用于防止心脏缺血-再灌注损伤的多肽的制作方法
【专利摘要】如下式的肽或者所述GLP-1肽的某些类似物：R1-NH-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVK-CONR2R3，其中，R＝H或含1-10个碳原子的有机化合物，且R2R3＝各自独立地为H或具1-4个碳原子的烷基；可用于治疗和预防心脏缺血-再灌注损伤。
【专利说明】用于防止心脏缺血-再灌注损伤的多肽
[0001]本发明涉及一种用于防治心脏缺血-再灌注损伤(heart ischemia-reperfus1ninjury)的多肽。
[0002]在对冠状动脉分支(一种供给心肌的动脉)闭合进行治疗之后，发生心肌损伤。此损伤称作再灌注损伤。该现象可以在一个实验环境中进行模拟，在此情况下模拟对大鼠离体心脏进行。
[0003]缺血-再灌注损伤(IRI)是一种在足够长的中断之后的血流恢复时影响心肌的综合症，例如冠状动脉血栓形成或心脏手术[1，2]中所遇到的情况。该综合症的主要组成包括:心肌细胞死亡、心肌顿抑、心律失常和无复流[I]。在最近30年中，为阐明IRI的病理生理学性质，积累了大量的实验研究素材，其中主要关注心肌细胞死亡及限制其的方案。一类这样的方案是药物后调理(pharmacological postcondit1ning),其中在血流恢复的同时施以心脏保护剂。这种时间选择使得后调理与临床前瞻性相关，其中在冠状动脉血栓形成和ST段抬高型心肌梗死之后的不可逆心肌损伤的限制仍是主要目标[3]。
[0004]Bose, A.K.等[4]在 Card1vasc Drugs Ther (2007) 21:253-256 中公开了单用GLP-1未能降低心肌梗塞，而当与GLP-1分解抑制剂缬氨酸吡咯烷(VP)联用时心肌梗塞的发生显著降低。 [0005]EP -A-1012188公布了用于治疗糖尿病和肥胖症的N-Ac-GLP-1-(7-34)-酰胺及其衍生物。
[0006]本发明的一个目的是提供一种心脏缺血-再灌注损伤疗法，该方法通过给予可作为单组分进行施用的GLP-1类似物并避免给予该药物与第二化合物。
[0007]本发明基于这样的意外发现:本发明的肽具有心血管保护作用而无需同时给予其它化合物，具体地，它们具有保护心脏抵御缺血-再灌注损伤的作用。使用N末端封闭、C末端截断的N-Ac-GLP-1 (7-34)酰胺进行后调理限制了大鼠离体心脏中的缺血-再灌注损伤。心舒期高挛缩减弱和梗塞面积减小体现了 N-Ac-GLP-1 (7-34)酰胺的该有益效果。
[0008]图1:该图概括了含氧量正常㈧和缺血-再灌注⑶实验的时间进程。
[0009]图2:缺血-再灌注对左室舒张压(LVD)、左室发展压(LVDEV)和心率血压乘积(RPP)的作用如图2A-C所示。在A图中，*表明与“无肽”条件相比，P〈0.05。
[0010]图3 =N-Ac-GLP-1 (7-34)酰胺对梗塞面积的作用。各柱代表平均梗死面积(IS) (N=7-14),计算为心肌缺血面积(Area at Risk, AAR) (% IS/AAR)的百分率,而各短棒指示SEM。各治疗组的命名如图2所示。*是指与“无肽”条件相比，P〈0.05。
[0011]根据本发明，式
[0012]Rl-NH-HAEGTFTsDVssYLEGQAAKEFIAffLVK-CONR2R3 所示肽可用于治疗和预防心脏缺血-再灌注损伤，
[0013]其中，R为H或含1-10个碳原子的有机化合物，且R2、R3独立地为H或具1_4个碳
原子的烷基；
[0014]可用于治疗和预防心脏缺血-再灌注损伤。
[0015]在该肽的序列中，氨基酸用单字符表示，但明确标明N末端(R1-NH-)和C末端(-CONR2R3)。
[0016]在本发明所用的肽中，R1代表酰基。
[0017]特别地，R1为甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丙酰基，和/或，特别地，R2、R3独立地为龜！、甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基，特别是，R2 = R3，为氣、甲基或乙基。例如，肽的C末端可以是酰胺、二甲基酰胺、二乙基酰胺，但也可以是混合酰胺，如单甲基酰胺、单乙基酰胺、甲基乙基酰胺等等。本领域技术人员不难理解这些组合。
[0018]该肽可经修饰，其中R-GLP-1- (7-34)-酰胺8位的A被选自下组的中性氨基酸取代:s、st、G、C、Ct、Sar、β -丙氨酸和 Aib ;和 / 或
[0019]R-GLP-1-(7-34)-酰胺10位的G被中性氨基酸取代；和/或
[0020]R-GLP-1-(7-34)-酰胺15位的D被酸性氨基酸取代。
[0021]特别地，在该肽中，A可以被S、St、G、C、Cl.、Sar、β_丙氨酸和Aib取代。
[0022]该肽可以与适合的药学上可接受的载体组合配制。这样的载体为本领域普通技术人员所熟知，并可容易地获自药物制剂的教科书。
[0023]例如，可将本发明的肽配制成永久性或脉动性释放剂型，或配制成用于皮下、静脉内、动脉内、经口、 [0024]作为本发明的肽的一个代表，N-Ac-GLP-1-(7-34)-酰胺，一种天然激素GLP-1的合成类似物，其已经显示在大鼠离体心脏中减弱这种心脏缺血-再灌注损伤，而无需与抑制GLP-1分解的物质，例如VP —同给药。
[0025]N-Ac-GLP-1-(7-34)_酰胺效应之应用模式的通用类型称作药物后调理。这类生物效应的细胞和分子细节仍不为人充分理解。在想不束缚于作用模式的如何假设或原理，但N-Ac-GLP-1-(7-34)-酰胺作用的一个可能机制可涉及心肌细胞上GLP-1受体的激活，其进而激活若干细胞内的信号传导机制，增加其存活能力。
[0026]籍下文的实施例进一步阐释本发明，但这些实施例不应被理解为限制保护范围。单独的或作任何组合的前述说明和以下实施例中公开的特征，皆是实施不同形式的本发明的材料。
实施例
[0027]方法
[0028]将全心缺血(35min)_再灌注(120min)施于离体的、逆行灌注的大鼠心脏。在再灌注发生时，肽存在15min。在整个灌注期间测量心脏功能参数(每分钟心跳、左心室发展压和舒张压、心率血压乘积)。用氯化2，3, 5-三苯基四氮唑(2，3, 5-tripehyItetrazoliumchloride)染色和测面积法进行测定收集的心脏梗死面积。
[0029]结果。
[0030]N-Ac-GLP-1 (7-34)-酰胺将梗死面积 g 28.4% (SEM2.8，N = 14)降低至 11.4%(SEM3.2，N = 8 ；P<0.05)。N-Ac-GLP-1 (7_34)-酰胺显著减弱了缺血后舒张挛缩。当进行施加而没有前期缺血时，N-Ac-GLP-1 (7-34)-酰胺对左心室发展压(LVDEV)或心率血压乘积(RPP)未有显著效果，亦未影响任一心脏功能参数。共同给予GLP-1受体拮抗剂艾塞那肽(exendin，9-39)消除了 N-Ac-GLP-l (7-34)-酰胺的效果。
[0031]材料和方法[0032]化学品
[0033]N-Ac-GLP-1 (7-34)-酸胺由 Polypeptide Laboratories 公司(美国圣地亚哥)合成。艾塞那肽(9-39)购自Bachem公司(瑞士)。
[0034]动物和实验步骤
[0035]使用了雄性Sprague Dawley大鼠(330_370g,购自丹麦Taconic公司)。这些动物研究符合《实验动物护理和使用指南》(Guide for Care and Use of Laboratory Animals)
(全国卫生出版学院，Nat1nal Institutes of Health Publicat1n, N0.85-23，1996 修订)以及管理动物实验的丹麦法规(1987)，并且，在得到了丹麦司法部动物实验监管局(AnimalExperiments Inspectorate, Ministry of Justice, Denmark)批准后，进行上述动物研究。
[0036]为进行麻醉，皮下给予咪达唑仑(2.5mg/kg)、氟阿尼酮(2.5mg/kg)和芬太尼朽1檬酸盐(0.08mg/kg)的混合物。肝素(1000即每kg)通过股静脉进行给药。动物经气管切开术，通以35% 02/65%N2的混合物，并且胸腔被打开。将切除的心脏立即放入冰冻冷却的Krebs Henseleit缓冲液中。该心脏被迅速固定至Langendorff灌流系统(购自英国 ADInstruments)并用改良的 Krebs-Henseleit 溶液(NaCl118.5mM、KC14.7mM、NaHC0325.0mM, MgSO4L 2mM、CaCl2L 4mM、葡萄糖 11.1mM)进行灌注，用 5% C02/95 % O2 的混合气体于37°C平衡至pH7.4。移除左心耳(Ieftauricle)并将一个7码的7气球(ADInstruments)通过左心房插入左心室并调节舒张压至4_10mmHg。灌注压设为70mmHg并通过伺服控制系统(ML175STH泵控制器，ADInstruments)维持于该平均值，根据流动阻力持续调节该蠕动泵转动。使心脏稳定20min，然后在接下来的1min中对左心室功能参数基线值进行记录:压 力(收缩期，LVS ;舒张期，LVD ;发展，LVDEV = LVS-LVD)，每分钟心跳次数(BPM)和心率血压乘积(RPP)。购自 ADInstruments 的 Power Lab8/30 系统和 Chart5Pro软件用于这些记录。
[0037]淘汰标准
[0038]如稳定期间的最后10分钟均值无法满足以下标准，则将心脏淘汰:BPM:210 -350min_\LVDEV: 80 - 150mm Hg,RPP: >22, 000 (mmHgXmirT1)。如果再灌注过程中发生心室颤动持续5分钟以上，则亦淘汰心脏。
[0039]治疗组
[0040]图1概括了含氧量正常㈧和缺血-再灌注⑶实验的时间进程。实验组为:含氧量正常对照，未添加肽；含氧量正常，N-Ac-GLP-1 (7-34)酰胺0.3nM ;缺血-再灌注(IR)对照，未添加肽；IR，N-Ac-GLP-1 (7-34)酰胺 0.3nM ；IR, N-Ac-GLP-1 (7-34)酰胺 0.3nM+ 艾塞那肽(9-39) 3nM; IR，艾塞那肽(9_39)3nM。图1.显示了示意含氧量正常灌注(A)和缺血-再灌注(B)的灌注时期的方案图。“Stab”是指30min稳定期。当存在时，自灌注(A)或再灌注⑶的最后120min起,添加肽,持续15min。总灌注时间总是185min,由以下组成:30min稳定,接着为155min的含氧量正常灌注(图1A)或35min全心缺血_120min再灌注(图 1B)。
[0041]测定梗死面积
[0042]再灌注后，如前所述，心脏进行氯化2，3，5-三苯基四氮唑染色和测定平面梗死面积[5]。由对实验条件未知的调查员进行定量测定。梗死面积(IS)表示为有风险的缺血总面积百分比(AAR) (% IS/AAR)。[0043]统计分析
[0044]所有数值以均值呈现，SEM在括号中给出。单向ANOVA与Dunnett事后检验(GraphPad Prism?5)用于比对处理结果和对照条件。P〈0.05视为显著。
[0045]结果
[0046]功能参数
[0047]基线参数值为(在所有实验中均为N= 14):BPM291(7)min_1, LVDEV105.2 (5.4)mmHg, LVD8.3 (0.7)mmHg, RPP30302 (1434)mmHg mirT1。在含氧量正常灌注结束时，这些值为(N = 5):BPM215 (H)HiirT1, LVDEV75.2 (8.6)mmHg, LVD19.2(5.2)mmHg 和 RPP16060 (1740)mmHg mirT1。在含氧量正常实验中这些参数的时间曲线未因灌注的35min和50min之间(即，与缺血-再灌注实验中施加肽所对应的期间)N-Ac-GLP-1 (7-34)酰胺的存在而受影响。
[0048]缺血-再灌注对LVD、LVDEV和RPP的影响示于图2A-2C。缺血-再灌注实验中左心室舒张压(LVD) (A)、左心室发展压(LVDEV) (B)和心率血压乘积(RPP) (C)的时间进程。点代表7-14次实验的均值，短棒表示SEM。标出了缺血和再灌注时期的起始、施加肽的时期(在灌注开始起15min)以及计算曲线下面积(AUC)的时期。以下的治疗组用标识(在A-C中为相同标识)不出意:对照缺血_无妝存在；N-Ac_GLP_l (7-34)酸胺0.3nM ；N-Ac-GLP-1 (7-34)酰胺 0.3nM+Exe (9-39)(艾塞那肽(9-39)) 3nM ；Exe (9-39) 3nM。“基线值”标记的诸点代表在稳定期间最后1min各组的均值。*是指与“不含肽”条件相比，P〈0.05。
[0049]在血流中断后LVD急剧上升，在朝向缺血期间末期有所下降，并在再灌注开始时再一次急剧上升(图2A)。在再灌注开始后约5-10min达到峰值，约60min后降至近平台(near-plateau)。曲线 下面积(AUC)用作再灌注的最后60min间功能参数值的时间积分测量值。在用N-Ac-GLP-1- (7-34)酰胺作后调理之后，与对照缺血相比，这些LVD的AUC值显著降低；在有GLP-1受体拮抗剂艾塞那肽存在下使用N-Ac-GLP-1-(7-34)酰胺进行后调理(9-39)，或在单用艾塞那肽(9-39)时，它们并未受影响(图2A)。
[0050]用N-Ac-GLP-1- (7-34)酰胺进行后调理并未显著降低LVDEV或RPP的AUC值(分别为图2B和2C)。向着LVDEV增加的趋势可能曾是明显的。
[0051]梗死面积
[0052]不作后调理(对照缺血-再灌注)时，梗死面积为24.8% (2.8%，N = 14)(图3)。该图亦显示了用N-Ac-GLP-1 (7-34)酰胺0.3nM作后调理对梗死面积IS/AAR)的影响。治疗组入图2那样命名。*指与“无肽”条件相比，P〈0.05。用N-Ac-GLP-1-(7-34)酰胺0.3nM进行后调理将梗死面积降低至11.4% (3.2%,N = 8，P〈0.05)。艾塞那肽(9_39)显示消除了 GLP-1的梗塞限制作用。在有艾塞那肽(9-39)存在下，用N-Ac-GLP-1 (7-34)酰胺进行后调理得到梗死面积为21.4% (2.4, N = 8),并与对照缺血的情况或仅艾塞那肽(9-39)单独存在下的数值(21.7% ；3.6，N = 9)无差异。
[0053]本发明公开了 N-Ac-GLP-1 (7-34)酰胺所示例的本发明肽的心脏保护效果。N-Ac-GLP-1 (7-34)酰胺是N末端乙酰化、C末端截断的GLP-1类似物。
[0054]测试了 N-Ac-GLP-1 (7-34)酰胺作为后调理剂的心脏保护性作用。在全心缺血后立即施加N-Ac-GLP-1 (7-34)酰胺，15min，其中再灌注持续120min。以该种方式，N-Ac-GLP-1 (7-34)酰胺在心肌性能水平以及梗塞面积方面皆具有有益的效果。LVD是受影响最为强烈的参数，在使用N-Ac-GLP-1 (7-34)酰胺进行后调理后显示出显著的降低(图2A)。缺血后的LVD升高，或高挛缩(hypercontracture)是导致再灌注时心肌细胞死亡的主要机制之一，这是因机械应力导致肌纤维膜破裂所致[6]。N-Ac-GLP-1 (7-34)酰胺的LVD-降低效果被艾塞那肽(9-39) (GLP-1受体拮抗剂)的存在而封闭。因此，N-Ac-GLP-1 (7-34)酰胺对缺血后挛缩的改善性活性是由已知在心肌中存在的GLP-1受体所介导[7]。
[0055]舒张高挛缩可能反映了恢复的肌细胞中ATP合成的恢复不足和/或Ca2+循环异常[8]。N-Ac-GLP-1 (7-34)酰胺后调理并未以统计学上显著的方式来影响LVDEV或RPP(图2B)。然而，用N-Ac-GLP-1 (7-34)酰胺进行后调理之后，朝向LVDEV改善的趋势看来存在，并且因艾塞那肽的存在而消除(9-39)(图2B)。
[0056]未发现N-Ac-GLP-1-(7-34)酰胺在含氧量正常条件下灌注期间对心肌性能有影响。
[0057]N-Ac-GLP-1 (7-34)酰胺后调理导致梗死面积显著下降(图3)，相对减小值约54%。与前文讨论的对LVD的作用一致，N-Ac-GLP-1 (7-34)酰胺的这种梗塞面积限制作用在有GLP-1受体拮抗剂艾塞那肽(9-39)存在下被消除。
[0058]参考文献 [0059][l]Yellon DM, Hausenloy DJ(2007)心肌再灌注损伤(Myocardialreperfus1ninjury).N.Engl.J Med.357:1121-1135
[0060][2]Turer AT, Hill JA(2010)心肌缺血再灌注损伤的发病机理以及治疗的理论基石出(Pathogenesis of myocardial ischemia-reperfus1n injury and rat1nale fortherapy).Am J Card1l106:360-368
[0061][3]0vize M, Baxter GF, Di Lisa F等(2010)再灌注损伤的后处理和保护:我们处在什么位置？来自欧洲心脏病学会心脏细胞生物学工作组的意见书(Postcondit1ningand protect1n from reperfus1n injury:where do we stand ? Posit1n paper fromthe working group of cellular b1logy of the heart of the European Society ofCard1logy).Card1vasc Res87:406-423
[0062][4]Bose A.K., Mocanu MM, Carr RD, Yellon DM(2007)心肌缺血再灌注损伤在体外大鼠心脏中为完整的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)所减弱，且可涉及P70S6K途径(Myocardial ischaemia-reperfus1n injury is attenuated by intact glucagon likepeptide-1(GLP-1)in the in vitro rat heart and may involve the p70s6K pathway).Card1vasc Drugs Ther21:253-256
[0063][5]Ossum A, van Deurs U, Engst「0m T, Jensen JS, Treiman M.(2009)GLP-1 和
GLP-1 (9-36)在分离的大鼠心脏中的后处理效应的心脏保护性和肌肉收缩性成分(Thecard1protective and inotropic components of the postcondit1ning effects ofGLP-1 and GLP-1 (9-36) a in an isolated rat heart).Pharmacol Res60:411-417
[0064][6] Inserte J, Barrabes JA, Hernando V, Garcia-Dorado D (2009)再灌注损伤的孤革巴点(Orphan targets for reperfus1n injury).Card1vasc.Res.83:169-178
[0065][7]Ban K, Noyan-Ashraf MH, Hoefer J, Bolz SS, Drucker DJ, Husain M(2008)膜高血糖素样肽I的心脏保护性和血管舒张性活性为胰高血糖素样肽I受体依赖性和非依赖性途径所介导(Card1protective and vasodilatory act1ns of Glucagon-likePeptidelare mediated through both Glucagon-Like Peptidelreceptor-dependentand-1ndependent pathways)。发行 117:2340-2350
[0066] [8] Ladi1v Y，Efe 0，Schafer C 等(2003)再充氧诱导性僵型挛缩(Reoxygenat1n -1nduced rigor-type contracture).J Mol Cell Card1l.35:1481-1490
【权利要求】
1.一种如下式的肽
Rl-NH-HAEGTFTsDVssYLEGQAAKEFIAffLVK-CONR2R3 其中，R为H或含1-10个碳原子的有机化合物，且R2、R3独立地为H或具1-4个碳原子的烷基； 用于治疗或预防心脏缺血-再灌注损伤。
2.如权利要求1所述的肽，其特征在于，R1代表酰基。
3.如权利要求1或2所述的肽，其中R1为甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丙酰基和/或R2、R3独立地为氣、甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基，特别地，R2 = R3且为氣、甲基或乙基。
4.如权利要求1-3中至少一项所述的肽，其特征在于， R-GLP-1-(7-34)-酰胺8位的A被选自下组的中性氨基酸取代:S、St、G、C、Ct、Sar、β -丙氨酸和Aib ;和/或 R-GLP-1-(7-34)-酰胺10位的G被中性氨基酸取代；和/或 R-GLP-1-(7-34)-酰胺1 5位的D被酸性氨基酸取代。
5.如权利要求4所述的肽，其特征在于，A被S、St、G、C、C十、Sar、β-丙氨酸和Aib取代。
6.如权利要求1-5中至少一项所述的肽，其与适合的药学上可接受载体组合。
7.如权利要求1-6中至少一项所述的肽，其特征在于，所述的肽配制成永久性或脉动性释放剂。
8.如权利要求1-6中至少一项所述的肽，其特征在于，所述的肽配制成用于皮下、静脉内、动脉内、经口、肌内或经肺给药。
【文档编号】A61K38/26GK104039344SQ201280053163
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2012年10月29日 优先权日:2011年10月28日
【发明者】M·特雷曼, H·K·萨林, K·杜乐, T·恩斯特龙 申请人:法瑞斯生物技术有限公司