用于癌症中使用的抗il-1r1抑制剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及阻断或抑制白介素-1受体1(IL-1R1)、IL-1β与IL-1R1的相互作用或IL-1R1和白介素-1受体辅助蛋白(IL-1RaCP)之间的相互作用的多肽。本发明具体涉及特异性靶向存在于肿瘤细胞、癌干细胞和对化疗或放疗耐受的癌干细胞上的IL-1R1的治疗性多肽。本发明具体涉及表达所述抑制剂结合的IL-1R1的癌干细胞(CSC)。最后，本发明涉及组合治疗，其包括借助标准化疗或放疗杀死致瘤分化的癌细胞，在此之前或之后，应用特异性靶向CSC且剥离具有其生成癌细胞子代能力的肿瘤的IL-1R1抑制剂。
【专利说明】用于癌症中使用的抗IL-1R1抑制剂
发明领域
[0001]本发明涉及阻断或抑制白介素-1受体I (IL-1Rl)、IL-1 P与IL-1Rl的相互作用或IL-1Rl和白介素-1受体辅助蛋白(IL-1RaCP)之间的相互作用的多肽。本发明具体涉及特异性靶向存在于肿瘤细胞、癌干细胞和对化疗或放疗耐受的癌干细胞上的IL-1Rl的治疗性多肽。本发明具体涉及表达所述抑制剂结合的IL-1Rl的癌干细胞(CSC)。最后，本发明涉及组合治疗，其包括借助标准化疗或放疗杀死正常分化的癌细胞，在此之前或之后，应用特异性靶向CSC的IL-1Rl抑制剂。
[0002]发明背景
肿瘤的细胞组成是异质的。如今已知，不是肿瘤中的每个细胞都是致瘤的。只有小亚群能够重新形成新的肿瘤。该细胞群体能够自我更新和产生异常分化的子代。由于这些功能与干细胞共享，所以该群体被命名为肿瘤干细胞(CSC) [Reya, T.，等人，Nature, 2001.414 (6859): p.105-11]，也被称为肿瘤起始细胞。
[0003]近年来，构成肿瘤的细胞块(bulk of cells)源自癌干细胞(CSC)亚群的概念已获得广泛的接受。CSC与肿瘤细胞的大群体的不同在于当它们以少量植入到实验动物中时能够成功地接种新的肿瘤，这样做在体内可以再生超过数代，且概括初始肿瘤的形态。相反，非CSC群体在体内不能起始肿瘤生长，甚至当以高数量植入吋。由于CSC亚群根据定义代表能够起始新的肿瘤生长的唯一肿瘤细胞，那么应当预期CSC在转移形成中发挥核心作用。
[0004]基于鉴定CSC的环境和肿瘤类型，CSC主要占肿瘤群体的1-10%。它们可操作地由以下特性来定义:(i)起始肿瘤和肿瘤増殖的选择性能力，(ii)自我更新的能力，和
(iii)通过细胞分化产生更成熟的 非干细胞子代的能力。此外，CSC的特征在于对化疗和放疗的耐受性的増加。因此，它们主要是静态或休眠的，从而避免了靶向增殖性肿瘤细胞的常规治疗方案。CSC被认为是转移的来源，因为它们活跃地贯穿机体迁移，在骨髄中的成骨细胞生境中停留，且归巢到它们可以重新形成新的肿瘤的各个器官厂7>?取巩A.和Viestler, Nat Clin Pract Oncol, 2008.5(6): p.337-47]。
[0005]归巢主要由使这些细胞朝向趋化因子信号梯度迁移的表面分子所介导。因此，细胞因子和趋化因子信号例如基质衍生因子(SDF)-1 /趋化因子受体(CXCR)-4，或骨调素/CD44或类似信号被认为在CSC中发挥重要作用厂Gofer, A尤和ふZ.Allan, J Cell MolMedf 2008.12(2): p.辦7。作为逻辑结果，当这些细胞逃避免疫监瞀时，贯穿机体的迁移过程仅仅是可能的Mo/?, T.和/Z Frank, Ann N Y Acad Sci，2009.1176:p.154-69'。在实体瘤中的CSC上已经鉴定了几种细胞表面标志物，诸如⑶133+、⑶44+、ABCB5+，然而在血液系统恶性肿瘤诸如AML和多发性骨髄瘤中，发现了上述所有⑶34+、CD38+。
[0006]当分离或富集的细胞注入免疫缺陷的小鼠中，并在其中形成初始肿瘤的新的拟表型时，定义癌干细胞的金标准仍然在体内给出。初始拟表型含有与初始肿瘤相同量的CSC，尽管当连续重新移植肿瘤时，可以繁殖略微富集。当在超低结合(ULA)板中未粘附、无血清且在添加某些细胞因子如EGF和/或bFGF的情况下生长时，CSC可以形成3维(3D)结构，所述3维(3D)结构与胚胎干细胞(ESC)形成的球体相似，被称为肿瘤球。丧失粘附后，分化细胞死于失巢凋亡(分离诱导的细胞凋亡)，因此，肿瘤球測定法富集具有致瘤潜能的CSC和未成熟祖细胞/--?体 G.和私 51 Wicha, J Mammary Gland Biol Neoplasia, 2005.10(1): p.人肿瘤球形成后，紧凑的聚集体可以通过使用酶混合物进行分离，且进一
步重新铺板。连续重新铺板在体外模拟自我更新特性，且暗示铺板的细胞的干细胞能力。
[0007]常规肿瘤治疗最初可以通过杀死具有有限自我更新和増殖能力的主要肿瘤块群体而缩小肿瘤，然而根据CSC假设，耐受性CSC可以在治疗后维持活力，且重建肿瘤生长，导致复发和肿瘤疾病进展。
[0008]与之相比，指向且靶向CSC的新疗法可以降低肿瘤生成癌细胞后代的能力，其抑制肿瘤生长，且可以导致肿瘤退化。优选的CSC目标和疗法包含与生理干细胞相反的恶性细胞中优先诱导或有效的那些分子或途径。
[0009]癌症治疗的效率经常受肿瘤对细胞毒性剂或电离辐射的内在或获得的耐受性的损害。
[0010]因此，存在开发新的有效的通过涉及CSC来治疗癌症疾病的策略。
[0011]IL-1细胞因子家族由三个成员(ILla (ILIA)、IL1@ (IL-1B)和ILl受体拮抗剂(ILlRA)，其各自由独立的基因编码)组成。这些基因产生前体蛋白，所述前体蛋白被蛋白水解切割以产生活性细胞因子。细胞因子的两种激动性形式是IL-1a和IL-P。IL-1a主要是膜结合的，很少在循环中发现，然而，相反，IL-P主要是分泌的。IL-1a和IL-3在IL-1响应细胞中介导相同的下游效应。第三个细胞因子成员，IL-1RA，无法激活下游的信号传递，且竞争性地抑制IL-1a和IL-P的活性。
[0012]IL-1 a、IL-1 P和IL-1RA都通过结合至I型ILl受体(ILlRl)而介导其作用。IL-1a或IL-P结合后，ILlRl与IL1R3(也称为ILl受体辅助蛋白(ILlRAcP))结合，导致形成活性信号传递复合物，所述活性信号传递复合物诱导包含IRAKs、MAPK p38、p42/44、ERK、JNK、STAT3的磷酸化级联且活化NF- k B。已经将IL1R2鉴定为不促进细胞内信号传递的诱饵受体[I]。IL-1应答的幅度受途径中拮抗和激动作用因子的平衡的严格调控。
[0013]炎症应答是包含多种细胞类型和细胞因子的复杂信号传递级联。对病原体的炎症应答通常由巨噬细胞起始，在其活化后所述巨噬细胞分泌IL-1 ^，所述IL-1 ^充当负责触发对感染的早期生理应答的急性期细胞因子。IL-1 P位于炎症级联的顶点，所述炎症级联包括产生各种额外的细胞因子和趋化因子包括IL8、IL6、MCP-1和VEGF。此外，IL-1驱动的Cox-2活化导致PGE2产生的増加。在正常状态下，炎症持续，直到感染根除。如果该反应受损，慢性炎症可以发生，且与癌症紧密相连。
[0014]随着肿瘤进展，它们聚集炎症细胞的致密浸润物，所述炎症细胞包括肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)以及基质成纤维细胞和血管内皮细胞。这些细胞类型生成支持肿瘤生长、转移和新血管生成的肿瘤微环境。该群体(orchestra)中的主要起作用者是IL-1 3。
[0015]对病原体的正常应答包括细菌副产物样LPS(是IL-1 P的強烈诱导剂)活化IL-1 P。LPS的感受细胞是分泌IL-1 P的巨噬细胞。表达ILlRl的细胞如内皮细胞(ECs)、上皮细胞、成纤维细胞、软骨细胞和淋巴细胞对IL-1 ^应答，且开始分泌促炎介质IL-1 ^自身、IL6、IL8、MCP-UMKP-1和Cox_2。为了控制该过程和调节体内平衡，存在几种ILlRl的生理抑制剂，特别是ILl受体拮抗剂和IL1R2受体，其作为诱饵受体起作用。右侧小图。促肿瘤炎症是复杂肿瘤微环境(由基质成纤维细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和肿瘤细胞自身组成)的产物。所有3种细胞类型都分泌IL-1 P和在它们的膜上表达IL-1a。ILl响应的细胞是肿瘤细胞、TAMs、成纤维细胞、ECs和淋巴细胞。这导致各种促炎蛋白如IL6、IL8、VEGF、MCP-1和C0X-2的表达。综合起来，这些介质通过诱导支持肿瘤生长和免疫抑制的STAT3支持癌症的发病机制。中性粒细胞的招募、C0X-2的表达和MCP-1还支持免疫抑制，且VEGF驱动肿瘤血管生成。
[0016]IL-1 P结合至ILlRl后，ILlRl与ILlR辅助蛋白(ILlRaCP)异源二聚化，且触发包括ILlR相关激酶(IRAK) ,MAPK和ERK/JNK的磷酸化级联，最终转录激活STAT3和NF- k B。从而促炎分子表达，且最終分泌，其抑制抗肿瘤免疫、促进肿瘤血管形成、且增强肿瘤基质。
[0017]因此，IL-1与IL-1Rl的相互作用已经牵连在几种疾病、优选免疫和炎性疾病、诸如关节炎(例如类风湿关节炎、骨关节炎)和炎性肠病的发病机制中。某些试剂，包括结合IL-1Rl和中和其活性(例如，IL-1Ra)的单克隆抗体已被证明是某些炎症状况的有效治疗剂，所述炎症状况诸如乳糜泻、克罗恩病；溃疡性结肠炎；特发性胃轻瘫；胰腺炎，包括慢性胰腺炎；急性胰腺炎，炎症性肠病和溃瘍，包括胃和十二指肠溃瘍，和中度至重度活动性类风湿关节炎，其可以用抗IL-1Rl抗体AMG 108 (Amgen)进行治疗。
[0018]其他针对IL-1 a或P (诸如CDP-484，Celltech)或针对IL-1受体(例如，AMG-108, Amgen ;R_1599, Roche)、或 IL-lRa (anakinra, Amgen)的嵌合、人源化或人抗体是众所周知的。
[0019]如提到的，在治疗炎症性疾病中使用这些抗体中的大部分。在一些情况下，据报道，这些抗IL-1Rl抗体可用于治疗淋巴增生性病症，包括自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)、慢性成淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、慢性淋巴性、白血病、伯基特淋巴瘤、组织细胞淋巴瘤、和霍奇金病。然而，没有证据得到证明。此外，没有关于使用IL-1Rl抑制剂用于治疗源自非淋巴瘤的癌症的可靠报道。
[0020]发明概述
本发明基于以下发现，IL-1Rl在化疗耐受和/或放疗耐受的癌细胞(优选癌干细胞(CSC))的表面上表达或过表达,然而该受体在正常分化的增殖性非致瘤肿瘤细胞或对化疗剂和/或放射毒性剂不耐受或不是CSC的肿瘤细胞上不表达或只有轻微表达。
[0021]根据本发明，在专门体外系统(球测定法)中分析来自不同癌症患者(诸如非小细胞肺癌(NSCLC)和结肠直肠癌(CRC)患者)的原发性CSC，并将它们与在分化条件下生长的CSC进行比较。此外，本发明人通过高剂量化疗处理从NSCLC细胞系选择耐受性肿瘤细胞。他们将细胞因子ILlP和其各自受体鉴定为差异调苄基因。ILlP是在各种细胞类型上表现其信号的细胞因子。在肿瘤背景中，它由肿瘤细胞产生且通过作用于内皮细胞、成纤维细胞和浸润性免疫细胞而影响肿瘤微环境。由此，它诱导ー些蛋白包括例如基质金属蛋白酶、VEGF, bFGF、IL8、IL6和其他的表达。下游过程通过干扰免疫监瞀和支持肿瘤生长和转移而产生保护。借助单克隆抗体或小化学化合物对IL-1Rl的抑制可以降低肿瘤生长(通过使用肿瘤球显示)，这与CSC表型的減少相关。由此表明，治疗性抗体对IL-1Rl的抑制可以用来靶向合适的肿瘤且用于治疗各自的肿瘤疾病。[0022]本发明提供以下結果:
1.将IL1/IL1R1信号传递鉴定为CSC相关途径。
[0023]2.1L-1 ^和ILlRl基因的表达与癌症患者中无肿瘤和整体存活的减少相关。
[0024]3.1LlRl在原发性CRC和NSCLC肿瘤细胞上表达，且在通过连续肿瘤球繁殖富集CSC后上调。
[0025]4.1LlRl在源自人原发性肿瘤的CRC和NSCLC细胞系上表达，且其表达在CSC富集的肿瘤球中上调。
[0026]5.LlRl的抗体阻断在体外抑制肿瘤球形成。
[0027]6.1LlRl阻断抑制IL-1 ^刺激的MAPKp38和STAT3磷酸化。
[0028]7.重组IL-1 ^诱导ILlRl在肿瘤球中的表达，而ILlRl的抗体阻断下调ILlRl表达。
[0029]8.CSC-富集的肿瘤球分泌ILl-响应性细胞因子hIL8和hVEGF，且ILlRl阻断可以抑制这些细胞因子的产生。
[0030]9.1LlRA药物Kineret (Amgen)在体内抑制源自CSC的异种移植肿瘤的生长且调节血清细胞因子。
[0031]10.肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)通过涉及IL-1的机制在体外促进肿瘤球形成。
[0032]总结且更归纳性地，本发明涉及以下主题:
?抑制ILlP和ILlRl的相互作用的药剂，优选多肽，更优选单克隆抗体，其用于治疗个体中的癌细胞和/或癌干细胞(CSC)，优选CSC。本发明的癌细胞可以包含癌干细胞(CSC)的亚群。本发明的CSC可以包含不是CSC的其他肿瘤细胞。本发明的多肽靶向优选在所述CSC的表面上、但不是或基本上不是在其他肿瘤细胞(其形成肿瘤组织上的主要群体，且不是癌干细胞)上表达的ILlRl。优选地，待治疗的癌症对常规化疗和/或放疗和/或其他靶向治疗耐受或主要耐受。
[0033]?抑制ILl ^和ILlRl的相互作用的各自药剂、多肽或单克隆抗体，其用于治疗癌细胞和/或CSC，其中待治疗的癌症是乳腺癌、结肠直肠癌(CRC)或非小细胞肺癌(NSCLC)，优选CRC。
[0034]?抑制ILlP和ILlRl的相互作用的各自药剂、多肽或单克隆抗体，其用于治疗癌细胞和/或CSC，其中所述药剂、优选抗体与细胞生长抑制剂或细胞毒性剂或放疗组合应用。所述细胞生长抑制剂或细胞毒性剂优选是抗肿瘤抗体诸如赫赛汀、利妥昔或爱必妥、或化疗剂，其在所述药剂、优选所述单克隆抗体之前或之后或与所述药剂、优选所述抗体同时应用于个体。
[0035]?适合用于治疗癌症疾病的药物组合物，其包含治疗有效量的如上所述的抗IL-1Rl药剂、优选多肽、更优选抗IL-1Rl抗体连同药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
[0036]?药剂盒，其包含至少ー个第一包装和ー个第二包装，其中
(i)所述第一包装包含所述各自的抗IL-1Rl药剂、优选多肽或抗IL-1Rl抗体或包含这种药剂/抗体的药物组合物；且(ii)所述第二包装包含细胞毒性剂和/或细胞生长抑制剂或包含所述药剂的药物组合物，其中所述第二包装预期在施用所述第一包装之前或之后、优选在所述施用之前施用。
[0037]?抑制ILl ^和ILlRl的相互作用的药剂、优选多肽、更优选单克隆抗体用于制备药物的用途，所述药物用于治疗个体中的単独或与不是CSC或CSC组织的其他肿瘤细胞或肿瘤组织组合的癌细胞和癌组织和/或癌干细胞(CSC)，其中所述癌细胞或组织可以包含癌干细胞(CSC)的亚群，且所述CSC可能包含不是CSC的其他肿瘤细胞。所述多肽或抗体或融合蛋白靶向IL1R1，所述ILlRl优选专门在所述CSC的表面上、但不是或基本上不是在其他肿瘤细胞(其形成肿瘤组织上的主要群体，且不是CSC)上表达。在本发明的ー个具体实施方案中，癌细胞和/或CSC对于常规化疗和/或放疗和/或其他靶向治疗广泛耐受。
[0038]?各自的药剂、多肽、或单克隆抗体，其与细胞生长抑制剂或细胞毒性剂或放疗组合应用于所述癌症。
[0039]?治疗个体中的化疗和/或放疗难治性癌症的方法，其包括将抗IL-1Rl剂或抗体施用于所述个体，优选地，其中所述个体中的化疗和/或放疗难治性癌症由先前的化疗和/或放疗所引起。
[0040]?抑制ILl ^与ILlRl的结合和/或ILlRl与ILlRaCP的异源二聚化的多肽用于制备药物的用途，所述药物用于治疗个体中的癌细胞群体，其中所述癌细胞群体包含単独或与其他块肿瘤细胞连同的癌干细胞(CSC)，其中任选地所述CSC对标准化疗和/或放疗和/或标准祀向治疗耐受(i)。
[0041]?抑制ILl ^与ILlRl的结合和/或ILlRl与ILlRaCP的异源二聚化的多肽用于制备药物的用途，所述药物用于治疗个体中的癌症，其中所述癌细胞群体包含癌干细胞(CSC)和任选的正常块肿瘤细胞，其中ILlR在所述CSC的表面上、但不是或基本上不是在非CRC肿瘤细胞上表达(ii)。
[0042]?各自(i) (ii)多肽的用途，其中所述癌症选自:结肠直肠癌(CRC)、非小细胞肺癌(NSCLC)和乳腺癌(iii) 。
[0043]?各自(i) (ii) (iii)多肽的用途，其中所述多肽与细胞生长抑制剂、细胞毒性剂或放疗组合施用于个体，其中例如所述细胞生长抑制剂或细胞毒性剂是抗肿瘤抗体，诸如赫赛汀、利妥昔或爱必妥、或化疗剂，且其中例如所述多肽在所述细胞生长抑制剂或所述细胞毒性剂或所述放疗治疗之前、同时或之后应用于个体。
[0044]?抑制或阻断ILl ^与ILlRl的结合和/或阻断或抑制ILlRl与ILlRaCP的异源二聚化的多肽用于制备药物的用途，所述药物用于治疗个体中的癌症，其中所述癌症是结肠直肠癌(CRC)、非小细胞肺癌(NSCLC)或乳腺癌，并且其中所述多肽靶向CSC和/或其他肿瘤细胞上的ILlRl，其中ILlRl优选在CSC的表面上、但不是或基本上不是在正常块肿瘤组织细胞上或在正常块肿瘤组织细胞上少于50%、60%、70%或80%(与CSC上的ILlRl表达相比)表达(iv)。
[0045]?各自(iv)多肽用于制备药物的用途，所述药物用于治疗癌细胞和/或CSC，其中所述CSC至少对标准化疗和/或放疗耐受，所述CSC任选由化疗剂、优选细胞毒性剂和/或细胞生长抑制剂的先前治疗所引起(V)。
[0046]?各自(iv)(v)多肽用于制备药物的用途，所述药物用于治疗癌细胞和/或CSC，其中所述多肽与细胞生长抑制剂或细胞毒性剂组合和/或与放疗组合施用于个体(vi)。
[0047]?各自(i)-(vi)多肽或包含治疗有效量的所述多肽的药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗癌细胞和/或CSC，其中所述多肽选自
(a)鼠单克隆抗体、人源化单克隆抗体、嵌合单克隆抗体或人单克隆抗体，优选抗ILlR抗体、抗ILlP抗体、抗ILlaCP抗体(抗IL-1受体辅助蛋白抗体)、或靶向ILlR和ILlRaCP的双特异性抗体；
(b)重组天然或修饰的ILlRA(白介素-1受体拮抗剂)，
(c)充当IL-1P的诱捕物且防止IL-1P可用干与IL-1Rl相互作用的ILlRl-1LlRaCP融合蛋白(vii)。
[0048]?生物标志物用于在基于细胞的先体内后体外测定中评价和预测药剂对癌症的作用的用途，其中
(a)所述生物标志物是IL-1Rl，
(b)所述细胞是在其表面上表达ILlRl的化疗或放疗耐受的癌干细胞(CSC)，
(c)且所述药剂是(i)-(vii)中所述的治疗性多肽，其中优选地，所述CSC通过用化疗剂和/或通过放射处理这些组织样品而作为个体的肿瘤组织样品的细胞亚群获得，其中，进ー步地，在本发明的一个优选实施方案中，在所述基于细胞的測定中的癌细胞源自患有NSCLC、CRC或乳腺癌的个体的样品。
[0049]【专利附图】
【附图说明】:
a 1-.esc-标志物在高剂量化疗剂选择的細胞中富集。
[0050]A.已知ABC转运蛋白在CSC中高度富集。它们负责药物的快速排出，其导致对通常治疗方案的耐受。高剂量化疗剂选择A549 NSCLC细胞系后，各种ABC转运蛋白上调。
[0051]B.CSC获得对通常治疗方案耐受的ー种进一歩机制是解毒酶如醛脱氢酶(ALDH)的表达提高。高剂量化疗剂选`择后，ALDH的各种同种型也上调。
[0052]图2'CSC-标志物在重新铺板的来自源自NSCLC和CRC患者的原发性患者材料的月中瘤球中上调。
[0053]A.肿瘤球測定富集CSC，相比之下，贴壁条件主要驱动分化。在微阵列上分析贴壁传代细胞相比于重新铺板的肿瘤球，其显示为已知CSC-标志物的ABCG2和ALDH-1的表达提闻。
[0054]B.用Aldefluor测定在功能上显示ALDH-1表达增加。与初始铺板细胞相比，重新铺板的肿瘤球增加~10倍。
[0055]C.增加的ABCG2表达增加了侧群中的细胞量，可以显示SP细胞可在重新铺板的肿瘤球中的增加。与初始铺板细胞相比增加~10倍。
[0056]Mll将ILl P和其各自受体ILlRl鉴定为在重新铺板的原发性肿瘤球和化疗剂选择的細胞中差异性上调的目标。
[0057]A.1Ll ^在贴壁(分化)条件下是稳定的，但在来自源自患者的原发性NSCLC细胞的肿瘤球中上调。
[0058]B.当与贴壁对照相比，ILlP在重新铺板的肿瘤球中显著上调。各自受体ILlRl的表达在重新铺板的源自患者的原发性NSCLC细胞的肿瘤球中也提高。
[0059]C.1LlP表达在来自源自患者的原发性CRC细胞的肿瘤球中上调。
[0060]D.当与贴壁对照相比，ILlP表达在重新铺板的CRC肿瘤球中上调。各自受体ILlRl的表达在重新铺板的源自患者的原发性CRC细胞的肿瘤球中明显提高。
[0061]E.1LlP在高剂量紫杉醇(Pac)和多柔比星(Dox)选择的细胞中显著上调。
[0062]B A:1LlRl在肿瘤细胞上表达，其表达在重新铺板的肿瘤球中提高。[0063]A.源自患者的原发性NSCLC细胞用来诱导免疫缺陷小鼠中的s.c.异种移植肿瘤。诱导肿瘤后，分离单细胞，并进ー步分析ILlRl的目标表达。CSC-标志物⑶133在这些群体中是低丰度的。
[0064]B.在肿瘤球测定中重新铺板来自s.c.异种移植物(A.)的单细胞。ILlRl的表达增加~7倍，且CSC-标志物⑶133的表达增加~15倍。因此，ILlRl似乎是CSC相关表面分子。
[0065]重^肺腺癌I期和CRC患者中无疾病和整体生存与ILl J3和IL IRl表达水平相关。
[0066]A.1Ll ^的探针组215561_s_at显示了肺腺癌I期患者的整体生存的生存益处和CRC患者中的无疾病生存益处。CRC患者的整体生存没有显著相关性。
[0067]B.1LlRA的探针组39402_at与肺腺癌I期的更好生存轻微相关，且与CRC中的无疾病和整体生存的生存益处相关。
[0068]图6:中和性抗体对ILlRl的抑制以剂量依赖的方式降低肿瘤球形成。
[0069]A.B.在肿瘤球測定中将源自患者的原发性细胞铺板，其中使用0，5和10 l^g/mL对照IgG(正常山羊IgG)或抗人ILlRl抗体。未经处理的细胞用作球形成的阳性对照。
[0070]A.在原发性NSCLC中抗IL-1Rl处理以剂量依赖的方式降低肿瘤球形成。B.在原发性CRC中观察到肿瘤球形成的剂量依赖性降低。实验一式三份进行，条形图表示相对于对照的倍数肿瘤球诱导；误差条代表SD。
[0071 ]图7:1LlRl在源自原发性CRC和NSCLC肿瘤的細胞系上表达，且其表达在作为肿瘤球铺板后上调。
[0072]源自患者的原发性NSCLC和CRC细胞在体外分化贴壁条件下培养，使用多克隆或单克隆抗体针对ILlRl表达进行染色，且通过流式细胞术检测表达。相同细胞系也进行如肿瘤球的ー轮培养。如NSCLC(上小图)和CRC(下小图)的柱状图叠加(贴壁=红色，球=蓝色)中显示，将肿瘤球和贴壁细胞中的ILlRl表达进行比较。两种抗体在NSCLC球培养物相比于贴壁培养物中检测到ILlRl的显著上调，然而在CRC球中，只有多克隆抗体能够探测到ILlRl上调。
[0073]图8:使用两种不同抗体在原发性NSCLC和CRC中检测ILlRl0
[0074]源自患者的原发性NSCLC和CRC细胞在体外分化贴壁条件下培养，使用以APC标记的来自R&D Systems的功能级PAB山羊AF269和以APC标记的对应于专利W02004022718A的Amgen Mab的MAB hIgG4 15C4针对ILlRl表达进行染色。使用对照山羊IgGl-APC作为各自同种型，且如从上至下的左边和中间小图中以蓝线显示，没有给出任何信号。相同小图中的红线显示两种抗体对ILlRl目标的识别。在右侧小图(上侧和下側)中比较了用两种抗ILlRl抗体获得的結果，显示多克隆抗体AF269 (红色柱状图)比单克隆抗体15C4 (蓝色柱状图)具有较强的目标识别，这最可能是由于识别多个表位引起的。
[0075]S 9:1L-1 J3激活pMAPKp38和pSTAT3和15C4 Mab对该途径的抑制作用。
[0076]在不存在生长因子的情况下将源自患者的原发性NSCLC细胞铺板。在37°C /5%C02过夜孵育后，A.C:以0，lpg/mL至1 00pg/mL的渐增浓度添加重组ILl。细胞孵育20 min，然后用HGNT缓冲液裂解。裂解假设分化表型的贴壁生长NSCLC细胞作为对照。B.D.用Ipg/mL重组IL-1P诱导另一部分球30 min，然后添加渐增浓度的抗ILlRl hIgG4 15C4 Mab,孵育24h，然后裂解用于进一歩分析。A.B.C.D.遵循制造商的说明，分别对于PSTAT3或pMAPKp38使用Pathscan ELISA分析裂解物。结果显示为任意单位的0D450nm。结果是初步的，仍有待确认結果。
[0077]图10:在用重组IL-1 3刺激或用抗ILlRl抗体处理后通过western印迹检测ILlRl水平。
[0078]在不存在生长因子的情况下在37°C /5%C02将源自患者的原发性NSCLC和CRC肿瘤球铺板。A.C:以0，lpg/mL至100pg/mL的渐增浓度添加重组IL-1 3。细胞孵育20 min,然后用HGNT缓冲液裂解。使用来自贴壁生长的NSCLC (代表分化表型)的裂解物作为对照。B.D:用lpg/mL重组IL-1 ^刺激肿瘤球30 min,随后添加渐增浓度的15C4抗ILlRl抗体。24h后，从细胞制备裂解物。A.B.C.D:通过western印迹分析裂解物。用5%乳封闭膜，且用在TBS中1:1000的抗ILlRl兔IgG(Millipore) —抗进行孵育。用在TBS中1:2000的抗兔POD 二抗进行检测。使用VersaDoc设备将膜成像。使用Quantity one软件进行密度分析，其结果表示为以上述任意単位的条形图。结果是初歩的，仍有待确认結果。
[0079] S 11:111-响应性细胞因子hIL8和h VEGF的体外分泌可以被抗ILlRl阻断。
[0080]将源自患者的原发性NSCLC细胞作为肿瘤球铺板，且在不存在生长因子的情况下在37°C /5%C02培养过夜。A.B:球和贴壁生长细胞的上清液在24小时后收集，且使用来自R&D Systems的定量ELISA分析hIL8和hVEGF水平。结果用以pg/mL为单位的细胞因子浓度的条形图显示。C.D:用lpg/mL重组IL-1 P刺激球30min，随后添加渐增浓度的15C4抗ILlRl Mab。孵育6h后，收集培养上清液，且通过ELISA测定hIL8和hVEGF水平。结果用以Pg/mL为单位的细胞因子浓度的条形图显示。结果是初歩的，仍有待确认結果。
[0081 ] 图12:使用来自Amgen的ILlRA药物Kineret抑制原发性CRC和NSCLC-CSC-肿瘤的肿瘤生长。
[0082]基于如通过Aldefluor分析测定的ALDH活性从源自原发性肿瘤的NSCLC和CRC细胞系培养物FACS富集CSC。将IO4个细胞/小鼠连同基质胶皮下移植到N0D/SCID小鼠中。将上样剂量的5Pg/mL Kineret (重组IL1RA，Amgen)应用于基质胶，随后在移植后第I天开始进行用5或10 mg Kineret的毎日皮下处理。每周监测肿瘤体积，对于CRC模型(A.)在第76天，对于NSCLC模型(B.)在第91天，将来自每组的三只小鼠处死，用于进一歩研究。对于其余动物，停止Kineret处理，且继续监测肿瘤进展。当肿瘤达到>2000 mm3时处死小鼠。在处死时一起采集血清用于细胞因子分析。A.CRC肿瘤模型研究中的肿瘤生长曲线和B.NSLCL模型研究中的生长曲线。曲线代表来自10只小鼠/组的以mm3为单位的平均肿瘤体积；误差条为SEM。对于每种模型显示的数据代表n = 2的类似实验。
[0083]图13:在用CSC-异种移植肿瘤移植的N0D/SCID小鼠血清中检测hIL8和h VEGF。
[0084]对从如图18中所述的肿瘤模型研究收集的血清进行本分析。使用从R&D systems获得的高灵敏度ELISA检测试剂盒进行血清分析。A.C.分析在第76天(CRC)(蓝色)和在第91天(NSCLC)(红色)的3只小鼠的血清的hIL8和hVEGF血清水平。结果以条形图显示，代表来自n=3只小鼠/组的以pg/mL +/- SD表示的平均细胞因子浓度。B.D:在CRC模型中停止Kineret处理后，本发明人基于肿瘤进展率将分类为高响应者、中等响应者和低响应者的三只个别小鼠的细胞因子水平进行比较。在所有条件下，在Kineret处理的小鼠中，hVEGF水平保持稳定，然而hIL-8水平急剧下降，观察到这与肿瘤负荷直接相关。这些结果将用第二次体内实验的血清进行确认。
[0085]图14:中和性抗体对ILlRl的抑制以剂量依赖的方式降低TAM支持的肿瘤球形成。
[0086]A.分离来自HER/neu转基因小鼠的自发性乳腺肿瘤，且分离肿瘤细胞。使用⑶IIb和F4/80连同泛造血标志物⑶45分选肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)。A.B.将HER2/neu细胞作为单独的肿瘤球和连同TAM进行铺板。単独的TAM充当对照。来自一式三份的每孔肿瘤球数的平均值和SD显示为条形图。TAM支持的HER2/neu球以TAM细胞数依赖的方式生长。C.抗鼠ILlRl仓鼠IgG Mab以0，5Mg/mL和10Mg/mg(左小图)添加至HER2/neu月中瘤球以及ffiR2/neu+TAM共培养物。肿瘤球数显示为来自一式三份的平均值和SD的条形图。在抗ILlRl处理下以剂量依赖的方式抑制TAM支持的球生长。
[0087]发明详述
如果没有另有指出，否则本发明中使用的术语及短语优选具有下文给定的意义和定义。此外，这些定义和意义更详细地描述了包括优选实施方案和/或方面的本发明。
[0088]“癌干细胞(CSC) ”:美国癌症研究协会(the American Association of CancerResearch)召集的ー个共识小组已经将CSC定义为“肿瘤内具有自我更新且引起组成肿瘤的癌細胞的异质谱系的能力的細胞”。应当指出的是，该定义没有指明这些细胞的来源ー这些肿瘤形成细胞可以假设源自干细胞、祖细胞或分化的细胞。因此，有时使用术语“肿瘤起始细胞”或“癌症起始细胞”而非“癌干细胞”，以避免混淆。肿瘤源自正常细胞通过遗传修饰聚集的转化，但它并没有明确确定干细胞是所有CSC的来源。因此，CSC假说没有暗示癌症总是由干细胞引起，或如同该报告的其他章节中讨论的，干细胞治疗状况诸如心脏疾病或糖尿病的可能应用将导致肿瘤形成。相反，肿瘤起始细胞在一定程度上具有干细胞样特征，其程度足以保证与干细胞进行比较；观察到的转移性癌细胞的实验和临床行为非常让人想起干细胞的经典特性。
[0089]因此，本发明的CSC可以视为肿瘤组织包括实体瘤和转移瘤内细胞的一个亚群(1-10%，优选2-5% )，其功能和任选表型不同于标准肿瘤组织细胞。CSC是致瘤的，这意味着它们可以生成新的肿瘤细胞。CSC显示长期的自我更新能力且生成分化的肿瘤块群体。CSC的特征还在于显示对化疗和/或放疗的耐受性的增强的能力。此外，CSC可以通过驱动将疾病传播到不同器官而支持转移。存在试图解释CSC来源的几种假说。CSC可能由(i)干细胞、由(ii)祖细胞、和由(iii)分化的成熟细胞产生。本发明的CSC可以包括其他不是CSC的肿瘤细胞，其范围为0 - 30%。
[0090]术语“肿瘤细胞”或“癌细胞”涉及，如果没有不同地指定，不受控制生长的细胞，其不是癌干细胞。肿瘤或癌细胞可以包含范围为0-30%的CSC。肿瘤细胞代表普通肿瘤组织的大部分群体。
[0091] 术语“癌”描述ー组疾病，其特征在于不受控制的细胞生长、细胞侵入相邻组织、和如果未在足够早期进行处理则转移的潜能。这些细胞畸变经由根本基因序列变化或表观改变(例如，不影响基因序列本身的基因活化或DNA相关蛋白的修饰)累积的遗传修饰而产生。癌症可以在实体器官诸如肺、脑或肝脏中形成肿瘤，或在组织诸如血液或淋巴中作为恶性肿瘤而存在。由异常细胞生长导致的肿瘤和其他结构含有具有不同生物学特征和潜力的异质细胞群体。事实上，癌组织足够异质，使得研究人员可能鉴定来自相同样本的几种组织样品之间的遗传概况之间的差异。尽管ー些基因分组允许科学家将器官或组织特异性癌症分类为可以最终提供治疗信息且提供预测信息的亚类，但是癌症生物学的显著复杂性继续混淆治疗努力。
[0092]借助本发明的药物组合物可治疗肿瘤，诸如乳房、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头和颈、卵巣、前列腺、脑、胰腺、皮肤、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、睾丸、子宫颈和肝脏的肿瘤。更具体地，所述肿瘤选自腺瘤、血管肉瘤、星形细胞瘤、上皮癌、生殖细胞瘤、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、错构瘤、血管内皮瘤、血管肉瘤、血肿、肝母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤和畸胎瘤。还更优选，肿瘤/癌症选自脑肿瘤、头颈部癌、直肠癌、星形细胞瘤，优选I1、III或IV级星形细胞瘤、胶质母细胞瘤，优选多形性胶质母细胞瘤(GBM)、小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，优选非小细胞肺癌(NSCLC)、转移性黑素瘤、转移性雄激素非依赖性前列腺癌(AIPCa)、转移性雄激素依赖性前列腺癌(AIPCa)、乳腺癌和结肠直肠癌(CRC)。
[0093]“受体”或“受体分子”优选为包含一个或多个结构域(配体可结合所述结构域以形成受体-配体复合体)的可溶性或膜结合或膜相关的蛋白或糖蛋白。通过结合可能是激动剂或拮抗剂的配体，所述受体被激活或失活，并可以启动或阻断信号转递途径。
[0094]“配体”或“受体配体”优选指结合受体分子以形成受体-配体复合体的天然或合成化合物。术语配体包括激动剂、拮抗剂和具有部分激动剂/拮抗剂活性的化合物。
[0095]“激动剂”或“受体激动剂”优选为天然或合成化合物，其结合受体以形成受体-激动剂复合体，分别通过激活所述受体和受体-激动剂复合体来启动信号转递途径和进一歩生物学过程。
[0096]“拮抗剂”或“受体拮抗剂”优选指具有与激动剂相反的生物效应的天然或合成化合物。拮抗剂通过与激动剂竞争受体来结合受体并阻断受体激动剂的作用。通过其阻断激动剂作用的能力来定义拮抗剂。受体拮抗剂也可以是抗体或其免疫治疗有效片段。下文引用并讨论了本发明的优选拮抗剂。
[0097]本文术语“抗体”或“免疫球蛋白”优选在最广泛的意义上使用并具体涵盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段(诸如Fe、Fab、F (ab’)2、scFv等)，只要它们展示出所需的生物学活性。该术语通常包括异种抗体，所述异种抗体由连接在一起的具有不同结合特异性的两种或更多种抗体或其片段构成。该术语还包括抗体融合蛋白(所述抗体融合蛋白由抗体或抗体片段和与抗体或抗体片段重组融合的多肽或蛋白构成)和免疫缀合物，其中所述抗体或抗体片段与化学实体化学连接。该术语进ー步包括人抗体、人源化抗体和嵌合抗体。
[0098]如本文所用的术语“细胞毒性剂”优选指抑制或阻止细胞功能和最后引起细胞解体和细胞死亡(尤其是肿瘤细胞死亡)的物质。所述术语优选g在包括放射性同位素、化学治疗剂和毒素诸如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段。所述术语还可包括细胞因子家族成员，优选为IFNy以及也具有细胞毒活性的抗肿瘤剂。
[0099]如本文所用的术语“细胞生长抑制剂”优选指抑制或阻止细胞功能、或阻碍细胞活性和复制、且最终引起防止细胞生长而没有杀死它们的物质，包括抗体、抗体片段、免疫缀合物或抗体融合蛋白。
[0100]根据本发明的理解，术语“ 化学治疗剤”、“化疗剂”或“抗肿瘤剂”优选认为是如上述的“细胞毒性剂”或“细胞生长抑制剂”类的成员，并包括直接作用在肿瘤细胞上例如通过细胞生长抑制作用或细胞毒作用来产生抗肿瘤效果(即阻止肿瘤细胞的发育、成熟或扩散)的化学活性剤，而不是通过诸如生物学应答修饰的机制间接作用。本发明合适的化疗剂优选为天然的或合成的化学化合物，但不表示排除生物分子诸如蛋白、多肽等。有大量处于商业使用、临床评价和临床前开发中可获得的抗肿瘤剂，其可包括在本发明中用于治疗肿瘤/瘤形成。化疗剂或药剂的实例包括烷化剂，例如氮芥、乙烯亚胺化合物、烷基磺酸酷和具有烷化作用的其它化合物诸如亚硝基脲、顺钼和达卡巴嗪；抗代谢物，例如叶酸、嘌呤或嘧啶拮抗剂；有丝分裂抑制剂，例如长春碱和鬼白毒素的衍生物；细胞毒抗生素和喜树碱衍生物。优选的化疗剂或化疗包括阿米斯丁(氨磷汀)、顺钼、达卡巴嗪(DTIC)、放线菌素D、二氯甲基二こ胺(氮芥)、链脲霉素、环磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(阿霉素)、多柔比星脂质体(盐酸多柔比星脂质体)、吉西他滨(健择)、柔红霉素、柔红霉素脂质体(枸櫞酸柔红霉素脂质体)、甲基苄肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、长春碱、长春新碱、博来霉素、紫杉醇(泰素)、多西他赛(多西紫杉醇)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡钼、卡拉屈滨、喜树碱、CPT-1lUO-羟基-7_乙基-喜树碱(SN38)、达卡巴嗪、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、伊达比星、美司钠、a干扰素、P干扰素、伊立替康、米托蒽醌、拓扑替康、醋酸亮丙瑞林、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、普卡霉素、曼托坦、培门冬酶(pegaspargase)、喷托他丁、哌泊溴烧、普卡霉素、链脲霉素、他莫昔芬、替尼泊苷、睾内酷、硫鸟嘌呤、噻替哌、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨、苯丁酸氮芥及其组合。与本发明的任何工程改造抗体组合使用的优选化疗剂可以是例如氨甲喋呤、长春新碱、阿霉素、顺钼、不含糖的氯乙基亚硝基脲(non-sugar containingchloroethyl nitrosoureas)、5 -氟尿嘧唳、丝裂霉素C、博来霉素、多柔比星、达卡巴嗪、紫杉醇、fragyline、Meglamine GLA、戍柔比星、卡莫司汀、UFT (替加氟/尿嘧唳)、ZD 9331、泰索帝/多西他赛、氟尿嘧啶(5-FU)、长春花碱、和该类别的其他已知化合物。
[0101]术语“治疗有效的”或“治疗有效量”指在哺乳动物中有效治疗疾病或病症的药物量。在癌的情况下，药物的治疗有效量可減少癌细胞数目；降低肿瘤大小；抑制(即在一定程度上减慢并优选停止)癌细胞浸润进周边的器官；抑制(即在一定程度上减慢并优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻ー种或多种与癌相关的症状。达到药物可以阻止癌细胞生长和/或杀死存在的癌细胞的程度，它可以是细胞生长抑制的和/或细胞毒性的。对于癌的治疗，例如可通过评估疾病进展时间(TTP)和/或测定应答率(RR)来测定效力。
[0102]对于约70千克的成人，本发明中使用的抗体(包括抗ILlIRl多肽)的治疗有效量为约50至4000毫克/每剂量的范围内，优选约100至1000 mg毫克/每剂量的范围内。对于每个月治疗一次或两次的70 kg成人，最优选剂量是约200 - 500毫克。
[0103]本文提到的化疗剂的治疗有效量通常是10 mg/kg至100 mg/kg的剂量。
[0104]施用优选为每2周一次或每个月一次，但是根据各自药剂在给定个体中的药代动力学行为也可以更多或更少。
[0105]术语“放疗”和相关术语根据本发明指施用或递送局灶性电离辐射，其中毎次施用或递送优选以每次0.5到5戈瑞(Gy)，更优选0.8到3 Gy,尤其是I到2.5 Gy,例如约1.0、约1.3 Gy、约1.6 Gy、约1.8 Gy、约2.0 Gy、约2.5 Gy或约3.0 Gy (其也优选为所述放射施用或递送发生的每天的放射量)，对患者施用或递送20到50戈瑞(Gy)，优选25到40Gy,更优选28到25 Gy,例如约28 Gy,约30 Gy或约35 Gy0因此，优选在一周内2天或3天姆天施用或递送1.5到2.5 Gy,并优选1.8到2.2 Gy。因此,也优选在一周内3天到6天，优选5天,并更优选连续5天姆天施用或递送0.7到1.3 Gy,并优选0.9到1.2 Gy。通常，尤其优选在一周内2天或3天姆天施用或递送1.0到3.0 Gy,优选约1.0、约2.0 Gy或约3.0 Gy0在癌类型的治疗中优选如上所述局灶性放射治疗的应用类型，所述癌类型选自小细胞肺癌和非小细胞肺癌，优选非小细胞肺癌、乳腺癌、转移性黑素瘤、前列腺癌、和结肠直肠癌。
[0106]将本发明的“药物组合物”配制成与其预期的施用途径相客。施用途径的实例包括肠胃外的例如静脉内的、真皮内的、皮下的、经ロ的(例如吸入)、经皮的(局部的)、跨粘膜的和直肠的施用。用来进行肠胃外、真皮内或者皮下应用的溶液或悬浮液可以包括下列组分:无菌的稀释剂诸如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成的溶剂；抗细菌剂诸如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂诸如こ二胺四こ酸；缓冲剂诸如醋酸盐、杵檬酸盐或磷酸盐以及调节张力的试剂诸如氯化钠或右旋糖。pH可以用酸或碱诸如盐酸或氢氧化钠调节。肠胃外制剂可以包装在安瓿、一次性注射器或用玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
[0107]“IL-1R抑制剂”:本发明的合适的IL-1R抑制剂是多肽，优选人单克隆抗体、嵌合单克隆抗体或人源化单克隆抗体，以及IL-1R受体拮抗剂(IL-1RA)，其是IL-1Rl的天然抑制剂。合适的抗体是抗IL-1Rl抗体或抗IL-1 P抗体或针对IL-1R辅助蛋白(IL-1RaP)的抗体或IL-1RaP和IL-1Rl两者的抗体，包括双特异性抗体。本发明的合适的IL-1R抑制剂进ー步包括上述特定抗体与其他靶向或功能上有效的分子的融合分子，以及作为天然IL-1Rl配体IL-1 ^的诱捕物发挥功能的融合分子，从而阻止IL-1 ^与IL-1受体的结合。
[0108]本发明的这种多肽的实例是本领域已知的。
[0109]WO 2004/039951 和 TO 2000/018932 描述了由与 IL-lRaP (Acralyst)融合的IL-1Rl组成的IL-1 P诱捕物。WO 1989/011540和WO 2001/042305描述了重组天然和修饰的 IL-1RA (anakinra/Kineret)。WO 2004/022718 公开了抗 IL-1R 抗体(AMG-108)。进一步的抗 IL-1R 抗体描述于 WO 2005 023872 (2D8)。WO 2002/016436 描述了人抗 IL-1 3抗体(canakinumab / Ilaris),且WO 2007/002261公开了另一种针对IL-1 ^的人源化抗体。在WO 2010/052505中公开了其他抗IL-1Rl抗体。
[0110]所有上述这些多肽/抗体曾经和现在仅用于治疗炎症性疾病的实践中。
[0111]由本发明提供且由本发明人下面详细展示的数据显示，沿IL-1 P/IL-1Rl轴的信号传递在CSC、肿瘤维持和转移中起重要作用。因此，IL-1Rl对CSC的抑制是肿瘤学中治疗原发性和转移性疾病的有效且有希望的目标。
[0112]假设大剂量化疗剂将根除肿瘤细胞的增生块且只留下具有内在耐受性的细胞，则本发明人用高剂量的多柔比星(Doxorubicin)和紫杉醇(Paclitaxel)处理人A549非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系，通过密度梯度离心回收幸存的细胞，且制备RNA提取物用于在AfTymetrix微阵列平台上的进ー步基因表达分析。通过来自Affymetrix的基因表达微阵列huU133 2.0plus分析样品，然后进一歩分析差异表达。将未处理的/野生型(WT)细胞与紫杉醇和多柔比星富集的A549进行比较。如下所示，在高剂量化疗剂选择的肿瘤细胞中，干细胞标志物如ABC转运蛋白(图1A)和用于快速排出和代谢的ALDH-同种型(图1B)上调。
[0113]在第二个步骤中，本发明人建立了模型系统来分析CSC相比于分化的肿瘤块细胞。肿瘤球測定用来通过连续重新铺板而富集CSC，然而使有血清的贴壁条件含有较高量的分化细胞。如图2A中所示，与贴壁条件相比，在肿瘤球中测定中干细胞标志物ABCG2和ALDH1A1上调。这些结果可以在干细胞的两个金标准功能測定中进行证明:来自StemCell Technologies (SCT)的 Aldefluor (AF)-测定和侧群(side population, SP)测定[GoodelI, M.A.,等人，J Exp Med, 1996.183(4): p.1797-806.]。当细胞作为肿瘤球铺板时，两种CSC-标志物上调，这显示肿瘤球测定是功能富集CSC的真正干细胞测定法(图2B和C)。
[0114]从铺板前的初始细胞(PO)和然后从连续重新铺板轮次的肿瘤球以及从连续的贴壁代提取RNA。以该方式培养来自结肠直肠癌(CRC)或NSCLC的原发性患者材料。
[0115]还通过来自Affymetrix的基因表达微阵列huU133 2.0plus分析样品，然后进一步分析差异表达。此处将贴壁代与肿瘤球铺板进行比较，且还考虑鉴定的差异表达基因的线性。线性表示肿瘤球与贴壁代相比一致的上调或下调。
[0116]本发明人鉴定了各种差异表达的基因，本发明人从其中选择分泌或者定位于细胞表面的基因。IL-1 P是原发性NSCLC中最严厉调控的基因之一(图3A和B)，且在CRC中也上调(图3C和D)。IL-1P在贴壁/分化代中的表达低且稳定，然而当与贴壁/分化代相比时，其在肿瘤球中显著上调。因此，明显地，在分化条件下，IL-1 P不发挥主要作用，然而在代表CSC条件的肿瘤球中，IL-1P上调，所以假设它是非常重要的。还发现，IL-1的受体，IL-1受体I (IL-1Rl)在NSCLC球中轻微上调(图3B)。在原发性CRC中，IL-1 ^只有略微上调，然而，ILlRl显著上调(图3D)。细胞因子IL-1 P在化疗剂选择的细胞中也上调，这提供了富集CSC的功能选`择方法的进ー步验证(图3E)。
[0117]IL-1 P及其各自受体的mRNA水平在功能富集的CSC中上调。为了在蛋白水平上进ー步评价关联性，本发明人分析源自原发性患者材料的NSCLC样品。患者材料作为在免疫缺陷小鼠的皮下(s.c.)异种移植物在体内繁殖。分离肿瘤，且在肿瘤球測定中进ー步分析以及重新铺板。ILlRl的蛋白表达存在于亲本患者肿瘤细胞(图4A)和衍生的肿瘤球两者上。在肿瘤球重新铺板后，表面上的IL-1Rl蛋白表达也上调，这与我们在RNA /微阵列-水平上的发现是一致的。CSC-标志物CD133在相同的重新铺板的肿瘤球中也上调，这表明LlRl是CSC相关表面分子(图4B)。
[0118]假设IL-1 P或其各自受体在肿瘤维持和转移中发挥主要作用，本发明人使用计算机芯片上的方法来评价IL-1 ^和IL-1Rl对无疾病和整体存活的影响。对于针对IL-1 ^的探针组215561_s_at和针对IL-1Rl的39402_at，本发明人发现IL-1 ^的低表达与肺腺癌I期患者中的生存益处和与在CRC中的延长的无疾病生存相关。CRC的整体生存没有显示出与高或低IL-1B表达的显著差异(图5A)。IL-1Rl的高表达显示了肺腺癌I期中生存的轻微生存益处和CRC中的无疾病和整体生存的明显益处(图5B)。
[0119]在肿瘤球重新铺板后，表面上的IL-1Rl RNA和蛋白表达上调，然而在贴壁条件下的RNA表达是稳定的。肿瘤球測定得以确立，且已经显示富集CSC和CSC样祖细胞，而分化的细胞死亡。因此，可以假设，IL-1 ^ /IL-1Rl信号传递可能在CSC表型的发生和/或维持中起重要作用。为了测试IL-1 P/IL-1Rl信号传递是否在肿瘤球中是重要的，本发明人在肿瘤球测定中铺板原发性NSCLC或CRC，且用O，5、5和10/50l^g/mL剂量范围的正常山羊IgGl或中和性山羊抗人IL-1Rl抗体处理细胞。此处，本发明人显示在源自NSCLC(图6A)和CRC患者的细胞系(图6B)中，中和性抗体对IL-1Rl的抑制以剂量依赖的方式降低铺板的细胞的球形成能力。
[0120]图7和8表示CRC和NSCLC肿瘤上IL-1Rl的表达上调和不同抗体对其的检测。
[0121]还显示了抗IL-1Rl抗体对IL-1 P的抑制作用(图9、10、14)。
实施例
[0122]实施例1:鉴定IL1/IL1R1信号传递作为CSC相关途径:
CSC的特征在于它们的药物流出转运蛋白和解毒酶的高表达。因此，本发明人假设，他们可以通过用超生理、高剂量的化疗剂处理癌细胞系而选择具有固有的CSC样特性的细胞。该方法根除了过度增生的块且留下具有固有(而非获得)耐受性的细胞。发明人用高剂量的多柔比星(Doxorubicin)和紫杉醇(Paclitaxel)处理A549非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系，通过密度梯度离心回收幸存的细胞，且制备RNA提取物用于在AfTymetrix微阵列平台上的进ー步基因表达分析。样品通过来自Affymetrix的基因表达微阵列huU133
2.0plus进行分析，然后通过与未处理/野生型(WT)细胞的比较来进一歩分析差异表达。如下所示，在高剂量化疗剂选择的细胞中，ABC转运蛋白(药物排出泵)(图1A)和ALDH-同种型(解毒酶)(图1B)的表达上调。因此，本发明的方法成功地富集表达高水平的已知CSC标志物的细胞群体。
[0123]CSC的另ー个特征是当它们放置在非贴壁培养条件时作为球体结构生长的能力。肿瘤球測定促进了 CSC在体外自我更新且防止分化。因此，将肿瘤球重新连续铺板进ー步富集CSC。通过比较，在贴壁条件下`，培养细胞的块代表分化的肿瘤细胞。使用源自人原发性NSCLC肿瘤材料的癌细胞，本发明人进行重新连续铺板的肿瘤球相比于贴壁培养物中基因表达模式的差异分析..如图2 A中所示，与分化的贴壁细胞相比，在肿瘤球中干细胞标志物ABCG2和ALDH1A1上调。使用两个干细胞的’金标准’功能测定进一步证明球繁殖细胞的 CSC-特性:来自 Stem Cell Technologies (SCT)的 Aldefluor (AF)-测定和侧群(side population, SP)测定[Godell 等人，1996, J.Exp.Med.183(4): 1797)]。AF+和SP+部分在肿瘤球中均显著增加，确认肿瘤球測定是用于功能富集CSC的真正測定(图2B 和 2C)。
[0124]使用人原发性CRC和NSCLC肿瘤材料，本发明人进行基因表达的差异分析，该分析比较了铺板前的初始细胞(PO)、作为肿瘤球连续传代的细胞和作为贴壁培养物连续传代的细胞。通过来自Affymetrix的基因表达微阵列huU133 2.0plus分析样品。分析考虑鉴定的差异表达基因的线性，线性被定义为在肿瘤球和贴壁代中一致的上调或下调。
[0125]鉴定了各种差异表达的基因，从该基因选择编码分泌或位于细胞表面上的蛋白的基因，因为本发明人认为该蛋白代表药物最容易到达的目标。IL-1 P的表达在贴壁/分化代中是低且稳定的，且被鉴定为原发性NSCLC中上调最高的基因之一(图3A和B)，且在CRC中也轻微上调(图3C和D)，这提示我们，IL-1 P可能在CSC的生物学中发挥重要作用。支持该假说的是，我们发现，ILl受体I(ILlRl)在NSCLC球中略有上调(图3B)。在原发性CRC中，IL-1 ^只有略微上调，然而，ILlRl显著上调(图3D)。还发现IL-1 ^在通过高剂量化疗剂选择而针对CSC样特征富集的细胞中上调(图3E)。
[0126]实施例2 ,IL-1P和ILlRl基因的表达与癌症患者中无肿瘤和整体存活的减少相关:
假设IL-13或其各自受体在肿瘤维持和转移中发挥主要作用，本发明人使用计算机芯片上的方法来评价IL-1 ^和ILlRl对无疾病和整体存活的影响。使用针对ILlRl的探针组215561_s_at和针对ILl ^的205067_at或39402_at，发现ILlRl的低表达与肺腺癌I期患者中的生存益处和与在CRC中的延长的无疾病生存相关。ILlRl表达水平的差异没有改变CRC中的整体生存(图5A)。ILl ^的高表达显示了朝向肺腺癌I期中的生存益处和CRC中的无疾病和整体生存的明显益处的趋势(图5B)。选择CRC和NSCLC适应症用于分析，这是基于以下事实:我们使用源自患有这些肿瘤类型的患者的原发性材料进行了 CSC中IL-1 ^和ILlRl表达的初步鉴定。
[0127]实施例3..1LlRl在原发性CRC和NSCLC肿瘤細胞上表达，且在通过连续肿瘤球繁歹直虽集CSC后上iM:
IL-1B及其各自受体的RNA水平在功能富集的CSC或CSC样细胞中上调。为了在蛋白水平上确定ILlRl的表达，进行源自患者的NSCLC原发性肿瘤样品的FACS分析。在分析之前，患者材料作为在免疫缺陷小鼠的皮下(s.c.)异种移植物在体内繁殖。将异种移植肿瘤酶促分解成单细胞，且使用市售荧光团缀合的抗体检测ILlRl表面表达。将直接取自异种移植肿瘤的细胞中的ILlRl表达与作为肿瘤球连续传代的源自异种移植物的细胞进行比较。ILlRl的蛋白表达存在于亲本异种移植肿瘤细胞(图4A)和源自异种移植的肿瘤球两者上。然而，与亲本细胞相比，肿瘤球中ILlRl蛋白表达更高；这与mRNA表达水平的发现是一致的，并且表明CSC具体依赖于ILl途径。CSC-标志物⑶133在肿瘤球中也上调，提供了ILlRl是CSC相关表面分子的进ー步证据(图4B)。
[0128]实施例4:1LlRl在源自人原发性肿瘤的CRC和NSCLC细胞系上表达，且其表达在CSC富集的肿瘤球中上调
为了进一步评价原发性NSCLC和CRC细胞表面上的ILlRl表达，使用市售多克隆抗体(AF269; R&D systems)和源自 Amgen 专利 W02004022718A2 的单克隆抗体(15C4)。后者抗体作为单克隆hlgG4产生。两种抗体都用APC标记，且通过流式细胞术检测表达。在图7中可见，两种抗体都能够检测到与贴壁细胞培养条件下生长的细胞相比在一轮球铺板后NSCLC细胞中ILlRl表达的上调(图7上小图)，而在CRC细胞系中，球中ILlRl的上调是弱的，并且只能用多克隆抗体检测到，但单克隆抗体检测不到(图7下小图)。
[0129]这些结果与图4中描述的结果是一致的，在图4中，发现与新鲜分离的异种移植肿瘤细胞相比，在源自连续传代的异种移植物的肿瘤球中ILlRl表达上调。
[0130]图8显示了对应于图10中显示的柱状图的源自原发性肿瘤的NSCLC和CRC细胞系各自的同种型对照(左边和中间小图的上方和下方)。当比较两种抗ILlRl抗体吋，清楚地观察到多克隆抗体对于目标识别具有更高的灵敏度，这最可能是由于识别多个表位引起的(图7，右小图的上方和下方)。
[0131 ] 实施例5 'LlRl的抗体阻断在体外抑制肿瘤球形成
根据本发明观察，由源自患者的原发性肿瘤生成的CSC-富集的肿瘤球的特征在于IL-1B和ILlRl基因表达和ILlRl蛋白表达的上调。因此，本发明人假设，IL-1途径在CSC表型的发生和/或維持中起重要作用。为了测试IL-1信号传递在体外是否促进肿瘤球形成，将原发性NSCLC和CRC细胞系铺板在肿瘤球培养条件下，且用一定浓度范围的中和性山羊抗人ILlRl抗体或同种型匹配的阴性对照IgG处理所述细胞。此处，显示在源自NSCLC (图6A)和CRC患者的细胞系(图6B)中，中和性抗体对ILlRl的抑制以剂量依赖的方式降低铺板的细胞的球形成能力。这些结果支持针对IL-1途径的治疗作为抑制CSC扩增的方式的用途。
[0132]实施例6 ,ILlRl阻断抑制IL-1P刺激的MAPKp38和STAT3磷酸化
显示ILlRl的抗体阻断部分抑制源自人原发性肿瘤的细胞系的肿瘤球形成。因此，本发明人考虑抑制IL-1信号传递是治疗干预癌症的可行策略，其具有抑制CSC功能的独特潜力。为了评价可以用来提供IL-1途径抑制剂的药理学评价信息的潜在生物标志物，分析丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38和信号转导子和转录激活子(STAT)3(已知其在IL1/IL1R1级联中被磷酸化)的状态。使用Pathscan ELISA (Cell Signaling)进行pMAPKp38和PSTAT3的检测。将肿瘤球铺板在缺乏生长因子的培养基中过夜，然后添加一定剂量范围的重组IL-1 P，随后孵育20 min。如图9A和C中可见，作为ILl刺激后的早期事件，MAPKp38和STAT3以剂量依赖的方式发生磷酸化。在没有用IL-1 ^刺激的情况下，已经在肿瘤球培养物中检测到pMAPKp38，而在贴壁生长的细胞中没有检测到，表明可能的自分泌活化回路在CSC中起作用(图9 A和B)。在相同测定条件下，观察到用抗ILlRl 15C4抗体的处理以剂量依赖的方式减少pMAPKp38和pSTAT3两者的磷酸化(图9 B和D)，pMAPKp38和pSTAT3的 IC50 分别为 0，69 nM 和 4，42 nM 。
[0133]可以得出结论，这两种蛋白的磷酸化状态可以用作针对鉴定抑制IL-1途径的化合物的筛选级联的读出值，并且还代表用于体外和体内药理学研究的最有希望的生物标志物。因为图9中的结果是初歩的，需要确认获得的结果以建立稳定的筛选级联。
[0134]实施例7.?重会日IL-13诱导ILlRl在肿瘤球中的表达，而ILlRl的抗体阻断下调ILlRl表达
为了建立最有希望的生物标志物，通过Western印迹分析上述相同样品的ILlRl表达水平(图9)。如图1OA和C中可见，ILlRl的表达存在于肿瘤球中，并且在重组IL-1 @刺激后进ー步增加。在源自CRC的肿瘤球中，ILlRl的诱导遵循明显的剂量依赖趋势，而在NSCLC球中，我们观察到ILlRl表达在高于I pg/mL浓度的降低；这表明在原发性NSCLC细胞中由于内在高ILlP产生而导致的负反馈回路。这与我们在微阵列分析中的发现是一致的，表明原发性NSCLC球具有显著较高水平的IL-1 ^ mRNA。用15C4抗ILlRl抗体处理后，IL-1 ^刺激的ILlRl表面表达降低，表明抗体參与触发了受体降解(图10 B和D)。
[0135]实施例8 ,CSC-富集的肿瘤球分泌ILl-响应性细胞因子hIL8和h VEGF，且ILlRl阻断可以抑制这些细胞因子的产生
上面已经显示，IL-1生物活性可以通过监测MAP38K和STAT3的磷酸化而在细胞系中检测到。然而，为了支持临床转化，鉴定可以在容易收集的液体生物材料(诸如尿或血液)中检测到的生物标志物将是重要的。细胞因子可以使用ELISA方法容易地在血清中測定。IL-1 P本身是ー种可以很容易地在血清样品中监测的细胞因子。公认的是，IL-1刺激其他细胞因子诸如IL-8和VEGF a的分泌。[0136]为了测试这些细胞因子是否可以用来监测对抗ILlRl抗体的响应，在来自CSC-富集的肿瘤球培养物的上清液(SN)中測定IL-8和VEGF水平。当比较分化的(贴壁)和肿瘤球培养物的上清液吋，发现在来自肿瘤球的SN中，IL8诱导' 7倍(图11A)，且VEGF诱导显著(图11B)。基于该观察结果，测定来自抗ILlRl-Mab处理的肿瘤球的SN中的IL-8和VEGF水平(图1lC和D)。如下面可见，ILlRl的阻断以剂量依赖的方式降低IL-8水平(图11C)，且还显著降低了 VEGF水平(图11D)。
[0137]这些数据将IL8和VEGF鉴定为可以用于评价IL-1途径抑制剂在体内的药理学活性的候选生物标志物。与来自图9和10的数据类似，该数据被认为是初歩的，因为它还没有在重复实验中证明。
[0138]实施例9 ,ILlRA药物Kineret (Amgen)在体内抑制源自CSC的异种移植肿瘤的生长且调节血清细胞因子
基于本发明人的观察结果(即抗ILlRl抗体在体外抑制肿瘤球形成)，进ー步测试了在体内CSC-异种移植模型中IL-1途径的抑制。用于该体内研究的最合适且随时可获得的分子是已知与mILlRl交叉反应的人ILlR-拮抗剂(IL1RA)。在此设置中，可以期望抗肿瘤活性与ILlRl抑制对肿瘤微环境(炎症性浸润细胞，间质成纤维细胞等)以及CSC区室的影响相关。ILlRA以商品名Kineret销售，且专利由Amgen (W01989/011540)持有。目前，Kineret被批准用于治疗类风湿关节炎。
[0139]使用荧光激活细胞分选(FACS)对源自从CRC(图12A)和NSCLC(图12B)患者获得的原发性肿瘤的人细胞培养物分选Aldeflour阳性群体。Aldefluor是高醛脱氢酶活性(其与正常干细胞和CSC表型相关)的标志物。将分选的aldefluor阳性(AF+)细胞悬浮于基质胶中，且以非常低的细胞数(2xl04个细胞/小鼠)皮下注射到N0D/SCID免疫缺陷小鼠中。基质胶悬浮物含有5|ag/mL的Kineret上样剂量，其相当于每天s.c.给药后报告的Kineret血清水平。AF+细胞接种后I天开始，姆天用5mg或IOmg的Kineret (购自Biovitrum)或药物媒介物处理 小鼠。施用途径是临床上对于Kineret标准的s.c.。
[0140]对于CRC模型每周监测肿瘤体积，持续76天，对于NSCLC模型每周监测肿瘤体积，持续91天。如在图12中可见，在两种模型中，我们观察到肿瘤生长的剂量依赖的抑制。在CRC中，我们看到在5和10 mg剂量两者的強烈抑制(图12A)，而仅在10mg/kg的较高剂量实现了 NSCLC响应。两种剂量都被小鼠良好耐受。
[0141]在第76天(CRC)或第91天(NSCLC)将来自每个研究组的三只小鼠处死。将肿瘤切下，分离成单细胞，且有活力地冷冻保存。还收集血清用于细胞因子检测。对于其余小鼠，停止Kineret处理，且进一步监测小鼠的肿瘤生长。当肿瘤达到伦理肿瘤负荷限值时，将小鼠处死，且收集肿瘤细胞和血清。停止Kineret处理后，在CRC研究中有一只小鼠几乎没有显示任何进展，被指定为对Kineret的高响应者(高响应者)，具有生长缓慢的肿瘤的一只小鼠被指定为中间响应者(中等响应者)，且具有快速生长的肿瘤的一只小鼠被指定为低响应者(低响应者)。从所有处死的小鼠，我们还收集且冻存了来自股骨和胫骨的骨髓细胞用于可能的分析。
[0142]经由ELISA的血清细胞因子分析显示在CRC和NSCLC模型两者中媒介物对照组中容易检测到的人IL8和人VEGF水平(图13)。用Kineret处理没有改变小鼠血清中的hVEGF水平(图13C);然而，发现hIL-8降低到检测不到的水平(图13A)。[0143]由于处理组的肿瘤的生长得到抑制，所以必须考虑降低的hIL8水平是降低的肿瘤大小的直接反映，因此hIL-8水平不能被验证为异种移植模型中的药效动力学响应的生物标志物(图13A)。在CRC模型中的三种不同分类的响应者中，我们再次观察到，hIL8的量与肿瘤大小密切对应(图13B)，我们没有看到VEGF水平的任何变化(图13D)。
[0144]这些初步的药理学研究表明，ILlRl抑制对于CRC和NSCLC源自CSC的异种移植模型在体内是有效的。小鼠血清中的人IL-8水平可以用作这些模型中与肿瘤大小相关的疾病响应的生物标志物，并且其在将来将可用作其中不能直接测量肿瘤体积的原位模型中肿瘤负荷的替代物读出值。人VEGF不能作为这些模型中的体内生物标志物，因为ILlRl抑制对hVEGF血清水平没有任何影响。
[0145]实施例10 肿瘤相关巨噬細胞(TAMs)通过涉及IL-1的机制在体外促进肿瘤球形成
肿瘤被所谓的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)(已经显示促进肿瘤细胞増殖、肿瘤免疫逃避、转移和血管生成)严重浸润。巨噬细胞是在炎症应答过程中分泌的IL-1的主要来源；考虑这一事实连同我们对于IL-1在支持CSC中作用的发现，本发明人假设，源自巨噬细胞的IL-1可能代表支持肿瘤内CSC生境的关键因素。
[0146]为了实验上解决该假设，使用上面描述和开发的Herf/neu肿瘤球/TAM共培养模型。Her2/neu小鼠是大鼠HER2/neu癌基因转基因的，所述大鼠HER2/neu癌基因在小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子的转录调控之下。Her2/neU小鼠在 4个月龄自发发展出乳腺肿瘤。建立了用于从Her2/neu肿瘤分离TAM的方法，其包括切出原发性乳腺肿瘤，将肿瘤酶促分离成单细胞，通过磁珠分离阴性选择(depletion)成纤维细胞、内皮细胞和红细胞谱系。然后经由FACS将肿瘤细胞和TAM分选成不同群体。最后，将TAM连同Her2/neu肿瘤细胞置于促进肿瘤球的培养条件下(图14A)。
[0147]培养的TAM不能形成 球体结构，然而HER2/neu肿瘤细胞容易形成乳腺肿瘤乳腺球(图14B)。在多轮共培养实验中，我们已经显示，TAM的存在一致促进HER2/neu肿瘤球形成。此外,肿瘤球数目随着共铺板的TAMs的数目增加而线性增加(图14B)。
[0148]为了研究IL-1信号传递在TAM支持的肿瘤球生长中的可能作用，以两种不同剂量的抗鼠ILlRl Mab处理HER2/neu-TAM共培养物。ILlRl阻断对仅含有TAM或仅含有HER2/neu肿瘤细胞的培养物没有显著影响。然而，在共培养条件下，ILlRl阻断导致Herf/neu肿瘤球形成的明显的剂量依赖的降低(图14C)，支持了 IL-1途径在CSC的TAM-介导的支持中的作用。
[0149]因此，可以说，ILlRl抑制对于乳腺癌干细胞及其保护微环境具有影响。
【权利要求】
1.抑制ILl^与ILlRl结合和/或ILlRl与ILlRaCP异源二聚化的多肽，其用于治疗个体中的癌细胞和/或癌干细胞(CSC)。
2.权利要求1的多肽，其用于治疗CSC。
3.权利要求2的多肽，其用于治疗CSC，其中所述CSC包含其他不是CSC的肿瘤细胞。
4.权利要求1的多肽，其用于治疗癌细胞，其中所述癌细胞进一歩包含CSC。
5.权利要求1-4中任ー项的多肽，其用于治疗癌细胞和/或CSC，其中ILlR在所述CSC的表面上、但不是或基本上不是在不是CSC的肿瘤细胞上表达。
6.权利要求1-5中任ー项的多肽，其用于治疗癌细胞和/或CSC，其中所述癌干细胞至少对化疗和/或放疗是耐受的。
7.权利要求1-6中任ー项的多肽，其用于治疗癌细胞和/或CSC，其中待治疗的癌症选自:结肠直肠癌(CRC)、非小细胞肺癌(NSCLC)和乳腺癌。
8.权利要求1-7中任ー项的多肽，其用于治疗癌细胞和/或CSC，其中所述多肽与细胞生长抑制剂、细胞毒性剂或放疗组合施用于所述个体。
9.权利要求8的多肽，其用于治疗癌细胞和/或CSC，其中所述细胞生长抑制剂或细胞毒性剂是抗癌抗体或化疗剂。
10.权利要求8或9的多肽，其用于治疗癌细胞和/或CSC，其中所述多肽在所述细胞生长抑制剂或所述细胞毒性剂或所述放疗治疗之前、同时或之后应用于所述个体。
11.权利要求1-10中任ー项的多肽，其用于治疗癌细胞和/或CSC，其中所述多肽是人单克隆抗体、嵌合单克隆抗体或人源化单克隆抗体。
12.权利要求11的多肽，其用于治疗癌细胞和/或CSC，其中所述单克隆抗体是抗ILlRl抗体、抗ILl ^抗体、抗ILlaCP抗体、或靶向ILlRl和ILlRaCP的双特异性抗体。
13.权利要求1-10中任ー项的多肽，其用于治疗癌细胞和/或CSC，其中所述多肽是重组的天然或修饰的IL1RA。
14.权利要求1-10中任ー项的多肽，其用于治疗癌细胞和/或CSC，其中所述多肽是ILlRl-1LlRaCP 融合蛋白。
15.权利要求1-14中任ー项的多肽，其用于治疗癌细胞和/或CSC，其中所述多肽是药物组合物的组分，所述药物组合物包含治疗有效量的所述多肽连同药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
16.生物标志物用于在基于细胞的先体内后体外測定中评价和预测药剂对癌症的作用的用途，其中 (i)所述生物标志物是IL-1Rl， (ii)所述细胞是在其表面上表达ILlRl的化疗或放疗耐受的癌干细胞(CSC)， (ii)且所述药剂是如权利要求1-15中任ー项指定的治疗性多肽。
17.权利要求16的生物标志物的用途，其中所述CSC通过用化疗剂或通过放射处理个体的肿瘤组织样品而作为这些肿瘤组织样品的细胞亚群获得。
18.权利要求16或17的生物标志物的用途，其中所述基于细胞的測定中的癌细胞源自患有NSCLC、CRC或乳腺癌的个体的样品。
【文档编号】A61P35/00GK103492416SQ201280018582
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2012年4月13日 优先权日:2011年4月15日
【发明者】A.泽希雷, M.沃尔夫, R.蒂格, H.萨布泽瓦里 申请人:默克专利股份公司