用于治疗退行性视网膜病况的组合物和方法
【专利摘要】本发明涉及用于治疗退行性视网膜病况的组合物和方法。根据一般方面，本发明涉及炎症介质，优选NLRP3-炎性小体的组分或底物，其用于治疗包括玻璃疣和过敏毒素诱导的脉络膜-新生血管形成的退行性视网膜病况。本发明还涉及用于治疗包括玻璃疣和过敏毒素诱导的脉络膜-新生血管形成的退行性视网膜病况的方法和涉及用于此类方法的重组载体和重组蛋白。本发明还提供了用于确定发展包括玻璃疣和过敏毒素诱导的脉络膜-新生血管形成的疾病的风险或监测其进展的方法。
【专利说明】用于治疗退行性视网膜病况的组合物和方法
[0001]本发明涉及用于治疗退行性视网膜病况的组合物和方法。
[0002]具体地，本发明涉及用于治疗包括玻璃疣和过敏毒素诱导的脉络膜新生血管形成的退行性视网膜病况的组合物和方法，以及涉及指导选择的基因产物(包括炎症介质、NLRP3-炎性小体的组分或底物)的表达的基因递送载体的用途，所述基因产物适合用于治疗或预防包括玻璃疣和过敏毒素诱导的脉络膜新生血管形成的退行性视网膜病况，包括病理地诱导的CNV。优选地，包括玻璃疣和过敏毒素诱导的脉络膜新生血管形成的退行性视网膜病况是年龄相关黄斑变性。
[0003]在发达国家，年龄相关黄斑变性(AMD)是老年个体中法定盲的最普遍的原因。AMD是进行性疾病，特征在于局灶性细胞外沉着物在黄斑中视网膜色素上皮(RPE)下的布鲁赫膜上的积聚，其在眼科检查中被公认为玻璃疣。玻璃疣积聚是干性和湿性AMD的共同主要病理标志物。玻璃疣在黄斑中的存在、沉着物的密度和被该材料覆盖的面积代表AMD疾病过程的早期阶段。具有玻璃疣的个体被认为处于进展至AMD的末期致盲形式(blindingform)的风险中。地图状委缩(GA)，AMD的萎缩“干性”形式的末期，在中央凹下的RPE的局灶性变性后以视力丧失告终。在无RPE的情况下，中央凹锥形光感受器变性，引起中央视网膜失明。脉络膜新生血管形成(CNV)表征了 AMD的渗出性“湿性”形式的末期，新血管突破出血的布鲁赫膜/RPE，从而在RPE与中央凹光感受器之间引起血块形成，从而导致立即失明。 [0004]疾病AMD是在分类上是多因素的，牵涉环境和遗传因素。与疾病易感性相关的序列变体现已被表征为数目不断增加的免疫调节的基因。眼表面上补体的活化被认为在早期疾病过程中起着主要作用，从而导致玻璃疣沉着。然而，在AMD受试者的眼中观察到的炎症反应的起始中所涉及的机制仍不清楚。
[0005]玻璃疣沉着物在本质上是天然的细胞外颗粒蛋白质聚集体，特征在于由含NACHT、LRR和PYD结构域的蛋白质3(NLRP3)介导的无菌炎症反应的已知激活物。NLRP3用作“危险”信号例如ATP、尿酸晶体、淀粉样蛋白样结构和线粒体功能障碍的受体，其活化包含NLRP3的炎性小体，包含半胱天冬酶募集结构域(ASC)和半胱天冬酶前体-1并且导致IL-1 β前体和IL-18前体裂解成它们的成熟促炎性形式的细胞凋亡相关斑点样结构域。此外，过量玻璃疣的积聚可破坏邻近的RPE细胞，所述细胞随后通过坏死(一个现在已知活化NLRP3炎性小体的细胞过程)死亡。
[0006]目前基于抗体的疗法通过抑制VEGF的生物活性来靶向AMD的晚期形式。然而，这些单克隆抗体( Lueentis?和Avastin? )的直接和定期眼内注射具有视网膜脱离、出血和感染的危险。对于干性黄斑变性还没有FDA批准的治疗，尽管少数治疗现在处于临床试验中。因此,新型AMD疗法的产生在商业上是重要的。
[0007]从临床角度来看,虽然炎症过程很久以来与AMD病理和疾病发展相关，但我们认为在湿性AMD的情况下视网膜的炎症的全局性抑制可能不是可靠疗法。通过借力给我们的
观察，英利昔单抗(Remicade?)在具有湿性AMD的个体中的最近的临床试验的结果显示在超过50 %的这些受试者中，症状极大地恶化。
[0008]IL-18是具有众多功能的分子，所述功能中有许多取决于IL-18被释放至其中的环境是彼此二元对立的。对于IL-18在调控血管生成或血管生长中的作用，情况就是这样。例如，已显示IL-18在类风湿关节炎的模型中具有促血管生成作用(Park等人，2001，Evidence of IL_18as a novel angiogenic mediator.Journal of Immunologyl67:1644-1653)，然而已显示其在疱疹性角膜基质炎中是抗血管生成的(Kim B等人，2006，Application of plasmid DNA encoding IL_18diminishes development of herpeticstromal keratitis by antiangiogenic effects.Journal of Immunologyl75:509-516)。IL-18作为血管生成剂的作用相对其作为抗血管生成剂的作用之间的差异的原因仍然不清楚，但部分受所牵涉的特定血管床决定。
[0009]Qiao 等人(Interleukin_18Regulates Pathological IntraocularNeovascularaization.Journal of Leukocyte Biology.第 81 卷，2007 年4 月，1012-1021)使用早产儿视网膜病的氧诱导的模型，其触发眼内新生血管形成的发展。眼内新生血管形成包括内衬在内部视网膜的血管的新生血管形成。Qiao等人在氧诱导的视网膜病变的发展过程中向C57BL/6小鼠施用重组IL-18，并且发现无新生血管形成的抑制。Qiao等人推断IL-18通过促进其消退而非抑制其发展来调控眼内视网膜新生血管形成。[0010]本发明涉及用于退行性视网膜病况的新型和改进的疗法，所述退行性视网膜病况包括玻璃疣和过敏毒素诱导的脉络膜新生血管形成和/或病理性诱导的CNV，优选与AMD相关的脉络膜新生血管形成，更优选湿性AMD。
[0011]脉络膜是处于眼外并且与视网膜完全分离的血管床。其不以与视网膜眼内血管系统相同的方式起作用。脉络膜新生血管形成(CNV)是眼的脉络膜层中新血管的产生。这是退行性黄斑病变湿性AMD (年龄相关黄斑变性)的共同症状并且与Qiao等人的视网膜新生血管形成(眼内)不同。
[0012]在本说明书中，术语脉络膜新生血管形成(CNV)理想地不包括视网膜新生血管形成(眼内)。眼内新生血管形成牵涉内衬内部视网膜的血管的新生血管形成。这与牵涉脉络膜(处于眼外并且与视网膜完全分离的血管床)的脉络膜新生血管形成不同。理想地，在本说明书中，不包括IL-18用于眼内新生血管形成的用途。
[0013]在本说明书中，术语“NLRP3炎性小体、组分或底物”经理解涵盖NALP3、ASC和半胱天冬酶前体-1和IL-18前体和IL-18。当NLRP3、ASC和半胱天冬酶前体_1寡聚体化时，它们产生活性半胱天冬酶-1，所述酶随后将IL18前体裂解成成熟的11-18。因此，IL18前体是炎性小体的组分，因为其是半胱天冬酶-1的底物。IL-18的24KDa无活性前体称为“IL-18 前体”，并且 18KDa 成熟 IL-18 称为 “IL-18” 或“促炎性 IL-18”。NLRP3 和 NALP3 在本说明书中可互换使用，并且是指相同的炎性小体组分。在优选实施方案中，NLRP3炎性小体、组分或底物是成熟的11-18，称为“11-18”。应理解对IL-18的引用还意指由NCBI登录号NM_001562.3定义的核苷酸序列和由NCBI登录号NP_001553.1定义的蛋白质序列。还应理解，对IL-18的递送的引用还涵盖重组IL-18(rIL-18)的递送，例如通过眼内注射局部递送或通过静脉内注射全身递送。
[0014]我们已显示从供体AMD眼分离的玻璃疣活化NLRP3-炎性小体，从而引起IL-1 β和IL-18的分泌。玻璃疣组分ClQ也活化NLRP3-炎性小体。此外，氧化应激相关蛋白质修饰羧乙基比咯(CEP) (AMD的生物标志物)引发炎性小体。我们已在CEP-MSA-免疫的小鼠的视网膜中的活化的巨噬细胞中发现该裂解的半胱天冬酶-1和NLRP3，所述小鼠建立了干性AMD样病理学的模型。我们显示激光诱导的脉络膜-新生血管形成(CNV)(湿性AMD的公认动物模型)在Nlrp3-/-但非Illrl-/-小鼠中恶化，从而直接表明IL-18参与调节CNV发展。这些发现表明NLRP3和IL-18在AMD进展中的保护性作用。
[0015]我们的意见是NLRP3及其组分直接用作抗AMD的主要疾病病理学的保护剂。因此，目的在于产生IL-18或将其递送至眼的策略可证明在阻止CNV的进展中，特别地在湿性AMD的情况中是有益的。
[0016]根据本发明的第一一般方面，提供了炎症介质，优选NLRP3-炎性小体的组分或底物以用于治疗包括玻璃疣和过敏毒素诱导的脉络膜-新生血管形成的退行性视网膜病况。
[0017]本发明的视网膜(眼内)新生血管形成和脉络膜(眼外)新生血管形成是血管系统的不同病况。我们已发现IL-18抑制脉络膜新生血管形成的增进。
[0018]理想地，NLRP3-炎性小体的组分或底物是IL-18，包括重组IL-18。
[0019]理想地，视网膜病况包括病理地诱导的CNV，例如与AMD相关的脉络膜-新生血管形成(CNV)，优选干性和/或湿性AMD，更优选湿性AMD。
[0020]根据本发明的该一般方面，炎症介质、组分或底物可用于控制、维持或刺激白细胞介素-18(IL-18)在处于发展年龄相关黄斑变性的风险中的受试者中的表达并且阻止CNV的进展，特别是在湿性AMD的情况中。
[0021]应理解，还可使用炎性小体的上游组分。这些组分包括NLRP3、ASC或半胱天冬酶前体-1、IL-18前体等。然而，IL-18或重组IL-18的递送是优选的。
[0022]理想地，在新生血管疾病的发展之前或在早期新生血管疾病中施用炎症介质、组分或底物，包括白细胞介素-18(IL-18)。
[0023]玻璃疣对NLRP3炎性小体的活化表明平衡可存在，由此一定局灶性水平的玻璃疣因其诱导IL-18的能力而被耐受，所述IL-18反过来可用作抗血管生成效应物，从而维持炎症性微环境中的脉络膜体内平衡。还可能的是一旦积聚临界水平的玻璃疣，其保护作用就因对周围组织的过度损害而被否定。重要的是，我们已证明玻璃疣可诱导的炎症介质可保护免受CNV发展，并且正是所得的NLRP3介导的IL-18的升高阻止VEGF的下游产生。此外，已显示IL-18在实验性葡萄膜炎(一种更常规的炎症模型)的发展中不起作用。
[0024]根据一个实施方案，退行性视网膜病况是年龄相关黄斑变性。应理解，整个本说明书中提及的年龄相关黄斑变性可以是湿性年龄相关黄斑变性或干性年龄相关黄斑变性。
[0025]根据本发明的优选实施方案，提供了用于控制处于发展湿性年龄相关黄斑变性(AMD)的风险中的患者的脉络膜-新生血管形成(CNV)的白细胞介素-18(11-18)或重组IL-18。所得的NLRP3介导的IL-18的升高防止VEGF的下游产生，我们发现这保护免受CNV发展。
[0026]应理解本文中对IL-18的所有引用还指重组IL-18(rIL_18)。
[0027]根据本发明的一般方面，IL-18或重组IL-18可被施用来产生和提供局部作用或全身性作用。
[0028]可施用IL-18或重组IL-18蛋白本身。IL-18或重组IL-18还可以药物组合物的形式施用。任选地，IL-18可与药学上可接受的佐剂一起施用。此类佐剂可包括载体、稀释剂和赋形剂例如无菌水和油。其它佐剂、赋形剂和辅助物质列于以下。
[0029]应理解，可通过多种途径进行施用。这些途径被设计来按需提供局部或全身性作用。这些途径包括但不限于口服、局部、经肺、经直肠、皮下、真皮内、鼻内、颅内、肌内、眼内或关节内注射等。最典型的施用途径是静脉内施用，其次皮下施用，尽管其它途径可同样有效。还可在手臂或腿部肌肉中进行肌内注射。
[0030]在一些方法中，可将IL-18直接注射入特定组织。在其它实施方案中，施用可作为持续释放组合物的部分。
[0031]对于胃肠外施用，可将IL-18以可注射剂量的物质在生理上可接受的稀释剂中的溶液或悬浮液与药物载体(其可以是无菌液体例如水、油、盐水、甘油或乙醇)一起施用。此外，辅助物质例如湿润剂或乳化剂、表面活性剂、PH缓冲物质等可存在于组合物中。药物组合物的其它组分是石油、动物、植物或合成来源的组分，例如花生油、大豆油和矿物油。一般地，二醇例如丙二醇或聚乙二醇是适当的液体载体，特别地用于可注射溶液。
[0032]还可以以积存注射或植入物制剂的形式施用IL-18，可以以这样的形式配制IL-18以允许蛋白IL-18的持续释放。
[0033]通常，组合物可被制备为可注射的，制备为液体溶液或悬浮液；还可制备适合于在注射之前于液体媒介物中形成溶液或悬浮液的固体形式。制剂还可被乳化或封装在脂质体或微粒例如聚乳酸、聚乙交酯或共聚物以增强递送。
[0034]口服制剂可采用溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊剂、持续释放制剂或粉剂的形式。局部施用可导致经皮肤或真皮内递送。或者，经皮肤递送可使用皮肤贴剂来实现。
[0035]理想地，上述施用模式导致IL-18至眼，优选至视网膜，更优选至脉络膜层的递送。
`[0036]根据本发明的优选实施方案，局部递送法包括IL-18、rIL-18或包含IL-18/rIL-18的药物组合物至眼的直接注射，例如眼内注射。注射可以是视网膜下的，进入眼的玻璃质的(玻璃体内)、眼后的(眼球后的)、在结膜下的(结膜下的)或在眼球筋膜下的(球筋膜下)。
[0037]根据另一个优选实施方案，促炎性白细胞介素-18(IL-18)、rIL_18或包含IL-18/rIL-18的药物组合物可被全身性递送至受试者。全身性递送方法可包括胃肠外或肠内方法，并且基本上包括所有非局部递送方法。理想地，全身性递送方法包括注射、直接注射和/或病毒介导的递送。
[0038]根据优选实施方案，全身性注射技术包括通过静脉内注射进行的静脉内递送。静脉内注射可以是至受试者的外周静脉。对于该施用途径，将IL-18、rIL-18或包含IL-18/rIL-18的药物组合物直接施用/注射进入受试者的血流。
[0039]优选地，通过直接注射例如静脉内注射和/或通过病毒介导的递送将IL-18全身性递送至视网膜。
[0040]病毒介导的递送技术包括腺病毒相关病毒(AAV)、腺病毒或慢病毒基因递送载体。任选地，病毒介导的递送技术，包括AAV疗法，可通过引入NLRP3、ASC或半胱天冬酶前体_1来应用于炎性小体组分的上游。
[0041]根据本发明的另一个优选实施方案，提供了指导IL-18前体或IL-18以适合用于治疗脉络膜新生血管形成的形式表达的重组病毒基因递送载体。[0042]重组病毒基因递送载体可以呈用于全身性施用例如通过静脉内施用的形式。
[0043]重组病毒基因递送载体还可以呈用于向处于发展AMD优选湿性AMD的风险中的受试者的眼施用的形式。
[0044]例如，载体可以呈适合用于通过眼内注射包括视网膜下或玻璃体内注射递送至眼的形式。
[0045]病毒载体可以是腺病毒相关病毒(AAV)、腺病毒或慢病毒基因递送载体。理想地，基因递送载体的递送是通过视网膜下注射，其中例如，将少量液体注射在视网膜下。这在单次施用后长期疾病管理方面具有优势。载体还可被最优化来用于受试者的玻璃体内施用。
[0046]根据本发明的最优选实施方案，提供了用于包括玻璃疣和过敏毒素诱导的脉络膜-新生血管形成，优选湿性AMD的退行性视网膜病况的新型基因疗法，包括使用IL-18的病毒，优选AAV介导的至受试者的递送，以控制、维持或刺激白细胞介素-18 (IL-18)在处于发展包括玻璃疣和过敏毒素诱导的脉络膜-新生血管形成的退行性视网膜病况，例如年龄相关黄斑变性(AMD)的风险中的受试者中的表达。
[0047]根据该优选实施方案，提供了重组腺病毒相关病毒(AAV)基因递送载体，其指导适合用于向处于发展AMD优选湿性AMD的风险中的受试者的眼施用的IL-18的表达。
[0048]AAV载体包含编码11-18基因的核苷酸。AAV可以是AAV血清型I至11中的任一种，优选血清型2、8或9。理想地，IL-18基因侧翼连接有AAV反向末端重复(ITR)。
[0049]可使用许多不同的启动子。这些启动子理想地是细胞特异性启动子。这些启动子可包括视网膜色素上皮细胞(RPE)特异性启动子例如CRALBP或RPE65、内皮细胞特异性启动子例如Tie-2或claudin-5,或光感受器特异性启动子包括视紫质。
[0050]AAV是用于眼疾病的主要病毒`载体，因为其在转导视网膜细胞中是非常高效的。其也不具有免疫原性，从临床观点来看这是非常重要的。AAV技术已显现为将基因递送至宿主组织，特别是中枢神经系统的组织例如视网膜的非常安全的方法。与可整合进入宿主基因组的腺病毒相反，AAV将感染细胞，并且随后它们的遗传物质将作为附加型DNA保留在细胞核中。该因素对于它们的优良安全特征和低免疫原性可能是关键的。同时，AAV技术现正被用于帕金森病、阿尔茨海默病和肌营养不良症的一些列临床试验，并且与该方案相关，AAV现被确认用于视网膜应用，其中称为先天性利伯氏黑蒙(LCA)的色素性视网膜炎的隐性形式的治疗的许多临床试验正在进行中。
[0051]迄今为止，11种AAV血清型已描述于文献中并且这些血清型的关键差异与它们可感染的靶细胞相关。已发现AAV-2、AAV-8和AAV-9有效地转导RPE细胞。因此，本发明可优选地包括AAV-2、AAV-8和/或AAV-9的用途。
[0052]根据一个优选实施方案，本发明包括通过克隆编码IL18的基因(包括5'和3' UTR)并且将该基因引入载体例如以并入左和右AAV末端重复(L-1TR和R-1TR)来构建载体(例如，AAV载体例如AAV血清型-2、-8和-9)。
[0053]根据本发明的第二方面，提供了治疗包括玻璃疣和过敏毒素诱导的脉络膜-新生血管形成的退行性视网膜病况的方法，包括向需要治疗的受试者施用炎症介质、NLRP3-炎性小体的组分或底物。
[0054]根据优选实施方案，提供了用于治疗湿性年龄相关黄斑变性(AMD)的方法，包括向处于发展年龄相关黄斑变性的风险中的受试者施用白细胞介素-18(11-18)。可施用IL-18来提供局部或全身作用。
[0055]根据优选实施方案，局部递送方法包括直接眼内注射。注射可以是视网膜下的，进入眼的玻璃质内的(玻璃体内)、眼后的(眼球后的)、在结膜下的(结膜下的)或在眼球筋膜下的(球筋膜下)。
[0056]根据另一个优选实施方案，促炎性白细胞介素-18 (IL-18)可被全身递送至受试者。全身递送方法可包括胃肠外或肠内方法，并且基本上包括所有非局部递送方法。理想地，全身递送意指包括注射、直接注射和/或病毒介导的递送。根据最优选实施方案，全身注射技术包括通过静脉内注射进行的静脉内递送。静脉内注射可以是至受试者的外周静脉。对于该施用途径，直接将重组IL-18施用/注射进入受试者的血流。
[0057]根据本发明的第三方面，提供了 NLRP3-炎性小体诱导的介质，优选促炎性IL-18 (11-18)用作表示发展包括玻璃疣和过敏毒素诱导的脉络膜新生血管形成的疾病(例如湿性或干性年龄相关黄斑变性)的风险的生物标志物的用途。
[0058]根据本发明的第四方面，提供了用于使用炎性小体诱导的介质，优选促炎性IL-18(IL-18)作为生物标志物确定受试者中发展包括玻璃疣和过敏毒素诱导的脉络膜新生血管形成的疾病(例如湿性或干性年龄相关黄斑变性)的风险或监测所述疾病的进展的方法，所述方法包括:
[0059]获得受试者中循环IL-18的水平和/或IL-18结合蛋白水平；
[0060]将IL-18的水平和/或IL-18结合蛋白水平与参照相比较，其中受试者的疾病玻璃疣和过敏毒素诱导的脉络膜-新生血管形成的发展或进展的风险基于与参照相比较的IL-18水平和/或IL-18结合蛋白的水平。
[0061]应理解，IL-18与其结合蛋白(IL-18结合蛋白)的比率常规地用作与正常参照相比较的变化的量度，尽管可单独使用IL-18水平。
[0062]现结合下列非限定性附图和实施例描述本发明:
[0063]图1:玻璃疣活化NLRP3炎性小体:(a)来自不吸烟的未受影响的、干性和湿性AMD影响的个体的眼底照相。(b)在从正好在500 μ m以下的尺寸至亚显微尺寸的颗粒的范围内的玻璃疣碎片。(c)布鲁赫膜(BM)/玻璃疣制剂的SDS-PAGE分析。(d)稳定地表达黄色荧光蛋白标记的-ASC(YFP-ASC)的永生化BL6BMDM的活细胞成像。用LPS引发细胞3小时，随后用250ng mr1玻璃疣再处理2小时，聚(脱氧腺苷酸脱氧胸苷酸)用作阳性对照。通过斑点形成观察ASC-YFP的寡聚化，原始放大倍数x60。(e, f)通过ELISA测量利用IOOngIiir1LPS引发过夜，随后用递增剂量的玻璃疣制剂(250ng cm-1和500ng cm-1)处理7小时的人PBMC中IL-1 β和IL-18的产生(林*Ρ ( 0.0001)。(g)在用玻璃疣处理THP-1细胞后半胱天冬酶-1的裂解产物的Western印迹。(h)如通过ELISA测量的用递增剂量的玻璃疣处理后的野生型(WT)(蓝色条)和NLRP3-缺陷型(Nlrp3+)(红色条)骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)的IL-1 β (左手图)和IL-6 (右手图)的产生(#*Ρ ( 0.0001)。⑴如通过ELISA测量的用递增剂量的玻璃疣处理后WT (蓝色条)和Ν11'ρ3+(红色条)骨髓来源的树突细胞(BMDC)的IL-1 β (左手图)和TNF □(右手图)的产生(#*Ρ ( 0.0001)。所有ELISA数据代表以一式三份进行的最少3次独立的实验。
[0064]图2:玻璃疣的组分CEP可引发NLRP3炎性小体:(a)以递增剂量(50和100 μ gmr1)利用LPS、CEP加合的白蛋白(CEP-HSA)或HSA引发的，并随后利用5mM ATP处理的人PBMC中IL-1 β的产生。(b)利用CEP-HSA引发的和随后利用ATP或聚(脱氧腺苷酸脱氧胸苷酸)(Poly (dAdT))活化的WT和Nlrp3^BMDM中IL-1 β的产生。(c，d)利用HSA或CEP-HSA引发的，利用ATP活化的或不进行处理的WT或Tlr2+BMDM中IL-1 β和IL-6的产生。(e，f)测量利用LPS或CEP引发的和利用ATP活化的C3H/HeN BMDM(WT)或C3H/HeJBMDM(其包含突变的TLR4)中IL-1 β和TNF α的产生。(g)稳定地表达YFP-ASC的永生化的BL6BMDM的活细胞成像。利用CEP-HSA(上图)或HSA(下图)引发细胞3h，随后利用250ng/ml玻璃疣处理细胞，再进行2小时。通过斑点形成观察ASC-YFP的寡聚化，原始放大倍数x60。所有ELISA数据代表以一式三份进行的最少3次独立的实验。
[0065]图3:玻璃疣的组分补体因子ClQ活化NLRP3炎性小体:(a)在利用CEP引发3h的并且以递增的剂量利用Clq活化6h的BMDM中IL-1 β (左图)和TNF α (右图)的产生。(b)利用LPS引发的并且以递增剂量的ClQ处理的THPl细胞中半胱天冬酶_1裂解产物的Western印迹。(c)稳定地表达YFP-ASC的永生化BL6BMDM的活细胞成像。利用LPS (上图)或CEP-HSA引发细胞3小时，随后用IOyg ml+ClQ(右图)处理另外2小时。通过斑点形成(最初放大倍数x60)观察ASC-YFP的寡聚化。(d)利用LPS(3h)引发的并且以递增剂量(2.5、5 和 10 μ g Hir7XlQ)利用 ClQ (16h)活化的 WT 和 Nlrp3_/_BMDC 中的 IL-1 β (左图)和TNF-α (右图)产生。(e)利用IOOng ml+LPS引发过夜并且利用5μ g ml+ClQ活化6h，外加在ClQ处理之前Ih用递增剂量(10倍)的ZVAD (半胱天冬酶-1抑制剂)处理的人PBMC中的IL-1 β、IL-18和IL-6产生。所有ELISA数据代表以一式三份进行的最少3次单独的实验。
[0066]图4 =CEP-MSA人源化小鼠中裂解的半胱天冬酶-1plO与活化的巨噬细胞共定位:(a-c)CEP-MSA免疫的小鼠的视网膜冰冻切片的免疫染色显示F4/80阳性巨噬细胞定位至(a)脉络膜的区域(b)从脉络膜延伸至布鲁赫膜和(c)存在于视网膜的外节段(OS)和外核层(ONL)中的RPE上方。(a，b)上图(c)左手图，微分干涉差(DIC)图像，(a，b)下图(c)右手图，荧光图像(F4/80-红，DAP1-蓝)。(d，e)利用半胱天冬酶-1plO (红)和F4/80 (绿)进行的CEP-MSA免疫的小鼠的视网膜冰冻切片的共标记显示(d)存在于脉络膜/布鲁赫膜内和外的巨噬细胞和(e)视网膜的OS中的巨噬细胞前突中的共定位。(f)CEP-MSA免疫的小鼠的视网膜冰冻切片的共标 记显示NLRP3 (红)和F4/80 (绿)的共定位。(g)高放大倍数的NLRP3和F4/80染色。
[0067]图5:NLRP3以不依赖于IL-1 β的方式保护免受激光诱导的CNV损伤形成:(a)显示激光烧伤后6天CNV发展的WT(上左图)4111)3+(上中图)和上右图)小鼠中的激光诱导的CNV。来自WT(下左图)、Nlrp3+(下中图)和Illrl+(下右图)的共焦Z-stack的三维重构图像。CNV体绘制(条形图)。(b)Nlrp3+和Illrl+小鼠的视杆和视锥功能的视网膜电图(ERG)分析。(c)显示活化的巨噬细胞(F4/80-绿色)至Nlrp3+小鼠中激光诱导的损伤部位的定位的免疫染色。(d)损伤后3小时WT (左手图)或Nlrp3+(右手图)视网膜冰冻切片的裂解的半胱天冬酶-1 (红色)的免疫染色。
[0068]图6:NLRP3通过其在IL-18产生中的作用赋予其抗CNV损伤形成的保护作用，这反过来调节VEGF水平:(a) 1118+小鼠的视杆和视锥功能的视网膜电图(ERG)分析。(b)显示激光烧伤后6天CNV发展的1118+小鼠中的激活诱导的CNV(左手图)。共焦Z-stack的三维重构图像(右手图)。CNV体 绘制(条形图)。(c)相较于WT小鼠CNV体积显著增加(图5) (*P = 0.0292)。在利用递增剂量的IL-18处理24小时或不进行处理的(d)ARPE_19细胞和(e)小鼠脑微血管内皮细胞(B.end3)中通过ELISA测定VEGF的产生。ELISA数据代表以一式三份进行的最少3次独立的实验。
[0069]图7: (a) ARPE-19细胞(左侧)和THPl细胞(右侧)中NLRP3表达的Western印迹，上样等量的蛋白质，如通过BCA测定的。(b)使ARPE-19细胞利用不同TLR配体:100ng/mlLPS 或 2 μ g/mlPam3Cys 或 25 μ g/ml 聚肌胞苷酸(Poly (1:C))或 I μ g/mlR848 或 5 μ g/mlCpG-ODN引发，和不进行处理或利用ATP再活化I小时。随后测量IL-1 β的产生。
[0070]图8:a)在光学显微镜下观察到RPE汤(RPE soup)包含在玻璃疣分离后产生的视网膜/RPE材料。b)将该材料(100ng/ml、250ng/ml和500ng/ml)添加至LPS引发的PBMC但不引起IL-1 β水平，或c) IL-18水平的升高。d)IL-6表达未随RPE汤的剂量递增而改变。e)RPE汤未引发WT或Nlrp3+小鼠BMDC的IL-1 β水平改变。f)在实验组之间不存在IL-6表达的差异变化。
[0071]图9:在利用玻璃疣处理THPl细胞后半胱天冬酶-1PlOWestern印迹的密度计分析。
[0072]图10:a)IL-1P水平在通过ATP活化的LPS引发的WT和Tlrf+BMDM中显著升高，b)IL-6水平没有显著不同。
[0073]图11:在利用递增剂量的ClQ处理THPl细胞后半胱天冬酶-1PlOWestern印迹的密度计分析。
[0074]图12:溶液中ClQ的ζ电位测量显示平均ζ电位为11.8mV。
[0075]图13:利用100ng/ml LPS引发过夜并且利用5 μ g/ml ClQ活化6h，外加在ClQ处理前Ih利用递增剂量(10倍)的(&)0?10^抑制剂)、(13)巴弗洛霉素(Bafilomycin)(抑制溶酶体酸化)、(c)CA-074Me (组织蛋白酶B抑制剂)处理的人PBMC中的IL-1 β、IL-18和IL-6产生。
[0076]图14 =CEP-MSA免疫的小鼠的视网膜的⑶68染色(红色)，显示巩膜和视网膜的外节段(OS)中的阳性细胞。
[0077]图15:对CEP-MSA免疫的小鼠视网膜冰冻切片的NLRP3进行染色，并且在(a)视网膜的外节段、(b)视网膜色素上皮(RPE)、(c)巩膜内的细胞和⑷脉络膜内的细胞中观察到阳性免疫反应性。
[0078]图16:共定位至WT小鼠中的激光诱导的CNV部位(右图)的F4/80 (左图，红色)和半胱天冬酶-1plO (中间图，绿色)。
[0079]图17:在损伤后24h，WT小鼠(左图-红色染色)的激光诱导的损伤部位中观察到的IL-18。该染色在Mrp3+小鼠(右图-红色染色)的损伤部位上不明显。
[0080]图18 (a)中和IL-18 (I μ g)抗体注射的激光诱发后的CNV显著增加WT小鼠的CNV尺寸，如通过表面荧光显微技术测量的，(b) CNV的共聚焦、Z-stack三维渲染图像。(C)在激光损伤后相较于虚假注射的小鼠在利用I μ gIL-18中和抗体注射的WT小鼠中观察到显著增加的 CNV (*P = 0.0368)。
[0081]图19 (a) BMDC和(b)BMDM的⑶IIc和⑶IIb染色的流式细胞术分析。
[0082] 图20(a) RPE与光感受器的外节段相邻。(b)利用引起50μπι直径损伤的532nm激光进行的视网膜/RPE/布鲁赫膜/脉络膜复合物的靶向热破坏，加纳籽(Griffoniasimplicifolia)同工凝集素-Alexa-568 (红色)和鬼笔环妝(Phalloidin)-Alexa-488 (绿色)。
实施例
[0083]材料和方法
[0084]玻璃疣分离
[0085]如先前所述⑶从6个AMD供体的眼(88M、91F、97M、85F、85M和80M)分离玻璃疣和少量布鲁赫膜以用于这些实验。
[0086]CEP-白蛋白产生
[0087]如先前所述(54)利用CEP加合人血清白蛋白(Sigma Aldrich, USA)。
[0088]ELISA 分析
[0089]将ELISA用于定量来自本研究从始至终使用的不同实验组的上清液中的细胞因子。从始至终分析 IL-1 β (RnD 系统)、IL-18 (MBL 国际)、IL-6 (RnD 系统)、TNF- a (RnD系统)和VEGF(RnD系统)。以一式三份进行所有ELISA最少3次。在在炎性小体活化之前Ih以下列最高浓度添加本研究中使用的抑制剂:I μ g/ml的半胱天冬酶-1抑制剂VI (Calbiochem)、5 μ M 细胞松弛素 D (Sigma Aldrich, Ireland)、10 μ MCA-O74Me (组织蛋白酶 B 抑制剂)(Sigma Aldrich, Ireland)、10 μ MDPI (Sigma Aldrich, Ireland)。
[0090]Western 印迹分析
[0091]一般而言,在4°C下在膜上使对半胱天冬酶-1 (Santa-Cruz Biotech)、β -肌动蛋白(Abeam)、NLRP3 (Sigma Aldrich, Ireland) > TLR-4 (Santa-Cruz Biotech)特异的抗体温育过夜。利用TBS洗涤膜，并且与有辣根过氧化物酶(HRP)缀合物的抗兔二抗(IgG)(1: 2500) (Sigma-Aldrich, Ireland)或小鼠(IgG) (1: 1000) (Sigma-Aldrich, Ireland)在室温下温育3小时。使用增强化学发光(ECL)检测免疫复合物。重复所有Western印迹最少3次。
[0092]细胞培养
[0093]ARPE-19 细胞系(ATCC CRL2302)获自 LGC promochem, THPl 细胞和原代分离的人外周血单核细胞(PBMC)用于体外炎性小体活化测定。将细胞在37°C、5% C02、95%的空气下于达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco' s modified Eagle' s medium) (DMEM)和Han^ s F12培养基(具有1.2g/L碳酸氢钠、2.5mM L-谷氨酰胺、15mM HEPES.0.5mM丙酮酸钠(Sigma Aldrich)和10%胎牛血清(FCS))的1:1混合物中进行培养。还从同类系 C57/B16 背景的 WT、NLRP3-/-、TLR-2-/-、C3H/HeN 和 C3H/HeJ 小鼠分离 BMDC 和 BMDM。利用抗CDIIc-APC和抗CDllb_PeCy7对BMDC和BMDM进行染色。针对活的单细胞对细胞进行分类，并通过流式细胞术评价⑶Ilc和⑶Ilb的表达(图19)。使小鼠bEnd.3微血管内皮细胞在纤连蛋白(Sigma Aldrich Ireland)涂覆的组织培养瓶中于包含Glutamax和10%FCS的DMEM上生长。
[0094]ASC斑点形成分析
[0095]利用LPS、HSA或CEP-HSA引发表达黄色荧光(YFP)蛋白标记的ASC的永生化BMDM(来自波恩大学Eicke Latz博士的礼物)，随后分别用玻璃疣或ClQ活化3或6小时。使用受温度和CO2调节的共聚焦激光扫描显微镜(Olympus FluoView TM FV1000)进行斑点形成的活细胞成像。
[0096]CEP-MSA 免疫
[0097]我们使用标准小鼠免疫方案(55)。我们用PBS中的氯胺酮-赛拉嗪(80_90mg/kg氯胺酮，2-10mg/ml赛拉嗪)麻醉小鼠。如先前所述(18)，对于初始和所有加强剂量，我们在CFA或IFA (Difco实验室)中使用200 μ g的CEP-MSA0
[0098]脉络膜新生血管形成(CNV)的鼠模型
[0099]本工作过程中进行的所有动物实验遵照视觉和眼科学研究学会(ARVO)标准并且在开始工作之前获得所有相关国家和机构的批准。如先前所描述的(21)，使用整合显微递送系统的绿色532nm Iridex虹膜激光器(532nm, 140mff, IOOmSec, 50 μ m的斑点大小，3个斑点/眼)在小鼠中诱发其中血管床增殖进入视网膜，模拟新生血管AMD的CNV。该技术用于在Nlrp3-/-、Illrl-/-、IL-18-/_和WT小鼠中诱发CNV，并且在每个实验性测定中，将动物进行性别配对。同时，我们还在激光烧伤后在玻璃体内直接注射抗IL18的中和抗体(Abeam)。实验后6天处死小鼠，并取出神经视网膜。随后使洗眼杯与加纳籽-同工凝激素-Aleax-568分子(分子探针)(I: 300)在4°C温育过夜，并通过共聚焦显微镜术评价CNV (图 20a，b)。
[0100]视网膜铺片和视网膜冷冻切片的间接免疫染色
[0101]将间接免疫染色用于分析存在于AMD动物模型中神经视网膜中的活化的巨噬细胞和裂解的半胱天冬酶-1。将抗F4/80、CD68 (Abcam)(用于活化的巨噬细胞)和半胱天冬酶-1 (PlO)(Santa Cruz Biotech)、NLRP3(Santa Cruz Biotech 和 Abeam)和 IL18(Abeam)的抗体与共聚焦激光扫描显微镜术(Olympus FluoView TM FV1000)结合使用。
[0102]统计分析
`[0103]当分析2个单个实验组时，使用学生T检验进行统计分析，其中显著性用< 0.05的P值表示。为了进行多重比较，如在ELISA分析中的情况一样，将ANOVA与Tukey-Kramer事后检验一起使用，并且显著以< 0.05的P值表示。
[0104]MM.[0105]RPE是位于外视网膜与脉络膜之间的单层立方细胞。这种变黑的神经上皮具有许多功能，包括a)散射光和反射光的吸收，b)外血-视网膜屏障(oBRB)的形成和c)通过吞噬作用除去光感受器外节段的衰弱尖端(22)。玻璃疣的蛋白质组学和免疫组织化学分析已鉴定了参与补体级联的几乎每一种蛋白质，淀粉状蛋白沉积物以及许多晶体蛋白中发现的蛋白质，响应应激合成的蛋白质(23，24)。考虑到最近的发现:宿主来源的颗粒物质例如胆固醇晶体和淀粉状蛋白沉积物(25，26)可活化NLRP3炎性小体，我们对确定玻璃疣是否也可起始炎性小体的活化感兴趣。
[0106]玻璃疣活化NLRP3炎性小体
[0107]相较于具有干性或湿性AMD的个体的眼，未患病的眼的眼底照相(图1a)。眼底图像中的点状浅色沉着物代表干性和湿性AMD中的玻璃疣积聚，其中视网膜下CNV在湿性AMD照片中明显。对分离的玻璃疣进行超声处理以使样品分裂成小的颗粒物(图lb)。玻璃疣样品的SDS-PAGE分析显示一个组群的超过60kDa的高分子量蛋白质(图1c)。炎性小体是多聚体蛋白质复合物。半胱天冬酶-1是在炎性小体复合物中被活化以将IL-1 β前体和IL-18前体裂解成它们的成熟形式的半胱氨酸蛋白酶。半胱天冬酶-1的活化需要形成寡聚物的蛋白质ASC，从而产生用于多聚体复合物的平台。通常地，ASC均匀分布在整个细胞中，但一旦活化，ASC聚集成称为“斑点”的单个点。稳定地表达黄色荧光蛋白标记的ASC(YFP-ASC)的BMDM用LPS引发，并且利用玻璃疣进行处理或利用聚(脱氧腺苷酸脱氧胸苷酸)(阳性对照)进行转染。ASC-YFP在利用单独的LPS处理的巨噬细胞中难以辨别(图ld，左图)，然而在利用玻璃疣活化的LPS引发的巨噬细胞中，单个强荧光斑点的形成十分明显，表明ASC寡聚化。
[0108]据认为与AMD相关的炎症反应具有局部和系统性组分。我们最初测试ARPE-19细胞系的NLRP3的存在以及它们响应一系列TLR配体和通过ATP的活化产生IL-1 β的能力。我们发现当ARPE-19细胞表达NLRP3时，IL-1 β的水平处于测定灵敏度的下限(图7)。外周髓样细胞是IL-1 β和IL-18的主要来源，对于它们进入AMD的视网膜的能力，我们假设这些细胞可以是我们的系统中的关键目标细胞。人外周血单核细胞(PBMC)响应通过玻璃疣(即使在极低的浓度下)的活化产生IL-1 β和IL-18(图le，f)。我们使用在从AMD眼剥离玻璃疣的过程中产生的RPE材料作为这些实验的对照(图8)。利用玻璃疣处理后的THP-1细胞裂解物中半胱天冬酶-1表达的免疫印迹分析确认了升高的水平的裂解的半胱天冬酶-1plO (图1g和图9)。总之，这些结果显示来自AMD供体眼的玻璃疣可活化半胱天冬酶-1和ASC炎性小体复合物，这反过来导致IL-1 β和IL-18在PBMC中产生。
[0109]我们推断NLRP3是玻璃疣诱导的炎性小体活化的可能传感器，因为其需要通过颗粒物进行的炎性小体活化。我们从野生型(WT)和NLRP3缺陷型(Ν1rΡ3+)小鼠分离骨髓，并且培养骨髓来源的巨噬细胞和树突细胞(BMDM和BMDC)。WT BMDM和BMDC响应玻璃疣而产生显著水平的IL-1 β，相反地，Nlrp3+BMDM和BMDC (图lh，i，左图)不能响应玻璃疣而促进成熟IL-1 β的产生。IL-6和TNFa的水平不因玻璃疣的存在而改变，表明对IL-1 β产生的特异性作用(图lh，i右图)。这些结果显示AMD玻璃疣能够活化NLRP3炎性小体。
[0110]CEP加合的人血清白蛋白引发NLRP3炎性小体
[0111]在从AMD和正常供体分离的玻璃疣中发现多至65%的已在玻璃疣中鉴定的蛋白质。然而，还已在玻璃疣(包括羧乙基吡咯蛋白质加合物)中观察到氧化蛋白质修饰。累积的氧化损伤促成老化并且长久以来被怀疑促成AMD的发病机制(27，28，29)。由含二十二碳六烯酸盐(DHA)的脂质的氧化独特地产生羧乙基吡咯(CEP)加合物，并且所述加合物在AMD受试者的玻璃疣和血清中显著更丰富(19)。最近，已显示羧基烷基吡咯中的CEP被内皮细胞上的Toll-样受体2 (TLR2)识别(30)。鉴于TLR2活化可引发细胞诱导IL-1 β前体、IL-18前体和NLRP3，我们假定玻璃疣中和布鲁赫膜上的CEP加合的蛋白质可呈递新型引发剂。
[0112]为了测试这，我们利用递增浓度的CEP-加合的HSA或单独的HSA引发PBMC，并且用ATP活化细胞。IL-1 β水平随CEP-HSAHAS的浓度增加而升高，但在利用单独的HSA引发的细胞中未观察到改变(图1a)。利用CEP-HSA引发并且利用ATP活化的WT BMDM也产生IL-1 β，在Nlrp3+小鼠中未观察到该作用(图2b)。为了确定CEP-HSA是否通过TLR2活化引发细胞，我们用HSA或CEP-HSA引发WT和TLR2+BMDM，并且用ATP进行活化。ATP活化在WT中但非用CEP-HSA引发的TLR2+BMDM中诱导IL-1 β增加。此外，在活化之前利用HSA引发的BMDM中未观察到IL-1 β诱导，再次确认正是CEP修饰推断出活化TLR2的能力(图2c)。IL-6水平在CEP-HSA处理的WT细胞之间是等同的，这确认了对于IL-1 β的反应的特异性(图2d)。测量通过ATP活化的LPS引发的WT和TLR2+BMDM中的IL-1 β水平以确保TLR2+BMDM最佳地反应(图10)。为了确保我们的CEP-HSA不被LPS污染，我们从C3H/HeN和C3H/HeJ小鼠分离BMDM。C3H/HeJ小鼠在它们的Tlr4基因中携带突变，所述突变使得它们对LPS不反应(31)。当用CEP-HSA而非LPS引发时(图2e)，C3H/HeJ BMDM响应ATP而产生IL-1 β，表明我们的CEP加合物是不含LPS的并且通过TLR2连接引发炎性小体。在LPS引发的WT C3H/HeN BMDM中但非CEP弓丨发的细胞中检测到TNF-α (图2f)。我们还通过测量CEP处理的BMDM中的ASC-YFP斑点形成检查CEP引发NLRP3炎性小体的能力。在利用CEP-HSA引发并且用玻璃疣活化的BMDM中观察到聚焦的ASC-YFP斑点(图2g，上图)。单独的玻璃疣似乎能够引起ASC的寡聚化(图2g，下图)，从而表明单独的玻璃疣可起始用于炎性小体活化的多蛋白质平台的形成。然而，当用单独的玻璃疣处理PBMC或BMDM/BMDC和通过ELISA测定时，我们不能一致地检测到IL-1 β增加。
[0113]玻璃疣组分补体因子ClQ活化炎性小体[0114]尽管玻璃疣可扭曲并最终破坏视网膜(如在GA中一样)(29)，但并非所有呈现玻璃疣的人发展视力丧失，从而可设想除了引起RPE的机械损伤的玻璃疣的颗粒性质外，玻璃疣的一些组分可以以更特异的方式参与炎性小体的活化。我们选择研究C1Q，即已在玻璃疣中鉴定的的经典补体途径的主要起始组分(32)。由于ClQ是先天性免疫系统的具有对宿主组织适成极大损害的潜能的效应物，因此其在玻璃疣中的存在表明更早的或正在进行的炎症性损伤。我们直接评价ClQ活化NLRP3炎性小体的能力。向BMDM中添加的单独的ClQ不引起IL-1 β的产生，然而在添加ClQ之前用CEP-HSA引发的细胞产生显著水平的IL-1 β (图3a，左图)。促炎性细胞因子TNF α的分泌在将ClQ添加至CEP-HSA引发的BMDM后保持不变(图3a，右图)，表明ClQ特异性活化炎性小体并且一般不参与促炎性细胞因子的上调。我们在利用ClQ活化的THPl人单核细胞中观察到裂解的半胱天冬酶-1plO (图3b，图11)，并进一步确认ClQ可引起ASC寡聚化，因为可在利用LPS (图3c，右上图)或CEP (图3c，右下图)引发后利用ClQ活化的细胞内集中的焦点中看到YFP-ASC斑点。
[0115]利用ClQ处理的WT BMDC产生显著水平的IL-1 β，然而，Nlrp3+BMDM不能响应ClQ活化而产生IL-Ιβ (图3d，左)，TNFa的水平保持不变(图3d，右)。为了确认半胱天冬酶-1的作用，在ClQ活化之前，我们将半胱天冬酶-1抑制剂ZVAD添加至人PBMC。半胱天冬酶-1抑制以剂量依赖性方式减少IL-1 β和IL-18的产生(图3e)。这些结果综合起来显示ClQ可用作通过NLRP3炎性小体感知的危险信号。所有从人血液分离的ClQ和玻璃疣中发现的ClQ具有聚集的倾向，并且我们已在ClQ溶液的ζ电位分析后显示该倾向，我们相信这是ClQ可如何活化NLRP3炎性小体的关键因素(图12)。
[0116]ClQ炎性小体活化牵涉吞噬溶酶体
[0117]已显示ClQ与其它补体因子一起的沉着物与淀粉样蛋白结构相关，或为其组分(33，34)。从而作为玻璃疣的组分的ClQ可能导致其聚集并且帮助巨噬细胞，因为它们试图吞噬这些颗粒沉着物。导致NLRP3炎性小体活化的机制仍然是有争论的问题并且可取决于刺激物。一个机制牵涉颗粒结构的吞噬，从而导致溶酶体捕获和溶酶体内容物的释放
(35)。另一个提出的机制牵涉活性氧类(ROS)的产生，这导致通过ROS-敏感性TXNIP蛋白对NLRP3炎性小体进行的活化(36)。为了确定ROS的ClQ诱导(37，38)是否负责炎性小体活化，我们在ClQ活化之前用NADPH氧化酶抑制剂DPI处理PBMC。DPI对ROS的抑制对ClQ诱导的IL-Ιβ释放没有作用(图13a)。提出的可选择的机制是溶酶体的不稳定性导致溶酶体-外肽酶组织蛋白酶B渗漏至细胞溶质，所述溶酶体-外肽酶通过炎性小体的组分来感知，从而导致其装配(35)。为了确定吞噬溶酶体在通过ClQ进行的炎性小体的活化中的作用，我们使用巴弗洛霉素A ( —种阻断溶酶体酸化所必需的空泡H+ATP酶系统的抑制剂)和组织蛋白酶B抑制剂CA-074Me。空泡H+ATP酶或组织蛋白酶B的抑制限制IL-1 β和IL-18的ClQ活化的产生但对IL-6产生无影响(图13b，c)。这直接表明ClQ改变吞噬溶酶体过程以触发NLRP3活化。
[0118]NLRP3炎性小体在CEP-MSA免疫的小鼠中具有活性
[0119]我们力图确定炎性小体是否参与干性AMD (CEP-MSA免疫的小鼠模型)的良好表征的模型的病理。该动物在利用CEP-MSA免疫后，在其视网膜和RPE中产生AMD样损伤。我们分析CEP-MSA免疫的小鼠的视网膜切片的活化的巨噬细胞(F4/80和CD68染色)、半胱天冬酶-1plO和NLRP3的存在。观察到活化的巨噬细胞存在于脉络膜和布鲁赫膜内(图4a，b，图14)，我们还在视网膜的外节段中的RPE上方观察到浸润的巨噬细胞(图4c)。这些切片的染色显示F4/80与裂解的半胱天冬酶-1plO (图4d，e)和NLRP3 (图4f，g，图15)的共定位。[0120]NLRP3保护免受恶化的激光诱导的CNV发展
[0121]湿性(渗出性)AMD的很常用的模型是激光诱导的CNV，其可能因组织内坏死微环境的诱导也是无菌炎症的理想模型(39)。已知坏死细胞通过NLRP3炎性小体触发无菌炎症反应(17)。我们假设NLRP3炎性小体可在响应局限性组织损伤的CNV发展中起着关键作用。为了测试我们的假说，我们对WKNlrpS+和Illrl+小鼠的视网膜施用局灶性激光烧伤，并估量CNV体积。令人惊讶的是，当与WT和Illrl+小鼠相比较时，我们在ΝlrP3+小鼠中发现显著更多的CNV发展和视网膜下出血(图5a)。CNV的三维Z-stack共焦体绘制确认了损伤后6天ΝlrP3+小鼠的CNV体积的显著增加(图5d，条形图)。视网膜电图(ERG)分析确认两种敲除小鼠具有伤前功能性视杆和视锥反应(图5b)。我们在ΝlrP3+小鼠的损伤部位观察到活化的巨噬细胞浸润(阳性F4/80免疫反应性)(图5c)，然而，裂解的半胱天冬酶-1和IL-18仅在WT小鼠的损伤部位中是明显的，并且明显地不存在于Nlrp3+小鼠(图5d，图16，17)中。这些发现描述了 NLRP3炎性小体在于该CNV的动物模型中观察到的无菌炎症反应中的作用，并且指向IL-18作为CNV发展的调节剂。
[0122]NLRP3通过IL-18赋予抗CNV损伤形成的保护作用
[0123]为了确认IL-18在NLRP3介导的抗恶化的CNV发展的保护作用中的作用，我们在IL18+小鼠中施用激光诱导的CNV。观察到这些小鼠具有正常视网膜功能(图6a)，如通过ERG分析评估的。损伤后6天IL18+小鼠中的布鲁赫膜的激光诱导的破坏和CNV体积的定量显示相较于WT CNV (图6c)显著增加的损伤(图6b)。在激光诱发CNV后，玻璃体内注射的IL-18中和抗体也导致显著增加的CNV发展(图18)。
[0124]我们推断IL-18可能通过VEGF合成的调控赋予其保护作用。为了测试该假说，我们利用重组IL-18处理ARPE19细胞和小鼠脑微血管内皮细胞系(bEnd.3)，随后分析生长培养基中的VEGF水平。IL-18显著降低由ARPE-19细胞和bEnd.3细胞(图6d，e)分泌的VEGF的水平。这些发现直接表明IL-18在调控VEGF表达中的作用，并且可能解释Nlrp3+和IL18+小鼠中恶化的CNV。[0125]结论
[0126]我们的研究已显示从AMD供体眼分离的玻璃疣可活化NLRP3炎性小体。此外，我们还显示羧乙基-吡咯(CEP)(通常发现的修饰玻璃疣蛋白的氧化应激相关蛋白修饰)可引发炎性小体。同时，我们显示补体成分ClQ可以以半胱天冬酶-1和吞噬溶酶体依赖性方式活化NLRP3炎性小体。我们在围绕与CEP-MSA免疫的小鼠(可接受的干性AMD模型)相关的玻璃疣样损伤的巨噬细胞中观察到活化的半胱天冬酶-1和NLRP3。我们还发现通常使用的湿性AMD动物模型依赖于NLRP3活化，但预料之外的是在NLRP3不存在的情况下，CNV发展恶化。我们认为IL-18是病理性新生血管形成的关键调节剂，并且提出NLRP3炎性小体在AMD发展中的保护作用。
[0127]我们的观察主要涉及AMD的预防。目前基于抗体的疗法通过抑制VEGF的生物活性革El向AMD的晚期形式。然而,这些单克隆抗体(Lueentis?和Avastin?:)的直接定期眼内注射具有视网膜脱离、出血和感染的危险。
[0128]我们已显示从AMD供体眼分离的玻璃疣可活化NLRP3炎性小体。AMD玻璃疣由蛋白质沉着物的集合组成，所述沉着物中有许多被加合至CEP。由于其颗粒性质，来自正常供体眼的玻璃疣还可能诱导炎性小体活化，然而根据定义其在视网膜中的水平比AMD玻璃疣低，并且生物化学组成不同。这些差异对于AMD的进展可能是重要的。然而，对照与和炎性小体活化相关的AMD玻璃疣的比较仍待完全阐明。
[0129]我们已证明CEP-HSA可通过TLR2活化引发炎性小体，从而为我们提供了以高水平在焦点上积累在AMD眼内的天然存在的引发剂。在NLRP3的情况下，危险信号在性质上通常是颗粒和细胞外的。已显示ClQ(—种玻璃疣的组分)以淀粉样蛋白的方式聚集。我们显示从人血液分离的ClQ以依赖于溶酶体酸化和组织蛋白酶B的方式活化NLRP3炎性小体。
[0130]在AMD中发生的无菌炎症反应可能是在与过度玻璃疣积累的下方相邻的RPE细胞中发生的局灶性坏死的结果。玻璃疣在布鲁赫膜中的积累是早期AMD发展的标志特性和诊断指标，并且被认为对疾病 的病理学极为重要。虽然我们已在与CEP-MSA免疫小鼠中的AMD样损伤相关的巨噬细胞中观察到炎性小体活化，但我们的观察第一次直接表明对进展至CNV(AMD的渗出性形式)中炎症过程的保护作用，并且正好与在疾病预防中针对炎症过程的抑制的现有教导相反。事实上现已接受一定水平的炎症(“轻度炎症”)对宿主可能是有益的。从临床角度来看，虽然炎症过程很久以来与AMD病状和疾病发展相关，但我们认为在湿性AMD的情况下视网膜的炎症的全局性抑制可能不是可靠疗法。通过借力给我们的观
察，英利昔单抗(Remicade?)在具有湿性AMD的个体中的最近临床试验的结果显示在超过
50 %的这些受试者中，症状极大地恶化。
[0131]目前还已显示NLRP3炎性小体通过IL-18产生赋予抗小鼠的实验性结肠炎和结直肠癌的保护作用。
[0132]先前的研究表明IL-18在视网膜血管发展中起着重要作用。11-18+小鼠显示血管扩张和血管渗漏，VEGF和bFGF水平在11-18+小鼠视网膜中也被上调。还已在出血后损伤和肿瘤血管生成的抑制中观察到IL-18的抗血管生成作用。
[0133]玻璃疣对NLRP3炎性小体的活化表明平衡可存在，由此一定局灶水平的玻璃疣因其诱导IL-8的能力而被耐受，所 述IL-18反过来可用作抗血管生成效应物，从而维持炎症微环境中的脉络膜动态平衡。可能一旦积聚临界水平的玻璃疣，其保护作用因对周围组织 的过度损害而被否定。重要的是，我们已证明可由玻璃疣诱导的炎症介质保护免受CNV发 展，并且正是所得的NLRP3介导的IL-18的升高阻止了 VEGF的下游产生。此外，已显示 IL-18在实验性葡萄膜炎（炎症的更常规模型）的发展中不起作用，这是对来源于我们的发 现的疗法的将来形式具有直接影响的发现。总之，我们的观察直接表明NLRP3为抗AMD的 主要疾病病理学的保护剂，并且表明目标在于产生IL-18或将其递送至眼的策略可证明在 预防湿性AMD的情况中的CNV的进展中是有益的。
[0134]补充方法
[0135]临床评价
[0136]AMD受试者和未受影响的个体由临床眼科医生在获得知情同意书后后进行评估。 使用斯内伦视力表（Snellen Chart)测量最佳矫正远视力。使用标准视力表评估近视力。 眼的前段利用裂隙灯活组织显微镜来检查。眼内压使用Goldmann眼压计来测量。在瞳孔 扩大后使用托吡卡胺（1%)进行详尽眼底检查和彩色眼底照相。干性AMD通过因AMD相关 黄斑变化（玻璃疣、色素沉着过多、RPE的色素减少或地图状委缩）引起的视觉变形的存在 来进行诊断。湿性AMD通过补充荧光素血管造影摄影术以显示CNV的临床检查来诊断。
[0137]小鼠的ERG分析
[0138]将小鼠进行暗适应过夜，并且准备在暗红光下进行视网膜电描记术。通过滴 注1%环戊通和2.5%去氧肾上腺素来进行瞳孔扩大。通过腹膜内（I.P.)注射氯胺酮 (2. 08mg/15g体重)和赛拉嗪(0. 21mg/15g体重)来麻醉动物。在Ganzfeld碗中将标准 化闪光呈现给小鼠以确保一致的视网膜照明。使用唯地息（Vidisic) (Dr Mann Pharma, Germany)作为传导剂和维持角膜水合,通过金丝电极（Roland Consulting Gmbh)同时记录 两只眼的ERG反应。将参考电极和接地电极置于皮下，分别距离外眦和尾前部约1mm。使用 由直肠温度探头控制的加热器将体温维持在37°C。使用RetiScan RetiPort电生理装置 (Roland Consulting Gmbh)分析反应。方案基于由人视网膜电描记术的国际临床标准委员 (International Clinical Standards Committee for human electroretinography)批 准的方案。使用相对在刺激之前将先前暗适应的动物暴露于其10分钟的具有30堪德拉/ m_2的视杆抑制性背景光提供的强度为3堪德拉/nT2/s的白色闪光来记录锥形隔离的反应。 用计算机计算对48次以0. 5Hz的频率提供的单次闪光的反应求平均值。遵照标准常规，测 量从基线至a-波谷的a-波和从a-波谷至b_波峰的b_波。
[0139]本发明不限于本文中描述的实施方案，但可在不背离本发明的范围的情况下进行 修正或改进。
[0140]现通过下列第一组实施方案描述本发明。
[0141]1.保护免受退行性视网膜病况的炎症介质
[0142]2.作为NLRP3-炎性小体的组分的炎症介质
[0143]3.作为促炎性白细胞介素-18 (IL-18)的NLRP3炎性小体组分
[0144]4.根据实施方案2至3中任一项所述的炎性小体组分，其用于治疗包括玻璃疣和 过敏毒素诱导的脉络膜-新生血管形成（CNV)的退行性视网膜病况
[0145]5.根据实施方案4所述的炎性小体组分，其中所述退行性视网膜病况是年龄相关 黄斑变性（AMD)，包括湿性和干性AMD。[0146]6.根据前述实施方案中任一项所述的NLRP3-炎性小体，其中维持和/或刺激IL-18的活性
[0147]7.NLRP3炎性小体诱导的IL-18、其变体或部分用于制造药剂的用途，所述药剂用于治疗包括玻璃疣和过敏毒素诱导的脉络膜-新生血管形成(CNV)的退行性视网膜病况，其中所述治疗包括将NLRP3炎性小体激活物例如IL-18递送至骨髓或骨髓来源的细胞或组织和/或直接递送至眼细胞或组织。
[0148]8.根据实施方案7所述的用途，其包括IL-18的病毒介导的递送。
[0149]9.一种用于延迟退行性视网膜病变的进展的方法，包括维持或刺激IL-18的活性。
[0150]10.NLRP3-炎性小体诱导的介质，优选促炎性细胞因子IL-18的用途，其用作生物标志物以指示发展包括玻璃疣和过敏毒素诱导的脉络膜-新生血管形成相关疾病的疾病，例如湿性或干性AMD的风险。
[0151]11.一种用于使用炎性小体诱导的介质，优选促炎性细胞因子IL-18作为生物标志物确定受试者中的疾病玻璃疣和过敏毒素诱导的脉络膜-新生血管形成相关疾病例如湿性或干性AMD的发展或进展的风险的方法，
[0152]所述方法包括:
[0153]-获得所述受:试者中循环IL-18水平的水平；
[0154]-将IL-18水平的水平与参照相比较，其中所述受试者的疾病玻璃疣和过敏毒素诱导的脉络膜-新生血管形成的发展或进展的风险基于与所述参照相比较的IL-18水平的水平。
[0155]现通过下列第二组实施方案描述本发明。
[0156]1.炎症介质，优选NLRP3-炎性小体的组分或底物，其用于治疗包括玻璃疣和过敏毒素诱导的脉络膜-新生血管形成的退行性视网膜病况。
[0157]2.根据实施方案I使用的炎症介质、组分或底物，其中所述视网膜病况是年龄相
关黄斑变性。
[0158]3.根据实施方案2使用的炎症介质、组分或底物，其中所述年龄相关黄斑变性是湿性年龄相关黄斑变性或干性年龄相关黄斑变性。
[0159]4.根据前述实施方案中任一项使用的炎症介质、组分或底物，其中所述NLRP3-炎性小体的组分是白细胞介素-18前体(IL-18前体)或白细胞介素-18(IL-18)。
[0160]5.根据前述实施方案中任一项使用的炎症介质、组分或底物，其用于其中在新生血管疾病发展之前或在早期新生血管疾病中向受试者施用白细胞介素-18前体(IL-18前体)或白细胞介素_18(IL-18)的方法。
[0161]6.根据前述实施方案中任一项使用的炎症介质、组分或底物，其用于控制、维持或刺激白细胞介素-18(IL-18)在处于发展年龄相关黄斑变性的风险中的受试者中的表达。
[0162]7.根据前述实施方案中任一项使用的白细胞介素-18前体(11-18前体)，其用于控制处于发展湿性年龄相关黄斑变性(AMD)的风险中的患者中的脉络膜-新生血管形成(CNV) ο
[0163]8.根据实施方案7使用的白细胞介素-18前体(11-18前体)，其中白细胞介素-18前体(IL-18前体)被递送至视网膜。[0164]9.根据实施方案8使用的白细胞介素-18前体(11-18前体)，其中白细胞介素-18前体(IL-18前体)通过直接注射和/或通过病毒介导的递送被全身性递送至视网膜。
[0165]10.根据实施方案8或9使用的白细胞介素-18前体(11-18前体)，其中白细胞介素-18前体(IL-18前体)通过腺病毒相关病毒(AAV)介导的递送被递送至视网膜。
[0166]11.根据实施方案10使用的白细胞介素-18前体(11-18前体)，其中表达可诱导的IL-18前体的腺病毒相关病毒(AAV)被递送至视网膜。
[0167]12.根据前述实施方案中任一项使用的白细胞介素-18前体(11-18前体)，其中半胱天冬酶-1在视网膜色素上皮(RPE)细胞中和视网膜色素上皮细胞周围的表达调控IL-18前体加工成IL-18，并且所述IL-18对脉络膜新生血管形成(CNV)发展具有保护作用。
[0168]13.一种重组病毒基因递送载体，其指导IL-18前体以适合用于治疗眼，优选脉络膜新生血管形成的形式表达。
[0169]14.根据实施方案13所述的重组病毒基因递送载体，其呈用于向处于发展AMD，优选湿性AMD的风险中的受试者的眼施用的形式。
[0170]15.根据实施方案13或14所述的重组病毒基因递送载体，其中所述载体呈适合用于通过视网膜下或玻璃体内注射递送至眼的形式。
[0171]16.根据实施方案13至15中任一项所述的重组病毒基因递送载体，其中所述病毒载体是腺病毒相关病毒(AAV)、腺病毒或慢病毒基因递送载体。
[0172]17.根据实施方案16所述的重组腺病毒相关病毒(AAV)基因递送载体，其指导IL-18前体的表达并且适合用于向处于发展AMD，优选湿性AMD的风险中的受试者的眼施用。
[0173]18.根据实施方案17所述的重组AAV载体，其中所述基因递送载体是包含编码11-18前体基因的核苷酸的AAV载体。
[0174]19.根据实施方案17或18所述的重组AAV载体，其中所述AAV是AAV血清型1至11中任何一种，优选血清型2、8或9。
[0175] 20.根据实施方案16至19中任一项所述的重组AAV载体，其中所述IL-18前体基因侧翼连接有AAV反向末端重复(ITR)。
[0176]21.一种治疗包括玻璃疣和过敏毒素诱导的脉络膜-新生血管形成的退行性视网膜病况的方法，包括向需要治疗的受试者施用NLRP3-炎性小体的炎症介质、组分或底物。
[0177]22.根据实施方案21所述的方法，其用于治疗湿性年龄相关黄斑变性(AMD)，包括向处于发展年龄相关黄斑变性的风险中的受试者施用白细胞介素-18前体(11-18前体)。
【权利要求】
1.炎症介质，优选所述NLRP3-炎性小体的组分或底物，用于治疗包括玻璃疣和过敏毒素诱导的脉络膜-新生血管形成的退行性视网膜病况。
2.根据权利要求1使用的炎症介质、组分或底物，其中所述NLRP3-炎性小体的组分是白细胞介素-18 (IL-18)，优选重组IL-18 (rIL-18)。
3.根据权利要求1或权利要求2使用的炎症介质、组分或底物，其中所述视网膜病况是年龄相关黄斑变性，优选湿性年龄相关黄斑变性或干性年龄相关黄斑变性。
4.根据权利要求1至3中任一项使用的炎症介质、组分或底物，其中所述NLRP3-炎性小体的组分，优选白细胞介素-18(IL-18)优选通过注射，更优选通过静脉内注射被全身性递送。
5.根据权利要求1至3中任一项使用的炎症介质、组分或底物，其中所述NLRP3-炎性小体的组分，优选白细胞介素-18(IL-18)优选通过眼内注射，更优选通过视网膜下注射、玻璃体内射、眼球后注射、结膜下注射和/或眼球筋膜下注射被局部递送。
6.根据权利要求4或5使用的炎症介质、组分或底物，用于递送至眼，优选用于递送至视网膜，更优选用于递送至脉络膜。
7.根据前述权利要求中任一项使用的炎症介质、组分或底物，其用于控制处于发展湿性年龄相关黄斑变性(AMD)的风险中的患者的脉络膜-新生血管形成(CNV)。
8.根据前述权利要求中任一项使用的炎症介质、组分或底物，其用于其中在新生血管疾病发展之前或在早期新生血管疾病中向受试者施用白细胞介素-18 (IL-18)的方法。
9.根据前述权利要求中任一项使用的炎症介质、组分或底物，其用于控制、维持或刺激处于发展年龄相关黄斑变性 的风险中的受试者中的白细胞介素-18(IL-18)表达。
10.根据权利要求2至9中任一项使用的白细胞介素-18(11-18)，其中白细胞介素-18(IL-18)被递送至视网膜。
11.根据权利要求10使用的白细胞介素-18(11-18)，其中白细胞介素-18 (IL-18)通过注射和/或通过病毒介导的递送被全身性递送至视网膜。
12.根据权利要求10或11使用的白细胞介素-18(11-18)，其中白细胞介素-18(IL-18)通过腺病毒相关病毒(AAV)介导的递送被递送至视网膜，优选其中表达可诱导的IL-18的腺病毒相关病毒(AAV)被递送至视网膜。
13.根据前述权利要求中任一项使用的白细胞介素-18(11-18)，其中IL-18对脉络膜新生血管形成(CNV)发展具有保护作用。
14.一种重组病毒基因递送载体，其指导IL-18以适合用于治疗脉络膜新生血管形成的形式表达。
15.根据权利要求14所述的重组病毒基因递送载体，其呈用于向处于发展AMD，优选干性AMD，更优选湿性AMD的风险中的受试者的眼施用的形式。
16.根据权利要求14或15所述的重组病毒基因递送载体，其中所述载体呈适合用于通过眼内注射，优选通过视网膜下注射、玻璃体内注射、眼球后注射、结膜下注射和/或球筋膜下注射递送至眼的形式。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的重组病毒基因递送载体，其中所述病毒载体是腺病毒相关病毒(AAV)、腺病毒或慢病毒基因递送载体。
18.一种治疗包括玻璃疣 和过敏毒素诱导的脉络膜-新生血管形成的退行性视网膜病况的方法，包括向需要治疗的受试者施用NLRP3-炎性小体的炎症介质、组分或底物。
19.根据权利要求18所述的方法，其用于治疗干性和/或湿性年龄相关黄斑变性(AMD)，包括向处于发展湿性年龄相关黄斑变性的风险中的受试者施用白细胞介素-18(11-18)。
20.NLRP3-炎性小体诱导的介质，优选促炎性细胞因子IL-18(IL-18)用作生物标志物以指示发展疾病的风险的用途，所述疾病包括玻璃疣和过敏毒素诱导的脉络膜-新生血管形成，例如湿性或干性年龄相关黄斑变性。
21.一种用于使用炎性小体诱导的介质，优选促炎性细胞因子IL-18(I1-18)作为生物标志物确定受试者中发展包括玻璃疣和过敏毒素诱导的脉络膜-新生血管形成的疾病例如湿性或干性年龄相关黄斑变性的风险或监测所述疾病的进展的方法，所述方法包括: 获得受试者中循环IL-18的水平和/或IL-18结合蛋白水平； 将所述IL-18水平和/或IL-18结合蛋白水平与参照相比较，其中所述受试者的疾病玻璃疣和过敏毒素诱导的脉络膜-新生血管形成的发展或进展的风险基于与参照相比较的IL-18水平 的水平。
【文档编号】A61K38/20GK103889441SQ201280051847
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年10月1日 优先权日:2011年9月29日
【发明者】M·坎贝尔, P·汉弗莱斯, M·汉弗莱斯, A-S·基昂, S·道尔, L·奥尼尔 申请人:伊丽莎白女王在都柏林附近神圣不可分割的三一学院教务长、研究员、学者及董事会其他成员