识别流行性感冒血凝素的受体-结合袋状结构的广泛中和人类抗体的制作方法

识别流行性感冒血凝素的受体-结合袋状结构的广泛中和人类抗体的制作方法
【专利摘要】本发明的特征为与流行性感冒凝血素特异性地结合，并且减少或抑制凝血素与唾液酸结合的新颖流行性感冒抗体。本发明亦提供特征为新颖抗体和其用于预防或治疗流行性感冒感染的方法、组合物以及试剂盒。
【专利说明】识别流行性感冒血凝素的受体-结合袋状结构的广泛中和 人类抗体
[0001] 相关申请案的对照参考
[0002] 本申请案主张于2011年8月3日提出申请的美国临时专利申请案第61/514,662 号的优先权，其内容以参考方式全部并入本文。
[0003] 美国联邦赞助的研究下进行的发明的权利声明
[0004] 此研究成果是由来自美国国家卫生院的补助款第U19AI067854号和第 P01GM62580号支持。美国政府对于本发明有特定权利。

【背景技术】
[0005] 流行性感冒病毒抗原性的周知季节性漂移说明了在先前感染的个体中缺乏长期 免疫保护。血凝素（HA)是一种结合病毒受体、促进融合以及从低pH核内体穿透的三聚体 表面碳水化合物蛋白，而且为流行性感冒病毒粒子的主表面抗原。HA呈现保守以及可变表 位,但针对后者的中和抗体主宰对免疫接种和感染的反应。
[0006] 从而，对于发展可有效地治疗或预防流行性感冒的漂移株的广泛中和治疗剂有需 求。


【发明内容】

[0007] 如下述，本发明是基于广泛中和流行性感冒抗原变异体的新颖抗体的发现。本发 明的特征为含有新颖抗体的组合物和试剂盒、以及使用此等新颖治疗分子治疗或预防流行 性感冒病毒感染的方法。
[0008] 于方面中，本发明提供与流行性感冒血凝素（HA)的表位特异性地结合的单离的 抗流行性感冒抗体或抗体片段。抗体或抗体片段与流行性感冒HA表位的结合减少或抑制 流行性感冒HA与唾液酸的结合。
[0009] 于具体实施例中，流行性感冒HA的表位包括唾液酸结合结构域。于具体实施例 中，HA为H1HA、H2HA、H3HA或H5HA (来自适应人类的H5病毒株的HA)。
[0010] 于相关具体实施例中，流行性感冒HA表位包括对应于来自A/Solomon Islands/3/2006 的 CDR HI 残基 158 ;CDR H2 残基 158 至 160 ;CDR H3 残基 135 至 136、190 至195以及226 ;⑶R L1残基222、225以及227 ;以及⑶R L3残基187和189的氨基酸
[0011] 于相关具体实施例中，流行性感冒HA表位包括SEQ ID N0 :17至44中任一者所表 示的氨基酸。
[0012] 于相关具体实施例中，流行性感冒HA表位包括SEQ ID N0 :17至44中任一者中的 CH65至CH67结合残基（例如，图15中辨识的CH65至CH67结合残基）。
[0013] 于具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段包括可变重（VH)链，而且其中V H 链包括SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:11或SEQIDN0 :12中所表示的氨基酸序 列。
[0014] 于具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段包括一个或多个存在于SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11或SEQ ID NO :12的可变重（VH)链氨基酸序列中的重 链⑶R区。于相关具体实施例中，一个或多个重链⑶R区包括存在于SEQ ID NO :9、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO :11或SEQ ID NO :12的可变重（VH)链氨基酸序列中的CDR3区。
[0015] 于具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段包括可变轻（')链，而且其中' 链包括 SEQ ID N0 :13、SEQ ID N0 :14、SEQ ID N0 :15 或 SEQ ID N0 :16 所表示的氨基酸序 列。
[0016] 于具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段包括一个或多个存在于SEQID N0 :13、SEQ ID N0 :14、SEQ ID N0 :15 或 SEQ ID N0 :16 的可变轻（VJ 链氨基酸序列中的 轻链⑶R区。于相关具体实施例中，一个或多个轻链⑶R区包括存在于SEQ ID N0:13、SEQ ID NO : 14、SEQ ID NO :15或SEQ ID NO :16的可变重（VJ链氨基酸序列中的CDR3区。
[0017] 于具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段包括i)可变重（VH)链氨基，其包 括SEQ ID N0 :10所表示的氨基酸序列，以及ii)可变轻（VJ链，其包括SEQ IDN0 :14所表 示的氨基酸序列。
[0018] 于具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段包括可变重（VH)链，其中V H链的 CDR3 区包括 Argl04、Serl05、Vall06、Aspl07、Tyrl09、Tyrll0、Tyrll2 或其组合。
[0019] 于具体实施例中，抗流行性感冒抗体为单克隆抗体或其抗体片段。
[0020] 于具体实施例中，抗流行性感冒抗体为人源化抗体。
[0021] 于具体实施例中，抗体片段为Fab片段、Fab'片段、Fd片段、Fd'片段、Fv片段、dAb 片段、F(ab'）2片段、单链片段、双链抗体或线性抗体。
[0022] 于具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段进一步包括与抗流行性感冒抗体 或其抗体片段偶联的剂。于相关具体实施例中，与抗体或其抗体片段偶联的剂是治疗剂或 可检测的标记。
[0023] 治疗剂可为任何适合与新颖抗体共享的治疗剂。此剂为本领域中周知，而且包含 小分子、纳米粒子、多肽、放射性同位素、抑制性核酸等。于具体实施例中，治疗剂为抗病毒 剂或毒素。于具体实施例中，治疗剂为减少流行性感冒病毒生产的siRNA、shRNA或反义核 酸分子。
[0024] 可检测的标记可为适合与新颖抗体共享的任何可检测的标记。此标记为本领域中 周知，而且包含可由光谱、光化学、生化、免疫化学、物理或化学手段检测的标记。于具体实 施例中，可检测的标记为已制成可检测的酶、荧光分子、颗粒标记、电子致密试剂、放射性标 记、微泡、生物素、地高辛或半抗原或蛋白质。
[0025] 于方面中，本发明提供含有本文所述的至少一种抗流行性感冒抗体或抗体片段的 医药组合物。于具体实施例中，医药组合物含有医药可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0026] 于方面中，本发明提供编码本文所述抗流行性感冒抗体或抗体片段的单离的多核 苷酸。于相关方面中，本发明提供包括此单离的多核苷酸的表达载体。于进一步相关方面 中，本发明提供包括此表达载体的宿主细胞。
[0027] 于方面中，本发明提供治疗或预防有需要的受试者的流行性感冒病毒感染的方 法。所述方法涉及对受试者给药有效量的本文所述抗流行性感冒抗体或抗体片段或含有所 述抗体或抗体片段的医药组合物。所述方法治疗或预防受试者的流行性感冒病毒感染，包 含减少或缓和与感染相关的症状。
[0028] 于方面中，本发明提供中和有需要的受试者中的流行性感冒病毒的方法。所述方 法涉及对受试者给药有效量的本文所述抗流行性感冒抗体或抗体片段或含有所述抗体或 抗体片段的医药组合物。所述方法中和受试者中的流行性感冒病毒，从而治疗或预防受试 者的流行性感冒病毒感染，包含减少或缓和与感染相关的症状。
[0029] 于方面中，本发明提供在有需要的受试者中建立流行性感冒病毒感染的方法。所 述方法涉及对受试者给药有效量的本文所述抗流行性感冒抗体或抗体片段或含有所述抗 体或抗体片段的医药组合物。所述方法抑制在受试者中建立流行性感冒病毒感染，从而预 防与感染相关的症状。
[0030] 于方面中，本发明提供抑制有需要的受试者的流行性感冒病毒感染的散播的方 法。所述方法涉及对受试者给药有效量的本文所述抗流行性感冒抗体或抗体片段或含有所 述抗体或抗体片段的医药组合物。所述方法抑制受试者中的流行性感冒病毒感染的散播， 从而减少或缓和与感染相关的症状。
[0031] 于方面中，本发明提供抑制流行性感冒病毒进入受试者中的细胞的方法。所述方 法涉及对受试者给药有效量的本文所述抗流行性感冒抗体或抗体片段或含有所述抗体或 抗体片段的医药组合物。所述方法抑制流行性感冒病毒进入受试者中的细胞，从而预防与 感染相关的症状或减少或缓和与感染相关的症状。
[0032] 于方面中，本发明提供抑制流行性感冒病毒进入细胞的方法。所述方法涉及使具 有流行性感冒病毒感染或有发展流行性感冒病毒感染的风险的细胞接触抗本文所述流行 性感冒抗体或抗体片段或含有所述抗体或抗体片段的医药组合物。所述方法抑制流行性感 冒病毒进入细胞。
[0033] 于以上任何方面中，受试者具有流行性感冒感染或有发展流行性感冒感染的风 险。于相关具体实施例中，受试者为哺乳动物（例如，人类）。于相关具体实施例中，受试者 易受病毒感染（例如，怀孕女性、年轻受试者或婴儿受试者、老年受试者）。
[0034] 于以上方面和具体实施例中任一者中，抗流行性感冒抗体或抗体片段或医药组合 物是通过肌内注射、静脉注射、皮下注射或吸入而给药。
[0035] 于方面中，本发明提供治疗或预防流行性感冒病毒感染的试剂盒；中和流行性感 冒病毒的试剂盒；抑制流行性感冒病毒感染的建立的试剂盒；抑制流行性感冒病毒感染的 散播的试剂盒；以及抑制流行性感冒病毒进入细胞的试剂盒。
[0036] 于具体实施例中，试剂盒含有本文所述抗流行性感冒抗体或抗体片段。
[0037] 于具体实施例中，试剂盒也含有治疗剂。于相关具体实施例中，治疗剂抑制流行性 感冒感染。
[0038] 于具体实施例中，试剂盒也含有在本文所述任何方法中使用试剂盒的指示。
[0039] 于以上任何具体实施例中，流行性感冒可为H1N1、H2N2、H3N2或人类适应H5流 行性感冒病毒株（即，已获得人类受体特异性的H5流行性感冒；参阅图14D的例示性病毒 株）。
[0040] 本发明的另外目的和优点将部分在以下描述中阐明，部分将自该描述显而易见， 或可从本发明的实施得知。本发明的目的和优点将通过本文揭露的组件和组合的方式实践 和实现，包含在附加的权利要求中指出的。应了解前述一般叙述和以下实施方式皆仅为例 示性和说明性，而且并非限制请求保护的发明。附图是并入本文和构成本说明书的一部分 且说明本发明的许多具体实施例，以及所述附图与描述内容共同解释本发明的原则。
[0041] 定义
[0042] -些术语和短语定义如下，以促进本发明的了解。
[0043] 如本文所使用，单数〃一（a)〃、〃一（an) 〃以及〃所述（the)"包含复数形式，除非 语境清楚指出。因此，例如，关于"一种流行性感冒抗体"包含关于超过一种流行性感冒抗 体。
[0044] 如本文所使用，术语〃或〃应了解为包含前后两者，除非具体注明或从语境显而易 见。
[0045] 如本文所使用，术语〃包括（comprises) 〃、〃包括（comprising) 〃、〃含有 (conaining)"、〃具有（having)"等可具有所述术语归于美国专利法所规定的含义，而 且可表示〃包含（includes) 〃〃包含（including) 〃等；〃基本上由…组成（consisting essentially of) 〃或〃基本上由…组成（consists essentially) 〃同样地具有归于美国专 利法所规定的含义，而且所述术语是开放式的，允许存在超过所述者，只要叙述的基本或新 颖特征未因超过叙述者而改变，但排除先前技术的具体实施例。
[0046] 术语"抗体"表示通过所具可变区内的至少一种抗原辨识位点辨识目标且与其特 异性地结合的免疫球蛋白分子，所述目标为蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质 或前述者的组合。如本文所使用，术语"抗体"涵盖完好的多克隆抗体、完好的单克隆抗体、 抗体片段（诸如，Fab、Fab'、F(ab'）2以及Fv片段）、单链Fv( SCFv)突变体、多特异性抗体 诸如从至少两种完好抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、包括抗体的抗原决定部分的 融合蛋白质、以及包括抗原辨识位点的任何其它改性的免疫球蛋白分子产生的双特异性抗 体，只要抗体展现期望的生物活性。抗体可为五种主要类别的免疫球蛋白分子：IgA、IgD、 IgE、IgG 以及 IgM，或其子类（同种型）（例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 以及 IgA2)中 的任何一种，其是基于分别称为α、Λ、ε、Y以及μ的免疫球蛋白分子的重链恒定结构 域的识别性。不同类别的免疫球蛋白分子具有不同且周知的亚单元结构和三维构形。抗体 可为无改性或与其它分子诸如毒素、放射性同位素等偶联。
[0047] 基本的四链抗体单元为由两个相同轻（L)链和两个相同重（Η)链所组成的异源四 聚体糖蛋白。IgM抗体是由5个基本的异源四聚体单元与称为J链的另外多肽所组成，而 且因此含有抗原结合位点，同时分泌的IgA抗体可聚合以形成包括2至5个基本的4链单 元与J链的多价集合。IgG的情况下，4链单元通常约150, 000道尔顿。取决于Η链的同种 型，各L链以一个共价双硫键链接Η链，同时两个Η链一个或多个双硫键彼此链接。各Η和 L链也具有规律分隔的链内双硫桥。各Η链在Ν端具有可变结构域（VH)，接着各α和Υ 链具有三个恒定结构域（CH)，以及μ和ε同种型具有四fCH结构域。各L链在Ν端具有 可变结构域（')，接着在其它端具有恒定结构域（Q)。八与￥ 11对齐，而且Q与重链（CH1) 的第一个恒定结构域对齐。据信，特别氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。 VH和' 的配对共同形成单一抗原结合位点。至于不同类别的抗体的结构和性质，参阅，例 如，Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P.Stites, Abba I.Terr and Tristram G. Parslow (eds.)，Appleton&Lange, Norwalk, Conn.，1994,第 71 页和第 6 章。
[0048] 〃单离的抗体〃为已与其自然环境的组分分离者及/或已自其自然环境的组分回 收者。其自然环境的污染物组分为会干扰抗体的诊断或治疗用途的物料，而且可包含酶、激 素以及其它蛋白质或非蛋白质溶质。于具体实施例中，抗体是纯化成：（1)以罗式法（Lowry method)所测定为80重量％、85重量％、90重量％、95重量％、99重量％或更高重量％的抗体； (2)通过使用旋转杯测序仪，而达成足以获得N端或内氨基酸序列的至少15个残基的程度； 或（3)使用考马斯亮蓝、银染等在还原或非还原的条件下用SDS-PAGE而得的均质性。单离 的抗体包含重组细胞内的原位抗体，因为抗体的自然环境的至少一种组分将不存在。于具 体实施例中，单离的抗体将以至少一个纯化步骤制备。
[0049] 术语〃抗体片段〃指完好抗体的一部分，而且指完好抗体的抗原决定可变区。抗 体片段的实例，包含，但非限于：Fab、Fab'、F(ab'）2以及Fv片段、线性抗体、单链抗体以及 形成自抗体片段的多特异性抗体。
[0050] 抗体的木瓜蛋白酶消化产生两种相同抗原结合片段，称为"Fab〃片段和残留〃Fe〃 片段，其是反映容易结晶的能力的指称。Fab片段是由整个L链与Η链（V H)的可变区结构 域和一个重链（CH1)的第一个恒定结构域所组成。各Fab片段的抗原结合方面是单价，即， Fab片段具有单抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单一大F (ab'）2片段，其大致对应 于具有二价抗原结合活性和仍能交联抗原的两种双硫化物链接的Fab片段。Fab'片段不 同于Fab片段，因为在CJ结构域的羧基端具有另外的几个残基，包含来自抗体铰链区的一 个或多个半胱氨酸。本文的Fab' -SH为其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离硫醇基的 Fab'的指称。？(&13'）2抗体片段原本产生为彼此之间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段对。亦 已知其它化学耦合的抗体片段。
[0051] "Fc"片段包括双硫化物维持的两个Η链的羧基端部分。Fc区亦为某些类型的细 胞上发现的Fc受体（FcR)辨识的部分，而且抗体的效应物功能是由所述Fc区中的序列测 定。
[0052] 〃Fv抗体〃是指含有完整抗原辨识和结合位点的最小抗体片段，其是其中一个重 链可变结构域和一个轻链可变结构域形成非共价二聚体的两个链，或其中一个重链可变结 构域和一个轻链可变结构域以柔性肽接头序列共价链接以便使两个链以相似的二聚体结 构相关联的单链（scFv或sFv)。于此构形中，各可变结构域的互补决定区（CDR)交互作用， 以定义Fv二聚体的抗原结合特异性。或者，单一可变结构域（或一半的Fv)可用以辨识和 结合抗原，虽然通常以较低的亲和力结合。
[0053] 术语〃双链抗体〃是指由以下述方法制备而成的小抗体片段：以VH和 '结构域之 间的短接头序列（约5个残基）构筑sFy片段（参阅前段），以致达成V结构域的链间（但 非链内）配对，造成二价片段，即，具有两种抗原结合位点的片段。双特异性双链抗体为两 个"交叠"sFy片段的异质二聚体，其中两个抗体的V H和 '结构域存在于不同多肽链上。双 链抗体更详述于，例如，￡卩404,097;冊93/11161;以及!1〇11;[1^616七31.，？1'0(3.似1:1.八0已(1· Sci. USA, 90 :6444-6448(1993)。
[0054] "单克隆抗体"指涉及高度特异性辨识和与单一抗原决定簇或表位的结合的同质 抗体群体。此单克隆抗体不同于典型包含不同抗体以针对对抗不同抗原决定簇的多克隆抗 体。术语〃单克隆抗体〃涵盖皆为完好和全长的单克隆抗体以及抗体片段（诸如Fab、Fab'、 F(ab'）2、Fv)、单链（scFv)突变体、包括抗体部分的融合蛋白质，以及包括抗原辨识位点的 任何其它改性免疫球蛋白分子。此外，〃单克隆抗体〃是指此以任何数量的方式制造的抗 体，所述方式包含，但非限于，杂交瘤、噬菌体选殖、重组表达以及转基因动物。
[0055] 术语"人源化抗体"是指含有最小非人类（例如，鼠类）序列的特异性免疫球 蛋白链、嵌合免疫球蛋白分子或其片段的非人类（例如，鼠类）抗体的形式。典型地，人 源化抗体为人类免疫球蛋白分子，所述人类免疫球蛋白分子中来自互补决定区（CDR)的 残基被来自非人类物种（例如，小鼠、大鼠、兔子、仓鼠等）的具有期望的特异性、亲和力、 以及能力的 CDR 的残基置换（Jones et al.，I986, Nature, 321 :522-525 ;Riechmann et al.，1988, Nature, 332 :323-327 ;Verhoeyen et al.，1988, Science, 239 :1534-1536)。于某 些情况下，人类免疫球蛋白的Fv骨架区（FR)残基以来自非人类物种的抗体中的具有期望 的特异性、亲和力以及能力的对应的残基置换。人源化抗体可进一步通过以下方式改性：取 代Fv骨架区中及/或被置换的非人类残基内的另外的残基，以细化和最优化抗体特异性、 亲和力及/或能力。通常，人源化抗体将包括实质上全部含有对应于非人类免疫球蛋白的 所有或实质上全部的CDR区的至少一种以及典型两种或三种的可变结构域，反观所有或实 质上全部的FR区为那些人类免疫球蛋白共有序列所具者。人源化抗体亦可包括至少一部 分的免疫球蛋白恒定区或结构域（Fc)，其典型为人类免疫球蛋白所具者。用以产生人源化 抗体的方法实例描述于US5, 225, 539。
[0056] 术语〃人类抗体〃表示由人类产生的抗体或使用本领域中已知的任何技术制造的 具有对应于人类产生的抗体的氨基酸序列的抗体。此人类抗体的定义包含完好或全长的抗 体、其片段、及/或包括至少一个人类重链及/或轻链多肽的抗体，诸如，例如，包括鼠类轻 链和人类重链多肽的抗体。
[0057]"杂交抗体"为其中来自具有不同抗原决定簇区的重链和轻链对共同组合以便使 两种不同表位或两种不同抗原可被辨识和与所产生的四聚体结合的免疫球蛋白分子。
[0058] 术语"嵌合抗体"是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自两种或更多种物种 的抗体。典型地，轻链和重链两者的可变区对应于源自哺乳动物（例如，小鼠、大鼠、兔子 等）中的一种物种的抗体的具有期望的特异性、亲和力以及能力的可变区，同时恒定区与 源自另一种物种（通常为人类）的抗体的序列同源，以避免在所述物种中引发免疫反应。
[0059] 抗体的"可变区"是指单独的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区，或其组合。 重链和轻链的可变区各由以三个互补决定区（CDR)(亦已知为高度可变区）连接的四个骨 架区（FR)所组成。各链中的CDR是由FR维持紧密靠近，而且与来自另一个链的CDR贡献 于抗体的抗原结合位点的形成。有至少两种测定CDR的技术：（1)基于跨物种序列变异性 的方法（参阅 Kabat et al. , Sequences of Poteins of Immunological Interest (5th ed.，1991，美国国家卫生院，Bethesda Md.));以及（2)基于抗原抗体复合物的结晶研究的 方法（参阅 Al-lazikani et al.J.Molec. Biol. 273 :927-948 (1997))。此外，本领域中有 时使用此两种方法的组合以测定CDR。
[0060] 本文定义"给药"为以造成剂在受试者的身体内，从而将所述剂或含有所述剂的 组合物提供给所述受试者的方式。此给药可为任何路径，包含，但无限制于，口服、经皮（例 如，阴道、直肠、口腔粘膜），通过注射（例如，皮下、静脉内、肠道外、腹膜内、鞘内）、或通过 吸入（例如，经口或鼻）。医药制剂当然是由适合各给药路径的形式给定。
[0061] 所谓"剂"表示任何小分子化学化合物、抗体、核酸分子或多肽或其片段。
[0062] 所谓"类似物"表示非相同，但具有类似的功能或结构特征的分子。例如，流行性 感冒抗体的酰胺、酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、酰脲或磷酸酯类似物是具有以下特性的分子：1) 不会破坏流行性感冒抗体的生物活性,而且赋予流行性感冒抗体有利的体内性质，诸如，吸 收、作用的持续时间或作用的开始；或2)本身为生物不起作用，但在体内转化成生物活性 化合物。类似物包含前药形式的流行性感冒抗体。此前药为当对生物系统给药时因自发性 化学反应、酶催化的化学反应及/或代谢化学反应的结果而产生流行性感冒抗体的任何化 合物。
[0063] 所谓"对照组〃是表示标准品或参考条件。
[0064] 术语〃衍生物〃是表示与给定剂（例如，流行性感冒抗体）有相等或接近相等的 生理功能性的医药活性化合物。如本文使用，术语〃衍生物〃包含任何医药可接受的盐、 醚、酯、前药、溶剂合物、包含对映异构物、非对映异构物或立体异构地富集或外消旋混合物 的立体异构物以及给药接受者时能（直接或间接）提供化合物或抗病毒活性代谢物或其残 基的任何其它化合物。
[0065] 所谓"疾病〃是表示破坏或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何状态或病症。
[0066] 术语〃表位〃或〃抗原决定簇〃在本文中互相交替使用，而且意指能被特别抗体 辨识和特异性地结合的抗原的部分。当抗原为多肽时，表位皆可形成自通过蛋白质的三级 折叠而并排的邻接的氨基酸和非邻接的氨基酸。形成自邻接的氨基酸的表位通常在蛋白质 变性时保留，反观以三级折叠形成的表位通常在蛋白质变性时流失。表位典型包含至少3 个，更常为至少5或8个氨基酸形成独特空间构形。
[0067] 抗体之间的竞争是以其中测试的免疫球蛋白抑制参考抗体与一般抗原的特异性 结合的检测法测定。已知有许多类型的竞争结合检测法，例如：固相直接或间接放射性免疫 检测法（RIA)、固相直接或间接酶免疫检测法（EIA)、三明治竞争检测法（参阅Stahli et al.，Methods in Enzymology9 :242-253(1983));固相直接生物素-抗生物素蛋白 EIA(参 阅 Kirkland et al.，J. Immunol. 137 :3614-3619(1986));固相直接标不检测法、固相直接 标不的三明治检测法（参阅 Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual, "Cold Spring Harbor Press (1988));使用 1-125 标记的固相直接标记 RIA(参阅 Morel et al.，Molec. Immunol. 25(1) :7-(1988));固相直接生物素-抗生物素蛋白 EIA(Cheung et al·，Virologyl76 :546-552 (1990));以及直接标不的 RIA(Moldenhauer et al.，Scand. J. Immunol. 32 :77-82(1990))。典型地，此检测法涉及使用与固体表面或具有未标示的测 试免疫球蛋白或标示的参考免疫球蛋白的细胞结合的纯化抗原。竞争抑制是通过在测试的 免疫球蛋白的存在下，测定与固体表面或细胞结合的标记量而测量。通常，测试的免疫球蛋 白存在过量。通过竞争检测法（竞争抗体）辨识的抗体包含与参考抗体结合相同表位的抗 体和与足够接近结合所述表位的所述参考抗体的相邻的表位结合的抗体，进而造成位阻发 生。当竞争抗体存在过量时，将抑制参考抗体与一般抗原的特异性地结合至少25%、50、75% 或更1?。
[0068] 所谓"加强〃或〃增加〃表示相对于参考物，至少约10%、25%、50%、75%或100%的 正向变化。
[0069] 所谓"片段"是表示多肽或核酸分子的一部分。此部分含有参考核酸分子或多肽 的整个长度的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。丨个片段可含有10、20、 30、40、50、60、70、80、90 或 100、200、300、400、500、600、700、800、900 或 1000 个核苷酸或氨 基酸。
[0070] 〃杂交〃表示氢键结，其可为互补核碱基之间的瓦生-克里克（Watson-Crick)、胡 思町（Hoogsteen)或反向胡思町氢键结。例如，腺嘌呤和胞腺嘧啶是通过氢键的形成而配 对的互补核碱基。
[0071] 所谓"单离的多核苷酸〃是表示不含基因的核酸（例如，DNA)，所述核酸在其中衍 生本发明的核酸分子的生物体的天然存在基因组中在所述基因的侧翼。所述术语因此包 含，例如，并入载体的重组DNA ;并入自主地复制的质体或病毒；或并入原核生物或真核生 物的基因组DNA ;或存在为与无关其它序列无关的个别分子（例如，由PCR或限制性内切核 酸酶消化产生的cDNA或基因组或cDNA片段）。此外，所述术语包含自DNA分子转录的RNA 分子，以及为编码另外的多肽序列的杂交基因的一部分的重组DNA。
[0072] 所谓〃单离的多肽〃是表示已从自然伴随它的组分单离的本发明的多肽。典型地， 当多肽为至少60重量％时是单离的，而且不含与其自然相关的蛋白质和天然存在的有机分 子。于具体实施例中，制备至少75重量％，至少90重量％或至少99重量％的本发明的多 肽。本发明的单离的多肽可通过，例如，从天然来源萃取而获得，通过表达编码此多肽的重 组核酸；或通过化学地合成蛋白质。纯度可通过任何适当方法，例如，柱色谱法、聚丙烯酰胺 凝胶电泳、HPLC分析等测量。
[0073] 于两种或更多种核酸或多肽的语境中，术语〃同一性〃或〃同一性百分率〃是指 当比较和比对（若需要，引入空位）最大对应，但不考虑任何保守氨基酸取代为序列同一性 的一部分时，相同或具有特定百分率的相同核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个的序列或 子序列。同一性百分率可使用序列比较软件或算法测量或目测测量。本领域中已知有多种 算法和软件，而且其可用以获得氨基酸或核苷酸序列的比对。序列比对算法的一个非限制 性实例是描述于 Karlin et al.，Proc. Natl. Acad. Sci.，87 :2264-2268 (1990)，由 Karlin et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. ,90 :5873-5877(1993)所修改的算法，以及并入 NBLAST 和 XBLAST 程序（Altschul et al·，Nucleic Acids Res. ,25 :3389-3402 (1991))。于某些具 体实施例中，有空位的 BLAST 可如 Altschul et al·，Nucleic Res. 25 :3389-3402(1997) 中所述使用。BLAST-2、WU-BLAST-2 (Altschul et al·，Methods in Enzymology, 266 : 460-480(1996))、ALIGN、ALIGN_2(Genentech，South San Francisco, California)或 Megalign(DNASTAR)为可用以比对序列的可公开取得的另外的软件程序。于某些具体实施 例中，两个核苷酸序列之间的同一性百分率是使用GCG软件中的GAP程序测定（例如，使用 NWSgapdna. CMP matrix 和 40、50、60、70 或 90 的空位重量和 1、2、3、4、5 或 6 的长度重量）。 于某些具体实施例中，GCG套装软件中的GAP程序并入可用以测定两个氨基酸序列之间的 同一性百分率（例如，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵和16、14、12、10、8、6或4的空 位重量和 1、2、3、4、5 的长度重量）的 Needleman and Wunsch 的算法（J.Mol.Biol. (48): 444-453(1970))。于某些具体实施例中，核苷酸或氨基酸序列之间的同一'丨生百分率是使用 Myers and Miller(CABI0S，4 :11-17(1989))的算法测定。例如，同一性百分率可使用ALIGN 程序（2.0版）测定，并且使用具有残基表的PAM1，空位长度罚分为12和空位罚分为4。特 别比对软件的最大比对的适当参数可由本领域的技术人员测定。于某些具体实施例中，使 用比对软件的预设参数。于某些具体实施例中，第一氨基酸序列与第二序列氨基酸的同一 性百分率"X"是计算为lOOx (Y/Z)，其Y为氨基酸残基的数目（其计数为第一个和第二序列 的比对中的相同配对）（如通过目测或特别序列比对程序而比对），而且Z为第二序列中的 残基总数。若第一序列的长度比第二序列更长，则第一个序列与第二序列的同一性百分率 将比第二序列与第一个序列的同一性百分率更长。
[0074] 作为非限制性实例，任何特别多核苷酸是否与参考序列具有特定序列同一性百分 率（例如，至少80%同一性、至少85%同一性、至少90%同一性，以及于一些具体实施例中， 至少95%、96%、97%、98%或99%同一性）可于某些具体实施例中使用最佳适配（Bestfit)程 序（Wisconsin 序列分析套组，Version8for Unix, Genetics Computer Group, University ResearchPark，575Science Drive，Madison，WI53711)测定。最佳适配使用 Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics2 :482489(1981)的局部同源性算法，得到两 种序列之间的同源性的最佳区段。当使用最佳适配或任何其它序列比对程序测定特别序列 是否为，例如，与根据本发明的参考序列为95%同一性时，参数设定成计算参考核苷酸序列 全长的同一性百分率，而且允许同源性的空位为高达参考序列的核苷酸总数的5%。
[0075] 于一些具体实施例中，当比较和比对最大对应时，如使用序列比较算法或目测测 量时，本发明的两个核酸或多肽为实质上相同，表示它们具有至少70%、至少75%、至少80%、 至少85%、至少90%，以及于一些具体实施例中，至少95%、96%、97%、98%、99%的核苷酸或氨基 酸残基同一性。同一性可存在于长度或其间的任何积分值为至少约5、至少约10、约20、约 40至60个残基的序列区，或超过60至80个残基，至少约90至100的残基的更长区，或与 比较的序列的全长相比实质同一性的序列。
[0076] "保守氨基酸取代"为其中一个氨基酸残基被具有相似的侧链的另一个氨基酸残 基置换者。具有相似的侧链的氨基酸残基家族已于本领域中定义，包含碱性侧链（例如， 赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、酸性侧链（例如，天冬氨酸、谷氨酸）、无电荷极性侧链（例如， 甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、非极性侧链（例如，丙 氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、β -支链侧链 (例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）以及芳族侧链（例如，酪氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、组 氨酸）。例如，以酪氨酸对苯基丙氨酸进行的取代为保守取代。优选地，本发明的多肽和抗 体序列上的保守取代不会废除含有氨基酸序列的多肽或抗体与抗原的结合。不会消除抗 原结合的辨识核苷酸和氨基酸保守取代的方法为本领域中周知者（参阅，例如，Brummell et al. , Biochem.32 ：1180-1187(1993) ；Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10)： 879-884(1999);以及 Burks et al.Proc. Natl. Acad. Sci.USA94 :.412-417 (1997))。
[0077] 〃医药可接受〃是指美国联邦或州政府的监管机关已核准或可核准者，或列于美 国药典者，或以于动物（包含，人类）的其它通常认可的药典。
[0078] 〃医药可接受的赋形剂、载体或稀释剂〃是指可与剂共同给药受试者的赋形剂、载 体或稀释剂，所述赋形剂、载体或稀释剂不会破坏剂的药理活性，而且当以足以递送治疗量 的剂给予剂量时是无毒的。
[0079] 本文所述流行性感冒抗体的〃医药可接受的盐〃为本领域中通常被认为适合接 触人类或动物的组织，但无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症的酸或碱盐。此 盐包含碱性残基的无机和有机酸盐诸如胺类，以及酸性残基的碱或有机盐的诸如羧酸。具 体医药盐包含，但非限于，下述酸的盐类，诸如盐酸、磷酸、氢溴酸、苹果酸、乙醇酸、反丁烯 二酸、硫酸、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、甲酸、甲苯磺酸、甲磺酸、苯磺酸、乙二磺酸、2_羟基 乙磺酸、硝酸、苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、硬脂酸、水杨酸、谷氨酸、 抗坏血酸、扑酸、琥珀酸、反丁烯二酸、顺丁烯二酸、丙酸、羟基顺丁烯二酸、氢碘酸、苯基乙 酸、烷酸诸如乙酸，HOOC-(CH2)n-COOH，其中η是0至4等。同样地，医药可接受的阳离子包 含，但非限于，钠、钾、钙、铝、锂以及铵。具有本领域一般知识者将辨识进一步用于本文提供 的抗体的医药可接受的盐，包含 Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed.，Mack Publishing Company, Easton, PA, p. 1418(1985)中所列者。通常，医药可接受的酸或碱盐可 通过任何传统化学方法从含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。简要地，此盐可通过使 此等化合物的游离酸或碱形式与化学计量含量的适当碱或酸在适当溶剂中反应而制备。
[0080] 术语〃病人〃或〃受试者〃是指治疗、观察或实验的目标动物。通过例举的方式 可知，受试者仅包含，但非限于，哺乳动物，包含，但非限于，人类或非人类哺乳动物，诸如非 人类灵长类、牛、马、犬、羊或猫。
[0081] 如本文所使用，术语〃预防（prevent) 〃、〃预防（preventing) 〃、〃预防 (prevention) 〃或〃预防性（prophylactic)治疗〃等是指减少在不会具有疾病或适应症但 有易于发展疾病或适应症的风险的受试者中发展疾病或适应症的概率。
[0082] 所谓"减少〃是表示相对于参考物，至少约10%、25%、50%、75%或100%地负向变化。
[0083] 所谓"参考〃是表示标准品或对照状态。
[0084] 所谓"特异性地结合〃是表示识别和结合本发明的多肽，但不会实质上辨识和结合 样本（例如，生物样本）中的其它分子（其自然包含本发明的多肽）的化合物或抗体，。 [0085] 抗体与表位或蛋白质〃特异性地结合"，表示抗体较另外物质（包含不相关的蛋 白质）更频繁、更快速、以更大持续时间、以更大亲和力或一些以上者的组合，而与表位或 蛋白质反应或相关联。于某些具体实施例中，"特异性地结合"表示，例如，抗体以约〇. ImM 更少的KD与蛋白质结合，但在其它时后更常少以约1 μ Μ的KD与蛋白质结合。于某些具体 实施例中，〃特异性地结合〃表示抗体有时以至少约〇. 1 μ Μ更少的KD与蛋白质结合，而在 其它时间以至少约〇. 01 μ Μ或更少的KD与蛋白质结合。因为不同物种中的同源蛋白质之 间的序列同一性，特异性地结合可在超过一种物种中包含识别特别蛋白质的抗体。应理解 与第一个目标特异性地结合的抗体或结合部分可或可不与第二目标特异性地结合。因此，" 特异性地结合〃不会一定需要（虽然其可包含）排除性结合，即，与单一目标结合。一般， 但非必需，关于结合是意指特异性地结合。
[0086] 如本文所使用，〃实质上纯〃是指物料为至少50%纯（S卩，不含污染物），更优选为 至少90%纯，更优选为至少95%纯，更优选为至少98%纯，更优选为至少99%纯。
[0087] 如本文所使用，术语〃治疗（treat) 〃、治疗（treating) 〃、〃治疗（treatment) 〃等 是指减少或改善与其相关联的病症及/或症状。所谓"改善"，是表示减少、阻抑、衰减、递 减、阻止、或稳定疾病的发展或进展。应理解，虽然非排除，但治疗病症或适应症不会需要将 与其相关联的病症、适应症或症状完全消除。
[0088] 术语〃治疗功效〃是指一定程度上缓解病症的一个或多个症状或其相关病理。所 述术语是指治疗处理和预防或预防措施两者，其中目的为预防针对的病理状态或病症或使 其变慢（减少）。需要治疗者包含已具有病症者以及易于具有病症者或那些待预防病症者。 若根据本发明的方法接受治疗量的抗体之后，对于下列情况的一个或多个，病人显示可观 察的及/或可测量的减少或没有，则受试者或哺乳动物的感染被成功地"治疗"：减少感染 细胞的数目或没有感染细胞；减少感染总细胞的百分率；缓解一个或多个与特异性感染相 关的症状（例如，与流行性感冒感染相关的症状）至一定程度；减少发病率和死亡率，以及 的改善生活质量问题。可容易地以医师熟悉的常规步骤测量用于评估成功的疾病治疗和改 善的以上参数。
[0089] 〃治疗有效量〃意欲定性需要达成治疗功效的含量。本领域中具有通常知识的医 师或兽医可容易测定和规定需要的医药组合物的〃治疗有效量〃（例如，ed 5(i)。例如，医师 或兽医会在医药组合物中以低于达成期望的治疗功效所需的剂量采用本发明的化合物而 开始，然后缓慢地增加剂量直到达成期望的功效。
[0090] 短语〃组合治疗〃采用流行性感冒抗体和第二治疗剂的给药，以作为意欲由此等 治疗剂的共同作用提供有益功效的特定治疗养生法的一部分。组合的有益功效包含，但非 限于，由组合的治疗剂所造成的药物动力或药效共同作用。此等治疗剂的组合给药典型是 于定义时期（取决于选择的组合，通常为分钟、小时、天或周）进行。〃组合治疗〃通常非 意欲涵盖两种或更多种此等治疗剂的给药作为顺便地和任意地造成本发明的组合物的个 别单一治疗养生法的一部分。〃组合治疗〃意欲以依序的给药方式采用此等治疗剂，其中 各治疗剂是于不同时间给药，以及此等治疗剂或至少两种的治疗剂是以实质上同时方式给 药。实质上同时给药可通过例如对受试者给药具有固定比率的各治疗剂的单一胶囊，或各 治疗剂的多个单一胶囊而实现。例如，本发明的一种组合在相同或不同时间包括流行性感 冒抗体和至少一种另外的治疗剂（例如，抗病毒剂，包含抗流行性感冒剂），或其可调配成 单一共同调配的包括两种化合物的医药组合物。作为另一个实例，本发明的组合（例如，流 行性感冒抗体和至少一种另外的治疗剂，诸如抗病毒剂）调配成可在相同或不同时间给药 的个别医药组合物。各治疗剂的依序或实质上同时给药可以任何适当路径包含，但非限于， 口路径、静脉内路径、肌内路径以及直接吸收通过粘膜组织（例如，鼻、口、阴道以及直肠） 而起效。治疗剂可通过相同路径或不同路径给药。例如，特别组合的一个组分可通过静脉 内注射而给药，同时组合的其它组分可口服给药。组分可以任何治疗有效的序列给药。
[0091] 短语〃组合〃采用有用为组合物治疗的一部分的化合物或非药物治疗的群组。
[0092] 术语〃载体〃表示能在宿主细胞中递送和表达感兴趣的一个或多个基因或序列的 构筑物。载体的实例包含，但非限于，病毒载体、无改性的DNA或RNA表达载体、质体、粘粒 或噬菌体载体、与阳离子性缩合剂相关的DNA或RNA表达载体、包囊于脂质体的DNA或RNA 表达载体以及某些真核细胞诸如生产细胞。
[0093] 除非具体注明或从语境显而易见，如本文所使用，术语〃约〃应理解为本领域中的 正常公差范围内，例如均值的2标准差内。可理解为注明值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、 2%、1%、0. 5%、0. 1%、0. 05%或0. 01%内。除非从语境指出清楚，本文提供的所有数值是以术语 "约〃修改。
[0094] 本文提供的范围应理解为范围内的所有值的略写。例如，1至50的范围应理解为 包含由 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 或 50 所组 成组的任何数字、数字的组合、或子范围。
[0095] 本文的变量的任何定义中化学基团列表的叙述包含所述变量为任何单一基团或 所列基团的组合的定义。本文变量或方面的具体实施例的叙述包含以任何单一具体实施例 或与任何其它具体实施例或其部分组合的方式的具体实施例。
[0096] 本文提供的任何组合物或方法提供可为与本文提供的一个或多个的任何其它组 合物和方法合并。

【专利附图】

【附图说明】
[0097] 图1. (A)克隆860的推测谱系。左图：从供体单离的三个抗体的未突变的一般原 始种型（UCA)(以其数字显示，右图）。（B)谱系中的重链（顶图）和轻链（底图）的序列 比对。（C)来自CH65的与HAL接触的Fab。重链为深蓝色；轻链为浅蓝色；(B)中标示⑶R 为有颜色者；HA为红色，而原子表面显示为部分透明覆盖。从UCA突变的残基为绿色棒状 物表示。
[0098] 图2. (A)具有结合的CH65Fab的HA三聚体。一个HA链为红色（HA1)和绿色（HA2); 其它两个链为灰色；聚糖为黄色。结合有颜色的HA链的Fab为深蓝色（重链）和浅蓝色 (轻链），而接触的CDR为图1B标示为有颜色者。（B)Fv区及其与HAI接触的放大图。颜色 与图1相同。注意重链⑶R3(洋红色）伸入HAI上的受体结合袋状结构，同时剩余的⑶R 具有更受限制的表面接触。（C)和（D)为FabCH65和HAI之间的接触的表面表示图，如箭头 所示处打开。一个HA亚单元上的唾液酸袋状结构为深红色；剩余的亚单元为暗红色；剩余 的两种亚单元为灰色；聚糖为黄色。
[0099] 图3. CH65 (A)和α -2, 6-唾液基乳糖⑶的交互作用的比较。
[0100] 图4. CH65-CH67谱系成员与Η1和Η3流行性感冒病毒株的反应性的酶链接免疫吸 附检测法（ELISA)。293Τ细胞以来自病毒株Χ31(Η3)的全长度ΗΑ转染（顶格，Α至C)或 以来自A/Solomon Islands/3/2006[Hl]的表达在细胞表面的球状头转染（底格，E至G)。 将细胞以甲醛固定，并且以CH65Fab(b和f)或CH66全长抗体（C和G)针探（probed)，接着 以对人类Fab有特异性的FITC-偶联的第二抗体特异性针探。细胞以FITC发射（532nm) 成像。至于对照组，转染细胞仅以第二抗体针探（A和E)。
[0101] 图5. CH65的VDJ重组位点的序列。基码（key)表示重链编码区段（V、D、J以及 η-核苷酸）的原点。
[0102] 图6. CH65-CH67HA抗体的重链DNA序列。
[0103] 图7. CH65-CH67HA抗体的轻链DNA序列。
[0104] 图8. CH65-CH67HA抗体的重链氨基酸序列。
[0105] 图9. CH65-CH67HA抗体的轻链氨基酸序列。
[0106] 图 10. CL860UCA、CH65、CH66 以及 CH67 的 VH DNA 序列的比对。
[0107] 图 1L CL860UCA、CH65、CH66 以及 CH67 的 VL DNA 序列的比对。
[0108] 图12. CL860UCA、CH65、CH66以及CH67的VH氨基酸序列的比对。
[0109] 图13. CL860UCA、CH65、CH66以及CH67的VL氨基酸序列的比对。
[0110] 图14.来自H1(A)、H2(B)、H3(C)以及Η5Φ)血凝素的代表性受体结合结构域。 CH65-CH67抗体结合表位是加底线。
[0111] 图15.来自HI、H2、H3以及H5血凝素的代表性受体结合结构域的序列比对。与 CH65-CH67抗体交互作用的氨基酸残基是加底线。

【具体实施方式】
[0112] 本发明的特征为广泛中和流行性感冒抗原变异体的新颖抗体。本发明亦提供含有 新颖抗体的组合物和试剂盒、以及使用此等新颖治疗分子治疗或预防（例如，疫苗接种）流 行性感冒感染的方法。
[0113] 受体流行性感冒病毒的受体为唾液酸，由α-2,3或α-2, 6端链接附接至糖蛋白 质或糖脂质上的聚糖（Wiley, D. C. and Skehel, J. J. Annu. Rev. Biochem. 56 :365-394 (1987) 中评论）。大部分的中和抗体阻挡细胞附接，因为其足迹与受体结合位点重叠或因为当 在HA表面上的别处结合时发挥立体干扰（Knossow，M.and Skehel，J.J.Immunologyll9: 1-7(2006))。已测定Fab :HA复合物的结构的两种小鼠单克隆中和抗体具有伸入HA上的唾 液酸结合袋状结构的环，而且在唾液酸羧酸酯大致所在处呈现天冬氨酸侧链（Fleur y，D. et al.，Nat. Struct. Biol. 5 :119-123(1998);以及 Barbey-Martin，C· et al.，Virology294 : 70-74(2002))。但此等抗体皆亦与其中逃逸突变会较受体位点更容易发生的其它表面区有 广泛接触，。
[0114] 本发明至少部分基于在受体袋状物中发现具有主要接触的新颖抗体。一种此抗体 被指定为CH65,而且其发现是通过从已接受2007三价疫苗的受试者获得的分选的单一浆 细胞单离重排的重键和轻链基因。CH65中和非常广泛范围的跨越超过三十年H1季节性单 离物。其19个残基重链互补性测定区3 (⑶R-H3)插置入受体袋状结构，仿真以唾液酸进 行的许多交互作用。重链和轻链CDR两者参与和HA1的朝外表面的更为限制的另外接触。 CH65的推测且未突变的原始种型与成熟亲和力的抗体在重链可变结构域中的12个位置和 在轻链可变结构域中的6个位置有所不同。因此，人类B-细胞库（repertiore)包含产生 主要针对受体结合位点的抗体的可能性。大量季节性H1病毒是由抗体CH65中和，暗示此 反应平常太少见以致无法选择抗性，或抗性造成不适合的代价太高（其为若潜在的逃逸突 变损害受体结合会发生的情况）。因此，令人惊奇的是，
【发明者】已发现广泛中和流行性感冒 病毒的可通过仿真那些受体所具者的接触的抗体而达成。从而，本发明提供模拟流行性感 冒HA和唾液酸受体之间的接触的新颖抗体。此等新颖抗体可有效地治疗及/或预防流行 性感冒感染的漂移株。因此，本发明的特征为含有新颖抗体的组合物和试剂盒、以及使用此 等治疗分子治疗及/或预防流行性感冒感染的方法。本发明亦有关包含新颖抗体的组合物 治疗。
[0115] CH65-CH67血凝素抗体
[0116] 本发明提供与流行性感冒血凝素（HA)的表位特异性地结合的新颖抗流行性感冒 抗体。抗体与HA的结合减少或抑制流行性感冒血凝素与唾液酸的结合。
[0117] 于具体实施例中，流行性感冒HA的表位包括唾液酸结合结构域。
[0118] 于具体实施例中，HA为H1HA、H2HA、H3HA或H5HA(来自适应人类的H5病毒株的 HA)。
[0119] 于相关具体实施例中，流行性感冒HA表位包括对应于来自A/Solomon Islands/3/2006 的 CDR HI 残基 158 ;CDR H2 残基 158 至 160 ;CDR H3 残基 135 至 136、190 至195以及226 ;⑶R L1残基222、225以及227 ;以及⑶R L3残基187和189的氨基酸。
[0120] 于相关具体实施例中，流行性感冒HA表位包括SEQ ID N0 :17至44中任一者所表 示的氨基酸。
[0121] 于相关具体实施例中，流行性感冒HA表位包括SEQ ID N0 :17至44中任一者中的 CH65-CH67结合残基（例如，图15中辨识的CH65-CH67结合残基）。
[0122] 于具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段包括可变重（VH)链，其中VH链包 括 SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:11 或 SEQ ID N0:12 中所表示的氨基酸序列。
[0123] 于具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段包括一个或多个存在于SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :11或SEQ ID NO :12的可变重（VH)链氨基酸序列中的重 链⑶R区。于相关具体实施例中，一个或多个重链⑶R区包括存在于SEQ ID NO :9、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO :11或SEQ ID NO :12的可变重（VH)链氨基酸序列中的CDR3区。
[0124] 于具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段包括可变轻（VJ链，其中 '链包 括 SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15 或 SEQ ID N0:16 所表示的氨基酸序列。
[0125] 于具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段包括一个或多个包括存在于SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15 或 SEQ ID NO :16 的可变轻（VJ 链氨基酸序列中 的轻链⑶R区。于相关具体实施例中，一个或多个轻链⑶R区包括存在于SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO : 14、SEQ ID NO :15或SEQ ID NO :16的可变重（VJ链氨基酸序列中的CDR3区 的。
[0126] 于具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段包括i)包括SEQ ID N0 :10所表 示的氨基酸序列的可变重（VH)链氨基，以及ii)包括SEQ ID N0 :14所表示的氨基酸序列 的可变轻（')链。
[0127] 于具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段包括可变重（VH)链，其中V H链的 CDR3 区包括 Argl04、Serl05、Vall06、Aspl07、Tyrl09、Tyrll0、Tyrll2 或其组合。
[0128] 于具体实施例中，抗流行性感冒抗体为其单克隆抗体或抗体片段。
[0129] 于具体实施例中，抗流行性感冒抗体为人源化抗体。
[0130] 于具体实施例中，抗体片段为Fab片段、Fab'片段、Fd片段、Fd'片段、Fv片段、dAb 片段、F(ab'）2片段、单链片段、双链抗体或线性抗体。
[0131] 于具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段进一步包括与抗流行性感冒抗体 或其抗体片段偶联的剂。于相关具体实施例中，与抗体或其抗体片段偶联的剂为治疗剂或 可检测的标记。
[0132] 治疗剂可为适合与新颖抗体共享的任何治疗剂。此剂为本领域中周知者，而且包 含小分子、纳米粒子、多肽、放射性同位素、抑制性核酸等。于具体实施例中，治疗剂为抗病 毒剂或毒素。于具体实施例中，治疗剂为减少流行性感冒病毒产生的siRNA、shRNA或反义 核酸分子。
[0133] 可检测的标记可为适合与新颖抗体共享的任何可检测的标记。此标记为本领域周 知者，而且包含可以光谱、光化学、生化、免疫化学、物理或化学方式检测的标记。于具体实 施例中，可检测的标记为已制成可检测的酶、荧光分子、颗粒标记、电子致密试剂、放射性标 记、微泡、生物素、地高辛或半抗原或蛋白质。
[0134] 于任何以上具体实施例中，流行性感冒可为H1N1、H2N2、H3N2或适应人类的H5病 毒株。
[0135] 本发明的抗体可通过任何本领域中已知的传统工具制备。例如，多克隆抗体可通 过以多重皮下或腹膜内注射视需要地偶联适合半抗原（例如，钥孔血蓝蛋白（KLH)、血清白 蛋白等）的相关抗原（例如，纯化肽片段、全长重组蛋白质、融合蛋白质等），而免疫接种动 物（例如，兔子、大鼠、小鼠、驴、山羊、仓鼠、豚鼠、绵羊、有蹄类动物、牛、骆骑、禽、鸡等）而 制备。抗原可以任何适合载液（例如，无菌食盐水）稀释，并且与佐剂（例如，完整或不完 整的弗氏佐剂（Freund' sAdjuvant))合并以形成乳剂。接着，自因此免疫接种的动物的血 液、腹水等回收多克隆抗体。使采集的血液凝固，并且将血清倒出，通过离心而变清澈，以及 检测抗体的效价。多克隆抗体可根据本领域中的标准方法，包含亲和力色谱法、离子交换色 谱法、凝胶电泳、透析等，从血清或腹水纯化。
[0136] 单克隆抗体可使用杂交瘤方法如 Kohler and Milstein, Nature256 :495 (1975) 中描述的那些方法制备。使用杂交瘤方法，将适当宿主动物如上述免疫接种，以引发淋巴 细胞产生将与免疫接种抗原特异性地结合的抗体的。淋巴细胞亦可体外免疫接种。免疫 接种以后，将淋巴细胞单离，并且使用例如聚乙二醇与适合的骨髓瘤细胞系融合，以形成可 接着从未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞单离的杂交瘤细胞。免疫沉淀、免疫印迹法或体外 结合检测法（例如，放射性免疫检测法（RIA)、酶链接免疫吸附检测法（ELISA)等）测定 的产生特异性地针对所选的抗原的单克隆抗体的杂交瘤可接着使用标准方法而以体外培 养物传播（参阅 Goding，Monoclonal Antibodies ：Principles and Practice, Academic Press, 1986)或以在动物中的腹水肿瘤方式而体内传播。如以上所述关于多克隆抗体者，单 克隆抗体可接着从培养基或腹水液体纯化。
[0137] 或者，单克隆抗体亦可使用美国专利US4, 816, 567中所述重组DNA方法进行。编 码单克隆抗体的多核苷酸是通过诸如使用具体扩增编码抗体的重链和轻链的基因的寡 核苷酸引物的RT-PCR，而从成熟B-细胞或杂交瘤细胞单离，而且其序列是使用传统程序 测定。接着，编码重链和轻链的单离的多核苷酸（包含本文所述单离的多核苷酸）克隆 化入适合的表达载体，当所述表达载体转染入宿主细胞诸如大肠杆菌（E.coli)细胞、猴 C0S细胞、中国仓鼠卵巢（CH0)细胞或不会产生免疫球蛋白蛋白质的骨髓瘤细胞时，所述 宿主细胞产生单克隆抗体。另，如所述，期望的物种的重组单克隆抗体或其片段可从表达 期望的物种的⑶R的噬菌体展示库单离（参阅McCafferty et al.，1990, Nature, 348 : 552-554 ;Clackson et al·，1991，Nature, 352 :624-628 ;以及 Marks et al·，1991，J. Mol. Biol. , 222 :581-597)〇
[0138] 编码单克隆抗体的多核苷酸可进一步以一些使用重组DNA技术的不同方式改性 以产生另外的抗体。于一些具体实施例中，例如，小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定结构 域可以下列者取代：1)例如，人类抗体的那些区以产生嵌合抗体，或2)非免疫球蛋白多肽 以产生融合抗体。于一些具体实施例中，将恒定区截短或移除，以产生单克隆抗体的期望的 抗体片段。可变区的位点引导或高密度突变可用以最优化单克隆抗体的特异性、亲和力等。
[0139] 于本发明的一些具体实施例中，单克隆抗体为人源化抗体。人源化抗体为含有来 自非人类（例如，啮齿动物）抗体的最小序列，所述非人类抗体在包括各抗体链内有三个互 补决定区（CDR)的抗原决定或高度可变区内。治疗地使用此抗体以减少当给药人类受试者 时的抗原性和HAMA (人类抗小鼠抗体）反应。实务上，人源化抗体为典型具有最小至实际 上无非人类序列的人类抗体。人类抗体为人类产生的抗体或具有对应于人类所产生的抗体 的氨基酸的抗体。
[0140] 人源化抗体可使用多种本领域中已知的技术产生。抗体可通过以那些具有期望的 特异性、亲和力以及能力的非人类抗体（例如，小鼠、大鼠、兔子、仓鼠等）的CDR取代人类 抗体的 CDR而人源化（参阅，例如，Jones et al.，Nature321 :522-5(1986) ;Riechmann et al.，Nature332 :323-327 (1988);以及 Verhoeyen et al.，Science239 :1534-1536 (1988) 的方法。人源化抗体可通过可变人类骨架区中及/或置换的非人类残基内的另外的残基的 取代而进一步改性，以细化和最优化抗体特异性、亲和力及/或能力。
[0141] 选择用于制造人源化抗体的人类重链及/或轻链可变结构域对于减少抗原性而 言可为重要的。根据〃最佳适配〃方法，针对已知人类可变结构域氨基酸序列的整个库 筛选非人类抗体的可变结构域的序列。因此，于某些具体实施例中，与从其中取CDR的非 人类抗体的氨基酸序列最同源的人类氨基酸序列是用作人源化抗体的人类骨架区（FR) (参阅 Sims et al.，J. Immunol. 151 :2296 (1993) ;Chothia et al.，J. Mol. Biol. 196: 901 (1987))。另一个方法使用衍生自特别轻链或重链子群的所有人类抗体的共有序列的特 别FR，而且可使用于许多不同的人源化抗体（参阅Carter et al.，PNAS89;4285(1992); Presta et al.，J. Immunol. 151 :2623(1993))。于具体实施例中，使用一组方法以挑出用于 产生人源化抗体的人类可变FR。
[0142] 应进一步理解待人源化的抗体必须保留与抗原的高亲和力以及其它有利的生物 性质。为了达成此目标，人源化抗体可通过分析来自待人源化的非人类抗体的亲本序列和 的多个候选人源化序列的过程而制备。那些本领域技术人员可用和熟悉三维免疫球蛋白模 型。计算机程序可用以说明和展示选择的候选抗体序列的可能三维构形结构。使用此等模 型允许对残基在待人源化的抗体的功能中的可能角色进行分析，即，分析影响候选抗体与 其抗原结合的能力的残基。以此方式，可从亲本抗体选择FR残基，并将其与接受者人源化 抗体合并以便达成期望的抗体特征。通常，人源化抗体中的亲本抗体（例如，具有期望的抗 原结合性质的非人类抗体）保留抗原决定区（或高度可变区）的CDR中的残基，以进行抗 原结合。于某些具体实施例中，人源化抗体中的亲本抗体保留可变FR内的至少一个另外的 残基。于某些具体实施例中，人源化抗体中的亲本抗体保留可变FR内的最多六个另外的残 基。
[0143] 来自免疫球蛋白分子的成熟重链和轻链的可变区的氨基酸分别指定为Hx和 Lx,其中X为根据美国卫生部门和人类服务（U.S.Department of Health and Human Services)，1987, 1991，免疫学感兴趣的蛋白质序列（Sequences of Proteins of Immunological Interest)Kabat的方案所指定的氨基酸位置数目。Kabat针对各子群列出 抗体的许多氨基酸序列，并且针对所述子群中各残基位置列出最常出现的氨基酸以产生共 有序列。Kabat使用一种对列表序列中的各氨基酸分配残基数的方法，而且此分配残基数的 方法已成为本领域中的标准。Kabat的方案扩展至不包含于他的概要中的其它抗体，通过以 参考保守氨基酸的方式而比对有疑问的抗体与Kabat中的共有序列之一。Kabat编号系统 的使用容易辨识在不同抗体中的相等位置的氨基酸。例如，在人类抗体的L50位置的氨基 酸占据小鼠抗体的L50氨基酸位置的相等位置。再者，通过使用Kabat编号系统以便将一 个抗体序列中的各氨基酸与具有相同Kabat数字的其它序列中的氨基酸对齐，而使任何两 种抗体序列可独特地对齐，例如，以测定同一性百分率。比对之后，若受试者抗体区（例如， 重链或轻链的整个成熟可变区）与参考抗体的相同区比较，则受试者和参考抗体区之间的 序列同一性百分率为受试者和参考抗体区两者中相同氨基酸占据的位置数除以两区的总 比对位置数（不算空位），并且乘以100以换算成百分率。
[0144] 除了人源化抗体之外，完整人类抗体可直接使用本领域中的已知多种技术制备。 可产生体外免疫接种的永生化人类B淋巴细胞或从针对目标抗原产生抗体的免疫接种的 个体单离的永生化人类B淋巴细胞（参阅，例如，Cole et al·，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) ；Boemer et al. , J. Immunol. 147 ： 86-95(1991);以及美国专利US5, 750, 373)。另，人类抗体可为选自噬菌体库，其中所述噬 菌体库表达人类抗体（参阅 Vaughan et al.，Nat.Biotech. 14 :309-314(1996) ;Sheets et al. , Proc. Nat'1. Acad. Sci. 95 :6157-6162 (1998) ；Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227 :381 (1991);以及 Marks et al.，J. Mol. Biol. 222 :581 (1991))。人类抗体亦可 在含有人类免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制造，所述基因座能在免疫接种时于缺乏 内源免疫球蛋白产生下产生完整库的人类抗体。此方法描述于美国专利第5, 545, 807 ; 5, 545, 806 ;5, 569, 825 ;5, 625, 126 ;5, 633, 425 ;以及 5, 661，016 号。
[0145] 本发明亦涵盖双特异性抗体。双特异性抗体为能特异性地识别和结合至少两种不 同表位的抗体。不同表位可在相同分子内（例如，流行性感冒HA)或在不同分子上，致使双 特异性抗体可特异性地辨识和结合感兴趣的抗原中的表位（例如，流行性感冒HA)以及， 例如，另一种病毒蛋白质（例如，神经氨酸酶、M2等）。双特异性抗体可为完好抗体或抗体 片段。制造双特异性抗体的技术为本领域中常见者（参阅Millstein et al.，Nature305: 537-539(1983) ；Brennan et al.,Science229：81 (1985) ；Suresh et al, Methods in Enzymol. 121 ： 1 (1986) ；Traunecker et al. , ΕΜΒ0 J. 10 :3655-3659(1991) ；Shalaby et al. , J. Exp. Med. 175 :217-2 (1992) ；Kostelny etal. , J. Immunol. 148 ： 1547-1553 (1992)； Gruber et al.，J. Immunol. 152 :5368 (1994);以及美国专利第 5,731，168 号）。亦预期具 有超过两个配价的抗体。例如，可制备三特异性抗体（参阅Tutt et al.，J. Immunol. 147 : 60(1991))。
[0146] 于具体实施例中，本发明的抗体为抗体片段。已知有多种产生抗体片段的技术：传 统上，此等片段经由蛋白水解消化完好抗体而衍生（参阅，例如，Morimoto et al.，Journal of Biochemical and Biophysical Methods24 ： 107-117(1993)；以及 Brennan et al.，Science229:81(1985))。抗体片段亦可重组地产生。Fab、Fv以及scFv抗体片段皆可 于大肠杆菌或其它宿主细胞中表达或从其分泌，因此允许生产大量的此等片段。此抗体片 段亦可从上述的抗体噬菌体库分离。抗体片段亦可为，例如，美国专利第5, 641，870号中描 述的线性抗体，而且可为单特异性或双特异性。其它生产的抗体片段的技术将对本领域技 术人员而目是容易显而易见的。
[0147] 根据本发明，可修改技术以生产对本发明的多肽有特异性的单链抗体（参 阅美国专利第4,946,778号）。此外，可修改方法以构筑Fab表达库（参阅Huse et al·，Science246 :1275-1281 (1989))，以允许快速和有效辨识对流行性感冒HA有期望的特 异性的单克隆Fab片段。可通过本领域中的技术产生含有本发明的多肽的独特型的抗体片 段，所述抗体片段包含，但非限于：（a)通过胃蛋白酶消化抗体分子而产生的F(ab'）2片段； (b)通过还原F(ab'）2片段的双硫桥而产生的Fab片段；（c)通过以木瓜蛋白酶和还原剂处 理抗体分子而产生的Fab片段；以及（d)Fv片段。
[0148] 可进一步期望，尤其是在抗体片段的情况下，改性抗体以增加其血清半衰期。这可 通过，例如，将补救受体结合表位以使抗体片段中的适当区突变的方式并入抗体片段，或将 表位并入接着以端或中间点融合抗体片段（例如，通过DNA或肽合成）的肽标记而达成。
[0149] 异种偶联抗体亦落入本发明的范畴。异种偶联抗体是由两个共价连结抗体所组 成。已提议用此抗体以例如使免疫细胞以无用细胞为目标（美国专利第4, 676, 980号）。 预期抗体可使用已知的合成蛋白质化学的方法体外制备，包含那些涉及交联剂的方法。例 如，免疫毒素可使用双硫化物交换反应或通过形成硫醚键而构筑。用于此目的适合试剂的 实例包含亚氨基硫醇酯和甲基-4-巯基丁酰亚氨酸酯。
[0150] 本发明预期的另一个变化为重链和轻链两者中的可变结构域以一个或多个CDR 的至少部分置换而改变，而且若需要，通过部分骨架区置换和序列改变而改变。虽然CDR可 衍生自与从其中衍生骨架区的抗体属于相同类别或甚至子类的抗体，预知CDR将衍生自不 同类别的抗体和优选地衍生自不同物种的抗体。可能不需要以来自供体可变区的完整CDR 置换所有CDR以将一个可变结构域的抗原结合能力转移成另一者。而是，可能只需要将那 些需要维持抗原结合位点的活性的残基者转移。有鉴于美国专利第5, 585, 089、5, 693, 761 以及5, 693, 762号所载说明，进行常规实验或通过尝试错误试验而获得具有获得减少免疫 原性的功能抗体将在那些本领域技术人员的能力范围内。
[0151] 虽然可变区有变化，那些本领域技术人员将意识到本发明的改性抗体可包括抗体 或其免疫反应性片段，其中当与具有包括天然或未变化的恒定区的大约相同免疫原性的抗 体比较时，一个或多个恒定区结构域的至少小部分已缺失或变化以便提供期望的生化的特 征，诸如，增加肿瘤局部化或减少血清半衰期。于一些具体实施例中，改性抗体的恒定区将 包括人类恒定区。与本发明兼容的恒定区的改性包括一个或多个结构域中的一个或多个 氨基酸的添加、缺失或取代。亦即，本文揭露的改性抗体可包括三个重链恒定结构域（CH1、 CH2或CH3)及/或轻链恒定结构域（CL)的一者或多者的变化或改性。于本发明的一些具 体实施例中，预期其中一个或多个结构域部分地或全部地缺失的改性恒定区。于一些具体 实施例中，改性抗体将包括结构域缺失的构筑物或变异体，其中整个CH2结构域已被移除 (ACH2构筑物）。于一些具体实施例中，省略的恒定区结构域将以提供一些典型由缺乏恒 定区展现的分子柔度的短氨基酸间隔物（例如，10个残基）置换。
[0152] 本发明进一步采用实质上与本文表示的嵌合、人源化以及人类抗体或其抗体片段 实质上同源的变异体和相等者。这些可含有，例如，保守取代突变，亦即，以相似的氨基酸取 代一个或多个氨基酸。例如，保守取意指以相同一般类别内的其它者取代的氨基酸，诸如， 例如，一个酸性氨基酸以另一个酸性氨基酸取代，一个碱性氨基酸以另一个碱性氨基酸取 代，或一个中性氨基酸以另一个中性氨基酸取代。所谓保守氨基酸取代的含义为本领域中 周知者。
[0153] 可以本领域中已知的任何方法检测本发明的抗体的免疫特异性结合。可使用的 免疫检测法包含，但非限于，使用技术诸如BIAcore分析、FACS分析、免疫荧光、免疫细胞化 学、免疫印迹法、放射性免疫检测法、ELISA、〃三明治〃免疫检测法、免疫沉淀检测法、沉淀 素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散检测法、凝集检测法、补体固定检测法、免疫放射分 析检测法、荧光免疫检测法、蛋白质A免疫检测法等的竞争和非竞争检测法系统。此检测法 为常规而且为本领域中周知者（参阅，例如，Ausubel et al，eds, 1994, Current Protocols in MolecularBiology，Vol.l，John Wiley&Sons，Inc.，New York，其是以参考方式全部并入 本文）。
[0154] 于具体实施例中，针对流行性感冒HA的抗体的免疫特异性是使用ELISA测定。 ELISA检测法包括制备抗原，以抗原涂布微孔板的孔、在孔中添加与抗体偶联的可检测的 化合物诸如酶物质（例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶），培养一段时期以及检测抗原 的存在。于一些具体实施例中，抗体非与可检测化合物偶联，但而是在孔中添加识别针对 流行性感冒HA抗原的抗体的第二偶联抗体。于一些具体实施例中，不是以抗原涂布孔， 而是可涂布抗体，而且可在涂布的孔中添加抗原后，添加与可检测的化合物偶联的第二 抗体。本领域中技术人员会了解可修改参数以增加侦测的信号以及其它本领域中已知 的 ELISA 变化（参阅例如，Ausubel et al，eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1，John Wiley&Sons, Inc.，New York atll. 2. 1) 〇
[0155] 抗体与流行性感冒HA的结合亲和力和抗体-抗原交互作用的解离速率可通过竞 争结合检测法测定。竞争结合检测法的一个实例为放射性免疫检测法，其包括在增加量的 未标示的抗原的存在下，培养标示的抗原（例如， 3H或1251)或其片段或变异体与感兴趣的 抗体，接着侦测与标示的抗原结合的抗体。抗体与抗原的亲和力和结合解离速率可从斯卡 查德（scatchard)图分析的数据测定。于一些具体实施例中，BIAcore动力分析是用以测 定抗体与癌症干细胞标记物的结合和解离速率。BIAcore动力分析包括分析抗体与在其表 面上有固相化癌症干细胞标记物抗原的芯片的结合与分尚。
[0156] 流行性感冒血凝素抗体多肽和多核苷酸
[0157] 本发明亦涵盖单离的多核苷酸，其编码包括流行性感冒血凝素（HA)抗体或其片 段的多肽。
[0158] 术语〃编码多肽的多核苷酸〃涵盖仅包含多核苷酸的编码序列以及包含另外的编 码及/或非编码序列的多核苷酸。本发明的多核苷酸可为RNA形式或DNA形式。DNA包含 cDNA、基因组DNA以及合成DNA ;以及可为双链或单链，以及若为单链，则可为编码链或非编 码（反义）链。
[0159] 本发明进一步有关多核苷酸的变异体，例如，片段、类似物以及衍生物。多核苷酸 的变异体可为多核苷酸的天然存在的等位基因变异体或多核苷酸的非天然存在的变异体。 于某些具体实施例中，多核苷酸可具有为揭露的多肽的编码序列的天然存在的等位基因变 异体的编码序列。如本领域中已知，等位基因变异体为具有，例如，一个或多个核苷酸的取 代、缺失或添加的多核苷酸序列的替代的形式，而且不会实质上改变编码的多肽的功能。
[0160] 于具体实施例中，多核苷酸可包括与协助例如多肽的表达和其从宿主细胞分泌 (例如，作用为控制多肽从细胞传送的分泌序列的前导序列）的多核苷酸以相同阅读框融 合的成熟多肽的编码序列。多肽具有为前蛋白的前导序列，且所述前导序列可被宿主切断 细胞以形成成熟形式的多肽。多核苷酸亦可编码为成熟蛋白质加上另外的5'氨基酸残基 的原蛋白。具有的原序列的成熟蛋白质为原蛋白，为且失活形式的蛋白质。一旦原序列被 断裂，则剩下活性成熟蛋白质。
[0161] 于具体实施例中，多核苷酸可包括与允许例如纯化编码的多肽的标记物序列以相 同阅读框融合的成熟多肽的编码序列。例如，标记物序列可为由PQE-9载体所供应的六组 氨酸标记，以在细菌宿主的情况下提供与标记物融合的成熟多肽的纯化，或当使用哺乳动 物宿主（例如，C0S-7细胞）时标记物序列可为衍生自流行性感冒血凝素蛋白质的血凝素 (HA)标记。另外的标记包含，但非限于，Calmodulin标记、FLAG标记、Myc标记、S标记、SBP 标记、软标记（Softage) 1、软标记3、V5标记、Xpress标记、Isopep标记、Spy标记、生物素、 竣基载体蛋白质（BCCP)标记、GST标记、突光蛋白质标记（例如，绿色突光蛋白质标记）、麦 芽糖结合蛋白质标记、Nus标记、Strep-标记、硫氧还蛋白标记、TC标记、Ty标记等。
[0162] 于具体实施例中，本发明提供单离的核酸分子，其具有与编码包括本发明的流行 性感冒HA抗体或抗体片段的多肽的多核苷酸具有为至少80%同一性，至少85%同一性，至 少90%同一性，至少95%同一性，或至少96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列。
[0163] 所谓多核苷酸具有，例如，与参考核苷酸序列具有为至少95%"同一'丨生〃的核苷酸 序列意指多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同，但针对参考核苷酸序列的每各1〇〇核苷 酸，所述多核苷酸序列可包含最多五个点突变。换句话说，为了获得具有与参考核苷酸序列 具有为至少95%同一'丨生的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中高达5%核苷酸可缺失或以其 它核苷酸取代，或参考序列中可插入所述参考序列中高达5%总核苷酸的一些核苷酸。参考 序列的此等突变可发生在参考核苷酸序列的氨基或羧基端位置或在那些端位置之间的随 处，所述突变是在参考序列中的核苷酸之间个别穿插或在参考序列内的一个或多个邻接的 基团中穿插。
[0164] 作为一个实际的问题，可传统上使用已知计算机程序测定，诸如最佳适 配程序(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version8for Unix,Genetics Group，University Research Park, 575Science Drive，Madison，WI53711)任何特别核 酸分子是否与参考序列为具有至少80%同一性、至少85%同一性、至少90%同一性，以及 于一些具体实施例中，至少95%、96%、97%、98%或99%同一性。最佳适配使用Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics2 :482489(1981)的局部同源性算法，以得到 两个序列之间的同源性的最佳区段。当使用最佳适配或任何其它序列比对程序测定特别序 列是否与根据本发明的参考序列具有，例如，95%同一性时，参数是设定成计算参考核苷酸 序列的全长的同一性百分率，并且允许同源性中的空位为高达5%的参考序列中的核苷酸 总数。
[0165] 多核苷酸变异体可含有编码区、非编码区或两者中的变化。于一些具体实施例中， 多核苷酸变异体含有产生静止取代（silent substitution)、添加或缺失的变化，但不会改 变编码多肽的性质或活性。于一些具体实施例中，由于遗传密码的简并性，核苷酸变异体是 由静止取代产生。多核苷酸变异体可因各种原因产生，例如，最优化特别宿主的密码子表达 (将人类mRNA中的密码子改成那些细菌宿主诸如大肠杆菌者首选者）。
[0166] 本发明的多肽可为对抗流行性感冒HA的重组多肽、天然多肽、或包括抗体的合成 多肽或其片段，本领域将识别本发明的一些氨基酸序列可变异，但对蛋白质的结构或功能 无显着效果。因此，本发明进一步包含显示对流行性感冒HA有实质活性或包含人源化抗体 或其片段的多肽的变异。此突变体包含缺失、插入、倒位、重复和类型取代。
[0167] 多肽和类似物可进一步改性以含有通常并非蛋白质的一部分的另外的化学部 分。那些衍生的部分可改善蛋白质的溶解度、生物半衰期或吸收。所述部分亦可减少或消 除蛋白质等的任何期望副作用。Remington's Pharmaceutical Sciences, Sciences, 20th ed·，Mack Publishing Co·, Easton, PA (2000)中可找到那些部分的概观。
[0168] 本文中的单离的多肽可描述为由任何本领域中已知的适合方法产生。此方法的 范围是从直接蛋白质合成方法至构筑编码单离的多肽序列的DNA序列和在适合的转化宿 主中表达那些序列的方法。于一些具体实施例中，通过单离或合成编码感兴趣的野生型蛋 白质的DNA序列，而使用重组技术构筑DNA序列。视需要地，序列可通过位点特异性突变 诱变，以提供其功能类似物。参阅，例如，Zoeller et al.，Proc. Nat' 1. Acad. Sci. USA81 : 5662-5066(1984)和美国专利第 4, 588, 585 号。
[0169] 于具体实施例中，编码感兴趣的多肽的DNA序列会通过使用寡核苷酸合成器进行 化学合成而构筑。此寡核苷酸可基于期望多肽的氨基酸序列而设计，并且选择在其中将产 生感兴趣的重组多肽的宿主细胞中有利的那些密码子。可应用标准方法以合成编码感兴趣 的单离的多肽的单离的多核苷酸序列。例如，完整氨基酸序列可用以构筑回译基因。又，可 合成含有编码特别的单离的多肽的核苷酸序列的DNA寡聚体。例如，可合成编码期望的多 肽的小部分的许多小寡核苷酸，接着将其连接。个别的寡核苷酸典型含有5'或3'单链突 出（overhang)端以进行互补组装。
[0170] 一旦组装（例如，通过合成、位点引导突变或其它方法），编码单离的特别感兴趣 的多肽的多核苷酸序列将插置入表达载体，并且视需要地与适合在期望的宿主中表达蛋白 质的表达控制序列操作链接。适当组装可通过核苷酸定序、限制性酶切作图以及在适合宿 主中表达生物活性多肽而确认。如本领域中周知，为了在宿主中获得高表达水平的转染基 因，基因可与在选择的表达宿主中有功能性的转录和翻译表达控制序列。
[0171] 重组表达载体用以扩增和表达编码流行性感冒HA抗体的DNA。重组表达载体为 具有编码流行性感冒HA抗体的合成或衍生自cDNA的DNA片段或生物相等类似物的可复制 DNA构筑物，所述生物相等类似物操作链接衍生自哺乳动物、微生物、病毒或病毒基因的适 合转录或翻译的调节组件。转录单元通常包括以下者的组合：（1)基因组件或在基因表达 中具有调节角色的组件，例如，转录启动子或增强子，（2)转录成mRNA和翻译成蛋白质的结 构或编码序列，以及（3)适当的转录和翻译起始和终止序列，如以下详述。此调节组件可包 含控制转录的操作子或序列。在宿主中复制的能力通常是由复制的原点所赋予，而且可另 外并入促进转化体的辨识的选择基因。当DNA区彼此功能性相关时，是操作链接的。例如， 若信号肽（分泌前导物）的DNA表达为参与多肽的分泌的前驱体时，则其与多肽的DNA操 作链接；若启动子控制序列的转录，则其与编码序列操作链接；或若核糖体结合位点定位 成以允许翻译，则其与编码序列操作链接。一般，操作链接表示邻近，而且在分泌前导物的 情况下，表示邻接且在阅读框中。意欲用于酵母表达系统的结构组件包含前导序列，使得宿 主细胞能细胞外分泌翻译的蛋白质。或者，当表达重组蛋白质，但无前导或传送序列时，其 可包含N-端甲硫氨酸残基。后来，此残基可视需要地从表达的重组蛋白质断裂，以提供最 终产物。
[0172] 表达控制序列和表达载体的选择将取决于宿主的选择。可采用广泛多种的表达宿 主/载体组合。真核宿主的有用表达载体包含，例如，包括来自SV40、牛乳突病毒、腺病毒以 及巨细胞病毒的表达控制序列的载体。细菌宿主的有用表达载体包含已知细菌质体，诸如 来自大肠杆菌的质体，包含pCRl、pBR322、pMB9以及其衍生物、更广的宿主范围质体，诸如， M13和丝状单链DNA噬菌体。
[0173] 表达多肽的适合宿主细胞包含在适当启动子的控制下的原核生物、酵母、昆虫或 更高真核细胞。原核生物包含格兰氏阴性或格兰氏阳性生物体，例如，大肠杆菌或杆菌 (Bacilli)。更高真核细胞包含哺乳动物来源的已建立的细胞系。亦采用不含细胞的翻 译系统。适合与细菌、真菌、酵母以及哺乳动物细胞宿主共享的克隆化和表达载体为本领 域中周知（参阅 Pouwels et al·，Cloning Vectors :A Laboratory Manual, Elsevier, N. Y. , 1985) 〇
[0174] 亦有利地采用多种哺乳动物或病毒细胞培养系统以表达重组蛋白质。可进行重 组蛋白质在哺乳动物细胞中的表达，因为此蛋白质通常正确折叠，适当地改性以及完全作 用。适合哺乳动物宿主细胞系的实例包含Gluzman(Cell23 :175，1981)描述的猴肾细胞 的C0S-7系和其它能表达适当载体的细胞系，包含，例如，L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢 (CHO)、HeLa以及BHK细胞系。哺乳动物表达载体可包括非转录组件诸如复制的原点、适合 启动子以及与待表达的基因链接的增强子以及其它5'或3'侧翼非转录序列、以及5'或 3'非翻译的序列诸如需要的核糖体结合位点、多聚腺苷化位点、剪切供体以及受体位点、 以及转录终止序列。用于在昆虫细胞中产生异源蛋白质的杆状病毒系统是由Luckow and Summers, Bio/Technology6 :47(1988)评论。
[0175] 由转化的宿主产生的蛋白质可根据任何适合方法纯化。此标准方法包含色谱法 (例如，离子交换、亲和力以及尺寸筛分柱色谱法等）、离心、差异溶解度，或通过蛋白质纯 化用的任何其它标准技术。亲和力标记诸如六组氨酸、麦芽糖结合结构域、流行性感冒病 毒膜序列、谷胱甘肽S-转移酶等可附接至蛋白质，以允许通过穿过适当亲和力柱而容易纯 化。单离的蛋白质亦可使用蛋白质水解、核磁共振以及X射线结晶学等技术而物理地特性 化。
[0176] 例如，来自分泌重组蛋白质入培养基的系统的上清液可使用商业可用蛋白质浓缩 过滤器，例如，Amicon或Millipore Pellicon超过滤单元先浓缩。此浓缩步骤之后，浓缩 物可施加于适合的纯化基质。或者，可采用阴离子交换树脂，例如，具有侧二乙基氨基乙基 (DEAE)的基质或物质。基质可为丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或其它常在蛋白质纯化 中采用的类型。或者，可采用阳离子交换步骤。适合的阳离子交换剂包含包括磺酸丙基或 羧基甲基的多种不溶基质。最后，可采用疏水性RP-HPLC介质，例如，具有侧甲基或其它脂 族基的二氧化硅凝胶，的一个或多个反相高效液相色谱法（RP-HPLC)步骤，以进一步纯化 癌症干细胞蛋白质-Fc组合物。亦可采用一些或所有的前述纯化步骤的多种组合以提供均 质重组蛋白质。
[0177] 细菌培养中产生的重组蛋白质可通过，例如，从细胞团块进行最初萃取，接着进行 浓缩、盐析、水性离子交换或尺寸排阻色谱法步骤的一者或多者而分离。可采用高效液相色 谱法（HPLC)进行最终纯化步骤。重组蛋白质的表达中采用的微生物细胞可通过任何便利 方法破坏，包含冻融循环、超声处理、机械破坏，或使用细胞溶解剂。
[0178] 治疗方法
[0179] 本发明提供治疗或预防流行性感冒感染的方法。
[0180] 于方面中，本发明提供治疗或预防有需要的受试者的流行性病毒感染的方法。所 述方法涉及对受试者给药有效量的本文所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，或含有所述 抗体或抗体片段的医药组合物。所述治疗或预防受试者的流行性感冒病毒感染的方法，包 含减少或缓和与感染相关的症状。
[0181] 于方面中，本发明提供中和有需要的受试者的流行性感冒病毒的方法。所述方法 涉及对受试者给药有效量的本文所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，或含有所述抗体或 抗体片段的医药组合物。所述方法中和受试者的流行性感冒病毒，从而治疗或预防受试者 的流行性感冒病毒感染，包含减少或缓和与感染相关的症状。
[0182] 于方面中，本发明提供在有需要的受试者中建立流行性感冒病毒感染的方法。所 述方法涉及对受试者给药有效量的本文所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，或含有所述 抗体或抗体片段的医药组合物。所述方法在受试者中抑制流行性感冒病毒感染的建立，从 而预防与感染相关的症状。
[0183] 于方面中，本发明提供在抑制有需要的受试者的流行性感冒病毒感染的散播的方 法。所述方法涉及对受试者给药有效量的本文所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，或所 述含有抗体或抗体片段的医药组合物。所述方法抑制受试者的流行性感冒病毒感染的散 播，从而减少或缓和与感染相关的症状。
[0184] 于方面中，本发明提供抑制流行性感冒病毒进入受试者中的细胞的方法。所述方 法涉及对受试者给药有效量的本文所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，或所述含有抗体 或抗体片段的医药组合物。所述方法抑制流行性感冒病毒进入受试者中的细胞，从而预防 与感染相关的症状或减少或缓和与感染相关的症状。
[0185] 于方面中，本发明提供抑制流行性感冒病毒进入细胞的方法。所述方法涉及使具 有流行性感冒病毒感染或有发展流行性感冒病毒感染的风险的细胞与本文所述的抗流行 性感冒抗体或抗体片段或含有所述抗体或抗体片段的医药组合物接触。所述方法抑制流行 性感冒病毒进入细胞。
[0186] 于任何以上方面，流行性感冒可为H1N1、H2N2、H3N2或适应人类的H5病毒株。
[0187] 于以上方面中任一者，受试者具有流行性感冒感染或有发展流行性感冒感染的风 险。于相关具体实施例中，受试者为哺乳动物（例如，人类）。于相关具体实施例中，受试者 易受病毒感染（例如，怀孕女性、年轻受试者或婴儿受试者、老年受试者）。
[0188] 于任何以上方面和具体实施例中，抗流行性感冒抗体或抗体片段或医药组合物是 通过肌内注射、静脉内注射、皮下注射、或吸入而给药。
[0189] 医药组合物
[0190] 本发明提供含有本文所述的新颖流行性感冒HA抗体的医药组合物。于具体实施 例中，医药组合物含有医药可接受的载体、赋形剂或稀释剂，而且包含本身不会对接受组合 物的受试者诱发有害的免疫反应的产生的任何医药剂，以及可在无过度毒性的情况下给 药。如本文所使用，术语"医药可接受的"表示美国联邦或州政府的监管机关核准或美国 药典、欧洲药典或其它通常认可的药典中所列用于哺乳动物，更特别于人类者。此等组合物 可有用于治疗及/或预防流行性感冒感染。
[0191] RemingtonJ s Pharmaceutical Sciences (17th ed. , Mack Publishing Company) 和 Remington :The Science and Practice of Pharmacy(21st ed.,Lippincott Williams&Wilkins)中呈现医药可接受的载体、稀释剂以及其它赋形剂的深入探讨，其特此 以参考方式并入。医药组合物的配方应适合给药的模式。于具体实施例中，医药组合物适 合对人类给药，而且可为无菌、非颗粒及/或无致热源。
[0192] 医药可接受的载体、赋形剂或稀释剂包含，但非限于，食盐水、缓冲盐水、葡萄糖、 水、甘油、乙醇、无菌等渗水性缓冲液以及其组合。
[0193] 组合物中亦可存在湿润剂、乳化剂以及润滑剂诸如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁， 以及着色剂、脱模剂、涂布剂、甜味剂、调味剂以及芳香剂、防腐剂以及抗氧化剂。
[0194] 医药可接受的抗氧化剂的实例包含，但非限于：（1)水溶性抗氧化剂，诸如，抗坏 血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏硫代硫酸钠、亚硫酸钠等；（2)油溶性抗氧化剂、诸如， 抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚（BHA)、丁基化羟基甲苯（BHT)、卵磷脂、羟乙酸丙 酯、α-生育酚等；以及⑶金属螯合剂，诸如，柠檬酸、乙二胺四乙酸（EDTA)、山梨糖醇、酒 石酸、磷酸等。
[0195] 于具体实施例中，医药组合物是以固体形式提供，诸如，适合复水的冻干粉剂、液 体溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、缓释型配方或粉剂。
[0196] 于具体实施例中，医药组合物是以液体形式提供，例如，在表示医药组合物中的活 性成分的含量和浓度的密封容器中。于相关具体实施例中，医药组合物的液体形式是以密 封的容器提供。
[0197] 调配本发明的医药组合物的方法为传统和本领域中周知者（参阅Remingtonand Remington's)。本领域技术人员可容易调配具有期望特性（例如，给药路径、生物安全性以 及释放外廓线）的医药组合物。
[0198] 制备医药组合物的方法包含使活性成分与医药可接受的载体和视需要地一种或 多种次要成分相关联的步骤。医药组合物的制备可通过使活性成分与液体载体或微细固 体载体或两者均匀地和直接地相关联，接着，若需要，使产物成型。制备医药组合物的另外 的方法包含多层剂量形式的制备在Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (9th ed.，Lippincott Williams&Wilkins)中描述，其特此以参考方式 并入。
[0199] 递送方法
[0200] 本发明的医药组合物可通过口服和非经口的方式（例如，局部地、经皮地、或通 过注射）而对受试者给药。此给药的模式和制备在其中使用的适当医药组合物的方法 在 Gibaldi, s Drug Delivery Systems in Pharmaceutical Care(1st ed. , American Society' s Health-System Pharmacists)中描述，其特此以参考方式并入。
[0201] 于具体实施例中，医药组合物是以固体形式口服给药。
[0202] 适合口服给药的医药组合物可为胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、菱形锭剂（使用矫味 的基底，通常为蔗糖和阿拉伯树胶或黄蓍胶）、粉剂、粒剂的形式，或作为水性或非水性液 体的溶液或悬浮液，或作为水包油或油包水的液体乳剂，或作为酏剂或糖楽剂，或作为锭剂 (使用惰性基底，诸如，明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯树胶）及/或作为漱口水等，各含有预 测定量的本文所述的化合物、其衍生物或医药可接受的盐或其前药作为活性成分。活性成 分亦可以团状物、冲剂或糊剂的方式给药。
[0203] 于口服给药的固体剂量形式（例如，胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸剂、粉剂、粒剂等） 中，活性成分与一种或多种医药可接受的载体、赋形剂或稀释剂，诸如，柠檬酸钠或磷酸氢 隹丐及/或以下任一者混合：（1)填料或增量剂，诸如，淀粉、乳糖、鹿糖、葡萄糖、甘露糖醇及 /或硅酸；（2)粘合剂，诸如，例如，羧基甲基纤维素、海藻酸酯、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖 及/或阿拉伯树胶；（3)保湿剂，诸如，甘油；(4)崩解剂，诸如，琼脂-琼脂、碳酸钙、土豆或 木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐以及碳酸钠；（5)溶液缓聚剂，诸如，石蜡；(6)吸收加速剂， 诸如，四级铵化合物；（7)湿润剂，诸如，例如，乙酰醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，诸如， 高岭土和膨润土； (9)润滑剂，诸如，滑石，硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫 酸钠、以及其混合物；以及（10)着色剂。胶囊、片剂以及丸剂的情况下，医药组合物亦可包 括缓冲剂。相似的类型的固体组合物的亦可在夹心软和夹心硬明胶胶囊中使用填料、以及 赋形剂诸如乳糖或乳糖、以及高分子重量聚乙二醇等制备。
[0204] 片剂可通过视需要地与一种或多种次要成分压缩或模塑而制造。压缩片剂可通过 使用粘合剂（例如，明胶或羟基丙基甲基纤维素）、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂（例 如，糖化钠淀粉或交联羧基甲基纤维素钠）、表面活化剂、及/或分散剂而制备。模塑片剂可 通过在适合机器中将濡惰性液体稀释剂的粉状活性成分的混合物模塑而制成。
[0205] 片剂和其它固体剂量形式，诸如，糖衣丸剂、胶囊、丸剂以及粒剂、可视需要地刻痕 (score)或与涂层和外壳制备，诸如肠涂层和其它本领域中周知的涂层。
[0206] 亦可调配医药组合物以便提供活性成分的缓慢、延长或控释，所述活性成分中使 用，例如，不同比例的羟基丙基甲基纤维素以提供期望的释放外廓线、其它聚合体基质、月旨 质体及/或微球体。医药组合物亦可视需要地含有乳浊剂和可为视需要地，以延迟的方式， 于胃肠道的某些部分，仅释放或优先释放活性成分的组合物。包埋组合物的实例包含聚合 体物质和蜡。若适当，活性成分亦可为与本领域中周知的一种或多种医药可接受的载体、赋 形剂或稀释剂成为微包囊形式（参阅，例如，Remington and Remington' s)。
[0207] 医药组合物可通过，例如，过滤通过使细菌留存的过滤器，或并入可溶解于无菌水 的无菌固体组合物形式的灭菌剂，或在使用前即并入一些其它无菌可注射介质而灭菌。
[0208] 于具体实施例中，医药组合物是以液体形式口服给药。
[0209] 口服给药活性成分的液体剂量形式包含医药可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮 液、糖浆剂以及酏剂。除了活性成分之外，液体剂量形式还可含有本领域中常用的惰性稀 释剂，诸如，例如，水或其它溶剂、增溶剂以及乳化剂，诸如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙 酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1，3_ 丁二醇、油（特别为棉籽油、花生油、玉米油、胚芽 油、橄榄油、蓖麻油以及芝麻油）、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇以及山梨聚糖的脂肪酸酯以 及其混合物。除了惰性稀释剂之外，液体医药组合物还可包含佐剂，诸如，湿润剂、乳化剂、 悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂以及防腐剂等。
[0210] 除了活性成分之外，悬浮液还可含有悬浮剂，诸如，但非限于，乙氧基化异硬脂醇、 聚氧乙烯山梨糖醇以及山梨聚糖酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂-琼脂以及黄 蓍胶、以及其混合物。
[0211] 于具体实施例中，医药组合物是通过非经口的方式给药，诸如，通过局部施用、经 皮施用、注射等。于相关具体实施例中，医药组合物通过注射、注入或植入（例如，静脉内、 肌内、关节内、皮下等）肠道外给药。
[0212] 非肠道使用的组合物可以单元剂量形式呈现，例如，含有许多剂量的安瓿或小玻 璃瓶，而且可在其中添加适合的防腐剂。此组合物可为溶液、悬浮液、乳剂、注入器件、植入 用递送器件的形式，或其可呈现为待使用之前以水或其它适合载液复水的干粉剂。亦可采 用一种或多种共同载液，诸如乙醇。除了活性成分之外，组合物还可含有可并入微球体、微 胶囊、纳米粒子、脂质体等进行控释的适合的肠道外可接受的载体及/或赋形剂或活性成 分。此外，组合物亦可含有悬浮剂、增溶剂、稳定剂、pH调整剂及/或分散剂。
[0213] 医药组合物可为无菌注射的形式。活性成分溶解或悬浮于肠道外可接受的液体 载液，以制备此组合物。例示性载液和溶剂包含，但非限于，水、通过添加适当量的盐酸、 氢氧化钠或适合的缓冲液而调整至适合的pH的水、1，3_ 丁二醇、林格溶液（Ringer' s solution)以及等渗氯化钠溶液。医药组合物亦可含有一种或多种防腐剂，例如，对羟苯甲 酸甲酯、对羟苯甲酸乙酯或对羟苯甲酸正丙酯。可添加溶解作用增强或增溶剂，或溶剂可含 有10至60%重量/重量的丙二醇等，以改善溶解度。
[0214] 医药组合物可含有一种或多种医药可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散 液、悬浮液或乳剂或可在使用前即复水成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉剂。此医药组 合物可含有抗氧化剂；缓冲液；抑菌剂；用意欲接受者的血液使配方为等渗的溶质；悬浮 齐U;增稠剂；防腐剂；等。
[0215] 本发明的医药组合物中可采用的适合的水性和非水性载体的实例包含水、乙醇、 多元醇（诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等）和其适合的混合物、植物油诸如橄榄油、以及可注 射的有机酯诸如油酸乙酯。适当流动性可通过，例如，使用涂布物料诸如卵磷脂而维持，通 过在分散液的情况下维持所需颗粒的尺寸而维持，以及通过使用表面活性剂而维持。
[0216] 于一些具体实施例中，期望减慢对来自皮下或肌内注射的化合物的吸收，以延长 活性成分的功效。这可通过使用具有差水溶解度的晶质或非晶质物料的液体悬浮液而完 成。接着，活性成分的吸收速率是取决于其溶解速率，顺次，可取决于结晶尺寸和晶质形式。 或者，肠道外给药的活性成分的延迟吸收是通过将化合物溶解或悬浮于油载液而完成。此 夕卜，可注射的医药形式的延长吸收可由包含延迟吸收的剂诸如单硬脂酸铝和明胶而导致。.
[0217] 控释的非肠道组合物可为水性悬浮液、微球体、微胶囊、磁性微球体、油溶液、油悬 浮液、乳剂的形式，或活性成分可并入生物兼容性载体、脂质体、纳米粒子、植入物或注入器 件。
[0218] 用于制备微球体及/或微胶囊的物料包含生物可降解/生物可腐蚀聚合体诸如， 聚交酯、聚（氰丙烯酸异丁酯）、聚（2_羟基乙基-L-谷氨酰胺）以及聚（乳酸）。
[0219] 当调配控释的非肠道配方时可使用的生物兼容性载体包含碳水化合物诸如，葡聚 糖、蛋白质诸如白蛋白、脂蛋白或抗体。
[0220] 用于植入物的物料可为非生物可降解，例如，聚二甲基硅氧烷，或生物可降解诸 如，例如，聚（己内酯）、聚（乳酸）、聚（乙醇酸）或聚（原酸酯）。
[0221] 于具体实施例中，活性成分通过气溶胶给药。通过制备水性气溶胶、脂质体制剂、 或含有所述化合物的固体颗粒而完成。可使用非水性（例如，氟碳推进剂）悬浮液。医药 组合物亦可使用声波喷雾器给药，所述声波喷雾器会使剂暴露于剪力最小化，可造成化合 物的降解。
[0222] 平常，通过共同调配活性成分的水性溶液或悬浮液的与传统医药可接受的载体和 稳定剂而制造水性气溶胶。载体和稳定剂随着特别化合物的需求而改变，但典型包含非离 子性表面活性剂（Tweens, Pluronics，或聚乙二醇）、无害蛋白质诸如血清白蛋白、山梨聚 糖酯、油酸、卵磷脂、氨基酸诸如甘氨酸、缓冲液、盐、糖或糖醇。气溶胶通常从等渗溶液制 备。
[0223] 局部或经皮给药活性成分的剂量形式包含粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、霜剂、洗 齐U、凝胶、溶液、贴剂以及吸入剂。适当时，活性成分可在无菌条件下与医药可接受的载体、 及与任何防腐剂、缓冲液或推进剂混合。
[0224] 适合用于本发明的经皮贴剂揭露于Transdermal Drug Delivery:Developmental Issues and Research Initiatives(Marcel Dekker Inc. , 1989)和美国专利第 4, 743, 249、4, 906, 169、5, 198, 223、4, 816, 540、5, 422, 119、5, 023, 084 号，其特此以参考方 式并入。经皮贴剂亦可为本领域中周知的任何经皮贴剂，包含经阴囊贴剂。此经皮贴剂中 的医药组合物可含有一种或多种本领域中周知的吸收增强剂或皮肤渗透增强剂（参阅，例 如，美国专利第4, 379, 454和4, 973, 468号，其特此以参考方式并入）。用于本发明经的皮 治疗系统可基于离子透入、扩散、或此两种效果的组合。
[0225] 经皮贴剂具有对活性成分提供控制递送至身体的增加的优点。此剂量形式可通过 在适当介质中溶解或分散活性成分而进行。吸收增强子亦可用以增加活性成分横跨皮肤的 通量。此通量的速率可通过提供速率控制膜片或将活性成分分散于聚合体矩阵或凝胶剂中 而控制。
[0226] 此医药组合物可为霜剂、软膏剂、洗剂、搽剂、凝胶、水凝胶、溶液、悬浮液、粘着剂、 喷雾剂、糊剂、硬膏剂以及其它种类的经皮药物递送系统的形式。组合物亦可包含医药可接 受的载体或赋形剂诸如乳化剂、抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、保湿剂、穿透增强剂、螯合剂、凝 胶形成剂、软膏剂基底、香料以及皮肤保护剂。
[0227] 乳化剂的实例包含，但非限于，天然存在的胶，例如，阿拉伯树胶或黄蓍胶、天然存 在的磷脂酸，例如，黄豆卵磷脂以及山梨聚糖单油酸酯衍生物。
[0228] 抗氧化剂的实例包含，但非限于，丁基化羟基茴香醚（BHA)、抗坏血酸以及其衍生 物、生育酚以及其衍生物、以及半胱氨酸。
[0229] 防腐剂的实例包含，但非限于，对羟基苯甲酸酯，诸如，对羟苯甲酸甲酯或对羟苯 甲酸丙酯以及氯化苄二甲烃铵。
[0230] 保湿剂的实例包含，但非限于，甘醇、丙二醇、山梨糖醇以及脲。
[0231] 穿透增强剂的实例包含，但非限于，丙二醇、DMS0、三乙醇胺、N，N_二甲基乙酰胺、 N，N-二甲基甲酰胺、2-吡咯啶酮以及其衍生物、四氢糠醇、丙二醇、具有丙二醇单月桂酸 酯或月桂酸甲酯的二乙二醇单乙基醚或二乙二醇单甲基醚、桉油精、卵磷脂、还氧二元醇 (Transcutof 8)以及阿佐恩（商品名）（Azone?)〇
[0232] 螯合剂的实例包含，但非限于，EDTA钠、柠檬酸以及磷酸。
[0233] 凝胶形成剂的实例包含，但非限于，卡波普、纤维素衍生物、膨润土、海藻酸酯、糖 浆剂以及聚乙烯吡咯啶酮。
[0234] 除了活性成分之外，本发明的软膏剂、糊剂、霜剂以及凝胶还可含有赋形剂，诸如， 动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、聚硅氧烷、膨润土、 硅酸、滑石以及氧化锌或其混合物。
[0235] 粉剂和喷雾剂可含有赋形剂，诸如，乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙以及聚酰 胺粉剂或此等物质的混合物。喷雾剂可另外含有惯用推进剂，诸如，氯氟烃和挥发性未经取 代的烃诸如丙烷和丙烷。
[0236] 可注射的补给形式是通过在生物可降解聚合体中形成本发明的化合物的微包覆 基质而形成，诸如，聚交酯-聚乙醇酸交酯。取决于化合物与聚合体的比率和采用的特别聚 合体的本质，可控制释放的化合物的速率。其它生物可降解聚合体的实例包含聚（原酸酯） 和聚（酐）。补给可注射的配方亦可通过以与身体组织兼容的脂质体或微乳剂包埋药物而 制备。
[0237] 皮下植入物为本领域中周知者，而且适合用于本发明。皮下植入方法优选为非刺 激性和有机械弹性。植入物可为基质类型、储存槽类型或其杂合体。于基质类型器件中，载 体物料可为多孔或非多孔、固体或半固体，以及可透或不可透活性化合物或化合物。给药之 后，载体物料可为生物可降解，或可缓慢腐蚀。于某些情况下，基质是非可降减，且反而是仰 赖于活性化合物扩散通过基质以使载体物料降解。另外的皮下植入方法利用储存槽器件， 其中活性化合物或化合物是由速率控制膜片包围，例如，与组分浓缩无关的膜片（具有零 级动力学）。亦适合使用由速率控制膜片包围所组成的的基质器件。
[0238] 储存槽和基质类型器件皆可含有诸如聚二甲基硅氧烷，诸如硅橡胶（商标名） (Silastic?，）或其它聚硅氧橡胶等物料。基质物料可为不溶性聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、 乙酸乙基乙烯酯、聚苯乙烯以及聚丙烯酸酯、以及棕榈酸硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯以及 廿二酸甘油酯类型的甘油酯。物料可为疏水性或亲水性聚合体和视需要地含有增溶剂。
[0239] 皮下植入物器件可为以任何适合聚合体，例如，描述于美国专利第5, 035, 891和 4, 210, 644号者（其特此以参考方式并入），而制成缓释胶囊。
[0240] 大体上，可应用至少四种不同方法，以对药物化合物的释放和经皮释放提供速率 的控制。此等方法为调节膜片的系统、控制粘性扩散的系统、基质分散类型系统以及微储存 槽系统。应理解可通过使用此等方法的适合混合，而获得控释的经皮及/或局部组合物。
[0241] 于膜片调节系统中，活性成分存在储存槽中，所述储存槽完全包囊于从不可透药 物的层压板（诸如，金属塑料层压板）和速率控制聚合体膜片（诸如微多孔或非多孔的聚 合体膜片（例如，乙烯-乙酸乙烯酯共聚体））模塑的浅隔室。活性成分释放通过速率控制 聚合体膜片。于药物储存槽中，活性成分可分散于固体聚合体基质中或悬浮于不可淋溶、粘 性液体介质诸如聚硅氧液体。于聚合体膜片的外表面上，施用粘性聚合体薄层以达成经皮 系统与皮肤表面的直接接触。粘性聚合体优选为低敏感性，而且与活性药物物质兼容的聚 合体。
[0242] 于控制粘性扩散的系统中，活性成分的储存槽的形成是通过直接分散活性成分于 粘性聚合体中，接着通过如溶剂浇铸在实质上不可透药物的金属塑料背衬平片材上扩散含 有活性成分的粘合剂以形成药物储存槽薄层。
[0243] 基质分散类型系统的特征为活性成分的储存槽是通过实质上均质分散活性成分 于亲水性或亲脂性聚合体基质而形成。接着，含有药物的聚合体模塑入具有实质上良好定 义的表面面积和控制厚度的圆盘。粘性聚合体沿着周长散布，以形成围绕圆盘的粘性条带。
[0244] 微储存槽系统可被认为是储存槽和基质分散类型系统的组合。于此情况下，活性 物质的储存槽的形成是通过首先悬浮药物固体于水溶性聚合体的水性溶液，以及接着分散 药物悬浮液于亲脂性聚合体中以形成多重不可淋溶、显微球状的药物储存槽。
[0245] 任何上述控释、延长的释放以及持续释放的组合物可调配成在约30分钟至约1 周、约30分钟至约72小时、约30分钟至24小时、约30分钟至12小时、约30分钟至6小 时、约30分钟至4小时、以及约3小时至10小时后释放活性成分。于具体实施例中，对受 试者给药医药组合物之后，在受试者中活性成分的有效浓缩持续4小时、6小时、8小时、10 小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时或更久。
[0246] 剂量
[0247] 当本文所述的剂作为医药剂而对人类和动物给药时，其可直接给药或作为含有活 性成分与医药可接受的载体、赋形剂或稀释剂的组合的医药组合物给药。
[0248] 本发明的医药组合物中的活性成分的实际剂量水平和时程可改变，以便获得于针 对特别病人、组合物以及给药的模式达成期望的治疗反应是有效的，但对病人是无毒性的 活性成分的含量。一般，本发明的剂或医药组合物的是以足够减少或消除症状与流行性感 冒感染相关的含量给药。例示性剂量范围包含每天〇. oimg至250mg，每天0. Olmg至lOOmg， 每天lmg至lOOmg，每天10mg至lOOmg，每天lmg至10mg，以及每天0· Olmg至10mg。优选 剂量的剂为病人可容忍和不发展严重或不可接受的副作用的最大剂量。于具体实施例中， 以每天每公斤的体重约10公克（g)至约lOOmg，每天约0. 1至约10mg/kg，或每天约l.Omg 至约10mg/kg的体重的浓度给药剂。
[0249] 于具体实施例中，医药组合物包括含量范围为1和10mg之间的剂，诸如1、2、3、4、 5、6、7、8、9 或 10mg。
[0250] 于具体实施例中，产生剂的血清浓度的治疗有效剂量为约0· lng/ml至约50至 100 μ g/ml。医药组合物典型应提供每天每公斤体重约0. OOlmg至约2000mg的化合物的剂 量。例如，对人类病人全身给药的剂量可为1至lOy/kgJO至80 μ g/kg、5至50 μ g/kg、75 至 150 μ g/kg、100 至 500 μ g/kg、250 至 750 μ g/kg、500 至 1000 μ g/kg、1 至 10mg/kg、5 至 50mg/kg、25 至 75mg/kg、50 至 100mg/kg、100 至 250mg/kg、50 至 100mg/kg、250 至 500mg/kg、 500 至 750mg/kg、750 至 1000mg/kg、1000 至 1500mg/kg、1500 至 2000mg/kg、5mg/kg、20mg/ kg、50mg/kg、100mg/kg、500mg/kg、1000mg/kg、1500mg/kg 或 2000mg/kg。医药剂量单兀形式 是制备成每剂量单元形式提供约lmg至约5000mg，例如约100至约2500mg的化合物或必要 成分的组合。
[0251] 于具体实施例中，对受试者给药约50nM至约1 μ Μ的剂。于相关具体实施例中，对 受试者给药约 50 至 100ηΜ、50 至 250ηΜ、100 至 500ηΜ、250 至 500ηΜ、250 至 750ηΜ、500 至 750ηΜ、500ηΜ 至 1 μ Μ,或 750ηΜ 至 1 μ Μ 的剂。
[0252] 有效量的测定孔是在那些本领域技术人员的充分能力内，尤其是有鉴于本文详细 揭示的内容。一般，有效的或有效量的剂的测定是通过首先给药低剂量的剂，以及接着递增 给药剂量或多种剂量直到在治疗的受试者中观察到期望的功效（例如，减少与流行性感冒 感染相关的症状）和最小或可接受的毒性副作用。可应用测定给药本发明的医药组合物的 适当剂量和用剂时间表的方法描述于，例如，Goodman and Gilman' s The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, Goodman et al. , eds. ,11th Edition, McGraw-Hi112005, and Remington ：The Science and Practice of Pharmacy, 20th and21st Editions, Gennaro and University of the Sciences in Philadelphia, Eds. ,Lippencott Williams&Wilkins(2003and2005)，各特此以参考方式并入。
[0253] 组合物治疗
[0254] 本文所述的药剂和医药组合物亦可与其它治疗分子组合给药。治疗分子可为任何 用以治疗流行性感冒感染的化合物。此等化合物的实例包含，但非限于，减少流行性感冒病 毒生产的抑制性核酸、抗病毒剂（例如，金刚烷胺、金刚乙胺、扎那米韦、奥司他韦等）、毒素 以及减少与流行性感冒感染相关的症状的剂（例如，抗发炎剂）。
[0255] 流行性感冒HA抗体可在给药之前、期间或给药另外的治疗剂之后给药。于具体实 施例中，在首次给药另外的治疗剂之后给药抗体。于具体实施例中，在首次给药另外的治疗 剂（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天）之后给药抗体。于具体实施 例中，抗体与首先给药另外的治疗剂同时给药。
[0256] 对受试者给药治疗剂的含量可由主治医师或兽医容易地测定。一般，有效的或有 效量的抗体和另外的治疗的测定是通过首次给药低剂量的一种或两种活性剂，接着递增给 药剂量或多种剂量直到观察到期望的功效（例如，减少流行性感冒感染症状）和最小或 无毒性副作用。可应用以测定给药本发明的组合物的适当剂量和用剂时间表的方法描述 于，例如，Goodman and Gilman' s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th Edition.以上，以及于Remington :The Science and Practice of Pharmacy, 20th and21st Editions 以上。
[0257] 试剂盒
[0258] 本发明提供预防或治疗流行性感冒感染的试剂盒；中和流行性感冒病毒；抑制流 行性感冒病毒感染的建立；抑制流行性感冒病毒感染的散播；以及抑制流行性感冒病毒进 入细胞。于具体实施例中，试剂盒含有本文所述的一种或多种剂或医药组合物。于具体实施 例中，试剂盒提供使用的指示。使用的指示可关于本文所述的任何方法。于相关具体实施 例中，指示关于使用治疗或预防流行性感冒感染的剂或医药组合物。根据本发明的此方面 的试剂盒可包括载体工具，诸如盒、箱、管等，于其中一个或多个容器工具，诸如小玻璃瓶、 管、安瓿瓶等密闭空间者。于具体实施例中，试剂盒提供调控医药或生物产物的生产、使用 或贩卖的政府机构规定的形式的通知，所述通知反映用于人类给药的试剂盒和其中组分的 生产、使用或贩卖的机构的批准。
[0259] 实施例
[0260] 应理解本发明不应被解释为限制至现在描述的实施例；而是，本发明应被解释为 包含本文提供的任何和所有应用，而且所有相等的变异是在普通技术人员的技能内。
[0261] 实施例1 :广泛中和抗体的克隆谱系
[0262] 重排的Ig VH和 '基因是通过RT/PCR而从外周血单核细胞分离，并且于疫苗接 种2007三价灭活疫苗（TIV)后一周自受试者采集（Liao, Η· X. et al. J. Virol. Methodsl58 : 171-179(2009))。如图1A所示，通过定序重排的基因而检测的克隆谱系有三段克隆 (mAbs CH65, CH66以及CH67)。抗体CH65、CH66以及CH67的克隆谱系的未突变的一般原 始种型（UCA)的推测序列是明显的，除了在位置99的重链可为甘氨酸或丙氨酸。图1B 显示各抗体的氨基酸序列与UCA的比对。所有三个成熟抗体与存在于疫苗（A/Solomon Islands/3/2006)中的HI血凝素（HA)以相同亲和力结合；UCA的结合更弱。
[0263] 实施例2 :中和活性的广度
[0264] CH65的重链与UCA在可变结构域中的位置12以及其轻链的位置6有所不同； CH65IgGl和其Fab是通过如下述的瞬时转染和纯化而于293T细胞中表达。针对大组的来 自过去30年的H1单离物，包含来自1977、1991以及1995的疫苗病毒株，测试中和并且观 察到惊人的广泛潜力（表1)。亦针对此组的子集测试CH67 (表1)。
[0265] 表1.季节性流行性感冒病毒株A/H1N1以人类MAb CH65和CH67的广泛中和
[0266]

【权利要求】
1. 一种单离的抗流行性感冒抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段与流行性感冒血凝 素（HA)的表位特异性地结合，从而减少或抑制与唾液酸结合的流行性感冒血凝素。
2. 根据权利要求1所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述流行性感冒HA上的 所述表位包括唾液酸结合结构域。
3. 根据权利要求1或2所述的抗流行性感冒抗体或其片段，其中所述HA为H1HA、H2HA、 H3HA 或 H5HA。
4. 根据权利要求3所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述表位包括： i. 对应于来自 A/Solomon Islands/3/2006 的 CDR H1 残基 158 ;CDR H2 残基 158 至 160 ;CDR H3 残基 135 至 136、190 至 195 以及 226 ;CDR L1 残基 222、225 以及 227 ;以及 CDR L3残基187和189的氨基酸； ii. SEQ ID NO : 17至44中任一者所表示的氨基酸；或 iii. SEQ ID NO :17至44中任一者的CH65-CH67结合残基。
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述抗流 行性感冒抗体或抗体片段包括可变重（VH)链，以及其中所述V H链包括SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11或SEQ ID NO :12中所表示的氨基酸序列。
6. 根据权利要求1至5中任一项所述的抗流行性感冒抗体或其片段，其中所述抗流行 性感冒抗体或抗体片段包括可变轻链，以及其中所述'链包括SEQ ID N0:13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO :15或SEQ ID NO :16中所表示的氨基酸序列。
7. 根据权利要求1至6中任一项所述的抗流行性感冒抗体或其片段，其中所述抗流行 性感冒抗体或抗体片段包括一个或多个重链⑶R区，所述重链⑶R区存在于SEQ ID NO :9、 SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11或SEQ ID NO :12所表示的可变重（VH)链氨基酸序列中。
8. 根据权利要求1至7中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述抗流 行性感冒抗体或抗体片段包括一个或多个轻链⑶R区，所述轻链⑶R区存在于SEQ ID NO : 13、SEQIDN0:14、SEQIDN0:15或SEQIDN0:16所表示的可变轻（V ?)链氨基酸序列中。
9. 根据权利要求1至8中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述抗流 行性感冒抗体或抗体片段包括：i)包括SEQ ID NO :10所表示的氨基酸序列的可变重（VH) 链氨基，以及ii)包括SEQ ID NO :14所表示的氨基酸序列的可变轻（')链。
10. 根据权利要求7所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述一个或多个重链 CDR 区包括存在于 SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11 或 SEQ ID NO :12 的可变重 (VII)链氨基酸序列中的CDR3区。
11. 根据权利要求10所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述一个或多个轻链 CDR 区包括存在于 SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15 或 SEQ ID NO :16 的可变 重（')链氨基酸序列中的CDR3区。
12. 根据权利要求1至4中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述抗流 行性感冒抗体或抗体片段包括可变重（VH)链，其中所述￥ 11链的所述CDR3区包括Argl04、 Serl05、Vall06、Aspl07、Tyrl09、Tyrll0、Tyrll2 或其组合。
13. 根据权利要求1至12中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述抗 流行性感冒抗体或抗体片段为单克隆抗体或其抗体片段。
14. 根据权利要求1至13中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述抗 流行性感冒抗体或抗体片段为人源化抗体或抗体片段。
15. 根据权利要求1至14中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述抗 体片段为Fab片段、Fab'片段、Fd片段、Fd'片段、Fv片段、dAb片段、F(ab'） 2片段、单链片 段、双链抗体或线性抗体。
16. 根据权利要求1至15中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其还包括偶 联所述抗流行性感冒抗体或抗体片段的剂。
17. 根据权利要求16所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中偶联所述抗体或抗体 片段的所述剂为治疗剂或可检测的标记。
18. 根据权利要求17所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述治疗剂为小分 子、纳米粒子、多肽、放射性同位素或抑制性核酸。
19. 根据权利要求18所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述治疗剂为抗病毒 剂或毒素。
20. 根据权利要求18所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述治疗剂为减少流 行性感冒病毒产生的siRNA、shRNA或反义核酸分子。
21. 根据权利要求17所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述可检测的标记可 通过光谱、光化学、生化、免疫化学、物理或化学工具检测。
22. 根据权利要求17或21所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述可检测标记 为已制成可检测的酶、荧光分子、颗粒标记、电子致密试剂、放射性标记、微泡、生物素、地高 辛或半抗原或蛋白质。
23. 根据权利要求1至22中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，其中所述流 行性感冒为H1N1、H2N2、H3N2或适应人类的H5病毒株。
24. -种医药组合物，包括根据权利要求1至23中任一项所述的抗流行性感冒抗体或 抗体片段。
25. 根据权利要求24所述的医药组合物，其中所述医药组合物包括医药可接受的载 体、稀释剂或赋形剂。
26. -种单离的多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1至15中任一项所述的抗 流行性感冒抗体或抗体片段。
27. -种表达载体，所述载体包括根据权利要求26所述的单离的多核苷酸。
28. -种宿主细胞，所述宿主细胞包括根据权利要求27所述的表达载体。
29. -种在治疗或预防有需要的受试者的流行性感冒病毒感染的方法，其中所述方法 包括对所述受试者给药有效量的i)根据权利要求1至23中任一项所述的抗流行性感冒抗 体或抗体片段，或ii)根据权利要求24或25所述的医药组合物，从而治疗或预防所述受试 者的流行性感冒病毒感染。
30. -种中和有需要的受试者中的流行性感冒病毒的方法，其中所述方法包括对所述 受试者给药有效量的i)根据权利要求1至23中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片 段，或ii)根据权利要求24或25所述的医药组合物，从而中和所述受试者中的所述流行性 感冒病毒。
31. -种抑制有需要的受试者的流行性感冒病毒感染的建立的方法，其中所述方法包 括对所述受试者给药有效量的i)根据权利要求1至23中任一项所述的抗流行性感冒抗体 或抗体片段，或ii)根据权利要求24或25所述的医药组合物，从而抑制所述受试者中的所 述流行性感冒病毒感染的建立。
32. -种抑制有需要的受试者的流行性感冒病毒感染散播的方法，其中所述方法包括 对所述受试者给药有效量的i)根据权利要求1至23中任一项所述的抗流行性感冒抗体或 抗体片段，或ii)根据权利要求24或25所述的医药组合物，从而抑制所述受试者中的流行 性感冒病毒感染的散播。
33. -种抑制流行性感冒病毒进入细胞的方法，其中所述方法包括对所述受试者给药 有效量的i)根据权利要求1至23中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，或ii) 根据权利要求24或25所述的医药组合物，从而抑制所述流行性感冒病毒进入所述受试者 中的细胞。
34. 根据权利要求29至33中任一项所述的方法，其中所述流行性感冒为H1N1、H2N2、 H3N2,或适应人类的H5病毒株。
35. 根据权利要求29至34中任一项所述的方法，其中所述受试者具有流行性感冒感染 或发展流行性感冒感染的风险。
36. 根据权利要求35所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物。
37. 根据权利要求36所述的方法，其中所述受试者为人类。
38. 根据权利要求35或36所述的方法，其中所述受试者易受病毒感染。
39. 根据权利要求38所述的方法，其中所述受试者为怀孕女性。
40. 根据权利要求38所述的方法，其中所述受试者为年轻受试者或婴儿受试者。
41. 根据权利要求38所述的方法，其中所述受试者为老年受试者。
42. 根据权利要求29至41中任一项所述的方法，其中i)所述抗流行性感冒抗体或抗 体片段，或ii)所述医药组合物是通过肌内注射、静脉注射、皮下注射、或吸入而给药。
43. -种抑制流行性感冒病毒进入细胞的方法，其中所述方法包括使具有流行性感冒 病毒感染或有发展流行性感冒病毒感染的风险的细胞与i)根据权利要求1至23中任一项 所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，或ii)根据权利要求24或25所述的医药组合物接 触，从而抑制流行性感冒病毒进入所述细胞。
44. 根据权利要求43所述的方法，其中所述流行性感冒为H1N1、H2N2、H3N2适应人类 的H5病毒株。
45. -种治疗或预防流行性感冒病毒感染的试剂盒，其中所述试剂盒包括有效量的i) 根据权利要求1至23中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，或ii)根据权利要求 24或25所述的医药组合物。
46. -种中和流行性感冒病毒的试剂盒，其中所述试剂盒包括有效量的i)根据权利要 求1至23中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，或ii)根据权利要求24或25所 述的医药组合物。
47. -种抑制流行性感冒病毒感染的建立的试剂盒，其中所述试剂盒包括有效量的i) 根据权利要求1至23中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，或ii)根据权利要求 24或25所述的医药组合物。
48. -种抑制流行性感冒病毒感染的散播的试剂盒，其中所述试剂盒包括有效量的i) 根据权利要求1至23中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，或ii)根据权利要求 24或25所述的医药组合物。
49. 一种抑制流行性感冒病毒进入细胞的试剂盒，其中所述试剂盒包括有效量的i)根 据权利要求1至23中任一项所述的抗流行性感冒抗体或抗体片段，或ii)根据权利要求24 或25所述的医药组合物。
50. 根据权利要求45至49中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括治疗剂。
51. 根据权利要求50所述的试剂盒，其中所述治疗剂抑制流行性感冒感染。
52. 根据权利要求45至51中任一项试剂盒的试剂盒，还包括在根据权利要求29至44 中任一项所述的方法中使用所述试剂盒的指示。
53. 根据权利要求45至52中任一项试剂盒的试剂盒，其中所述流行性感冒为H1N1、 H2N2、H3N2或适应人类的H5病毒株。
【文档编号】A61K47/48GK104114186SQ201280046220
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2012年8月3日 优先权日:2011年8月3日
【发明者】J·惠特尔, S·C·哈里森, B·F·海恩斯, H-x·廖, M·A·穆迪, T·B·开普勒, A·G·施密特 申请人:儿童医疗中心有限公司, 杜克大学