菌属(Lactobacillus species),而配方乳哺育婴儿具有更为复杂的微生物群，具有双歧杆菌属和拟杆菌属(Bacteroides species),通常还存在梭状芽孢杆菌(clostridia)和链球菌(streptococci)。断乳之后，随着时间推移建立起与成人模式类似的肠微生物群模式[Penders, J.等人(2006) ；Gut microbiota composition and development of atopicmanifestations in infancy:the KOALA birth cohort study.Gut56:661-667]。
[0016]这些发现提供一种通过给人类膳食补充益生菌来预防过敏性疾病的合理疗法。此外，众所周知，与配方乳哺育儿童相比，母乳哺育儿童发生过敏症的频率和/或严重程度较低，因此支持益生菌干预，所述益生菌干预促进非母乳哺育儿童中的肠微生物群与母乳哺育儿童尽可能地类似。
[0017]也有证据证明:通过环境因素的免疫规划可在窄机会窗口内作用，无论是妊娠期间还是在免疫反应仍发展的儿童早期[Aaltonen, J., Ojala, T., Laitinen, K., Poussa,T., Ozanne, S., Isolauri, E.(2011) ；Impact of maternal diet during pregnancyand breastfeeding on infant metabolic programming:a prospective randomizedcontrolled study.E.Eur.J.Clin.Nutr.65 ; 10-19]。
[0018]因此，新生儿的免疫状态是重要的。该状态包括婴儿出生时存在的保护和在婴儿生命的最初几个小时、最初几天或最初几周期间获取该免疫保护。获取和维持该保护的能力是婴儿面对新环境时的健康状况的关键因素。因此，产前、围产期和/或产后干预相当于一种调节免疫反应从而促进和/或维持非特应性状态的有前景的方法。此外，与儿童期引导性干预相比，妊娠/哺乳期的干预在便利性和依从性方面可具有相当大的优势。
[0019]然而，近来的报导证实:围产期和/或产后益生菌治疗没有产生可预测的结果。例如，W001 / 97822中公开,若鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)自分婉之前2至4周起和在母乳哺育期间给予母体或自出生起6个月直接给予婴儿，则处于高风险的儿童中，2岁时湿疹的发病率降低约50%。然而，在来自Kopp等人(2008)的论文中，关于同一菌株报导了矛盾的结果[Kopp 等人(2008) ；Randomized, Double Blind, PlaceboControlled Trial of probiotics for Primary Prevention:No clinical Effects ofLactobacillus GG supplementation Pediatrics,第 121 卷，第 4 期]。
[0020]在预期分娩之前4至6周将鼠李糖乳杆菌GG施用于母体，然后在6个月的时间内施用后代，既未降低特应性皮炎的发病率，也没有改变受影响儿童的特应性皮炎的严重程度。该论文的结论为一般不推荐鼠李糖乳杆菌GG用于初级预防。这些实验是对一般群体的特定子群即具有高 过敏风险的子代进行的。
[0021]W02009 / 118243中公开:在妊娠期或哺乳期向雌性小鼠施用或在出生后直接向子代施用特定益生菌微生物增强了子代免疫力。因此，施用鼠李糖乳杆菌CGMCC1.3724(LPR)增加了小鼠幼仔对麻疹疫苗的外周IgG反应。然而，该作用对所用菌株具有特异性。
[0022]因此，根据这些引用的现有技术文献，需要在施用益生菌作为改善新生幼儿和婴幼儿的健康状况的方式的领域取得进一步的发展。
[0023]因此，需要通过待产母体的目标营养膳食积极影响子代的健康状况，尤其目的在于对子代起作用。
[0024]需要在子代生命中尽早预防过敏或降低过敏风险的领域促进子代的健康状况。
[0025]具体而言，需要有助于确保子代中的最佳免疫系统，以便使子代针对早期生命抗原攻击做出最佳准备，以及增强其免疫系统的未来成熟以更好地促进随后婴儿期的保护。
[0026]需要在妊娠期间尽可能早的阶段以及免疫系统迅速成熟的新生儿生命的早期阶段影响子代的免疫系统的构建。
[0027]发明概述
[0028]本发明提供一种益生菌副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)NCC2461,即ST11，其用于通过施用于待产雌性和/或哺乳母体和其子代以减少或预防子代形成过敏性免疫反应。过敏性免疫反应的减少是相对于未用STll治疗的母体的子代而言。
[0029]子代可为有特应性疾病风险的子代。本发明关注的过敏性免疫反应针对食品或空气传播过敏原，尤其桦树花粉过敏原Bet Vl和Bet v2。过敏性免疫反应可为过敏原特异性回忆(recall)反应或非过敏原特异性(有丝分裂原)诱导反应。过敏免疫反应的减少在过敏原特异性回忆反应的情况下可表现为IL-4和IL-5产生减少，和/或在有丝分裂原诱导反应的情况下表现为通过定型淋巴细胞产生的IL-5减少。
[0030]因此婴儿对过敏原的免疫反应减少，从而在子代中产生“减弱”(dampened)的过敏反应。因此可在子代中预防过敏，包括特应性反应。
[0031]根据本发明，在分娩之前将STll施用于待产母体至少两周，并且在分娩之后直接或经由母体乳汁施用于子代至少2个月，优选分娩后长达6个月或甚至长达I年。
[0032]因此，母体在其至少部分或所有妊娠期以及分娩后至少部分或所有哺乳期(若其哺乳)以日剂量接受ST11。STll可优选在食品、饮料、膳食补充剂或药物组合物中经口施用于待产或哺乳母体。
[0033]分娩之后直接或经由母体乳汁将日剂量的STll施用于新生婴儿至少两个月，优选长达6个月。其可以其纯化形式或稀释于水、母乳或婴儿配方乳中来施用。
[0034]施用于待产或哺乳母体的STll的日剂量为IX IO6至IX IO11Cfu,优选IX IO8至I X IO10Cfu (cfu=菌落形成单位)，而施用于新生婴儿的日剂量为I X IO2至I X IO10,优选I X IO2至I X 104cfu (cfu=菌落形成单位)ο
[0035]本发明也关于初级预防或减少婴儿形成过敏性免疫反应的方法，其包括
`[0036]-在分娩之前，向妊娠女性施用日剂量的活副干酪乳杆菌NCC2461(STll)至少两周，和
[0037]-在分娩之后，向新生婴儿施用日剂量的活益生菌至少2个月，优选分娩后长达6个月或I年。
[0038]附图简述
[0039]图1:实验设计
[0040]桦树花粉过敏的实验小鼠模型(雌性BALB / c小鼠；n=8)的方案，用以证明母体补充副干酪乳杆菌STll保护子代以免产生过敏性表型。
[0041]图2:组织学
[0042]用苏木精和伊红(H&E)染色剂(图2A、B和C)以及用过碘酸希夫氏染色法(periodic acid-Schiff-stained, PAS)(图2D、E和F)染色的固定的全肺石腊包埋切片。图框A和图框D对应于非致敏/非攻击和非益生菌处理的小鼠；图框B和图框E对应于用Bet Vl致敏并用桦树花粉攻击的小鼠；图框C和图框E对应于用Bet vl致敏并用桦树花粉攻击且围产期接受副干酪乳杆菌STll处理的小鼠。
[0043]图3:子代小鼠中的肺炎
[0044]STll围产期处理对肺炎的作用。图框A显示子代的支气管肺泡灌洗(BAL)液中的细胞浸润(巨噬细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞计数)。图框B、C和D分别显示BAL液、肺和肺纵隔引流淋巴结中的白介素5(IL-5)的水平。白色条带对应于未用副干酪乳杆菌STll处理的母体的子代(桦树花粉致敏并攻击)。黑色条带对应于用STll处理的母体的子代(桦树花粉致敏并攻击)。[0045]图4:脾细胞离体刺激后的细胞因子产生
[0046]来自补充副干酪乳杆菌STll的母体的致敏且受攻击子代(黑色条带)相较于源自对照母体的致敏和受攻击子代(白色条带)的离体过敏原再刺激脾细胞培养物分泌的Th2细胞因子IL-4(A)和IL-5 (B)的水平。通过用rBetvl (10 μ g / ml)离体再刺激脾细胞培养物分泌的Th2细胞因子IL-4(C)和IL-5 (D)的水平。使用假(对照)处理母体之后代的脾细胞评估副干酪乳杆菌STll的免疫调节潜能:用与rBet ν1(10μ g / ml)混合的副干酪乳杆菌STll (IO8Cfu / ml)孵育脾细胞48小时。
[0047]图5:脾细胞离体刺激后的细胞因子产生
[0048]来自已接受STll的母体(黑色条带)或来自对照小鼠(白色条带)的用桦树花粉致敏并用有丝分裂原伴刀豆球蛋白A (Con A)刺激的子代的脾细胞分泌的IL-4(A)和IL-5⑶的水平。自用副干酪乳杆菌STll处理(黑色条带)或未用副干酪乳杆菌STll处理(白色条带)的母体的子代分离的、过敏原诱导(Bet vl)或ConA诱导(ConA)的脾细胞(C)和MLN(D)的离体增殖。
[0049]详述
[0050]定义:
[0051]在本说明书中，以下术语具有以下含义:
[0052]“断乳期”是婴儿由纯液体营养物适应于固体或半固体食品和由几乎唯一食品类型(一般为母体乳汁或婴儿配方乳)适应于多种食品的时期。
[0053]“致敏”意指过敏原特异性IgE抗体的诱导/形成。
[0054]“非过敏原特异性免疫反应`”意指通过伴刀豆球蛋白A(Con A)以非特异性方式刺激免疫细胞时产生细胞因子，该伴刀豆球蛋白A为有丝分裂原刺激性淋巴细胞，即定型T细胞。因此，术语“非过敏原特异性免疫反应”与“有丝分裂原诱导的免疫反应”同义。
[0055]“益生菌”意指对宿主的健康或良好状态具有有益作用的微生物细胞制剂或组分。(Salminen S, Ouwehand A.Benno Y.等人，“Probiotics:how should they be defined”，Trends Food Sc1.TechnOl.(1999):10107-10)。益生菌的定义一般被认为与 WHO 定义一致。益生菌可包含唯一微生物菌株、各种菌株的混合物和/或各种细菌物种以及细菌属的混合物。在混合物的情况下，单数术语“益生菌”仍可用以表示益生菌混合物或益生菌制剂。就本发明而言，认为乳杆菌属(Lactobacillus)的微生物是益生菌。
[0056]“益生元” 一般意指通过选择性刺激宿主的肠道中存在的微生物的生长和/或活性而有利影响宿主并因此试图改善宿主健康状况的不可消化的食品成分。
[0057]苜Ij干酪乳杆菌(L.paracasei)菌株NCC2461 (雀巢菌种保藏中心(NestleCulture collection))为替代名称为在本文全文中所用的ST11,并且国际识别参考码为CNCM1-2116 (巴斯德研究所的国立微生物保藏中心(Collection Nationale de Culturesde Microorganismes at Institute Pasteur)，Paris, France, 1999 年 I 月 12 日保藏)的副干酪乳杆菌。CNCM标识符是指巴斯德研究所的国立微生物保藏中心，28ROUX博士路，F-75724巴黎15区，法国。
[0058]《过敏和/或特应性疾病的风险》意指个体(a)具有阳性过敏家族史，其中至少I个一级亲属父母或同胞具有所声明的过敏性疾病，如特应性湿疹、哮喘、枯草热或食品过敏,或者(b)展现至少一个过敏事件如特应性湿疫、哮喘、枯草热或食品过敏。此定义与例如科技出版物中所用的有过敏风险的婴儿的通用定义一致，如J.Allergy Clin.1mmunol,第121卷，第6期，第1443-1447页，Berg等人，第1443页“Subjects”段落。
[0059]本发明提供一种益生菌STl I，其用于通过施用于待产母体和其子代以减少或预防子代形成过敏性免疫反应。因此，本发明提供初级预防或减少婴儿发生过敏的方法。所有婴儿均可受益于本发明，包括由于其家族史而有发生特应性疾病风险的婴儿。
[0060]根据本发明，在分娩之前将日剂量的STll施用于妊娠女性至少两周，并且在分娩之后将日剂量的STll直接或经由母体乳汁施用于新生婴儿至少两个月。
[0061 ] 因此，本发明也涉及包含STl I的组合物，其用于根据如上所示方案通过施用于待产母体和其子代，减少或预防子代中过敏性免疫反应的形成。
[0062]通过施用本发明的ST11，有利地影响婴儿的肠微生物群。通过在妊娠期向母体施用STll和分娩后向婴儿施用ST11，对过敏原的免疫反应减少，因此过敏反应“减弱”，并且可预防包括特应性反应的过敏。在以下段落中对此作用进行详细阐述。
[0063]益生菌的剂暈:
[0064]施用于待产或母乳哺育母体的STll的日剂量为I X IO6至I X IO11Cfu,优选I X IO8至I X IO10Cfu (cfu=菌落形成单位)。适用于新生幼儿的日剂量在I X IO2至I X IO10,优选I X IO2至I X IO4Cfu的范围内。
[0065]因此，组合物中STll的百分比可在广泛范围内，条件是其递送所述免疫保护作用。然而，优选地，组合物中STll的量等于IX IO2至IxiO11Cfu / g干组合物。这包括细菌为活的、灭活的或死的或甚至以片段如DNA或细胞壁物质存在的可能性。换句话说，配方乳中所含细菌的量以假设所有细菌均为活细菌的细菌量的菌落形成能力来表示，而不管所述细菌实际上是活的、 灭活的或死的、片段化或所述状态中的任何或所有状态的混合状态。优选地，对于施用于待产或哺乳母体，益生菌的含量等于I X IO4至IX 109efu / g干组合物，甚至更优选含量等于IX IO6至IXlO8Cfu / g干组合物。
[0066]施用于子代的每克干组合物中益生菌的含量可能较低且应考虑上文所述日剂量。_7] 施用方法:
[0068](i)施用于待产母体:
[0069]组合物可通过各种方法施用于待产母体，只要其诱导组合物与雌性(females)的胃肠道之间的接触即可。优选地，组合物作为待产母体的食品、饮料或膳食补充剂的一部分经口施用。也可以在药物组合物中施用组合物。优选经口施用。然而，在病理性病状中或当另外使用经肠喂食时，可将施用的组合物添加至经肠喂食中。
[0070](ii)施用于新生子代:
[0071]STll也可单独(纯化形式或稀释于例如水或母体乳汁)作为食品补充剂或作为婴儿配方乳中的成分经口直接施用于子代。该配方乳可为婴儿“早产儿配方乳”(若子代在足月前出生或出生重量低)、“初生婴儿配方乳(starter formula) ”或“较大婴儿配方乳(follow-on formula)”。配方乳也可为低过敏(HA)配方乳,其中牛乳蛋白为水解蛋白。实施例2中提供该初生婴儿配方乳的实例。
[0072]在本发明的一个实施方案中，经由哺乳母体将STll或包含STll的组合物或包含STll的组合物的一部分施用于婴儿。哺乳母体接受如上所述STll或包含STll的组合物。据信，在某些情况下STll可经由人类母乳将益处递送给婴儿。不受理论束缚，据信，该益处可直接通过将STll传给乳汁直接或间接通过将STll诱导的化合物或代谢物传给人类母乳
或通过调节免疫调节化合物(如免疫球蛋白、可溶性⑶14、TGF-13或细胞因子等......)
的母乳含量而递送给婴儿。
[0073]在本发明的一个实施方案中，STll经由施用STll的哺乳母体的人类母乳施用于婴儿。
[0074]在一个实施方案中，将STll施用于哺乳母体且STll的有益作用通过人类母乳(例如通过母体中STll诱导的化合物)传输至婴儿。
[0075]与其它化合物一起施用:
[0076]STll可单独(纯品或稀释于水或乳汁，包括例如母乳)或以与其它化合物(如膳食补充剂、营养补充剂、药品、载体、调味剂、可消化或不可消化成分)的混合物形式施用。维生素和矿物质为典型膳食补充剂的实例。在一个优选实施方案中，组合物连同增强对于子代免疫的所述作用的其它化合物一起施用。此类协同化合物可为促进STll递送至待产母体的肠道或可以以其它方式增强组合物对于子代免疫系统作用的载体或基质。此类化合物可为协同或单独影响婴儿的免疫反应和/或增强益生菌作用的其它活性化合物。此类协同化合物的实例为麦芽糖糊精。麦芽糖糊精的作用之一是提供益生菌的载体、增强其作用和预防聚集。
[0077]其它实例包括已知益生元化合物，如选自下组的碳水化合物:菊粉、低聚果糖(FOS)、短链低聚果糖(短链F0S)半乳寡糖(GOS)、低聚木糖(XOS)、神经节苷脂、部分水解的瓜尔胶(PHGG)、阿拉伯胶、大豆胶、苹果提取物、乳糖枸杞(Iactowolfberry)、枸杞提取物或其混合物。其它碳水化合物可以存在，如与第一碳水化合物协同起作用的第二碳水化合物，并且选自下组:低聚木`糖(XOS)、胶、阿拉伯胶、淀粉、部分水解的瓜尔胶或其混合物。组合物日剂量中，一种或多种碳水化合物的含量可为约Ig至20g或I %至80 %、或20 %至60%。或者，碳水化合物的含量为干组合物的10%至80%。
[0078]与STll —起施用的碳水化合物和所有其它化合物的日剂量始终应遵守公开的安全指南和法规要求。这对于施用于新生幼儿尤其重要。
[0079]在一个实施方案中，营养组合物优选包含蛋白来源。优选将膳食蛋白作为蛋白来源。膳食蛋白可为任何适当膳食蛋白，例如动物蛋白(如乳蛋白或肉蛋白)、植物蛋白(如大豆蛋白、小麦蛋白、米蛋白或豆类蛋白)、游离氨基酸混合物或其组合。尤其优选乳蛋白如酪蛋白和乳清蛋白。
[0080]进行中的研究中现一致推荐在断乳期即出生后3至7个月将可能致敏的食品喂养幼儿，而幼儿仍至少接受部分母乳哺育。我们坚信将STll施用于婴儿(经由母乳哺育或通过直接施用)有助于将可能的致敏性食品如乳蛋白引入儿童的膳食中。
[0081]该组合物也可包含碳水化合物来源和/或脂肪来源。
[0082]若本发明的组合物为营养组合物且包括脂肪来源，则脂肪来源优选提供约5%至约55%的营养组合物能量；例如约20%至约50%的能量。
[0083]构成脂肪来源的脂质可为任何适当脂肪或脂肪混合物。植物脂肪如大豆油、棕榈油、椰子油、红花油、葵花油、玉米油、菜籽油、卵磷脂等尤其适合。如果需要，也可添加如乳脂的动物脂肪。
[0084]可将其它碳水化合物来源添加至营养组合物中。优选提供约40%至约80%的营养组合物能量。可使用任何适当碳水化合物，例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖浆固体、麦芽糖糊精或其混合物。
[0085]如果需要，也可添加其它膳食纤维。如果添加，则其优选占营养组合物能量的多达约5 %。膳食纤维可来自任何适当来源,包括例如大豆、豌豆、燕麦、果胶、瓜尔胶、阿拉伯胶、低聚果糖或其混合物。适合的维生素和矿物质可以以符合适合指南的量包括在营养组合物内。
[0086]组合物内可包括一种或多种必需长链脂肪酸(LC-PUFA)。可添加的LC-PUFA的实例为二十二碳六烯酸(DHA)和花生四烯酸(AA)。可添加一定浓度的LC-PUFA，以便其构成组合物中存在脂肪酸的0.0I %以上。
[0087]如果需要，营养组合物中可包括一种或多种食品级乳化剂；例如二乙酰酒石酸的单甘油酯和二甘油酯、卵磷脂和单或二甘油酯或其混合物。类似地，可包括适合的盐和/或稳定剂。可将调味剂添加至组合物中。
[0088]施用时间:
[0089]待产母体一旦意识到其妊娠即可开始获取ST11。然而，施用时间也可在妊娠起始之前开始，例如如果女性试图妊娠的情况下。施用可在妊娠起始之后的任何时间开始。可在妊娠中相对晚的时间开始，在人类妊娠的情况下优选在妊娠的第3、4、5、6、7或8个月，或对于其它哺乳动物在相应时期，或在预产期之前长达两周。
[0090]施用时间可连续(例如直至且包括哺乳至断乳)或不连续。优选连续施用以得到更为持久的作用。然而，推测不连续模式(例如每月在一周时间内或每隔一周每天施用)可诱导对子代的积极作用。
[0091]施用的持续时间可不同。尽管在相对短施用持续时间(例如新生儿在一周时间内每天施用以及成人一个或两个月内每天施用)下预期有积极作用，但据信较长持续时间提供增强的作用(例如，人类中3、5或`8个月的持续时间和其它哺乳动物中相应的时期)。
[0092]施用应涵盖至少一部分妊娠期和至少一部分哺乳期，或未母乳哺育新生儿时的相等时期。优选地，待产母体的施用时间涵盖实质上全长妊娠期，但该时期可能更短。类似地，哺乳母体的施用时间优选涵盖实质上全长哺乳期，但此时期也可能更短。
[0093]优选地，通过每天摄取(每天获取一次或两次)或每周摄取(每周获取一次或两次)而施用于母体。
[0094]可将STll直接施用于婴儿。如果母体未进行母乳哺育或母体中止母乳哺育后尤其如此。然而，母乳哺育中的婴儿也可通过直接施用接受ST11。经由母乳哺育或通过直接施用或两种方法施用于婴儿可持续至6个月或甚至I岁的年龄。因此，若进行哺乳则可在哺乳期间或在部分或完全断乳之后施用ST11。
[0095]优选地，通过每天摄取(每天获取一次或两次)或每周摄取(每周获取一次或两次)而施用于婴儿。
[0096]施用益生菌的作用:
[0097]已令人惊奇地发现将STll施用于待产母体可保护子代以免形成过敏。
[0098]至少另一个研究中已发现STll在预防过敏中未展现出作用或展现极低作用:例如，在 Vaccine29(2011) 1981-1990(可在线获得 7 / I / 2011)中，1.Schabussova 等人展示在草和桦树花粉过敏原多元致敏的小鼠模型中，以预防模式(在致敏之前)鼻内施用STll不能保护小鼠，而NCC3011(长双歧杆菌(B.1ongum))能保护。在同一论文中，为控制症状而给予(在致敏和攻击时)的STll以及NCC3001保护了小鼠。该论文的结论为益生菌菌株的选择和应用时间对于免疫耐受诱导至关重要。
[0099]现今也充分确立且认识到并非所有益生菌物种或菌株均具有关于免疫调节或过敏类似的作用和特性。参见例如:
[0100]-Van Hemert S,Meij erink M,Molenaar D,Bron PA,de Vos P,Kleerebezem M,Wells JM, Marco ML.1dentification of Lactobacillus piantarum genes modulatingthe cytokine response of human peripheral blood mononuclear cells.BMCMicrobiol.2010 年 11 月 16 曰；10:293。
[0101]-Meij erink M,van Hemert S,Taverne N,ffeis M,de Vos P,Bron PA,SavelkoulHF, van Bilsen J, Kleerebezem M, Wells JM.1dentification of genetic loci inLactobacillus piantarum that modulate the immune response of dendritic cellsusing comparative genome hybridization.PLoS One.2010年5 月 13 日；5 (5):el0632o
[0102]因此，一般而言，可以说益生菌对过敏完全没有作用或很难预测的作用，并且仅目标实验可证明此类作用。
[0103]不受理论束缚，将STll施用于妊娠母体和其对子代的作用可通过STll和/或STll诱导的化合物和/或代谢物传给婴儿来解释。该传送可出现在子宫内且可进一步与出生后施用的STll协同作用(例如强化)。然而，该传送的确切机制仍为进行中的科学研究的目标。因此，根据本发明，STll的积极作用可在免疫或肠发展关键期内、婴儿生命的极早期(在子宫中)开始，并且延长至出生后的成熟期。
[0104]将STll 施用于待产母体保护了子代以免发生过敏。因此，与未处理母体的子代相t匕，用特定过敏原致敏且接着用同一过敏原攻击的STll处理母体的子代的过敏反应(在此情况下为过敏原特异性回忆反应)减少。类似地，当用有丝分裂原刺激时，在经处理母体的子代中观测到减少水平的免疫反应(即非特异性反应)。
[0105]在本发明的一个实施方案中，母体STll施用减少了空气传播过敏原如桦树花粉致敏(研究概述参见实施例1，图1)且接着受相同过敏原攻击的子代中气道炎症的形成。这可表现为与来自未用STll处理的母体的致敏且受攻击子代相比，嗜酸性粒细胞至气管腔的浸润较低(参见图3A)。
[0106]发明人也已证明:母体STll补充对子代对抗感染的能力没有不利作用。尽管嗜酸性粒细胞数目(这些嗜酸性粒细胞为发动过敏反应直接涉及的细胞)减少，但实施例1的子代的支气管肺泡灌洗(BAL)液中巨噬细胞和淋巴细胞的数目相比于未经STll处理的母体的子代相比未受影响(参见图3A)。
[0107]肺切片的组织学分析揭示:与对照母体的子代相反，STll处理母体的子代的肺中，气道炎症、杯形细胞组织转化和黏液产生减少(参见图2)。对照小鼠的子代展示支气管和血管周围的大规模细胞浸润(图2B、E)。在源自STll暴露母体的子代中检测到显著减轻的支气管周围炎症，仅伴有稀少单核细胞浸润(图2C、F)。在未处理动物的肺中不存在浸润(图2A、D)。相应地，肺切片的过碘酸-希夫氏(PAS)染色揭示:与母体接受水而非STll的对照组(图2E)相比，STll处理母体的子代中杯状细胞增生和黏液分泌过多的发生强烈减少(图2F)。来自未处理小鼠的肺切片显示不分泌黏液(图2A、D)。综上所述，这些数据表明母体暴露于STll在子代中引起黏膜免疫反应变化，以致随后用过敏原刺激引起远程气管炎症。
[0108]在本发明的另一个实施方案中，母体施用STll降低了空气传播过敏原例如Betvl致敏(实施例1)且接着用桦树花粉气溶胶攻击的小鼠中BAL液(图3B)、肺(图3C)和肺相关淋巴结(图3D)中白介素5(IL-5)的水平。发现在未用STll处理的母体的子代中IL-5的水平显著更高。因此，母体施用STll减少了子代中过敏原特异性回忆反应。
[0109]为检测母体STll补充是否通过改变细胞Thl / Th2平衡在子代中具有持久免疫印迹，将致敏且受攻击子代的脾细胞用Bet vl刺激。与源自对照母体的子代相比，在来自补充STll的母体的子代的脾细胞中观测到Th2细胞因子(IL-4和IL-5)分泌水平显著更低(图4A、B)。此外，在STll存在下体外用Bet vl刺激来自围产期假处理(对照组)子代的脾细胞使Bet vl诱导的IL-4和IL-5明显减少(图4C、D)。
[0110]STll对于(对于嗜酸性粒细胞的募集和存活是关键的)IL-5产生的抑制作用为STll处理母体的子代中气道嗜酸性粒细胞增多的降低提供了机械论的解释。
[0111]因此,母体施用STll减少了过敏原特异性回忆反应。
[0112]在本发明的另一个实施方案中，母体施用STll降低了桦树花粉致敏并用有丝分裂原伴刀豆球蛋白A(Con A)刺激的子代脾细胞中白介素5(IL-5)分泌的水平(实施例1)。Con A为已知能刺激T细胞子集产生功能上不同的T细胞群体的凝集素(Dwyer等人(1981)，Clin Exp Immunol46(2):237-249)。IL-4 水平保持不变(参见图 5A、B)。
[0113]因此，母体补充STll减少了有丝分裂原诱导的免疫反应以及过敏原特异性细胞免疫反应。
`[0114]发明人已发现:围产期补充STll使过敏原诱导和有丝分裂原诱导的脾和肠系膜淋巴结(MLN)细胞的离体增殖反应减少(分别图5E和F)。因此，这表明:母体施用STll可产生新生小鼠免疫系统的完整印迹，调节抗原特异性和非特异性刺激后的细胞反应。
[0115]根据本发明，在STll处理母体的子代中减少或预防过敏性免疫反应发生可以是减少或预防对空气传播过敏原、食品过敏原或接触过敏原如镍的过敏性免疫反应。空气传播过敏原可为室内尘螨、动物皮屑(dander)和树以及草花粉，尤其桦树花粉。Bet vl, Betv2抑制蛋白(profilins)和交叉反应性碳水化合物决定子(CTD)是一些已知桦树花粉过敏原。
[0116]根据本发明，在经STll处理母体的子代中减少或预防过敏性免疫反应发生可以是减少或预防对与桦树花粉具有交叉反应性的过敏原的过敏性免疫反应。这些过敏原可为可含有与Bet vl具有交叉反应性的过敏原的食品过敏原，如苹果、核果、芹菜、胡萝卜、坚果和大豆。这些过敏原也可为已知与Bet v2过敏原具有反应性的桃、橙、荔枝、草莓、柿子、西葫芦(zucchini)和胡萝卜。
[0117]根据本发明，在经STll处理母体的子代中过敏性免疫反应发生的减少或预防可以是与未经处理母体的子代相比，减少至少5%，更优选10%，更优选至少30%且最优选至少 50%。
[0118]STll菌株为自母乳哺育儿童的粪便微生物群分离的益生菌。因此，关于试图尽可能接近地模拟母乳哺育儿童的微生物群的健康促进策略，尤其向非母乳哺育儿童施用STll可提供优于母乳哺育儿童中未发现的其它菌株的优势。[0119]实施例1:
[0120]使用桦树花粉过敏的小鼠模型表明母体补充STll将保护子代以免产生过敏性表型。
[0121]BALB / c小鼠在妊娠最后一周期间和哺乳期内每天接受含STll的饮用水。妊娠和哺乳雌性小鼠母体每天用含活益生菌菌株STll的饮用水喂食。将STll处理母体或假处理母体的子代用重组主要桦树花粉过敏原Bet Vl致敏并用桦树花粉提取物攻击(图1实验设计)。
[0122]动物:
[0123]妊娠BALB / c 小鼠(妊娠第 14 天)购自 Charles River (Sulzfeld, Germany)且维持于常规圈养条件下。具有C57BL / 6遗传背景的雌性TLR2和TLR4缺陷和野生型小鼠获自 University of Veterinary Medicine of Vienna (Austria)。所有实验均经维也纳大学的动物实验协会(Animal Experimentation Committee of the University of Vienna)和联邦科学与研究部(Federal ministry of Science and Research)批准。
[0124]益生菌:益生菌STll为副干酪乳杆菌NCC2461CNCM 1_2116 (副干酪乳杆菌)且属于雀巢研究菌种保藏中心(Nestl6Research Center bacterial collection) (Lausanne,Switzerland)。对于围产期经口施用，使用饮用水稀释的喷雾干燥细菌制剂。对于体外实验，在室温用1%甲醛-PBS使副干酪乳杆菌制剂灭活3小时，用无菌PBS洗涤两次，并且储存于-20°C。
[0125]围产期STll暴露:由妊娠末三个月(third trimester)起始(第_7天)且持续整个哺乳期直至断乳当天(第21天)，妊娠BALB / c小鼠每天接受含5X IO8Cfu / ml STll的饮用水(达到平均日剂量为2 X IO9Cfu` /小鼠)总计4周(实验设计；图1)。年龄匹配的对照动物仅接受水。
[0126]通过PCR分析测试粪便中STll的存在。由粪便样品制备DNA且使用STll特异性PCR引物扩增。正如所料，仅在来自STll处理母体小鼠、而非来自对照母体小鼠的样品中检测到STll特异性PCR产物(数据未显示)。在第21日龄(断乳)收集子代的大便样品。PCR分析揭示在STll处理母体或对照母体的子代中不存在STll (数据未显示)。
[0127]子代的致敏和攻击:
[0128]在第21、35和49天,用总体积为150 μ i的在氢氧化招(帆,Serva, Heidelberg,Germany)中乳化的I μ g重组主要桦树花粉过敏原Bet vl (rBet vl ；Biomay, Vienna,Austria)，对来自围产期STll暴露或对照品处理的母体小鼠的子代皮下(s.c.)致敏三次(实验设计；图1)。为诱导气道炎症，在最后一次致敏之后I周，通过暴露于气溶胶化1%桦树花粉提取物(BP ;Allergon, Viilinge, Sweden)连续两天(第56-57天)攻击小鼠。在最终气道攻击(第60天)之后72小时最终用七氟烧(Sevofiuran) (Abbott, Vienna,Austria)麻醉小鼠。
[0129]BAL和分类细胞计数:
[0130]最终麻醉来自STll或对照品处理的母体小鼠的子代，并使用2ml含有蛋白酶抑制剂合剂的PBS (Roche, Mannheim, Germany)收集BAL两次。计数总白细胞并用苏木精和伊红(H&E ; Hemaco丨or?, Merck, Darmstadt, Germany)染色细胞离心涂片器(cytospin)(Shadon Cytospin?, Shadon Southern Instruments, USA)。使用标准形态指南鉴别细胞类型，并且经由光学显微术每细胞离心涂片器计数200个细胞。将无细胞上清液储存于-20°C以供进一步分析。
[0131]肺组织学:
[0132]自小鼠移除全肺并用10%甲醛-PBS固定以进行组织学分析。用H&E染色石蜡包埋的组织切片。对于过碘酸-希夫氏染色(PAS, Sigma-Aldrich)切片分析气道黏液阻塞。
[0133]细胞培养物的离体刺激:
[0134]处死后收集脾、肺、肺纵隔引流淋巴结(肺LN)和肠系膜淋巴结(MLN)，并由所有器官制备单细胞悬浮液。在指示时，在37°C在96孔盘中于培养基(补充有10%热灭活FCS、2mM L-谷氨酰胺、100U / mi青霉素、IOOyg / ml链霉素的RPMI1640)中用rBet vl (10 μ g / ml)或伴刀豆球蛋白 A(ConA) (I μ g / mi, Sigma-Aldrich)刺激细胞(2.5X IO7 / ml)持续72小时。作为对照，单独用培养基培养细胞。在最后18小时添加3[H]-胸腺嘧唳核苷(每孔 0.5 μ Ci, Amersham, Buchter, Braunschweig, Germany)之后，通过闪烁计数测定脾和MLN细胞培养物的增殖反应。此外，为体外研究STll的免疫调节潜能，用STll (IO7Cfu / ml)与rBet vl(10yg / ml)的混合物孵育假处理母体的子代脾细胞48小时。
[0135]细胞因子测量:
[0136]根据制造商的说明书、用ELISA试剂盒(Endogen, Cambridge, MA)测量IL-4和IL-5的水平。
[0137]统计分析:`[0138]所有数据均显示为平均值土SEM。通过使用Graph Prism软件(Graph PadSoftwar, Inc, San Diego, CA)和非参数曼-惠特尼(Mann-Whitney) U-检验分析显著性。认为p〈0.05时具有显著差异。
[0139]实施例2:
[0140]以下提供根据本发明使用的婴儿配方乳的组成的实例。该组成仅以举例说明的方式给出。蛋白来源为乳清蛋白与酪蛋白的常规混合物。
[0141]
【权利要求】
1.副干酪乳杆菌NCC2461(STll)，其用于通过施用于待产母体以及由所述母体生出的子代，以减少或预防子代形成过敏性免疫反应。
2.权利要求的副干酪乳杆菌NCC2461(STll)，其中所述对母体的施用延长至所述子代的哺乳期间或/和对子代的施用经由所述哺乳母体的人类母乳进行。
3.权利要求1或2的副干酪乳杆菌NCC2461(STll)，其中所述子代有特应性疾病的风险。
4.权利要求1或2或3的副干酪乳杆菌NCC2461(STll)，其中所述过敏性免疫反应是针对食品和/或空气传播过敏原的过敏性免疫反应。
5.权利要求4的副干酪乳杆菌NCC2461(STll)，其中所述过敏性免疫反应是针对空气传播过敏原、尤其是桦树花粉过敏原Bet vl和Bet v2的过敏性免疫反应。
6.权利要求4的副干酪乳杆菌NCC2461(STll)，其中所述过敏性免疫反应是针对与树过敏原、优选桦树花粉过敏原Bet vl和Bet v2具有交叉反应性的食品过敏原的过敏性免疫反应。
7.权利要求6的副干酪乳杆菌NCC2461(ST11)，其中所述食品过敏原为苹果、梨、核果、芹菜、胡萝卜、坚果和/或大豆。
8.前述权利要求中任一项的副干酪乳杆菌NCC2461(STll)，其中所述过敏性免疫反应可为过敏原特异性回忆反应或非过敏原特异性免疫反应。
9.前述权利要求的副干酪乳杆菌NCC2461(STll)，其中所述子代中所述过敏性免疫反应的减少为 (i)在过敏原特异性回忆反应的情况下，IL-4和IL-5的产减少生，和/或 (?)在非过敏原特异性免疫反应的情况下，IL-5的产生减少， 所述反应的减少是相对于未使用STll治疗的母体的子代。
10.根据权利要求1至9中任一项的副干酪乳杆菌NCC2461(STll)，其中在分娩之前将所述STll施用于待产母体至少两周，并且在分娩之后直接或经由母体乳汁施用于所述子代至少2个月，优选长达分娩后6个月。
11.根据权利要求10的副干酪乳杆菌NCC2461(STll)，其中所述STll优选在食品、饮料、膳食补充剂或药物组合物中经口施用于所述待产或哺乳母体。
12.根据权利要求11的副干酪乳杆菌NCC2461(STll)，其中所述STll经由所述母体的乳汁施用于所述子代或作为补充剂、以其纯化形式或稀释于水、母乳或婴儿配方乳中直接施用于婴儿。
13.前述权利要求中任一项的副干酪乳杆菌NCC2461(STll)，其中所述STll以IxlO6至lxlOncfu、优选IxlO8至IxlOiciCfu(cfu=菌落形成单位)的日剂量施用于所述待产或哺乳母体。
14.权利要求1-12中任一项的副干酪乳杆菌NCC2461(STll)，其中所述STll以IxlO2至lxl01C1、优选地IxlO2至IxlO4Cfu(cfu=菌落形成单位)的日剂量施用于所述子代。
15.前述权利要求中任一项的副干酪乳杆菌NCC2461(STll)，其中所述STll以每克干组合物包含IO2至IO8Cfu的组合物施用于所述母体或幼儿。
16.权利要求15的副干酪乳杆菌NCC2461(STll)，其中所述组合物包含其它成分或益生元，优选选自:菊粉、低聚果糖(FOS)、短链低聚果糖(短链10S)、低聚半乳糖(GOS)、低聚木糖(XOS)、神经节苷脂、部分水解的瓜尔胶、阿拉伯胶、大豆胶、枸杞乳、枸杞、苹果提取物或其混合物。
17.前述权利要求中任一项的副干酪乳杆菌NCC2461(STll)，其中所述STll已灭活，如使其不能复制。
18.组合物，其包含活副干酪乳杆菌NCC2461(STll)，其用于初级预防或减少婴儿形成过敏性免疫反应的方法，所述方法包括 -在分娩之前向妊娠女性施用日剂量的活副干酪乳杆菌NCC2461 (STll)至少两周，和 -在分娩之后，向哺乳女性或新生婴儿施用日剂量的活益生菌至少2个月，优选长达分娩后6个月或I年。
19.权利要求18的方法，其中在分娩之后，经由所述哺乳母体将副干酪乳杆菌NCC2461 (STll)施用于所述新生婴儿。
20.权利要求18或19的方法，其中对于所述待产或哺乳母体的日剂量为约IxlO6至IxlO11Cfu,优选 IxlO8 至 IxlO10Cfu (cfu=菌落形成单位)的 STll0
21.权利要求18或19的方法，其中对于所述子代的日剂量为约IxlO2至1x10'优选IxlO2至IxlO4Cfu (cfu=菌落形成单位)的副干酪乳杆菌NCC2461 (STll)。
【文档编号】A61P37/08GK103826648SQ201280018572
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年4月11日 优先权日:2011年4月15日
【发明者】A·梅赛尼尔, A·齐歇尔, S·努特恩, U·维德曼, I·沙布索瓦 申请人:雀巢产品技术援助有限公司