用于呼吸道合胞病毒的重组纳米颗粒rsv f疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明一般地涉及经修饰或突变的呼吸道合胞病毒融合(F)蛋白及其制备和使用方法，包括免疫原性组合物如用于治疗和/或预防RSV感染的疫苗。在一个方面，本发明提供了与野生型RSV?F蛋白相比包含修饰的或突变的氨基酸序列的重组RSV?F蛋白。一般而言，这些修饰或突变使所述RSV?F蛋白与野生型RSV?F蛋白相比增加表达，减少细胞毒性和/或增强免疫原性。在某些示例性实施方案中，所述RSV?F蛋白为人RSV?F蛋白。
【专利说明】用于呼吸道合胞病毒的重组纳米颗粒RSV F疫苗
[0001]对相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2009年9月30日提交的美国临时申请序列号N0.61/542，040，2011年10月3日提交的美国临时申请序列号N0.61/542，721，2012年3月16日提交的美国临时专利申请系列号N0.61/611，834和2012年3月12日提交的61/614，286的优先权，其每一个就所有目的均通过全文提述并入本文。
[0003]电子提交的文本文件的内容通过全文提述并入本文:序列表的计算机可读形式的拷贝(文件名:N0VV_048_04W0_SeqList.txt，记录日:2012年9月27日；文件大小:74kb)。
【技术领域】
[0004]本发明一般地涉及修饰或突变的呼吸道合胞病毒融合(F)蛋白及其制备和使用方法，包括免疫原性组合物如疫苗以供治疗和/或预防RSV感染。
[0005]发明背景
[0006]呼吸道合胞病毒(RSV)是副粘病毒科(Paramyxoviridae)肺病毒属(Pneumovirus)的成员。人RSV (HRSV)是幼儿中严重下呼吸道疾病的最主要原因，并在人中导致相当的发病率和死亡率。RSV还被认为是在免疫妥协的成人和老人中重要的致病原。由于天然感染之后感染宿主对RSV的不完全抗性，RSV可在儿童期和成人期多次感染。
[0007]该病毒具有由单链反义RNA组成的基因组，其与病毒蛋白紧密相联形成核壳。病毒包膜由质膜来源、含有病毒编码的结构蛋白的脂双层组成。在病毒粒体中包裹病毒聚合酶，其将基因组RNA转录为mRNA。RSV基因组编码三个跨膜结构蛋白:F、G和SH，两个基质蛋白:M和M2，三个核壳蛋白:N、P和L，以及两个非结构蛋白:NS1和NS2。
[0008]认为HRSV和细胞膜的融合发生于细胞表面，并为感染早期病毒核糖核蛋白转移至细胞质所必需的步骤。该过程是由融合(F)蛋白介导的，其还促进受感染细胞的膜与邻接细胞的膜融合以形成特征性的合胞体，其不仅为显著的细胞病变效果，而且还是病毒扩散的另外手段。相应地，中和融合活性在宿主免疫中是重要的。事实上，针对F蛋白开发的单克隆抗体已显示中和病毒的感染性并抑制膜融合(Calder等，2000, Virology271:122-131)。
[0009]RSV的F蛋白与其他副粘病毒(paramyxovirus)的F糖蛋白分享结构特征,和有限但却显著的氨基酸序列同一性。其作为无活性的574个氨基酸的前体(FO)合成，所述前体在内质网中在天冬酰胺上在翻译的同时发生糖基化，在此处其装配为同寡聚体。在到达细胞表面之前，H)前体由蛋白酶剪切为来自N端的F2和来自C端的FI。F2和Fl链仍由一个或多个二硫键共价连接。
[0010]已发现免疫亲和纯化的全长F蛋白以微团形式聚集(也表现为玫瑰花结(rosette)),类似于对其他全长病毒膜糖蛋白所观察的一般(Wrigley等，1986，inElectron Microscopy of Proteins, Vol5, p.103-163, Academic Press, London)。在电子显微镜下，玫瑰花结中的分子表现为或者是倒转的圆锥形杆状物(~70%)或棒棒糖形状(~30%)的结构，其较宽的端从玫瑰花结中央向外伸出。该杆状构象状态与融合前(pre-fus1n)失活状态的F糖蛋白相关,而棒棒糖构象状态与融合后(post-fus1n)、活性状态的F糖蛋白相关。
[0011]电子显微术可用于区分融合前和融合后(或者命名为融合前的(prefusogenic)和融合的(fusogenic)构象,如Calder等，2000，Virology271:122-131所说明。融合前构象还可与融合的(融合后)构象通过脂质体相关测定法来区分。此外，可使用特异性识别存在于RSV F蛋白的一种或另一种融合前或融合的形式，但不存在于其他形式的构象表位的抗体(例如单克隆抗体)来区分融合前和融合的构象。此种构象表位可为由于分子表面上抗原决定簇的偏好性暴露所致。或者，构象表位可来自在直链多肽上非连续的氨基酸的并列。
[0012]之前已显示F前体在两个位点被剪切(位点I，在残基109之后，和位点II，在残基136之后)，两者之前均为由弗林蛋白酶(furin)样蛋白酶识别的基序。位点II邻近融合肽，且F蛋白在两个位点的剪切对于膜融合是必需的。(Gonzalez-Reyes等，2001, PNAS98 (17): 9859-9864)。当在两个位点剪切均完成时，认为杆状物从圆锥形状转变为棒棒糖形状。
【发明内容】
[0013]如本文中所述，本发明已发现，当对RSV F蛋白的结构进行某些修饰时，可实现令人惊讶的高水平融合(F)蛋白的表达。此类修饰还令人意想不到地减少了 RSV F蛋白在宿主细胞中的细胞毒性。此外，本发明经修饰的F蛋白表现改善的展示融合后“棒棒糖”形态而非融合前“杆状”形态的能力。因此，在一个方面，本发明经修饰的F蛋白还可展示与野生型F蛋白相比改善的免疫原性。这些修饰显然适用于疫苗的开发和使用该疫苗以供治疗和/或预防RSV的方法。本发明提供了与野生型RSV F蛋白相比表现表达增加，细胞毒性减少和/或免疫原性增强的重组RSV F蛋白。
[0014]在一个方面，本发明提供了与野生型RSV F蛋白相比包含修饰的或突变的氨基酸序列的重组RSV F蛋白。一般而言，这些修饰或突变使所述RSV F蛋白与野生型RSV F蛋白相比增加表达，减少细胞毒性和/或增强免疫原性。在某些示例性实施方案中，所述RSVF蛋白为人RSV F蛋白。
[0015]所述RSV F蛋白优选与野生型RSV F蛋白(例如示例于SEQ ID NO:2)相比包含修饰的或突变的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述RSV F蛋白含有在对应于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO:2)位置P102的氨基酸处的修饰或突变。在另一个实施方案中，所述RSVF蛋白含有在对应于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO:2)位置1379的氨基酸处的修饰或突变。在另一个实施方案中，所述RSV F蛋白含有在对应于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO:2)位置M447的氨基酸处的修饰或突变。
[0016]在一个实施方案中，所述RSV F蛋白含有在对应于上述位置的氨基酸处的两个或更多个修饰或突变。在另一个实施方案中，所述RSV F蛋白含有在对应于上述位置的氨基酸处的三个修饰或突变。
[0017]在一个具体实施方案中，本发明涉及其中位置102处的脯氨酸由丙氨酸取代的RSV F蛋白。在另一个具体实施方案中，本发明涉及其中位置379处的异亮氨酸由缬氨酸取代的RSV F蛋白。还在另一个具体实施方案中，本发明涉及其中位置447处的甲硫氨酸由缬氨酸取代的RSV F蛋白。在某些实施方案中，所述RSV F蛋白含有在对应于这些具体实施方案中所述的位置的氨基酸处的两个或更多个修饰或突变。在某些其他的实施方案中，所述RSV F蛋白含有在对应于这些具体实施方案中所述的位置的氨基酸处的三个修饰或突变。在一个示例性实施方案中，所述RSV蛋白具有SEQ ID NO:4中所述的氨基酸序列。
[0018]在一个实施方案中，进一步优化所述RSV F蛋白的编码序列以增强其在合适宿主细胞中的表达。在一个实施方案中，所述宿主细胞是昆虫细胞。在一个示例性实施方案中，所述昆虫细胞是Sf9细胞。
[0019]在一个实施方案中，经密码子优化的RSV F基因的编码序列是SEQ ID N0:3。在另一个实施方案中，所述经密码子优化的RSV F蛋白具有SEQ ID NO: 4中所述的氨基酸序列。
[0020]在一个实施方案中，所述RSV F蛋白进一步在F2的隐含多聚(A)位点包含至少一个修饰。在另一个实施方案中，所述RSV F蛋白进一步在主要剪切位点(CS)包含一种或多种氨基酸突变。在一个实施方案中，所述RSV F蛋白在对应于野生型RSV F蛋白(SEQ IDNO: 2)或经密码子优化的RSV F蛋白(SEQ ID NO:4)的位置R133处含有修饰或突变。在另一个实施方案中，所述RSV F蛋白在对应于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO:2)或经密码子优化的RSV F蛋白(SEQ ID NO:4)的位置R135处含有修饰或突变。还在另一个实施方案中，所述RSV F蛋白在对应于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO:2)或经密码子优化的RSV F蛋白(SEQ ID NO:4)的位置R136处含有修饰或突变。
[0021]在一个具体实施方案中，本发明涉及其中位置133处的精氨酸由谷氨酰胺取代的RSV F蛋白。在另一个具体实施方案中，本发明涉及其中位置135处的精氨酸由谷氨酰胺取代的RSV F蛋白。还在另一个具体实施方案中，本发明涉及其中位置136处的精氨酸由谷氨酰胺取代的RSV F蛋白。在某些实施方案中，所述RSV F蛋白含有在对应于这些具体实施方案中所述的位置的氨基酸处的两个或更多个修饰或突变。在某些其他的实施方案中，所述RSV F蛋白含有在对应于这些具体实施方案中所述的位置的氨基酸处的三个修饰或突变。在一个示例性实施方案中，所述RSV蛋白具有SEQ ID NO:6中所述的氨基酸序列。
[0022]在另一个实施方案中，所述RSV F蛋白进一步在融合域的N端一半(N-terminalhalf)中包含对应于SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 6的氨基酸137-146的缺失。在一个示例性实施方案中，所述RSV F蛋白具有SEQ ID NO:8中所述的氨基酸序列。在一个替代实施方案中，所述RSV F蛋白具有SEQ ID NO: 10中所述的氨基酸序列。
[0023]进一步包括在本发明范围内的是除了人RSV F蛋白(SEQ ID NO:2)之外的RSV F蛋白，其含有对应于那些如上所示的改变。此类RSV F蛋白可包括但不限于来自人RSV A株、人RSV B株、牛RSV株和禽RSV株的RSV F蛋白。
[0024]在一些实施方案中，本发明涉及在宿主细胞中相比野生型RSVF蛋白如SEQ IDNO:2所示的蛋白表现表达增加的修饰的或突变的RSV F蛋白。在其他实施方案中，本发明涉及在宿主细胞中相比野生型RSV F蛋白(如SEQ ID N0:2所示的蛋白)表现细胞毒性减少的修饰的或突变的RSV F蛋白。还在其他实施方案中，本发明涉及相比野生型RSV F蛋白(如SEQ ID NO:2所示的蛋白)表现免疫原性增加的修饰的或突变的RSV F蛋白。
[0025]在其他方面，本发明提供了包含一种或多种如本文中所述的修饰的或突变的RSVF蛋白的免疫原性组合物。在一个实施方案中，本发明提供了由一种或多种修饰的或突变的RSV F蛋白组成的微团(例如RSV F微团)。
[0026]在另一个实施方案中，本发明提供了包含修饰的或突变的RSV F蛋白的病毒样颗粒(VLP)。在一些实施方案中，所述VLP进一步包含一种或多种其他蛋白。
[0027]在一个实施方案中，所述VLP进一步包含基质(M)蛋白。在一个实施方案中，所述M蛋白来源于人RSV株。在另一个实施方案中，所述M蛋白来源于牛RSV株。在其他实施方案中，所述基质蛋白可为来自流感病毒株的Ml蛋白。在一个实施方案中，所述流感病毒株是禽流感病毒株。在其他实施方案中，所述M蛋白可来源于新城疫病毒(NDV)株。
[0028]在其他实施方案中，所述VLP进一步包含RSV糖蛋白G。在另一个实施方案中，所述VLP进一步包含RSV糖蛋白SH。还在另一个实施方案中，所述VLP进一步包含RSV核壳N蛋白。
[0029]所述修饰或突变的RSV F蛋白可用于预防和/或治疗RSV感染。因此，在另一个方面，本发明提供了用于引发针对RSV的免疫应答的方法。所述方法涉及将免疫学上有效量的含有修饰的或突变的RSV F蛋白的组合物施于受试者,如人或动物受试者。
[0030]在另一个方面，本发明提供了包含修饰的或突变的RSV F蛋白的药学上可接受疫苗组合物，包含修饰的或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或包含修饰的或突变的RSV F蛋白的VLP。
[0031]在一个实施方案中，本发明包括包含至少一个有效剂量的经修饰或突变的RSV F蛋白的免疫原性配制物。在另一个实施方案中，本发明包括包含至少一个有效剂量的包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团的免疫原性配制物。还在另一个实施方案中，本发明包括包含至少一个有效剂量的包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP的免疫原性配制物。
[0032]在另一个实施方案中，本发明提供了包含充满本发明的疫苗配制物的一种或多种成分的一个或多个容器的药物包或试剂盒。
[0033]在另一个实施方案中，本发明提供了配制诱导针对对哺乳动物的感染或其至少一种疾病症状的免疫的疫苗或抗原性组合物的方法，包括将有效剂量的经修饰或突变的RSVF蛋白、包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP添加至所述配制物。在一个优选实施方案中，所述感染是RSV感染。
[0034]本发明经修饰或突变的RSV F蛋白可用于制备刺激赋予针对传染原的免疫或实体免疫的免疫应答的组合物。因此，在一个实施方案中，本发明提供了在受试者中诱导针对感染或其至少一种疾病症状的免疫的方法，包括施用至少一个有效剂量的经修饰或突变的RSV F蛋白、包含经修饰或突变的RSVF蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP。
[0035]还在另一个方面，本发明提供了在受试者中诱导针对RSV病毒感染或至少一种疾病症状的实体免疫的方法，包括施用至少一个有效剂量的经修饰或突变的RSV F蛋白、包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP。
[0036] 本发明的组合物当施于脊椎动物(例如人)时可在该脊椎动物中诱导实体免疫。因此，在一个实施方案中，本发明提供了在受试者中诱导针对RSV病毒感染或至少一种疾病症状的实体免疫的方法，包括施用至少一个有效剂量的经修饰或突变的RSV F蛋白、包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP。在另一个实施方案中，本发明提供了免疫接种哺乳动物免受RSV的方法，包括将诱导保护量的经修饰或突变的RSV F蛋白、包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP施于所述哺乳动物。
[0037]在另一个实施方案中，本发明包括在受试者中诱导针对感染或其至少一种症状的保护性抗体应答的方法，包括施用至少一个有效剂量的经修饰或突变的RSV F蛋白、包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP。
[0038]在另一个实施方案中，本发明包括在受试者中诱导针对RSV感染或其至少一种疾病症状的保护性细胞应答的方法，包括施用至少一个有效剂量的经修饰或突变的RSV F蛋白。在另一个实施方案中，本发明包括在受试者中诱导针对RSV感染或其至少一种疾病症状的保护性细胞应答的方法，包括施用至少一个有效剂量的包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团。在另一个实施方案中，本发明包括在受试者中诱导针对RSV感染或其至少一种疾病症状的保护性细胞应答的方法，包括施用至少一个有效剂量的VLP，其中所述VLP包含经修饰或突变的RSV F蛋白。
[0039]还在另一个方面，本发明提供了编码本发明经修饰或突变的RSV F蛋白的分离的核酸。在一个示例性实施方案中，所述编码经修饰或突变的RSV F蛋白的分离的核酸选自下组:SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7 或 SEQ ID NO:9。
[0040]还在另一个方面，本发明提供了包含编码本发明经修饰或突变的RSV F蛋白的核酸的分离的细胞。在一个示例性实施方案中，所述编码经修饰或突变的RSV F蛋白的分离的核酸选自下组:SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7 或 SEQ ID NO:9。
[0041]还在另一个方面，本发明提供了包含编码本发明经修饰或突变的RSV F蛋白的核酸的载体。在一个示例性实施方案中，所述编码经修饰或突变的RSVF蛋白的分离的核酸选自下组:SEQ ID NO:3、S EQ ID NO:5、SEQ ID NO:7 或 SEQ ID NO:9。在一个实施方案中，所述载体是杆状病毒载体。
[0042]还在另一个方面，本发明提供了制备RSV F蛋白的方法，包括(a)转化宿主细胞以表达编码本发明经修饰或突变的RSV F蛋白的核酸；和(b)在有助于产生所述RSV F蛋白的条件下培养所述宿主细胞。在一个实施方案中，所述编码经修饰或突变的RSV F蛋白的核酸选自下组:SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7 或 SEQ ID NO: 9。在另一个实施方案中，所述宿主细胞是昆虫细胞。在进一步的实施方案中，所述宿主细胞是用包含本发明经修饰或突变的RSV F蛋白的杆状病毒载体转染的昆虫细胞。
[0043]还在另一个方面，本发明提供了制备RSV F蛋白微团的方法，包括(a)转化宿主细胞以表达编码本发明经修饰或突变的RSV F蛋白的核酸；和(b)在有助于产生所述RSV F蛋白的条件下培养所述宿主细胞。在一个实施方案中，所述编码经修饰或突变的RSV F蛋白的核酸选自下组:SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7 或 SEQ ID NO:9。在一个实施方案中，所述宿主细胞是昆虫细胞。在一个示例性实施方案中，所述宿主细胞是用包含本发明经修饰或突变的RSV F蛋白的杆状病毒载体转染的昆虫细胞。
[0044]在一个方面，本发明涉及RSV融合表面糖蛋白(F)纳米颗粒疫苗。在一个实施方案中，所述疫苗包括全长F蛋白。在进一步的实施方案中，所述全长F蛋白剪切为二硫化物连接的Fl和F2三聚体。所述Fl和F2三聚体，在一个实施方案中，存在于具有直径约20nm至40nm的微团中。
[0045]在另一个方面，提供通过本发明的疫苗产生的抗体。
[0046]还在另一个方面，提供用于接种需要其的受试者的方法。在一个实施方案中，所述方法包括将重组RSV融合糖蛋白(F)纳米颗粒疫苗施于受试者。在进一步的实施方案中，所述全长F蛋白剪切为二硫化物连接的Fl和F2三聚体。所述Fl和F2三聚体，在一个实施方案中，存在于具有直径约20nm至40nm的微团中。
[0047]在一个实施方案中，本发明的疫苗以选自下组的剂量施于:5 μ g，15 μ g，30 μ g和60 μ go
[0048]在另一方面，提供用于接种需要其的受试者的方法。在一个实施方案中，所述方法包括将包含全长F蛋白和佐剂的重组RSV 融合糖蛋白(F)纳米颗粒疫苗施于受试者。在进一步的实施方案中，所述佐剂是明矾。
【专利附图】
【附图说明】
[0049]图1描绘了野生型HRSV F。蛋白和主要(SEQ ID NO:32)和次要(SEQ ID NO:33)剪切位点的结构。
[0050]图2描绘了具有实施例3中所述的剪切位点突变的修饰的RSV FO蛋白的结构，对应 SEQ ID NO:28(KKQKQQ)，29(GRRQQR)，30(RAQQ)和 31 (KKQKRQ)。
[0051]图3描绘了修饰的HRSV F蛋白BV#541(SEQ ID NO:6)的主要剪切位点中的保守取代(R133Q、R135Q 和 R136Q)。
[0052]图4描绘了修饰的HRSV F蛋白BV#541 (SEQ ID NO:6)的序列和结构。
[0053]图5描绘了修饰的HRSV F蛋白BV#622(SEQ ID NO: 10)的序列和结构。
[0054]图6描绘了经纯化的重组HRSV F蛋白BV#622存在或不存在β ME时的SDS-PAGE考马斯染色的凝胶。
[0055]图7Α描绘了 RSV F融合域突变体的Western印迹分析。图7B描绘了 RSV F融合域的细胞表面RSV F蛋白免疫染色。图7C描绘了修饰的HRSV F蛋白BV#683 (SEQ IDNO:8)的结构。图7D描绘了亲本克隆BV#541(A0)和在融合域中具有Λ2，Λ 4，Λ 6，Λ 8，Δ 10 (BV#683), Δ 12, Δ 14, Λ 16和Λ18缺失的突变体。BV#541包括一种蛋白，其中所述融合域的氨基酸序列包含SEQ ID N0:6的位点137至154。所述缺失突变体的融合域部分的氨基酸序列包含SEQ ID Ν0:6(Λ6)的位点143至154，posit1nl45tol54of SEQID Ν0:6(Δ8)的位点 145 至 154，SEQ ID Ν0:6(Δ 10 ；BV#683)的位点 147 至 154，SEQ IDΝ0:6( Λ 12)的位点 149至 154，SEQ ID NO:6 ( Λ 14)的位点 151 至 154，或SEQ ID Ν0:6(Δ 16)的位点153至154。对应SEQ ID NO:6中位点137至154的完整融合域在具有Λ 18缺失的突变体中缺失。
[0056]图8描绘了经纯化的重组HRSV F蛋白BV#622和BV#683存在或不存在β ME时的SDS-PAGE考马斯染色的凝胶(左侧)，和它们的结构。
[0057]图9描绘了经纯化的重组HRSV F蛋白BV#683存在或不存在β ME时的SDS-PAGE考马斯染色的凝胶(左侧)和Western印迹(右侧)分析。
[0058]图10描绘了用于通过扫描光密度法(左侧)和Western印迹(右侧)对经纯化的重组HRSV F蛋白BV#683的纯度分析中的SDS-PAGE考马斯染色的凝胶。
[0059]图11描绘了在负染电子显微镜中摄取的经纯化的重组HRSV F蛋白BV#683微团(玫瑰花结)的照片。
[0060]图12A描绘了 HRSV F蛋白BV#683的反向HPLC分析。图12B描绘了 HRSV F蛋白BV#683的排阻HPLC分析。图12C描绘了 HRSV F蛋白BV#683微团的颗粒大小分析。
[0061]图13描绘了在粗细胞培养收获物(胞内)或通过30%蔗糖梯度分离所沉淀的样品中经修饰的HRSV F蛋白BV#622和BV#623(SEQ ID NO: 21)与或不与HRSV N和BRSV M蛋白共同表达时的SDS-PAGE考马斯染色的凝胶(左侧)和Western印迹(右侧)分析，以及BV#622和BV#623的结构。
[0062]图14描绘了在粗细胞培养收获物(胞内)样品中的经修饰的HRSV F蛋白BV#622、双串联(double tandem)嵌合 BV#636 (BV#541+BRSV Μ)、BV#683、BV#684 (具有 YIAL L-域的BV#541)以及BV#685 (具有YKKL L-域的BV#541)与或不与HRSV N和BRSV M蛋白共同表达时的SDS-PAGE考马斯染色的凝胶(左侧)和Western印迹(右侧)分析，以及每一个经分析的经修饰的HRSV F蛋白的结构。
[0063]图15描绘了在通过30%蔗糖梯度分离的沉淀的样品中的经修饰的RSV F蛋白BV#622 (SEQ ID NO: 10)、双串联嵌合 BV#636 (BV#541+BRSV M)、BV#683 (SEQ ID NO: 8)、BV#684(具有 YIAL L-域的BV#541)以及BV#685 (具有YKKL L-域的BV#541)与或不与HRSVN和BRSV M蛋白共同表达时的SDS-PAGE考马斯染色的凝胶(左侧)和Western印迹(右侧)分析，以及每一个经分析的经修饰的HRSV F蛋白的结构。
[0064]图16A-D描绘了实施例9中所述的每个经修饰的RSV F蛋白的结构、克隆名、描述、Western印迹和SDS-PAGE考马斯结果以及结论。
[0065]图17描绘了实施例10中所述的RSV攻击研究的实验过程。
[0066]图18 描绘了在第 31 日和第 46 日用 PBS、生活 RSV、F1-RSV、I μ g PFP、I μ gPFP+AlumUOy g PFPUOy g PFP+Alum、30 μ g PFP和阳性对照(绵羊抗F)免疫接种的小鼠的RSV中和测定结果。
[0067]图19描绘了在感染性RSV攻击之后4日，用PBS、生活RSV、FI_RSV、ly g PFPU μ gPFP+Alum、10 μ g PFP、10 μ g PFP+Alum和30 μ g PFP免疫接种的小鼠的肺组织中的RSV效价。
[0068]图20描绘了在2-8°C储藏0、1、2、4和5周的纯化的重组RSV F蛋白BV#683的用考马斯染色的SDS-PAGE凝胶。
[0069]图21描绘了用生活RSV(RSV)、福尔马林失活的RSV(F1-RSV)、具有或不具有铝的RSV-F蛋白BV#683 (PFP和PFP+铝佐剂)和PBS对照免疫接种之后的RSV A和RSV B中和抗体应答。
[0070]图22描绘了在用生活RSV(RSV)、福尔马林失活的RSV(F1-RSV)、具有或不具有铝的RSV-F蛋白BV#683 (F-微团(30 μ g)和F-微团(30 Ug) +铝佐剂)和PBS对照免疫接种的大鼠中用RSV攻击之后的肺部病理状况(pathology)。
[0071]图23为显示在棉鼠(y轴，表示为Log2效价)对比在不同的接种处理组(x轴)中对RSV A中和抗体应答的图。每个组的线为中和100%的终点效价的几何平均数。
[0072]图24为显示在棉鼠(y轴，表示为Log2效价)对比在不同的接种处理组(x轴)中对RSV A中和抗体应答的图。每个组的线为中和100%的终点效价的几何平均数。
[0073]图25为显示棉鼠(表示为组织的loglOpfu/gram)对比不同的接种处理组(x轴)的肺病毒效价的图。所述病毒效价显示为土SEM。
[0074]图26A为显示ELISA单位对比接种组的图，且提供了在用RSV F疫苗，F1-RSV,活RSV或PBS处理的动物中抗体产生的测量方法。图26B为显示在每个疫苗组中如通过RSV-F IgG效价测定的抗体产生的图。图26C为描绘在每个接种组中针对RSV的血清中和抗体效价的图。图26D为显示来自得自每个接种组的血清池的帕利珠单抗竞争性的IgG效价的图。
[0075]图27为收获自用本发明的纳米颗粒疫苗处理后且随后用RSV攻击的大鼠肺组织的典型显微图。
[0076]图28为显示帕利珠单抗表位(SEQ ID NO: 35)和通过本发明的疫苗产生的抗体间的结合竞争性的图。
[0077]图29A为显示不同浓度的Synagis? mAb结合帕利珠单抗表位肽的图。图29B为显示不同浓度的Synagis? mAb结合重组RSV F微团的图。
[0078]图30提供了实施以检测本发明纳米颗粒疫苗免疫原性的各种测定法的图解。
[0079]图31为显示利用来自用本发明的疫苗处理的受试者的人血清的ELISA研究结果的图。
[0080]图32为显示在来自用本发明的疫苗处理的受试者的人血清中检测的抗-RSVF(A)和抗-RSV G(B)的图。
[0081]图33为显示明矾处理组抗-RSV F IgG水平几何平均升高倍数的图。
[0082]图34为显示用本发明的纳米颗粒疫苗处理前后，不同时间点受试者的噬菌斑减少中和效价的图。
[0083]图35显示了安慰剂和30 μ g+明矾组中第O日，第30日和第60日的反向累积分布。
[0084]图36A显示了用于用来评估人血清中针对RSV F的抗体亲合力的基于BIAcoreSPR的抗原结合测定法的阳性测定法对照。图36B显示了对比阳性对照帕利珠单抗，来自第O日和安慰剂对照的血清的传感图。
[0085]图37显示了如用基于BIAcore SPR的抗原结合测定法测定的，帕利珠单抗和来自疫苗组的代表性样品的结合曲线。
[0086]图38为显示不同处理组(I)抗-F IgG(左柱)和⑵丽(右柱)两者抗体效价升高的几何平均值的图。
[0087]图39为显示以不同剂量施于RSV纳米颗粒疫苗的患者中抗体几何平均效价(GMT)的图。所述抗体应答针对抗原性位点II肽254-278。
[0088]图40A为显示通过RSV F蛋白纳米颗粒疫苗产生的抗体与帕利珠单抗相竞争的图。图40B为显示所有疫苗组中剂量I后和剂量2后帕利珠单抗竞争性抗体的图。
[0089]图41为显示帕利珠单抗竞争性测定法的结果的图。所述结果显示RSV F纳米颗粒疫苗诱导的抗体与对帕利珠单抗结合位点竞争性的抗体相关联。
[0090]图42显示所示的单克隆抗体的RSV F结合效价和全长RSV F抗原上每个单克隆抗体的抗体识别位点。
[0091]图43为显示来自在有或无佐剂时用F1-RSV，RSV-F纳米颗粒疫苗免疫，或在免疫后第O，28和49日用活RSV免疫的棉鼠的血清中抗-RSV F IgG抗体效价的图。
[0092]图44为显示在有或无佐剂时用F1-RSV，RSV-F纳米颗粒疫苗，或活RSV免疫后第0，28和49日的棉鼠的中和抗体应答的图。
[0093]图45为显示来自在有或无佐剂时用F1-RSV，RSV-F纳米颗粒疫苗，或活RSV免疫的棉鼠的血清中融合抑制效价的图。
[0094]图46为显示来自在有或无佐剂时用F1-RSV，RSV-F纳米颗粒疫苗，或活RSV免疫的棉鼠的血清中竞争性ELISA效价的图。
[0095]图47显示来自在有或无佐剂时用F1-RSV，RSV-F纳米颗粒疫苗，或活RSV免疫的棉鼠的血清中与所示的中和RSV F-特异性单克隆抗体竞争性的疫苗诱导的抗体的效价。
[0096]发明详述
[0097]定义
[0098]如用于本文，术语“佐剂”指当在配制物中与特定免疫原(例如经修饰或突变的RSV F蛋白、包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP)组合使用时，会提高或者以其他方式改变或修饰所得的免疫应答的化合物。免疫应答的修饰包括加强或拓宽抗体和细胞免疫应答之一或两者皆是的特异性。免疫应答的修饰亦可意指减少或抑制某些抗原特异性免疫应答。
[0099]如用于本文，术语“抗原性配制物”或“抗原性组合物”指当施于脊椎动物特别是鸟或哺乳动物时，会诱导免疫应答的制备物。
[0100] 如用于本文，术语“禽流感病毒”指主要见于禽类但亦可感染人或其他动物的流感病毒。在一些情况下，禽流感病毒可从一个人传染或散布至另一个人。感染人的禽流感病毒具有引起流感流行，即人类发病和/或病死的潜力。当新的流感病毒株(人对其不具有天然免疫的病毒)出现时，发生流行，散布至个别区域之外，可能遍及全球，并同时感染许多人。
[0101]如用于本文“有效量”一般指足以诱导免疫、预防或减轻感染或减少感染或疾病的至少一种症状和/或增强另一剂的经修饰或突变的RSV F蛋白、包含经修饰或突变的RSVF蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP效力的本发明经修饰或突变的RSV F蛋白、包含经修饰或突变的RSVF蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP的量。有效剂量可指足以延迟或最小化感染或疾病发作的经修饰或突变的RSVF蛋白、包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP的量。有效剂量亦可指在治疗或控制感染或疾病中提供治疗益处的经修饰或突变的RSV F蛋白、包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP的量。此外，有效剂量是在治疗或控制感染或疾病中提供治疗益处的针对本发明的经修饰或突变的RSV F蛋白、包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP自身的量，或与其他治疗组合的量。有效剂量亦可为足以增强受试者(例如人)针对后续暴露于传染原或疾病的本身的免疫应答的量。免疫的水平可例如通过测量中和性的分泌和/或血清抗体(例如通过噬菌斑中和、补体结合、酶联免疫吸附或微中和测定)，或通过测量细胞应答(如细胞毒性T细胞、抗原呈递细胞、辅助T细胞、树突状细胞和/或其他细胞应答，但不限于此)来进行监视。T细胞应答可通过例如使用特异性标记通过荧光流式细胞计数或T细胞测定法(如T细胞增殖测定、T细胞细胞毒性测定、TETRAMER测定和/或ELISP0T测定)来测量例如存在的⑶4+和⑶8+细胞的量来进行监视。在疫苗的情况下“有效剂量”是预防疾病和/或减少症状严重性的剂量。
[0102]如用于本文，术语“有效量”指实现所需生物作用所必须的或足以实现所需生物作用的经修饰或突变的RSV F蛋白、包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP的量。组合物的有效量会是实现选定结果的量，且此种量可由本领域技术人员作为常规实验事项加以确定。举例而言，预防、治疗和/或减轻感染的有效量可为在暴露于本发明的经修饰或突变的RSV F蛋白、包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP时，造成免疫系统激活，导致抗原特异性免疫应答的发生所必需的量。该术语亦为“足量”的同义词。
[0103]如用于本文，术语“表达”指多聚核酸转录为mRNA并翻译为肽、多肽或蛋白的过程。如果多聚核酸来源于基因组DNA，表达可包括mRNA的剪接(如果选取适当的真核宿主细胞或生物)。在本发明的上下文中，该术语亦涵盖在其表达之后取得的RSV F基因mRNA和RSV F蛋白的产出。
[0104]如用于本文，术语“F蛋白”或“融合蛋白”或“F蛋白多肽”或“融合蛋白多肽”指具有RSV融合蛋白多肽全部或部分氨基酸序列的多肽或蛋白。类似地，术语“G蛋白”或“G蛋白多肽”指具有RSV附接蛋白(attachment protein)多肽的全部或部分氨基酸序列的多肽或蛋白。已描述了多种RSV融合和附接蛋白，且其对于本领域技术人员是已知的。W0/2008/114149，其通过全文提述并入本文，列举了示例性F和G蛋白变体(例如，天然存在的变体)。
[0105]如用于本文，术语“免疫原”或“抗原”指能够引发免疫应答的物质如蛋白、肽、肽、核酸。两个术语均涵盖表位，并可互换使用。
[0106]如用于本文，术语“免疫刺激剂”指通过机体自身的化学信使(细胞因子)增强免疫应答的化合物。这些分子包括多种具有免疫刺激、免疫增强和促炎症活性的细胞因子、淋巴因子和趋化因子，如干扰素(IFN-Y)、白介素(例如IL-1、IL-2、IL_3、IL_4、IL-12、IL-13);生长因子(例如，粒细胞-巨噬细胞(GM)集落刺激因子(CSF));和其他免疫刺激分子，如巨噬细胞炎症因子、Flt3配体、B7.1 ;B7.2等。所述免疫刺激剂分子可与本发明的VLP在相同配制物中施用，或可分别施用。可施用该蛋白或编码该蛋白的表达载体以产生免疫刺激作用。
[0107]如用于本文，术语“免疫原性配制物”指当施于脊椎动物例如哺乳动物时，会诱导免疫应答的制备物。
[0108]如用于本文，术语“传染原”指在脊椎动物中造成感染的微生物。通常所述生物为病毒、细菌、寄生物、原生生物和/或真菌。
[0109]如用于本文，术语“突变的”、“修饰的”、“突变”或修饰指任何导致核酸或多肽改变的对核酸和/或多肽的修饰。突变包括，例如在多核苷酸中的点突变、缺失或插入单一或多个残基，其包括在基因的蛋白编码区内出现的改变以及在蛋白编码序列之外的区(如调节或启动子序列，但不限于此)中的改变。遗传变化可以是任何类型的突变。举例而言，所述突变可包括点突变、移码突变、插入或缺失部分或整个基因。在一些实施方案中，所述突变为天然存在的。在其他实施方案中，所述突变为人工突变压力的结果。仍在其他实施方案中，RSV F蛋白中的突变是遗传工程的结果。
[0110]如用于本文，术语“多价的”指具有一个或多个针对多种类型或株的传染原或疾病的抗原性蛋白/肽或免疫原的组合物。
[0111]如用于本文，术语“药学上可接受的疫苗”指含有本发明的经修饰或突变的RSV F蛋白、包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP的配制物，其为能够施于脊椎动物并诱导足以诱导免疫以预防和/或减轻感染或疾病，和/或减少感染和/或疾病至少一种症状，和/或增强另一剂的经修饰或突变的RSV F蛋白、包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP的效力的保护性免疫应答的形式。通常而言，所述疫苗包含本发明组合物悬于或溶解于其中的常规的盐水或经缓冲的水溶液介质。以此形式，本发明的组合物可方便地用于预防、减轻或以其他方式治疗感染。当导入宿主时，所述疫苗能够激发包括但不限于产生抗体和/或细胞因子和/或激活细胞毒性T细胞、抗原呈递细胞、辅助T细胞、树突状细胞和/或其他细胞应答的免疫应答。
[0112]如用于本文，短语“保护性免疫应答”或“保护性应答”指由针对传染原或疾病的抗体介导的免疫应答，其由脊椎动物(例如人)所展示，预防或减轻感染，或减少其至少一种疾病症状。本发明的经修饰或突变的RSV F蛋白、包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSVF微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP可刺激抗体的产生，所述抗体例如中和传染原、阻断传染原进入细胞、阻断传染原的复制和/或保护宿主细胞免受感染和破坏。该术语亦指由T淋巴细胞和/或其他白细胞介导针对免疫原或疾病的免疫应答，其由脊椎动物(例如人)展示，预防或减轻感染或疾病，或减少其至少一种症状。
[0113]如用于本文，术语“脊椎动物”或“受试者”或“患者”指任何脊索动物亚门(subphylum cordata)的成员，包括但不限于人和其他灵长类，包括非人灵长类如黑猩猩和其他猿和猴物种。牲畜(farm animal)如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物如犬和猫；实验室动物包括啮齿类如小鼠、大鼠(包括棉鼠)和豚鼠；禽类，包括家养、野生和猎禽如鸡、火鸡和其他鸡类、鸭、鹅等亦为非限定性实例。术语“哺乳动物”和“动物”包括在该定义中。旨在涵盖成体和新生个体两者。具体而言，婴幼儿为RSV疫苗的适当受试者或患者。
[0114]如用于本文，术语“病毒样颗粒”(VLP)指至少一个属性类似病毒但不表现为感染性的结构。病毒样颗粒依照本发明并不携带编码病毒样颗粒的蛋白的遗传信息。一般而言，病毒样颗粒缺乏病毒基因组，并因此不具感染性。此外，病毒样颗粒经常通过异源表达大量产生，并可方便地纯化。
[0115]如用于本文，术语“嵌合VLP”指含有来自至少两个传染原的蛋白(异源蛋白)或其部分的VLP。通常而言，一种蛋白来源于能够驱动从宿主细胞的VLP形成的病毒。就说明的目的的实例为BRSV M蛋白和/或HRSV G或F蛋白。术语RSV VLP和嵌合VLP在适当时可互换使用。
[0116]如用于本文，术语“疫苗”指死的或减弱的病原体或衍生的抗原决定簇的制备物，其用于诱导针对该病原体的抗体或免疫的形成。给予疫苗以提供对疾病例如流感(其由流感病毒引起)的免疫。此外，术语“疫苗”亦指施于脊椎动物以产生保护性免疫(即预防或减少与感染相关的疾病严重性的免疫)的免疫原(例如，经修饰或突变的RSV F蛋白、包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP)的悬液或溶液。本发明提供了具免疫原性并可提供针对与感染相关的疾病的保护的疫苗组合物。
[0117]RSV F 蛋白
[0118]RSV F蛋白和方法在2009年9月9日提交的美国专利申请系列号N0.12/633，995(在 2010 年 9 月 23 日作为美国公布 N0.2010/0239617 公开)，2008 年 12 月9日提交的美国临时申请系列号N0.61/121，126，以及2009年4月14日提交的美国临时申请系列号N0.61/169，077和2009年7月10日提交的美国临时申请系列号N0.61/224，787中描述，所述每篇的公开内容就所有目的通过全文提述并入本文。
[0119]两个结构膜蛋白，F和G蛋白表达于RSV的表面，并显示为中和抗体的靶标(Sullender, W., 2000, Clinical Microb1logy Reviewl3, 1-15)。这两个蛋白亦主要负责病毒识别和进入靶细胞；G蛋白结合于特定细胞受体，而F蛋白促进病毒与细胞的融合。F蛋白亦表达于感染细胞的表面，并负责其之后与其他细胞的融合，导致合胞体的形成。因此，针对F蛋白的抗体可中和病毒，或阻断病毒进入细胞或防止合胞体形成。尽管对G和F蛋白两者，已描述了 A和B亚型之间的抗原性和结构差异，更显著的抗原性差异存在于G蛋白，其氨基酸序列仅为53%同源，而抗原相关性为5% (Walsh等(1987) J.1nfect.Dis.155，1198-1204 ；and Johnson 等(1987)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA84, 5625-5629)。与之相对，针对F蛋白培育的抗体在亚型A和B病毒中显示高度的交叉反应性。
[0120]RSV F蛋白指导RSV通过病毒粒体的包膜蛋白与宿主细胞质膜之间的融合进行的穿透。之后在感染过程中，表达于细胞表面的F蛋白可介导与相邻细胞的融合以形成合胞体。F蛋白是I型跨膜表面蛋白，其具有N端剪切的信号肽和靠近C端的膜锚着点(membraneanchor)。RSV F是作为无活性的Ftl前体合成的，其装配为同三聚体，并通过在反面高尔基复合体(trans-Golgi complex)中由细胞内肽酶剪切得到两个二硫键连接的亚基，F1和F2亚基而激活。由剪切产生的F1亚基的N端含有直接插入靶标膜中以起始融合的疏水域(融合肽)。F1亚基亦含有在融合中结合从而驱动使病毒和细胞膜彼此紧密接近的构象改变(conformat1nal shift)的七重复，(Collins和Crowe, 2007，Fields Virology, 5th ed., D.M Kipe 等，Lipincott, Willia ms and ffilkons, p.1604) ? SEQ ID NO: 2 (GenBank 登录号AAB59858)描绘了代表性RSV F蛋白，其由SEQ ID NO:1 (GenBank登录号Ml 1486)中所示的基因编码。
[0121]自然界中，RSVF蛋白作为命名为FO的长574个氨基酸的单一多肽前体表达。在体内，FO在内质网中寡聚化，并由弗林蛋白酶在两个保守的弗林蛋白酶共同序列(弗林蛋白酶剪切位点)RARR(SEQ ID N0:23)(次要)和KKRKRR(SEQ ID N0:24)(主要)进行蛋白水解加工以生成由两个二硫键连接的片段组成的寡聚物。这些片段中较小的命名为F2，其起源于FO前体的N端部分。本领域技术人员会知道，缩写F0、Fl和F2在科学文献中常常命名为Fc^F1和F2。较大的C端Fl片段通过疏水性氨基酸的序列将F蛋白锚定于膜，所述疏水性氨基酸邻近24个氨基酸的细胞质尾部。三个F2-F1 二聚体结合形成成熟F蛋白，其采用亚稳的融合前的(融合前)构象，在与靶细胞膜接触时受触发发生构象改变。该构象改变暴露称作融合肽的疏水序列，该序列与宿主细胞膜结合并促进病毒或感染细胞的膜与靶细胞膜的融合。
[0122]Fl片段含有至少两个七重复域，称为HRA和HRB，并分别处在靠近所述融合肽和跨膜锚定域的位置。在融合前构象中，F2-F1 二聚体形成球状的头和柄(head and stalk)结构，其中所述HRA域处于球状头部中的分段(延伸)的构象。与之相对，HRB域形成从头部区延伸的三链的卷曲螺旋柄。在从融合前至融合后构象的转变过程中，HRA域折叠(collapse)并移至靠近HRB域处以形成反平行的六个螺旋束。在融合后状态，融合肽和跨膜域并排以促进膜融合。
[0123]尽管上述对构象的描述是基于结晶学数据的分子建模，融合前和融合后构象之间的结构差异可无需诉诸结晶学即可进行监视。举例而言，可使用电子显微术以区分融合前和融合后(或者称为融合前的和融合的)构象，如Calder等，Virology, 271:122-131 (2000)和 Morton 等，Virology, 311:275-288 所阐明(就其技术教导的目的通过提述并入本文)。融合前构象也可以通过脂质体相关测定法(liposomeassociat1n assay)而区别于融合的(融合后)构象,如 Connolly 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 103:17903-17908(2006)(就其技术教导的目的通过提述并入本文)。此外，融合前和融合的构象可使用特异性识别RSV F蛋白的一种或另一种融合前或融合形式上存在，但不存在于其他形式的构象表位的抗体(例如单克隆抗体)进行区分。此类构象表位可为由于抗原决定簇在分子表面有偏好的暴露所致。或者，构象表位可来自直链多肽上非连续的氨基酸的并置。
[0124]经修饰或突变的RSV F蛋白
[0125]本发明人已发现当对RSV F蛋白的结构进行特定修饰时，可取得令人惊讶地高水平的融合(F)蛋白的表达。此类修饰亦令人意想不到地减少了 RSV F蛋白在宿主细胞中的细胞毒性。此外，本发明的修饰的F蛋白表现了改善的展示融合后“棒棒糖”形态而非融合前“杆状”形态的能力。因此，在一个方面，本发明经修饰的F蛋白与野生型F蛋白(例如由SEQ ID N0:2所示例，其对应于GenBank登录号AAB59858)相比亦可显示改善的(例如增强的)免疫原性。这些修饰显然适用于使用所述疫苗用于治疗和/或预防RSV的疫苗和方法的开发。
[0126]依照本发明，可对天然或野生型RSV F蛋白进行任何数量的突变，且在一个优选的方面，可进行多重突变以导致与天然或野生型RSV F蛋白相比改善的表达和/或免疫原性。此类突变包括点突变、移码突变、缺失和插入，优选一个或多个(例如一个、两个、三个或四个等)突变。
[0127]所述天然F蛋白多肽可选自RSV A株、RSV B株、HRSV A株、HRSV B株、BRSV株或禽RSV株的任何的F蛋白，或其变体(如上所定义)。在某些示例性实施方案中，所述天然F蛋白多肽是由SEQ ID N0:2代表的F蛋白(GenBank登录号AAB59858)。为了协助理解本公开，所有氨基酸残基位置，无论是何种株，均针对(即所述氨基酸残基的位置相对于)示例性F蛋白的氨基酸位置给出。来自其他RSV株的F蛋白的相应氨基酸位置可由本领域普通技术人员容易地通过将选定的RSV株的氨基酸序列与示例性序列使用方便可得且公知的比对算法(如BLAST，例如使用缺省参数)进行比对来确定。来自不同RSV株的F蛋白多肽的多个其他实例公开于W0/2008/114149(其通过全文提述并入本文)。其他变体可通过遗传漂变发生，或可使用定点或随机诱变或通过重组两个或更多个已经存在的变体而人工产生。此类其他的变体亦适于本文中公开的经修饰或突变的RSV F蛋白的上下文。
[0128] 可使用任何本领域技术人员已知的方法将突变导入本发明的RSV F蛋白。突变可通过例如在作为二价金属离子辅因子的锰的存在下进行PCR反应而随机导入。或者，寡核苷酸导向的诱变可用于构建允许在沿编码DNA分子上任何决定的位点进行所有可能类型的碱基对变化的突变的或修饰的RSV F蛋白。一般而言，该技术涉及将互补于(除了一个或多个错配)编码目标RSV F蛋白的单链核苷酸序列的寡核苷酸退火。然后通过DNA聚合酶延伸错配的寡核苷酸，生成在一条链的序列中含有所需变化的双链DNA分子。该序列中的变化可例如导致氨基酸的缺失、取代或插入。然后可将双链多核苷酸插入适当的表达载体，并由此产生突变的或修饰的多肽。上述寡核苷酸导向的诱变可例如通过PCR实施。
[0129]其他RSV蛋白
[0130]本发明还涵盖包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV病毒样颗粒(VLP)，其可配制为疫苗或抗原性配制物以供保护脊椎动物(例如人)免受RSV感染或其至少一种疾病症状。在一些实施方案中，所述包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP进一步包含其他的RSV蛋白，如M、N、G和SH。在其他实施方案中，所述包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP进一步包含来自异源的病毒株的蛋白，如流感病毒蛋白HA、NA和Ml。在一个实施方案中，流感病毒蛋白Ml来源于禽流感病毒株。
[0131]RSV N蛋白紧密结合于基因组RNA和复制中间物反义基因组RNA以形成抗RNAse的核壳。SEQ ID N0:16(野生型)和SEQ ID NO: 18 (密码子优化的)描绘了 RSV N蛋白的代表性氨基酸序列，而SEQ ID NO: 15 (野生型)和SEQ ID NO: 17 (密码子优化的)描绘了编码所述RSV N蛋白的代表性核酸序列。本发明中涵盖了与SEQ ID NO: 18至少约20%、约30%、约 40%、约 50%、约 60%、约 70%或者约 80%、约 85%、约 90%、约 95%、约 96%、约97%、约98%或约99%相同的RSV N蛋白，及其所有的片段和变体(包括嵌合蛋白)。
[0132]RSV M蛋白是在质膜中积累的非糖基化的内部病毒粒体蛋白，其与RSVF蛋白和其他因子在病毒形态发生过程中相互作用。在某些优选的实施方案中，RSV M蛋白是牛RSV(BRSV)M蛋白。SEQ ID NO: 12 (野生型)和SEQ ID NO: 14 (密码子优化的)描绘了 BRSVM蛋白的代表性氨基酸序列，而SEQ ID NO: 11 (野生型)和SEQ ID NO: 13 (密码子优化的)描绘了编码所述BRSV M蛋白的代表性核酸序列。本发明中涵盖了与SEQ ID N0:12和14至少约 20%、约 30%、约 40%、约 50%、约 60%、约 70%或约 80%、约 85%、约 90%、约 95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的RSV(包括但不限于BRSV)M蛋白，及其所有的片段和变体(包括嵌合蛋白)。
[0133]RSV G蛋白是在接近N端具有单一疏水区的II型跨膜糖蛋白，其既充当未剪切的信号肽，还充当膜锚定点，留下分子C端的三分之二朝向外侧。RSVG亦表达为分泌蛋白，其来自从ORF中第二个AUG (约在氨基酸48处)(其位于信号/锚定点之内)进行的翻译起始。RSV G外功能区的大部分在RSV株之间是高度分歧的(同前，1607页)。SEQ ID NO: 26描绘了代表性RSV G蛋白，其由SEQ ID NO:25中所示的基因序列所编码。本发明中涵盖了与 SEQ ID N0:26 至少约 20%、约 30%、约 40%、约 50%、约 60%、约 70%或约 80%、约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%相同的RSV G蛋白，及其所有的片段和变体(包括嵌合蛋白)。
[0134]RSV的SH蛋白是含有64个(RSV亚组A)或65个氨基酸残基(RSV亚组B)的II型跨膜蛋白。一些研究表明RSV SH蛋白可在病毒融合或在改变膜渗透性中起作用。然而，缺乏SH基因的RSV可以存活，导致合胞体形成并与野生型病毒一样良好地生长，表明SH蛋白对于病毒进入宿主细胞或合胞体形成并不是必需的。RSV的SH蛋白显示抑制TNF-α信号传导的能力。SEQ ID Ν0:27描绘了 RSV SH蛋白的代表性氨基酸序列。本发明中涵盖了与SEQ ID NO:27 至少约 20%、约 30%、约 40%、约 50%、约 60%、约 70%或约 80%、约 85%、约90 %、约95 %、约96 %、约97 %、约98 %或约99 %相同的RSV SH蛋白，及其所有的片段和变体(包括嵌合蛋白)。
[0135]RSV 疫苗
[0136]目前，唯一批准用于预防RSV疾病的方法是被动免疫接种。表明IgG具有保护性作用的初始证据是从涉及雪紹(Prince, G.A.，Ph.D.diss.，Universityof California,Los Angeles, 1975)中和人(Lambrecht 等，(1976)J.1nfect.Dis.134, 211-217 ；和 Glezen 等(1981)J.Pediatr.98, 708-715)中母体抗体的观察获得的。Hemming 等(Morell 等，eds.，1986，Clinical Use of IntravenousImmunoglobulins, Academic Press, London at pages285_294)在涉及怀疑摧患新生儿败血病的新生儿中的静脉内免疫球蛋白(IVIG)的药物代谢动力学的研究过程中认识到RSV抗体可能可用于治疗或预防RSV感染。他们注意到一个呼吸系统分泌物产生RSV的婴儿在IVIG灌注之后迅速恢复。对于该IVIG批次的后续分析揭示了不寻常的高效价的RSV中和抗体。同一组的研究者随后检查了该富集了 RSV中和抗体的超免疫的血清或免疫球蛋白保护棉鼠和灵长类免受RSV感染的能力(Prince等(1985) Virus Res.3, 193-206 ；Prince等(1990) J.Virol.64，3091-3092)。这些研究的结果表明预防性给予的RSV中和抗体抑制RSV在棉鼠中的呼吸道复制。当治疗性给予时，RSV抗体既在棉鼠中还在非人灵长类模型中减少了肺部病毒复制。此外，免疫血清或免疫球蛋白的被动灌注并未在随后用RSV攻击的棉鼠中产生增强的肺部病理状态。
[0137]因为RSV感染可通过将中和抗体提供给脊椎动物来防止，包含经修饰或突变的RSV F蛋白的疫苗当施于脊椎动物时，可在体内诱导中和抗体。偏好将经修饰或突变的RSVF蛋白用于预防和/或治疗RSV感染。因此，本公开的另一个方面涉及引发针对RSV的免疫应答的方法。该方法涉及将免疫学上有效量的含有经修饰或突变的RSV F蛋白的组合物施于受试者(如人或动物受试者)。免疫学上有效量的所述组合物的给药引发了对于所述经修饰或突变的RSV F蛋白上存在的表位具有特异性的免疫应答。此种免疫应答可包括B细胞应答(例如中和抗体的产生)和/或T细胞应答(例如细胞因子的产生)。优选地，由经修饰或突变的RSV F蛋白引发的免疫应答包含对于所述经修饰或突变的RSV F蛋白上存在的至少一种构象表位具有特异性的要素。在一个实施方案中，所述免疫应答对于见于“棒棒糖”融合后活性状态的RSV F蛋白上存在的表位具有特异性。可将RSV F蛋白和组合物施于受试者而使其与RSV接触之后不增强病毒疾病。优选地，本文中公开的经修饰或突变的RSV F蛋白和适当配制的免疫原性组合物引发偏好Thl的免疫应答，其减少或预防RSV感染和/或减少或预防在RSV感染之后的病理应答。
[0138]在一个实施方案中，本发明的RSV F蛋白见于微团形式(例如，玫瑰花结)。依照本发明可获得的微团由具有玫瑰花结样结构的免疫学上有活性的F突起蛋白(spike protein)的聚集体组成。所述玫瑰花结在电子显微镜下是可见的(Calder等，2000, Virology271:122-131)。优选地，包含经修饰或突变的RSV F蛋白的本发明的微团展示表明融合后活性状态的“棒棒糖”形态。在一个实施方案中，在于宿主细胞中表达之后纯化微团。当施于受试者时，本发明的微团优选诱导中和抗体。在一些实施方案中，所述微团可与佐剂一同施用。在其他实施方案中，所述微团可无需佐剂施用。
[0139]在另一个实施方案中，本发明涵盖了包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV病毒样颗粒(VLP)，其可配制为疫苗或抗原性配制物以供保护脊椎动物(例如人)免受RSV感染或其至少一种疾病症状。本发明还涉及包含来源于不同株的RSV病毒的野生型和突变RSV基因或其组合的RSV VLP和载体，当将其转染入宿主细胞时，会产生包含RSV蛋白的病毒样颗粒(VLP)。
[0140]在一些实施方案中，RSV病毒样颗粒可进一步包含至少一种病毒基质蛋白(例如RSV M蛋白)。在一个实施方案中，所述M蛋白来源于人RSV株。在另一个实施方案中，所述M蛋白来源于牛RSV株。在其他实施方案中，所述基质蛋白可为来自流感病毒株的Ml蛋白。在一个实施方案中，所述流感病毒株是禽流感株。在一个优选实施方案中，所述禽流感株是H5N1株A/Indonesia/5/05。在其他实施方案中，所述基质蛋白可来自新城疫病毒(NDV)。
[0141]在一些实施方案中，所述VLP可进一步包含RSV G蛋白。在一个实施方案中，所述G蛋白可来自HRSV组A。在另一个实施方案中，所述G蛋白可来自HRSV组B。还在另一个实施方案中，所述RSV G可来源于HRSV组A和/或组B。
[0142]在一些实施方案中，所述VLP可进一步包含RSV SH蛋白。在一个实施方案中，所述SH蛋白可来自HRSV组A。在另一个实施方案中，所述SH蛋白可来自HRSV组B。还在另一个实施方案中，所述RSV SH可来源于HRSV组A和/或组B。
[0143]在一些实施方案中，所述VLP可进一步包含RSV N蛋白。在一个实施方案中，所述N蛋白可来自HRSV组A。在另一个实施方案中，所述N蛋白可来自HRSV组B。还在另一个实施方案中，所述RSV N可来源于HRSV组A和/或组B。
[0144]在进一步的实施方案中，本发明的VLP可包含一种或多种异源免疫原，如流感血凝素(HA)和/或神经氨酸酶(NA)。
[0145] 在一些实施方案中，本发明在一个或多个VLP中还包含来自相同的和/或不同的株的不同的RSV M、F、N、SH和/或G蛋白的组合。此外，所述VLP可包含一种或多种其他分子以供增强免疫应答。
[0146]在本发明的另一个实施方案中，所述RSV VLP可携带药剂如核酸、SiRNA、微RNA、化疗剂、成像剂和/或其他需递送至患者的药剂。
[0147]本发明的VLP可用于制备疫苗和免疫原性组合物。VLP的一个重要特征是表达目标表面蛋白的能力，从而使得脊椎动物的免疫系统诱导针对目标蛋白的免疫应答。然而，并非所有蛋白可表达于VLP表面。为何某些蛋白在VLP表面不表达或表达不良可能有许多原因。一个原因是所述蛋白未被引导至宿主细胞膜或者所述蛋白没有跨膜域。作为一个实例，靠近流感血凝素羧基端的序列对于HA掺入成熟流感包膜核壳的脂双层和对于HA三聚体相互作用与流感基质蛋白Ml装配可为重要的(Ali，等，(2000) J.Virol.74，8709-19)。
[0148]因此，本发明的一个实施方案包括包含来自RSV的经修饰或突变的F蛋白和至少一种并不通常有效地表达于细胞表面或并非正常RSV蛋白的免疫原的VLP。在一个实施方案中，所述经修饰或突变的RSV F蛋白可与目标免疫原融合。在另一个实施方案中，所述经修饰或突变的RSV F蛋白与所述免疫原通过跨膜域和异源病毒表面膜蛋白例如MMTV包膜蛋白的细胞质尾部结合。
[0149]本发明的其他嵌合VLP包括包含经修饰或突变的RSV F蛋白和至少一种来自异源传染原的蛋白的VLP。异源传染原的实例包括但不限于病毒、细菌、原生生物、真菌和/或寄生物。在一个实施方案中，来自另一个传染原的免疫原是异源病毒蛋白。在另一个实施方案中，来自异源传染原的蛋白是包膜相关蛋白。在另一个实施方案中，来自另一个异源传染原的蛋白是在VLP表面表达的。在另一个实施方案中，来自传染原的蛋白包含在脊椎动物中会生成保护性免疫应答的表位。在一个实施方案中，来自另一个传染原的蛋白与经修饰或突变的RSV F蛋白共同表达。在另一个实施方案中，来自另一个传染原的蛋白融合于经修饰或突变的RSV F蛋白。在另一个实施方案中，仅来自另一个传染原的蛋白的一部分融合于经修饰或突变的RSV F蛋白。在另一个实施方案中，仅来自另一个传染原的蛋白的一部分融合于经修饰或突变的RSV F蛋白的一部分。在另一个实施方案中，融合于经修饰或突变的RSV F蛋白的所述来自另一个传染原的蛋白的部分在VLP表面表达。
[0150]本发明还涵盖在本发明的VLP之上或之中表达的蛋白的变体。所述变体可在其组成蛋白的氨基酸序列中含有改变。针对蛋白的术语“变体”指相对参照序列改变了一个或多个氨基酸的氨基酸序列。所述变体可具有“保守”变化，其中取代的氨基酸具有类似的结构或化学性质，例如用异亮氨酸替代亮氨酸。或者，变体可具有“非保守”的变化，例如用色氨酸替代甘氨酸。类似的次要变异还可包括氨基酸缺失或插入，或两者皆是。确定可取代、插入或缺失哪些氨基酸残基而不会消除生物学或免疫性活性的指导可使用本领域公知的计算机程序例如DNASTAR软件来发现。
[0151]天然变体可由于蛋白中的突变而出现。这些突变可在每组传染原例如流感中导致抗原性变异(variability)。因此,经例如流感株感染的个体针对该病毒产生抗体,随着新病毒株的出现，针对旧株的抗体不再识别新病毒，而可出现重新感染。本发明涵盖了来自传染原的蛋白的所有抗原性和遗传变异以供制备VLP。
[0152]描述适用于本发明的分子生物学技术如克隆、突变、细胞培养等的通用文本包括 Berger 和 Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods inEnzymology volume152Academic Press, Inc., San Diego, Calif.(Berger) ；Sambrook等，Molecular Cloning—A Laboratory Manual(3rd Ed.), Vol.1-3, Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spr ing Harbor, N.Y., 2000 ( “Sambrook”)以及 Current Protocols inMolecular B1logy, F.M.Ausubel 等，eds.，Current Protocols, a joint venture betweenGreene Publishing Associates, Inc.and John ffiley&Sons, Inc., (“Ausubel”)。这些文本描述了诱变、载体的使用、启动子和许多其他相关的主题，涉及例如RSV的F和/或G分子的克隆和突变等。因此，本发明还涵盖使用已知的蛋白质工程方法和重组DNA技术以改善或改变在本发明的VLP之上或之中表达的蛋白的特征。多种类型的诱变可用于产生和/或分离编码蛋白分子的变体核酸和/或进一步修饰/突变本发明VLP之中或之上的蛋白。其包括但不限于定位、随机点诱变、同源重组(DNA改组)、使用含有尿嘧啶的模板的诱变、寡核苷酸导向的诱变、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、使用有间隔的双链DNA的诱变等。其他合适的方法包括点错配修复、使用修复缺陷型宿主株的诱变、限制-选择和限制-纯化、缺失诱变、通过全基因合成的诱变、双链断裂修复等。诱变例如涉及嵌合构建体的诱变，亦包括在本发明中。在一个实施方案中，诱变可由天然存在的分子或经改变或突变的天然存在的分子已知的信息例如序列、序列比较、物理性质、晶体结构等所指导。
[0153]本发明进一步包括显示实质生物学活性例如当表达于本发明的VLP之上或之中时，能够引发有效的抗体应答的蛋白变体。此类变体包括根据本领域已知的一般规则选定使其对活性几乎无作用的缺失、插入、倒位、重复和取代。
[0154]克隆蛋白的方法在本领域是已知的。举例而言，编码具体RSV蛋白的基因可通过RT-PCR从来自经RSV病毒感染的细胞提取的多聚腺苷酸化mRNA来分离。所得的产物基因可作为DNA插入克隆入载体。术语“载体”指通过其核酸可增殖和/或在生物、细胞或细胞组分之间转移的物事。载体包括自主复制或可整合入宿主染色体的质粒、病毒、细菌噬菌体、原病毒、噬菌粒、转座子、人工染色体等。载体亦可为并不自主复制的裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、由在同一链中DNA和RNA两者组成的多核苷酸、多赖氨酸缀合的DNA或RNA、肽缀合的DNA或RNA、脂质体缀合的DNA等。在许多但非所有的常见实施方案中，本发明的载体是质粒或杆粒。
[0155]因此，本发明包括编码蛋白的核苷酸，包括嵌合分子，其克隆入可在细胞中表达诱导本发明VLP生成的表达载体。“表达载体”是能够促进表达以及掺入其中的核酸的复制载体如质粒。通常，所述待表达的核酸“可操作地连接于”启动子和/或增强子，并受该启动子和/或增强子转录调节调控。在一个实施方案中，所述核苷酸编码经修饰或突变的RSV F蛋白(如上所讨论)。在另一个实施方案中，所述载体进一步包含编码M和/或G RSV蛋白的核苷酸。在另一个实施方案中，所述载体进一步包含编码M和/或N RSV蛋白的核苷酸。在另一个实施方案中，所述载体进一步包含编码M、G和/或N RSV蛋白的核苷酸。在另一个实施方案中，所述载体进一步包含编码BRSV M蛋白和/或N RSV蛋白的核苷酸。在另一个实施方案中，所述载体进一步包含编码BRSV M和/或G蛋白，或流感HA和/或NA蛋白的核苷酸。在另一个实施方案中，所述核苷酸编码经修饰的或突变的RSV F和/或RSV G蛋白与流感HA和/或NA蛋白。在另一个实施方案中，所述表达载体是杆状病毒。
[0156]在本发明的一些实施方案中，蛋白可包含含有产生沉默取代、插入或缺失，但并不改变编码蛋白的性质或活性或该蛋白如何制备的突变。可由于多种原因产生核苷酸变体，例如，为了对于特定宿主优化密码子表达(将人mRNA中的密码子变为昆虫细胞如Sf9细胞优选的那些)。参见美国专利公开2005/0118191，就所有目的通过全文提述并入本文。
[0157]此外，可对所述核苷酸进行测序以确保克隆了正确的编码区，且其不含有任何不希望的突变。该核苷酸可亚克隆入表达载体(例如杆状病毒)以供在任何细胞中进行表达。上述仅为如何可克隆RSV病毒蛋白的一个实例。本领域技术人员理解其他方法是可获得并为可能的。
[0158]本发明还提供了包含编码RSV结构基因包括F、M、G、N、SH,或其一部分，和/或任何上述的嵌合分子的RSV核苷酸的构建体和/或载体。所述载体可为，例如噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体。所述包含RSV结构基因，包括F、M、G、N、SH，或其一部分，和/或任何上述的嵌合分子的构建体和/或载体，应可操作地连接于适当的启动子，如AcMNPV多角体蛋白启动子(或其他杆状病毒)、噬菌体lambda PL启动子，大肠杆菌lac、phoA和tac启动子，SV40早期和晚期启动子，和逆转录病毒LTR的启动子为非限定性实例。其他合适的启动子根据宿主细胞和/或所需的表达速率对本领域技术人员是已知的。表达构建体会进一步含有转录起始、终止位点，并在转录区中，含有用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的转录物的编码部分优选会在起始处含有翻译起始密码子而在待翻译的多肽末端适当位置含有终止密码子。
[0159]表达载体优选会包含至少一个选择性标记。此类标记包括二氢叶酸还原酶、G418或新霉素抗性(对于真核细胞培养)；和四环素、卡那霉素或氨苄西林抗性基因(对于大肠杆菌和其他细菌的培养)。优选的载体包括病毒载体如杆状病毒、痘病毒(例如牛痘病毒、禽痘病毒、犬痘病毒、鸡痘病毒、浣熊痘病毒、猪痘病毒等)、腺病毒(例如犬类腺病毒)、疱疹病毒和逆转录病毒。其他可用于本发明的载体包括用于细菌的载体，其包括pQE70、pQE60和 pQE_9, pBluescript 载体、Phagescript 载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、PKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。优选的真核载体包括 pFastBaclpWINEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl和pSG、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其他合适的载体对本领域技术人员而言是容易想到的。在一个实施方案中，包含编码RSV基因包括经修改或突变的RSV F基因，以及M、G、N、SH的基因或其部分，和/或任何上述的嵌合分子的核苷酸的载体，是pFastBac。
[0160]上述提及的重组构建体可用于转染、感染或转化，并可表达RSV蛋白，包括经修饰或突变的RSV F蛋白和至少一种免疫原。在一个实施方案中，所述重组构建体包含经修饰或突变的RSV F、M、G、N、SH或其部分，和/或任何上述的分子进入真核细胞和/或原核细胞。因此，本发明提供了宿主细胞，其包含含有编码RSV结构基因包括经修饰或突变的RSVF和至少一种免疫原例如但不限于RSVG、N或SH或其部分和/或任何上述的分子的核酸，并允许基因包括RSV F、G、N、M或SH或其部分和/或任何上述分子在宿主细胞中在允许VLP形成的条件下表达的载体。
[0161]真核宿主细胞包括酵母、昆虫、禽类、植物、秀丽隐杆线虫(C.elegans)(或线虫)和哺乳动物宿主细胞。昆虫细胞的非限定性实例为草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf)细胞，例如Sf9、Sf21，粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞，例如High Five细胞，和果蝇属(Drosophila) S2细胞。真菌(包括酵母)宿主细胞的实例为酿酒酵母(S.cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces Iactis) (K.1actis),假丝酵母属(Candida)菌种包括白色假丝酵母(C.albicans)和光滑假丝酵母(C.glabrata)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe (S.pombe))、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和解脂西洋蓍霉(Yarrowia Iipolytica)。哺乳动物细胞的实例为COS细胞、幼仓鼠肾细胞、小鼠L细胞、LNCaP细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，人胚肾(HEK)细胞和非洲绿猴细胞、CVl细胞、HeLa细胞、MDCK细胞、Vero和H印-2细胞。亦可使用非洲爪蟾(Xenopus Iaevis)卵母细胞或两栖类来源的其他细胞。原核宿主细胞的实例包括细菌细胞例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)和分枝杆菌。
[0162]载体，例如包含经修饰的或突变的RSV F蛋白，和至少一种免疫原包括但不限于RSV G、N或SH或其部分，和/或任何上述的嵌合分子的多核苷酸的载体，可依照本领域公知方法转染入宿主细胞。举例而言，将核酸导入真核细胞可通过磷酸钙共沉淀、电穿孔、微注射、Iipofect1n和采用多胺转染剂的转染。在一个实施方案中，上述载体是重组杆状病毒。在另一个实施方案中，上述重组杆状病毒转染入真核细胞。在一个优选实施方案中，上述细胞是昆虫细胞。在另一个实施方案中，上述昆虫细胞是Sf9细胞。
[0163]该发明还提供了增加VLP产生效率的构建体和方法。举例而言，将前导序列添加至RSV F、M、G、N、SH或其部分，和/或任何上述嵌合或异源分子，可改善蛋白在细胞内转运的效率。举例而言，可将异源信号序列融合于F、M、G、N、SH或其部分，和/或上述任何嵌合或异源分子。在一个实施方案中，所述信号序列可来源于昆虫细胞的基因并融合于M、F、G、N,SH或其部分和/或上述任何嵌合或异源分子。在另一个实施方案中，所述信号肽是壳多糖酶信号肽，其在杆状病毒表达系统中有效运作。
[0164]另一个增加VLP产生效率的方法是针对具体细胞类型密码子优化编码RSV包括经修饰或突变的RSV F蛋白、M、G、N、SH或其部分和/或上述任何嵌合或异源分子的核苷酸。对于密码子优化核酸以供在Sf9细胞中表达的实例，参见SEQ ID No:3、5、7、9、13、17、19和25。
[0165]本发明还提供了产生VLP的方法，所述方法包括在允许VlP形成的条件下表达RSV基因包括经修饰或突变的RSV F蛋白和至少一种其他蛋白包括但不限于RSV M、G、N、SH或其部分，和/或上述任何嵌合或异源分子。取决于选定的表达系统和宿主细胞，在重组蛋白表达和VLP形成的条件下通过培养由表达载体转化的细胞来产生VLP。在一个实施方案中，本发明包括产生VLP的方法，包括将编码至少一种经修饰或突变的RSV F蛋白的载体转染入合适的宿主细胞并在允许VLP形成的条件下表达经修饰和突变的RSV F蛋白。在另一个实施方案中，真核细胞选自下组:酵母、昆虫、两栖类、禽类或哺乳动物细胞。适当生长条件的选择在本领域的技术和本领域一般技术人员的技术范围内。
[0166]培养经工程改造产生本发明VLP的细胞的方法包括但不限于分批、分批补料、连续和灌注细胞培养技术。细胞培养意指细胞在细胞增殖并表达蛋白(例如重组蛋白)以供纯化和分离的生物反应器(发酵室)中的生长和增殖。通常而言，在灭菌、受控的温度和大气条件下在生物反应器中进行细胞培养。生物反应器是可监视环境条件如温度、大气、搅拌和/或PH的用于培养细胞的室。在一个实施方案中，所述生物反应器是不锈钢的室。在另一个实施方案中，所述生物反应器是预灭菌的塑料袋(例如Cellbag." ,WaveB1tech, Bridgewater, NJ)。在其他实施方案中，所述经预灭菌的塑料袋为约50L至1000L的袋。
[0167]然后使用保存VLP完整性的方法如梯度离心例如氯化铯、蔗糖和碘克沙醇，以及标准纯化技术包括例如离子交换和凝胶过滤层析来分离VLP。
[0168]下述是如何制备、分离和纯化的本发明的VLP的实例。通常而言VLP是从经工程改造在细胞培养中培养细胞时产生VLP的重组细胞系产生的(见上)。本领域技术人员会知道有其他可用于制备和纯化本发明VLP的方法，因此本发明并不限于所述方法。
[0169]本发明VLP的产生可通过将Sf9细胞(非感染的)接种入摇瓶来起始，允许细胞随着细胞生长和繁殖而扩展并规模放大(scale up)(例如从125ml烧瓶至50L Wave袋)。将用于生长细胞的培养基对于适当的细胞系进行配制(优选无血清培养基，例如昆虫培养基EXCel 1-420, JRH)。之后，以最有效的感染复数(multiplicity of infect1n)用重组杆状病毒感染细胞(例如每细胞约I至约3个空斑形成单位)。一旦发生感染，经修饰或突变的RSV F蛋白，M、G、N、SH或其部分，和/或任何上述嵌合或异源分子从病毒基因组表达，自主装配入VLP，并在感染后大约24至72小时从细胞分泌。通常而言，当细胞处于对数生长中期(4-8xl06个细胞/ml)并至少约90%存活时感染最为有效。
[0170]本发明的VLP可在感染后大约48至96小时，当细胞培养基中VLP的水平接近最大值，但在大量细胞裂解之前时进行收获。收获时点Sf9细胞密度和存活性可为约0.5xl06个细胞/ml至约1.5xl06个细胞/ml与至少20%存活性，如染色排阻测定显示。之后，去除并澄清培养基。将NaCl添加至培养基至浓度为约0.4至约1.0M,优选至约0.5M，以避免VLP聚集。从含有本发明VLP的细胞培养基去除细胞和细胞碎片可通过具有一次性使用的、经预灭菌的中空纤维0.5或1.00 μ m过滤筒的切向流过滤(TTF)或类似装置来达成。
[0171]之后，在澄清的培养基中的VLP可通过超滤使用一次性、经预灭菌的500，000分子量截取值中空纤维筒来浓缩。浓缩的VLP可针对含有0.5M NaCl的10体积的pH7.0至8.0磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析过滤以去除残余的培养基组分。
[0172]浓缩的、透析过滤的VLP可进一步在20%至60% %不连续蔗糖梯度上在含0.5MNaCl的pH7.2PBS缓冲液中通过以6500x g在约4°C至约10°C离心18小时来纯化。通常而言，VLP会在约30%至约40%蔗糖之间或在界面(以20%和60%分步梯度)形成明显可见的条带，其可从该梯度收集并储藏。可稀释该产物至包含200mM NaCl的制备物以供纯化工艺的下一个步骤。该产物含有VLP并可含有完整的杆状病毒颗粒。
[0173]VLP的进一步纯化可通过阴离子交换层析或44%等密度鹿糖垫(cush1n)离心来达成。在阴离子交换层析中，将来自蔗糖梯度的样品(见上)加载入含有具有阴离子(例如Matrix Fractogel EMD TMAE)的介质的柱，并通过可将VLP从其他污染物(例如杆状病毒和DNA/RNA)分离的盐梯度(从约0.2M至约1.0M NaCl)来洗脱。在蔗糖垫方法中，将包含VLP的样品添加至44%蔗糖垫，并以30000g离心约18小时。VLP在44%蔗糖顶部形成条带，而杆状病毒沉淀在底部，而其他的污染蛋白停留在顶部的0%蔗糖层。收集VLP峰或条带。
[0174]视需要，可将完整的杆状病毒失活。失活可通过化学方法例如福尔马林或丙内酯(BPL)来达成。完整杆状病毒的去除和/或失活亦大体上可通过使用上述例示的本领域已知的选择性沉淀和层析方法来达成。失活方法包括将含有所述VLP的样品在0.2% BPL中在约25°C至约27°C温育3小时。杆状病毒也可通过将含有所述VLP的样品在0.05% BPL中在4°C温育3日，然后在37°C温育I小时来失活。
[0175]在失活/去除步骤之后，可将包含VLP的产物经过另一个透析过滤步骤运行以去除任何来自失活步骤的试剂和/或任何残余的蔗糖，并将VLP置于所需的缓冲液(例如PBS)中。包含VLP的溶液可通过本领域已知方法灭菌(例如无菌过滤)并储藏于冷藏箱(refrigerator)或冷冻箱(freezer)。
[0176]上述技术可以多种规模进行实践。举例而言，T-烧瓶、摇瓶、旋转瓶(spinerbottle)，直至工业大小的生物反应器。所述生物反应器可包括不锈钢罐或经预灭菌的塑料袋(例如，由Wave B1tech, Bridgewater, NJ出售的系统)。本领域技术人员会知道就其目的最需要的是什么。
[0177]杆状病毒表达载体的表达和产生和用重组杆状病毒感染细胞以产生重组RSV VLP如前所述可在昆虫细胞例如Sf9昆虫细胞中达成。在一个实施方案中，所述细胞为经工程改造产生RSV VLP的重组杆状病毒感染的SF9。
[0178]药物或疫苗配制物和给药
[0179]可用于本文的药物组合物含有药学上可接受的载体，包括任何合适的稀释剂或赋形剂，其包括任何自身并不诱导有害于接受该组合物的脊椎动物的免疫应答产生并可不带来不必要的毒性地进行施用的医药试剂，以及本发明的经修饰或突变的RSV F蛋白，包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP。如用于本文，术语“药学上可接受”意指由联邦或州政府的管理机构批准，或列于美国药典、欧洲药典或其他一般接受的药典供用于哺乳动物特别是人。这些组合物可用作疫苗和/或抗原性组合物以供在哺乳动物中诱导保护性免疫应答。
[0180] 本发明涵盖了包含VLP的药学上可接受的疫苗组合物，所述VLP包含至少一种经修饰或突变的RSV F蛋白，以及至少一种其他蛋白，包括但不限于RSV M、G、N、SH或其部分，和/或任何上述的嵌合或异源分子。在一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP包含至少一种经修饰或突变的RSV F蛋白和至少一种其他免疫原。在另一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP包含至少一种经修饰或突变的RSV F蛋白和至少一种RSV M蛋白。在另一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP包含至少一种经修饰或突变的RSV F蛋白和至少一种BRSVM蛋白。在另一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP包含至少一种经修饰或突变的RSV F蛋白和至少一种流感Ml蛋白。在另一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP包含至少一种经修饰或突变的RSV F蛋白和至少一种禽流感Ml蛋白。
[0181 ] 在另一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP进一步包含RSV G蛋白，包括但不限于HRSV、BRSV或禽RSV G蛋白。在另一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP进一步包含RSV N蛋白，包括但不限于HRSV、BRSV或禽RSV N蛋白。在另一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP进一步包含RSV SH蛋白，包括但不限于HRSV、BRSV或禽RSV SH蛋白。
[0182]在另一个实施方案中，本发明涵盖了包含嵌合VLP的药学上可接受的疫苗组合物，如包含BRSV M和经修饰或突变的RSV F蛋白和/或来自RSV的G、H或SH蛋白和任选地来源于流感病毒的HA或NA蛋白的VLP，其中所述HA或NA蛋白融合于RSV F和/或G蛋白的跨膜域和细胞质尾部。
[0183]本发明还涵盖了如上所述包含经修饰或突变的RSV F蛋白，包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP的药学上可接受的疫苗组合物。
[0184]在一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP包含经修饰或突变的RSV F蛋白和至少一种其他蛋白。在另一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP进一步包含RSV M蛋白，如BRSV M蛋白但不限于此。在另一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP进一步包含RSV G蛋白，包括但不限于HRSV G蛋白。在另一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP进一步包含RSV N蛋白，包括但不限于HRSV、BRSV或禽RSV N蛋白。在另一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP进一步包含RSV SH蛋白，包括但不限于HRSV、BRSV或禽RSV SH蛋白。在另一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP包含BRSV M蛋白和来自HRSV组A的F和/或G蛋白。在另一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP包含BRSV M蛋白和来自HRSV组B的F和/或G蛋白。在另一个实施方案中，本发明涵盖了包含嵌合VLP如包含来自BRSV的嵌合M蛋白和任选地来源于流感病毒的HA蛋白的VLP的药学上可接受的疫苗组合物，其中所述M蛋白融合于所述流感HA蛋白。在另一个实施方案中，本发明涵盖了包含嵌合VLP如包含BRSV M和来自RSV的嵌合F和/或G蛋白和任选地来源于流感病毒的HA蛋白的VLP的药学上可接受的疫苗组合物，其中所述嵌合流感HA蛋白融合于RSVF和/或G蛋白的跨膜域和细胞质尾部。在另一个实施方案中，本发明涵盖了包含嵌合VLP如包含BRSV M和来自RSV的嵌合F和/或G蛋白和任选地来源于流感病毒的HA或NA蛋白的VLP的药学上可接受的疫苗组合物，其中所述HA或NA蛋白融合于RSV F和/或G蛋白的跨膜域和细胞质尾部。
[0185]本发明还涵盖了包含嵌合VLP的药学上可接受的疫苗组合物，所述VLP包含至少一种RSV蛋白。在一个实施方案中，所述药学上可接受的疫苗组合物包含VLP，所述VLP包含经修饰或突变的RSV F蛋白或至少一种来自异源传染原或患病细胞的免疫原。在另一个实施方案中，所述来自异源传染原的免疫原是病毒蛋白。在另一个实施方案中，所述来自异源传染原的病毒蛋白是包膜相关蛋白。在另一个实施方案中，所述来自异源传染原的病毒蛋白表达于VLP表面。在另一个实施方案中，所述来自传染原的蛋白包含在脊椎动物中产生保护性免疫应答的表位。
[0186]本发明还涵盖了用于免疫接种脊椎动物如人受试者的包含VLP的试剂盒，所述VLP包含至少一种RSV蛋白。在一个实施方案中，所述试剂盒包含的VLP包含经修饰或突变的RSV F蛋白。在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含RSV M蛋白如BRSV M蛋白。在另一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含RSV G蛋白。在另一个实施方案中，本发明涵盖了包含VLP的试剂盒，其包含来自BRSV的嵌合M蛋白和任选地来源于流感病毒的HA蛋白，其中所述M蛋白融合于BRSV M0在另一个实施方案中，本发明涵盖了包含VLP的试剂盒，其包含来自BRSV的嵌合M蛋白、RSV F和/或G蛋白和来自异源传染原的免疫原。在另一个实施方案中，本发明涵盖了包含VLP的试剂盒，其包含来自BRSV的M蛋白、嵌合RSV F和/或G蛋白和任选地来源于流感病毒的HA蛋白，其中所述HA蛋白融合于RSV F或G蛋白的跨膜域和细胞质尾部。在另一个实施方案中，本发明涵盖了包含VLP的试剂盒，其包含来自BRSV的M蛋白，嵌合R SV F和/或G蛋白和任选地来源于流感病毒的HA或NA蛋白，其中所述HA蛋白融合于RSV F和/或G蛋白的跨膜域和细胞质尾部。
[0187]在一个实施方案中，本发明包含免疫原性配制物，其包含至少一个有效剂量的经修饰或突变的RSV F蛋白。在另一个实施方案中，本发明包含免疫原性配制物，其包含至少一个有效剂量的包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团。还在另一个实施方案中，本发明包含免疫原性配制物，其包含至少一个有效剂量的如上所述的包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP。
[0188]本发明的免疫原性配制物包含经修饰或突变的RSV F蛋白、包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP，和药学上可接受的载体或赋形剂。药学上可接受的载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、无菌等张水性缓冲液及其组合。对药学上可接受的载体、稀释剂和其他赋形剂的详尽讨论呈现于Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub.C0.N.J.目前版本)。配制物应适合给药模式。在一个优选实施方案中，所述配制物适于对人给药，优选是无菌的，非颗粒的和/或非致热原性的。
[0189]所述组合物，视需要，还可含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。所述组合物可为固体形式，如适于重构的冻干粉、液体溶液、悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊剂、持续释放配制物或散剂。经口配制物可包括标准载体如医药级别甘露醇、乳糖、淀粉、硫酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
[0190]本发明还提供了包含一种或多种充以本发明疫苗组合物的一种或多种成分的容器的医药包或试剂盒。在一个优选实施方案中，所述试剂盒包含两个容器，一个含有经修饰或突变的RSV F蛋白、包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP，而另一个含有佐剂。与此种(类)容器相配套的可为管理药物或生物产品的制造、使用和销售的政府机构规定的通告，该通告反映了该机构批准用于人给药的制造、使用和销售。
[0191]本发明还提供了将该配制物包装于指示组合物量的密封的容器如安瓿瓶或小袋(sachette)。在一个实施方案中，将组合物作为液体提供，在另一个实施方案中，作为置于密封容器中的干燥的经灭菌的冻干粉或无水浓缩物提供，并可用例如水或盐水重构至适当浓度以供施于受试者。
[0192]在另一个实施方案中，将组合物以液体形式置于指示组合物量和浓度的密封容器中提供。优选地，组合物的液体形式是在密封容器中以至少约50μ g/ml，更优选至少约100 μ g/ml,至少约 200 μ g/ml,至少 500 μ g/ml,或至少 lmg/ml 提供的。
[0193]作为一个实例，包含本发明经修饰或突变的RSV F蛋白的嵌合RSV VLP以足以刺激免疫应答的有效量或数量(如上所定义)施用，每个均为针对一个或多个RSV株的应答。本发明经修饰或突变的RSV F蛋白、包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或VLP的施用引发针对RSV的免疫。通常而言，可在该范围之内基于例如年龄、生理状况、体重、性另O、食谱、给药时间和其他临床因素来调整剂量。预防性疫苗配制物是通过例如皮下或肌肉内注射使用针头和注射器，或无针头的注射装置进行系统性施用。或者，将所述疫苗配制物通过滴剂、大颗粒气雾剂(大于约10微米)或喷雾而鼻内施用进入上呼吸道。尽管所有上述递送途径导致免疫应答，鼻内给药赋予了在许多病毒包括RSV和流感病毒进入位点引发粘膜免疫的附加益处。
[0194]因此，本发明还包括配制对哺乳动物诱导针对感染或其至少一种疾病症状的免疫的疫苗或抗原性组合物的方法，包括将有效剂量的经修饰或突变的RSV F蛋白、包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP添加至所述配制物。在一个实施方案中，所述感染是RSV感染。
[0195]尽管用单一剂量刺激免疫是可能的，可通过相同或不同的途径施用额外的剂量以取得所需的效果。在新生儿和婴儿中，例如，可能需要多次施用以引发充足水平的免疫。可在整个儿童期(childhood)视需要按间隔施用，以维持充足水平的针对感染例如RSV感染的保护。类似地，特别易感于重复或严重感染的成人，如例如健康护理工作者、日托工作者、幼儿的家庭成员、老年人和具有缺损心肺功能的个体，可能需要多次免疫接种以确立和/或维持保护性免疫应答。可监视所诱导的免疫的水平，例如通过测量中和性分泌和血清抗体的量，并视需要调整剂量或重复接种以引发并维持所需水平的保护。
[0196]施用包含经修饰或突变的RSV F蛋白、包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP的组合物(例如疫苗和/或抗原性配制物)的方法包括但不限于肠胃外给药(例如皮内、肌肉内、静脉内和皮下)、硬膜外和粘膜(例如鼻内和经口或肺部途径或通过栓剂)。在一个具体实施方案中，本发明的组合物是肌肉内、静脉内、皮下、经皮或皮内施用的。所述组合物可通过任何方便的途径施用，例如通过灌注或推注注射，通过经由上皮或粘膜皮肤膜的吸收(例如，口粘膜、结肠、结膜、鼻咽、口咽、阴道、尿道、膀胱、和肠粘膜等)，并可与其他生物活性剂一同施用。在一些实施方案中，本发明组合物的鼻内或其他粘膜施用途径可诱导实质上高于其他给药途径的抗体或其他免疫应答。在另一个实施方案中，本发明的鼻内或其他粘膜给药途径可诱导会诱导针对其他RSV株交叉保护的抗体或其他免疫应答。给药可为系统性的或局部的。
[0197]还在另一个实施方案中，所述疫苗和/或免疫原性配制物以为了在免疫接种位点引发免疫应答而靶向粘膜组织的方式施用。举例而言，可靶向粘膜组织如肠相关淋巴组织(GALT)以通过使用经口施用含有具有特定粘膜靶向性质的佐剂的组合物进行免疫接种。亦可靶向其他粘膜组织，如鼻咽淋巴组织(NALT)和支气管相关淋巴组织(BALT)。
[0198]本发明的疫苗和/或免疫原性配制物亦可以剂量日程施用，例如，起始的疫苗组合物给药与后续的增强给药。在具体实施方案中，第二剂的组合物是在起始给药之后从两周至一年，优选从约1、约2、约3、约4、约5至约6个月的任何时点施用的。此外，第三剂可在第二剂之后和起始给药之后从约三个月至约两年，或甚至更长，优选约4、约5，或约6个月，或约7个月至约一年时施用。当在第二剂之后在受试者的血清和/或尿或粘膜分泌物中检测不出具体免疫球蛋白或检测出低水平的具体免疫球蛋白时，可任选地施用第三剂。在一个优选实施方案中，第二剂是在第一次给药之后约一个月施用的，而第三剂是在第一次给药之后约六个月施用的。在另一个实施方案中，第二剂是在第一次给药之后约六个月施用的。在另一个实施方案中，本发明的组合物可作为联合疗法的一部分施用。举例而言，本发明的组合物可与其他免疫原性组合物；抗病毒剂和/或抗生素一同配制。
[0199]药物组合物的剂量可方便地由本领域技术人员来确定，例如通过首先鉴定有效引发预防性或治疗性免疫应答的剂量，例如通过测量病毒特异性免疫球蛋白的血清效价或通过测量血清样品或尿样或粘膜分泌物中抗体的抑制比。所述剂量可从动物研究确定。用于研究疫苗效力的动物的非限定性列表包括豚鼠、仓鼠、雪貂、南美栗鼠、小鼠和棉鼠。大多数动物并非传染原的天然宿主，但仍可用于疾病多种方面的研究。举例而言，任何上述动物可按剂量给药疫苗候选例如经修饰或突变的RSV F蛋白、包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP，以部分表征诱导的免疫应答，和/或确定是否产生了任何中和抗体。举例而言，许多研究是在小鼠模型中进行的，因为小鼠具有较小的大小，且其较低的成本允许研究者以较大规模进行研究。
[0200]此外，本领域技术人员可进行人的临床研究以确定对于人的优选有效剂量。此类临床研究在本领域是常规的和公知的。待采用的准确剂量亦取决于给药途径。有效剂量可从来源于体外或动物测试系统的剂量-应答外推。
[0201]如本领域中亦公知的，具体组合物的免疫原性可通过使用称作佐剂的免疫应答的非特异性刺激剂来增强。佐剂实验性用于促进针对未知抗原的免疫的一般性增长(例如，美国专利4，877，611号)。免疫接种实验方案已使用佐剂刺激应答多年，故此，佐剂对于本领域一般技术人员是公知的。一些佐剂影响抗原呈递的方式。举例而言，当用明矾沉淀蛋白抗原时，免疫应答增加。抗原的乳化亦延长了抗原呈递的持续时间。本发明的范围涵盖了包含任何描述于 Vogel 等，“A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2ndEdit1n) ” (就所有目的通过全文提述并入本文)中的佐剂。
[0202]示例性的佐剂包括完全弗氏佐剂(含有被杀灭的结核分枝杆菌的非特异性免疫应答刺激剂)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。其他佐剂包括GMCSP、BCG、氢氧化铝、MDP化合物如thur-MDP或nor-MDP、CGP (MTP-PE)、脂质A和单磷酰基脂质A (MPL)。涵盖了 RIBI，其含有三个提取自细菌的组分，即MPL、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)在2%鲨烯/Tween80中的乳剂。亦可使用MF-59、Novasomes?、MHC抗原。
[0203]在本发明的一个实施方案中，佐剂是具有约二至十个双层以由水层分隔的实质上为球形壳的形式排列，围绕不含脂双层的较大无定形中央空腔的少片层(paucilamellar)脂质小囊。少片层脂质小囊可以以几种方式起作用刺激免疫应答，作为非特异性刺激剂，作为抗原载体，作为其他佐剂的载体及其组合。当例如通过将抗原与完成的(performed)小囊相互混合从而使得抗原相对小囊保持在胞外时，少片层脂质小囊作为非特异性免疫刺激剂起作用。通过将抗原包埋于小囊的中央空腔内，所述小囊作为免疫刺激剂和抗原载体起作用。在另一个实施方案中，所述小囊主要由非磷脂小囊构成。在其他实施方案中，所述小囊为Novasomes?。Novasomes'为范围为约10nm至约500nm的少片层非磷脂小囊。其包括Bri j72、胆固醇、油酸和藍烯。已显示Novasomes为对于流感抗原的有效佐剂(参见美国专利5，629，021,6, 387，373和4，911，928，就所有目的通过全文提述并入本文)。
[0204]本发明的组合物亦可用“免疫刺激剂”配制。其为机体用于增加免疫系统应答的自身化学信使(细胞因子)。免疫刺激剂包括但不限于多种具有免疫刺激、免疫增强和促炎活性的细胞因子、淋巴因子和趋化因子，如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL_4、IL-12、IL-13);生长因子(例如粒细胞-巨噬细胞(GM)集落刺激因子(CSF));和其他免疫刺激分子，如巨噬细胞炎症因子，Flt3配体，B7.1 ;B7.2等。所述免疫刺激分子可在与本发明的组合物相同的配制物中施用，或可单独施用。可施用蛋白或编码蛋白的表达载体以产生免疫刺激作用。因此在一个实施方案中，本发明包括抗原性和疫苗配制物，所述配制物包含佐剂和/或免疫刺激剂。
[0205]刺激免疫应答的方法
[0206]本发明的经修饰或突变的RSV F 蛋白、包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或VLP可用于制备刺激免疫应答的组合物，所述免疫应答赋予针对传染原的免疫或实质免疫。粘膜和细胞免疫可促进对传染原和疾病的免疫。在上呼吸道局部分泌的抗体为对天然感染抗性的主要因素。分泌型免疫球蛋白A(SlGA)涉及上呼吸道的保护，而血清IgG涉及下呼吸道的保护。由感染诱导的免疫应答保护免受相同病毒或抗原性类似的病毒株的再次感染。举例而言，RSV发生频繁和不可预测的变化；因此，在自然感染之后，由宿主的免疫提供的保护有效期针对在社区中传播的新病毒株可能仅有效几年。
[0207]因此，本发明涵盖了诱导受试者中对感染或其至少一种疾病症状的免疫的方法，包括施用至少一个有效剂量的经修饰或突变的RSV F蛋白、包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP。在一个实施方案中，所述方法包括施用包含经修饰或突变的RSV F蛋白和至少一种其他蛋白的VLP。在另一个实施方案中，所述方法包括施用进一步包含RSV M蛋白例如BRSV M蛋白的VLP。在另一个实施方案中，所述方法包括施用进一步包含RSV N蛋白的VLP。在另一个实施方案中，所述方法包括施用进一步包含RSV G蛋白的VLP。在另一个实施方案中，所述方法包括施用进一步包含RSVSH蛋白的VLP。在另一个实施方案中，所述方法包括施用进一步包含来自HRSV组A和/或组B的F和/或G蛋白的VLP。在另一个实施方案中，所述方法包括施用包含来自BRSV的M蛋白和嵌合RSV F和/或G蛋白或MMTV包膜蛋白，例如来源于流感病毒的HA或NA蛋白的VLP，其中所述HA和/或NA蛋白融合于RSV F和/或RSV G蛋白或MMTV包膜蛋白的跨膜域和细胞质尾部。在另一个实施方案中，所述方法包括施用包含来自BRSV的M蛋白和嵌合RSV F和/或G蛋白和任选地包含来源于流感病毒的HA或NA蛋白的VLP，其中所述HA或NA蛋白融合于RSVF和/或RSV G蛋白的跨膜域和细胞质尾部。在另一个实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在另一个实施方案中，所述哺乳动物是人。在另一个实施方案中，RSV VLP与佐剂或免疫刺激剂一同配制。
[0208]在一个实施方案中，本发明包括诱导针对受试者中RSV感染或其至少一种疾病症状的免疫的方法，包括施用至少一个有效剂量的经修饰或突变的RSV F蛋白。在另一个实施方案中，本发明包括诱导针对受试者中RSV感染或其至少一种疾病症状的免疫的方法，包括施用至少一个有效剂量的包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团。还在另一个实施方案中，本发明包括诱导针对受试者中RSV感染或其至少一种疾病症状的免疫的方法，包括施用至少一个有效剂量的RSV VLP，其中所述VLP包含经修饰或突变的RSV F蛋白，M、G、SH和/或N蛋白。在另一个实施方案中，诱导针对受试者中RSV感染或其至少一种疾病症状的免疫的方法，包括施用至少一个有效剂量的RSV VLP，其中所述VLP基本上由BRSV M(包括嵌合M)和RSV F、G和/或N蛋白组成。所述VLP可以以可忽略的浓度包含其他RSV蛋白和/或蛋白污染物。在另一个实施方案中，诱导针对受试者中RSV感染或其至少一种疾病症状的免疫的方法，包括施用至少一个有效剂量的RSV VLP，其中所述VLP由BRSV M (包括嵌合M)、RSV G和/或F组成。在另一个实施方案中，诱导针对受试者中RSV感染或其至少一种疾病症状的免疫的方法，包括施用至少一个有效剂量的包含RSV蛋白的RSV VLP,其中所述RSV蛋白由BRSV M(包括嵌合M)、F、G和/或N蛋白组成，包括嵌合F、G和/或N蛋白。这些VLP含有BRSV M(包括嵌合M)、RSV F、G和/或N蛋白，并可含有其他细胞成分如细胞蛋白、杆状病毒蛋白、脂质、糖类等，但并不含有其他RSV蛋白(除了 BRSVM的片段(包括嵌合M)，BRSV/RSV F、G和/或N蛋白之外)。在另一个实施方案中，所述受试者是脊椎动物。在一个实施方案中，所述脊椎动物是哺乳动物。在另一个实施方案中，所述哺乳动物是人。在另一个实施方案中，所述方法包括通过将所述配制物以一剂施用来诱导针对RSV感染或至少一种疾病症状的免疫。在另一个实施方案中，所述方法包括通过将所述配制物以多剂施用来诱导针对RSV感染或至少一种疾病症状的免疫。
[0209] 所述组合物可以以合适的蛋白剂量范围施用。在一些方面，所述蛋白剂量范围具有约100 μ g,约80 μ g,约60 μ g,约30 μ g,约15 μ g,约10 μ g,或约5 μ g的上限。在另外的方面，所述剂量范围具有约30 μ g,约15 μ g,约5 μ g,或约I μ g的下限。因此,合适的范围包括但不限于，例如约lug到约100 μ g,约5 μ g到约80 μ g,约5 μ g到约60 μ g,约15 μ g到约60 μ g，约30 μ g到约60 μ g,和约15 μ g到约300 μ g蛋白。
[0210]如用于全文的，术语“约”指所指值的±10%。
[0211]本发明亦涵盖诱导针对受试者中由传染原造成的感染或其至少一种症状的免疫，包括施用至少一个有效剂量的经修饰或突变的RSV F蛋白、包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP。在一个实施方案中，所述方法包括施用包含经修饰或突变的RSV F蛋白和至少一种来自异源传染原的VLP。在一个实施方案中，所述方法包括施用包含经修饰或突变的RSV F蛋白和至少一种来自相同或异源传染原的蛋白的VLP。在另一个实施方案中，所述来自异源传染原的蛋白是病毒蛋白。在另一个实施方案中，所述来自传染原的蛋白是包膜相关蛋白。在另一个实施方案中，所述来自传染原的蛋白可为在VLP表面上表达的传染原。在另一个实施方案中，所述来自传染原的蛋白包含在脊椎动物中产生保护性免疫应答的表位。在另一个实施方案中，所述来自传染原的蛋白可与RSV M蛋白如BRSV M蛋白、RSV F、G和/或N蛋白相结合。在另一个实施方案中，所述来自传染原的蛋白融合于RSV蛋白如BRSV M蛋白、RSVF、G和/或N蛋白。在另一个实施方案中，仅仅来自所述传染原的一部分融合于RSV蛋白如BRSV M蛋白、RSV F、G和/或N蛋白。在另一个实施方案中，仅仅来自所述传染原的蛋白的一部分融合于RSV蛋白的一部分如BRSV M蛋白、RSV F、G和/或N蛋白。在另一个实施方案中，所述来自传染原的蛋白融合于所述RSV蛋白的部分表达于VLP的表面。在其他实施方案中，所述融合于来自传染原的蛋白的RSV蛋白或其部分与RSV M蛋白结合。在其他实施方案中，所述RSV蛋白或其部分来源于RSV F、G、N和/或P。在另一个实施方案中，所述嵌合VLP进一步包含来自RSV的N和/或P蛋白。在另一个实施方案中，所述嵌合VLP包含多于一个来自相同和/或异源传染原的蛋白。在另一个实施方案中，所述嵌合VLP包含多于一个传染原蛋白，从而构建多价VLP。
[0212]本发明的组合物当施于脊椎动物(例如人)时，可在脊椎动物中诱导实质免疫。该实质免疫产生自针对本发明组合物的，在脊椎动物中保护或减轻感染或至少减轻感染的症状的免疫应答。在一些实例中，如果所述脊椎动物受感染，该感染会是无症状的。该应答可能不是完全保护性的应答。在此情况下，如果所述脊椎动物受传染原感染，所述脊椎动物与未经免疫接种的脊椎动物相比会经受减少的症状或较短期间的症状。
[0213]在一个实施方案中，本发明包括诱导受试者中针对RSV病毒感染或至少一种疾病症状的实质免疫的方法，包括施用至少一个有效剂量的经修饰或突变的RSV F蛋白、包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP。在另一个实施方案中，本发明包括接种哺乳动物针对RSV的方法，包括将诱导保护量的经修饰或突变的RSV F蛋白、包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP施于所述哺乳动物。在一个实施方案中，所述方法包括施用进一步包含RSV M蛋白如BRSV M蛋白的VLP。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括施用包含RSVG蛋白例如HRSV G蛋白的VLP。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括施用包含来自HRSV组A的N蛋白的VLP。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括施用包含来自HRSV组B的N蛋白的VLP。在另一个实施方案中，所述方法包括施用包含来自BRSV的嵌合M蛋白和来源于RSV的F和/或G蛋白的VLP，其中所述F和/或G蛋白融合于M蛋白的跨膜和细胞质尾部。在另一个实施方案中，所述方法包括施用包含来自BRSV的M蛋白和嵌合RSVF和/或G蛋白的VLP，其中所述F和/或G蛋白融合于流感HA和/或NA蛋白的跨膜域和细胞质尾部。在另一个实施方案中，所述方法包括施用包含来自BRSV的M蛋白和嵌合RSVF和/或G蛋白和任选地包含流感HA和/或NA蛋白的VLP，其中所述F和/或G蛋白融合于HA蛋白的跨膜域和细胞质尾部。在另一个实施方案中，所述方法包括施用包含来自BRSV的M蛋白和嵌合RSV F和/或G蛋白和任选地包含流感HA和/或NA蛋白的VLP，其中所述HA和/或NA蛋白融合于RSV F和/或G蛋白的跨膜域和细胞质尾部。
[0214]本发明还涵盖了诱导受试者中针对由传染原造成的感染或至少一种疾病症状的实质免疫的方法，包括施用至少一个有效剂量的经修饰或突变的RSV F蛋白、包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP。在一个实施方案中，所述方法包括施用进一步包含RSV M蛋白如BRSV M蛋白和至少一种来自另一种传染原的蛋白的VLP。在一个实施方案中，所述方法包括施用进一步包含BRSV M蛋白和至少一种来自相同或异源传染原的蛋白的VLP。在另一个实施方案中，所述来自传染原的蛋白是病毒蛋白。在另一个实施方案中，所述来自传染原的蛋白是包膜相关蛋白。在另一个实施方案中，所述来自传染原的蛋白表达于VLP表面。在另一个实施方案中，所述来自传染原的蛋白包含在脊椎动物中会产生保护性免疫应答的表位。在另一个实施方案中，所述来自传染原的蛋白可与RSV M蛋白结合。在另一个实施方案中，所述来自传染原的蛋白可与BRSV M蛋白结合。在另一个实施方案中，所述来自传染原的蛋白融合于RSV蛋白。在另一个实施方案中，仅来自所述传染原的蛋白的一部分融合于RSV蛋白。在另一个实施方案中，仅来自所述传染原的蛋白的一部分融合于RSV蛋白的一部分。在另一个实施方案中，融合于所述RSV蛋白的来自所述传染原的蛋白的部分表达于VLP表面。在其他实施方案中，所述融合于来自传染原的蛋白的RSV蛋白或其部分与RSV M蛋白结合。在其他实施方案中，所述融合于来自传染原的蛋白的RSV蛋白或其部分与BRSV M蛋白结合。在其他实施方案中，所述RSV蛋白或其部分来源于RSV F、G、N和/或P蛋白。在另一个实施方案中，所述VLP进一步包含来自RSV的N和/或P蛋白。在另一个实施方案中，所述VLP包含来自传染原的多于一种蛋白。在另一个实施方案中，所述VLP包含多于一种传染原蛋白，从而构建多价VLP。
[0215]在另一个实施方案中，本发明包括诱导受试者中针对感染或其至少一种症状的保护性抗体免疫的方法，包括施用至少一个有效剂量的如上所述的经修饰或突变的RSV F蛋白，包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团或包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP。
[0216]如用于本文，“抗体”是包含由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段实质或部分编码的一种或多种多肽的蛋白。识别的免疫球蛋白基因包括kappa、lambda、alpha、gamma、delta、epsilon和mu恒定区基因，以及繁多的免疫球蛋白可变区基因。轻链归类为kappa或lambda。重链归类为gamma、mu、alpha、delta或epsilon,其随之分别限定免疫球蛋白类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。典型的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两个相同对的多肽链组成，每对具有一个“轻”(约25kD)和一个“重”链(约50-70kD)。每个链的N端限定约100至110或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识另O。抗体作为完整的免疫球蛋白或通过用多种肽酶消化产生的多种充分表征的片段存在。
[0217] 在一个实施方案中，本发明包括诱导受试者中针对RSV感染或至少一种疾病症状的保护性细胞应答的方法，包括施用至少一个有效剂量的经修饰或突变的RSV F蛋白。在另一个实施方案中，本发明包括诱导受试者中针对RSV感染或至少一种疾病症状的保护性细胞应答的方法，包括施用至少一个有效剂量的包含经修饰或突变的RSV F蛋白的RSV F微团。在另一个实施方案中，本发明包括诱导受试者中针对RSV感染或至少一种疾病症状的保护性细胞应答的方法，包括施用至少一个有效剂量的VLP，其中所述VLP包含如上所述的经修饰或突变的RSV F蛋白。细胞介导的免疫还在从RSV感染恢复中起作用，并可预防RSV相关的并发症。RSV特异性细胞性淋巴细胞在受感染的受试者的血中和下呼吸道分泌物中检测出。RSV感染细胞的细胞溶解是通过CTL与RSV特异性抗体和补体协同介导的。在受感染或经接种的个体中主要的细胞毒性应答在血中在6-14日之后可检测出，并在第21日消失(Ennis等，1981)。细胞介导的免疫亦可在从RSV感染恢复中起作用，并可预防RSV相关的并发症。RSV特异性细胞性淋巴细胞在受感染的受试者的血中和下呼吸道分泌物中检测出。
[0218]如上所提及，本发明免疫原性组合物预防或减少受试者中RSV感染的至少一种症状。RSV的症状在本领域是公知的。其包括鼻漏、咽喉痛、头疼、声撕、咳嗽、痰、发热、啰音、喘鸣和呼吸困难。因此本发明的方法包括预防或减少至少一种与RSV感染相关的症状。症状的减少可主观或客观地确定，例如由受试者自我评价，通过医师的评价或通过进行适当的测定法或测量(例如体温)，包括例如生活品质评价，RSV感染或其他症状的进行减慢，RSV症状的严重程度减少，或合适的测定法(例如抗体效价和/或T细胞激活测定法)。客观评价包括动物和人评价。
[0219]本发明进一步通过下述实施例加以说明，其不应认为是限制性的。所有本申请中引用的参考文献、专利和公开的专利申请的内容以及附图和序列表，就所有目的通过全文提述并入本文。
实施例
[0220]实施例1
[0221]生成重组杆粒，转染昆虫细胞以制备重组病毒原种，空斑纯化，和用初级病毒原种感染昆虫细胞
[0222]为了构建重组病毒，将目标病毒基因密码子优化以供Sf9昆虫细胞表达，并克隆A pFastBac? 载体。
[0223]一旦确证并纯化了所需的构建体，对于每个构建体，将一个小瓶的MAXEfficiency? DHlOBac?感受态细胞在冰上融化。将大约Ing (5 μ I)所需的pFastBac?构建体质粒DNA添加至细胞并轻柔混合。将细胞在冰上温育30分钟。接着，将细胞在42°C不振荡热激45秒。之后，将试管转移至冰上，并冰冻2分钟。随后将900 μ I室温S.0.C.培养基添加至每个试管。将试管置于振荡器上在37°C以225rpm振荡4小时。对于每个pFastBac?转化，使用S.0.C.培养基制备10倍系列稀释的细胞(10-1，10_2和10_3)。之后，将100 μ I的每个稀释铺板于含有50 μ g/ml卡那霉素、7 μ g/ml庆大霉素、10 μ g/ml四环素、100 μ g/ml Bluo-gal和40 μ g/ml IPTG的LB琼脂板上。将该板在37°C温育48小时。挑取白色集落以供分析。
[0224]对于每个构建体制备来自上述的不同杆粒DNA，并将其分离。将这些DNA沉淀并添加至Sf9细胞5小时。
[0225]之后，将30ml的Sf9昆虫细胞(2xl06个细胞/ml)用0.3ml的空斑洗脱物用表达目标病毒蛋白的杆粒感染，并温育48-72小时。保存大约Iml的粗培养物(细胞+培养基)和澄清的培养收获物以供表达分析，并将剩余物保存以供纯化目的。
[0226]实施例2
[0227]经修饰的HRSV F蛋白的表汰、钝化和分析
[0228]将编码经修饰的目标HRSV F蛋白的基因作为重叠的寡核苷酸在体外合成，并在宿主细胞中克隆和表达。经修饰的RSV F基因的克隆和表达是依照本领域已知方法达成的。
[0229]挑取并确证含有目标病毒蛋白的重组空斑。然后将重组病毒通过Sf9昆虫细胞的感染进行扩增。在一些情况下，将Sf9昆虫细胞由表达经修饰的F蛋白的重组病毒和另一个表达其他病毒蛋白(例如BRSV M蛋白和/或HRSVN蛋白)的重组病毒共同感染。将昆虫细胞的培养物用携带多种构建体的杆状病毒以~3M0I (感染复数=病毒ffu或pfu/细胞)感染。在感染后48-72小时收获培养物和上清。将粗收获物，大约30mL，通过以大约800x g离心15分钟来澄清。将所得的含有经修饰的HRSV F蛋白的粗细胞收获物如下所述进行纯化。
[0230]将经修饰的目标HRSV F蛋白从感染的Sf9昆虫细胞培养收获物纯化。将非离子型表面活性剂Tergko丨⑩NP-9 (壬基苯酹乙氧化物，Nonylphenol Ethoxylate)用于膜蛋白提取实验方案。将粗提取物通过经由阴离子交换层析、小扁豆凝集素亲和/HIC和阳离子交换层析来进一步纯化。
[0231]蛋白表达通过SDS-PAGE并用考马斯染色对总蛋白进行染色来进行分析。以大约15至20 μ I (约7.5 μ I至10 μ I培养物)/泳道将等体积的来自粗收获物的细胞样品和含有β ME ( β -巯基乙醇)2χ样品缓冲液加载至SDS Laemmli凝胶。
[0232]在一些情况下，替代层析法，将粗细胞收获物中的经修饰的HRSV F蛋白通过30%蔗糖梯度分离方法浓缩，然后通过用考马斯染色的SDS-PAGE，或使用抗RSV F单克隆抗体的Western印迹进行分析。
[0233]含有经修饰的重组F蛋白的粗细胞收获物，纯化的重组F蛋白或通过蔗糖梯度浓缩的重组F蛋白可进一步通过使用抗RSV F单克隆抗体和/或抗RSV F多克隆抗体的Western印迹进行分析。
[0234]实施例3
[0235]编码F蛋白BV#541的经修饰的HRSV F某闵
[0236]表达全长HRSV F蛋白的最初尝试证明无法成功地获得高表达水平。用于该表达中的F基因序列为SEQ ID NO:1 (野生型HRSV F基因，GenBank登录号Ml 1486)。其编码574aa的无活性前体(Ftl)15该前体在成熟过程中由弗林蛋白酶样蛋白酶剪切两次以得到两个二硫键连接的多肽，来自N端的亚基F2和来自C端的F1 (图1)。该两个剪切位点在残基109和136，在其之前是由弗林蛋白酶识别基序(RARR, aal06-109 (SEQ ID NO: 23)和KKRKRR, aal31-136 (SEQ ID N0:24)) ? SEQ ID NO:1 的 F 基因序列对于在 Sf9 昆虫细胞中表达含有欠佳的密码子使用，并携带3个错误，产生展示非最优的折叠(SEQ ID NO: 2, GenBank登录号AAB59858)的蛋白。此外，在编码F2亚基的区鉴定了可能的多聚(A)腺苷酸化位点(ATAAAA)。而且，野生型F基因序列富含大约65%的AT，而Sf9昆虫细胞表达系统中基因序列理想的GC-AT比为大约1:1。
[0237]为了尝试克服HRSV F蛋白的不良表达水平，设计了新的F基因序列，从而使得:
[0238](a)修正了所述三个GenBank测序的错误；
[0239](b)修饰了编码F2亚基的区的隐含多聚㈧位点；
[0240](c)优化了 F基因密码子；和
[0241](d)该F基因编码具有失活的主要剪切位点的修饰的F蛋白。
[0242]所述三个经修正的氨基酸错误为P102A、I379V和M447V。修正了 HRSVF基因中的隐含多聚(A)位点而未改变其氨基酸序列。
[0243]密码子优化方案是基于下述标准的:(1)在鳞翅类物种的昆虫细胞中对于如Levin, D.B.等(Journal of General Virology, 2000, vol.81, pp.2313-2325)所述的给定氨基酸，其特定密码子的氨酰tRNA的丰度，⑵维持基因序列中的GC-AT比为大约1:1，(3)最低限的回文或茎环DNA结构的导入，和(4)最低限的转录和后转录阻遏子Oppressor)元件序列的导入。经优化的F基因的序列的实例示为SEQ ID N0:19(RSV-F BV#368)。
[0244]为了失活HRSV F蛋白的主要剪切位点(1° CS，KKRKRR，aal31_136)，将弗林蛋白酶识别位点突变为KKQKQQ(SEQ ID NO:28)或GRRQQR(SEQ ID N0:29)。衡量了几种具有此类剪切位点突变的修饰的F蛋白以确定防止剪切的效率。图2显示了经衡量的几种经修饰的F蛋白。结果表明HRSV F蛋白的主要剪切位点可由三个保守氨基酸变化R133Q、R135Q和R136Q失活。这些从极性带电荷分子的精氨酸(R)至极性中性分子的谷氨酰胺(Q)的保守氨基酸变化，改变了这些位点的电荷状态，并防止弗林蛋白酶样蛋白酶的剪切(参见图3)，而仍然保留F蛋白的3D结构。防止1° CS处的剪切导致F蛋白的膜融合活性减少。
[0245]非限定的示例性经修饰以具有所有上述提及的修饰的HRSV F基因序列示于图4。该经修饰的F基因(SEQ ID NO: 5, RSV-F BV#541)编码SEQ ID N0:6的经修饰的F蛋白。该基因序列在体外作为重叠的寡核苷酸合成，在宿主细胞中克隆和表达。从受感染的Sf9昆虫细胞培养收获物纯化经修饰的HRSV F蛋白BV#541，并将其通过由考马斯染色的SDS-PAGE进行分析。纯化和SDS-PAGE分析的方法描述于实施例2。在Sf9昆虫细胞中，F蛋白RSV-FBV#541 (例如F蛋白541)的表达水平与野生型F。蛋白相比得到改善。
[0246]实施例4
[0247]具有F1亚基融合域部分缺失的经修饰的HRSV F蛋白
[0248]为了进一步改善RSV F蛋白的表达，设计了包含下述修饰的额外修饰的HRSV F基因:
[0249](a)修正了所述三个GenBank测序错误；
[0250](b)修饰了编码F2亚基的区处的隐含多聚㈧位点；
[0251](c)优化了 F基因密码子；和
[0252](d)部分缺失了编码F1亚基融合域的核苷酸序列。在一个实验中，缺失了编码F1亚基融合域前10个氨基酸的核苷酸序列(对应于SEQ ID NO:2的氨基酸137-146)。
[0253]包含所述修饰的非限制性示例性经修饰的RSV F基因示于图5，命名为SEQ IDN0:9(RSV-F BV#622,例如F蛋白622)，编码SEQ ID NO: 10的经修饰的F蛋白。从受感染的Sf9昆虫细胞培养收获物纯化经修饰的HRSV F蛋白BV#622，并通过考马斯染色的SDS-PAGE进行分析。纯化和SDS-PAGE分析的方法描述于实施例2。观察到HRSV F蛋白BV#622的高表达水平，如示于图6中的SDS-PAGE。
[0254]实施例5
[0255]具有失活的主要剪切位点和F1融合域部分缺失的经修饰的HRSV F蛋白
[0256]为了确定失活的主要剪切位点和F1融合域部分缺失的组合可否进一步促进RSV F蛋白的表达，特别是在Sf9昆虫细胞中的表达，设计了另一种包含下述修饰的经修饰的RSVF基因:
[0257](a)修正了所述三个GenBank测序错误；
[0258](b)修饰了编码F2亚基的区处的隐含多聚㈧位点；
[0259](c)优化了 F基因密码子；
[0260](d)失活了主要剪切位点；和
[0261](e)部分缺失了编码Fl亚基融合域的核苷酸序列。在一个实验中，缺失了编码所述F1亚基融合域的前10个氨基酸的核苷酸序列(对应于SEQ ID NO: 2的氨基酸137-146)。
[0262]其中缺失了编码所述F1亚基融合域的前10个氨基酸(对应于SEQ ID N0:2的氨基酸137-146)的非限制性示例性经修饰的RSV F基因示于图7A，命名为SEQ ID N0:7(RSV-FBV#683,例如F蛋白683)，编码SEQ ID NO:8的经修饰的F蛋白。从受感染的Sf9昆虫细胞培养收获物纯化经修饰的RSV F蛋白BV#683(例如F蛋白683)，并通过考马斯染色的SDS-PAGE进行分析。纯化和SDS-PAGE分析的方法描述于实施例2。取得了表达水平的进一步增强，如示于图8中的SDS-PAGE。
[0263]包含所述其中缺失了编码所述F1亚基融合域的前10个氨基酸(对应于SEQ IDNO: 2的氨基酸137-146)的非限制性示例性经修饰的RSV F基因示于图7A，命名为SEQ IDN0:7(RSV-F BV#683,例如F蛋白683)，编码SEQ ID N0:8的经修饰的F蛋白。从受感染的Sf9昆虫细胞培养收获物纯化经修饰的RSV F蛋白BV#683 (例如F蛋白683)，并通过考马斯染色的SDS-PAGE进行分析。纯化和SDS-PAGE分析的方法描述于实施例2。取得了表达水平的进一步增强，如示于图8中的SDS-PAGE。
[0264]替代实施例5
[0265]修饰的HRSV F蛋白融合域缺失
[0266]Fl 融合域中来自 Phel37_Vall54 的 Λ 2，Λ 4，Λ 6，Λ 8，Λ 10，Δ 12，Δ 14，Λ 16 或Δ 18氨基酸的缺失导入克隆#541中(图7Α)。用表达这些缺失突变体的杆状病毒感染的Sf9细胞用于分析用非离子洗涤剂(图7Β)从感染细胞提取的RSV F蛋白，以及通过染色细胞的FACS分析用于分析RSV F(图7C)。相对于亲本克隆BV#541 (图7B)，Phel37_Serl46最多10个氨基酸的缺失(图7ΑΛ2，Λ4，Λ6，Λ8和Λ10)提高提取自所述细胞的可溶Fl的水平。随着增加所述融合域大于10个氨基酸的缺失，观察到可溶RSV F的显著损失，很可能是因为所述分子的错误-折叠。与这些结构一致，具有Fl融合肽Λ 2，八6和八10氨基酸缺失的构建体呈现最高的RSVF细胞表面表达(图7C)。
[0267]实施例6
[0268]经修饰的HRSV F蛋白BV#683的表汰和钝化
[0269]如实施例1中所述将经修饰的HRSV F蛋白BV#683 (例如F蛋白683，SEQ ID NO:8)表达于杆状病毒表达系统，并挑取和确证表达HRSV F蛋白BV#683的重组空斑。然后通过感染Sf9昆虫细胞扩增所述重组病毒。将昆虫细胞的培养物以~3M0I (感染复数=病毒ffu或Pfu/细胞)用杆状病毒感染。在感染后48-72小时收获培养物和上清。将粗收获物，大约30mL，通过以大约800x g离心15分钟进行澄清。如下所述纯化了所得的含有HRSV F蛋白BV#683的粗细胞收获物。
[0270]将HRSV F蛋白BV#683从受感染的Sf9昆虫细胞培养收获物纯化。将非离子型表面活性剂Tergitol? np-9(壬基苯酚乙氧化物)用于膜蛋白提取实验方案。将粗提取物进一步通过经由阴离子交换层析、小扁豆凝集素亲和/Hic和阳离子交换层析纯化。
[0271] 将经纯化的HRSV F蛋白BV#683如实施例2中所述通过用考马斯染色的SDS-PAGE和使用抗RSV F单克隆抗体的Western印迹进行分析。结果示于图9。取得了 HRSV F蛋白BV#683的优异表达水平(例如F蛋白683，SEQ ID N0:8)。预计粗细胞培养中表达水平为高于10mg/L，而回收的F蛋白BV#683为约3.5mg/L细胞培养。在一些情况下，取得了高于20mg/L的表达水平，并回收了约5mg/L的经修饰的F蛋白BV#683(参见图10)。如通过扫描光密度法确定，经回收的F蛋白BV#683的纯度达到高于98% (参见图10)。
[0272]实施例7
[0273]经钝化的HRSV F蛋白BV#683微闭(玫瑰花结)
[0274]通过负染电子显微术分析纯化的HRSV F蛋白BV#683(参见图11)。F蛋白以微团(玫瑰花结)的形式聚集，类似于对于野生型HRSV F蛋白观察到的那些(Calder等，2000，Virology271, pp.122-131),和其他全长病毒膜糖蛋白(Wrigley 等，Academic Press, London, 1986, vol.5, pp.103-163)。在电子显微镜下,F突起展示棒棒糖形状的杆状形态，其较宽端从玫瑰花结的中心向外伸出。单个三聚体的长度为约20nm，而微团颗粒的直径为约40nm(参见图12)。这些结果表明HRSV F蛋白BV#683具有天然、活性蛋白的正确3D结构。
[0275]替代实施例7
[0276]经钝化的HRSV F蛋白BV#683微闭(玫瑰花结)的HPLC分析
[0277]通过HPLC分析经纯化的HRSV F蛋白BV#683。反相高压液相色谱法(RP-HPLC)分析显示由90.1 %的处于11.195分钟停留时间的F1+F2和9.9%的处于6.256分钟停留时间的Fl多肽组成的经纯化的RSV F微团(图12A)。11.195分钟的F1+F2峰显示双峰，提示不同的糖基化种类。F1+F2和Fl的同一性通过分离的HPLC峰部分的SDS-PAGE和Western印迹分析证实。通过质谱法测定的完整的质量表明Fl和F1+F2分别具有50Kd和6IKd的分子量，与所预测的分子量类似。
[0278]利用HPLC排阻色谱法(SEC)进一步分析经纯化的RSV F纳米颗粒。所述RSV F纳米颗粒主要由具有低水平游离Fl亚基的共价连接的Fl和F2(图12B ；F1+F2)组成。F1+F2为总峰面积的95.8%，而Fl为总峰面积的3.8%。RSV F颗粒的纯度估计≥98%。F1+F2峰以SEC柱的空隙容积洗脱，如预期为Fl三聚体，Fl峰具有约180Kd的质量。分析超离心(AUC)研究表明RSV F纳米颗粒的大多数种类具有约100万至约800万Da之间的分子量。
[0279]所述单个三聚体的长度为约20nm，而所述胶团的颗粒直径为约40nm(参见图12C)。这些结果表明HRSV F蛋白BV#683具有天然、有活性蛋白的正确的3D结构。
[0280]总而言之，设计、表达并纯化了经修饰的重组HRSV F蛋白(例如BV#683)。该修饰的全长F经糖基化。主要剪切位点和融合域的修饰一起极大地增强了 F蛋白的表达水平。此外，该经修饰的F蛋白可剪切二硫键连接的F1和F2亚基。Fl和F2亚基的三聚体形成棒棒糖形状的19.6nm的突起和40.2nm的颗粒。而且,该经修饰的F蛋白在Sf9昆虫细胞中高度表达。在纯化之后取得了 >98%的微团纯度。该修饰的蛋白的突起具有棒棒糖形态(其可进一步从40mm的微团颗粒形成)的事实,表明经修饰的F蛋白BV#683具有天然蛋白的3D结构。
[0281]实施例8
[0282]在VLP产牛中经修饰的HRSV F蛋白与BRSV M和/或HRSV N的共表汰
[0283]本发明还提供了包含经修饰或突变的RSV F蛋白的VLP。此类VLP可用于诱导针对病毒蛋白抗原的中和抗体，并由此可施用以确立针对RSV的免疫。举例而言，此类VLP可包含经修饰的RSV F蛋白，和BRSV M和/或HRSVN蛋白。编码BRSV M(SEQ ID NO: 14)或HRSV N (SEQ ID NO: 18)蛋白的基因的密码子可针对在昆虫细胞中的表达进行优化。举例而言，经优化的BRSV M基因序列示于SEQ ID NO: 13，而经优化的RSV N基因序列示于SEQ IDNO:17。
[0284]在一个实验中，经修饰的F蛋白BV#622和另一种经修饰的F蛋白BV#623 (SEQ IDNO: 21，经修饰使得两个剪切位点均失活)单独表达或与HRSV N蛋白和BRSV M蛋白共同表达。含有VLP的粗细胞收获物或从30%蔗糖梯度分离收集的VLP沉淀两者均通过用考马斯染色的SDS-PAGE，和使用抗RSV F单克隆抗体的Western印迹进行分析。图13显示了经修饰的F蛋白BV#622和BV#623的结构，以及SDS-PAGE和Western印迹分析的结果。BV#622自身高度表达或与HRSV N蛋白和BRSV M蛋白共同表达，而BV#623具有非常不良的表达，表明两个剪切位点的失活均抑制F蛋白表达。
[0285]在另一个实验中，将修饰的F蛋白BV#622，双重串联基因BV#636 (BV#541+BRSVM)，BV#683，BV#684(具有 YIAL L-域导入 C 端的 BV#541)和 BV#685 (具有 YKKL L-域导入C端的BV#541)单独表达，或与HRSV N蛋白和BRSV M蛋白共同表达。在逆转录病毒中，L域(晚期域)是保守序列，并存在于Gag内与细胞蛋白一同作用以有效地将病毒粒体从细胞表面释放(Ott等，2005，Journal of Virology79:9038-9045)。每个经修饰的F蛋白的结构不于图14。将含有VLP的粗细胞收获物(胞内)和从30%蔗糖梯度分离收集的VLP沉淀通过用考马斯染色的SDS-PAGE和使用抗RSV F单克隆抗体的Western印迹进行分析。图14显示含有VLP的粗细胞收获物(胞内)的SDS-PAGE和Western印迹分析的结果，而图15显示从30%蔗糖梯度分离收集的VLP沉淀的SDS-PAGE和Western印迹分析的结果。BV#622和BV#683自身高度表达，或与HRSV N蛋白和BRSV M蛋白共同表达，而BV#636、BV#684和BV#685具有不良表达。
[0286]实施例9
[0287]筛选具有高表达的嵌合HRSV F蛋白
[0288]进行了筛选其他可以可溶形式在昆虫细胞中高度表达并可形成具有更佳产率的VLP的RSV F蛋白的努力。设计、表达和分析了多种F基因。Western印迹和SDS-PAGE均用于衡量所述表达。
[0289]图16A至图16D总结了对于每个嵌合HRSV F克隆的结构、克隆名、描述、Western印迹/考马斯分析结果和结论。
[0290]如结果所示，野生型全长F蛋白表达不良。含有F1但非F2亚基的嵌合HRSV F蛋白可良好表达，但产物或者是不可溶的(可能是由于错折叠)，或者在共同感染之后无法与其他病毒蛋白装配形成具有良好产率的VLP。主要剪切位点的失活本身并不导致表达的实质增加，但当主要剪切位点的失活与其他修饰如隐含多聚(A)位点的缺失和GenBank aa错误的修正组合(例如BV#541)时取得了更好的表达。YKKL L域导入BV#541的C端在与BRSVM和HRSV N蛋白的共同表达中增强了含有经修饰的F蛋白的VLP的分泌约2-3倍。结果进一步显示由BV#541基因和BRSV M基因组成的双重串联的嵌合基因与BV#541和BRSV M蛋白的共同感染相比，显示改善的胞内和VLP产率，表明当串联表达时，BRSV M蛋白可促进含有经修饰的HRSV F蛋白的VLP在昆虫细胞中的产生。由BV#541、BRSV M和HRSV N组成的三重串联嵌合基因与上述提及的双重串联的嵌合基因或BV#541、BRSV M和HRSV N蛋白的共同感染相比具有甚至更高的胞内和远为更佳的VLP产率。此外，结果表明嵌合HRSV F蛋白BV#683(例如F蛋白 683，SEQ ID N0:8)具有最佳的胞内表达。由BV#683和BRSV M基因组成的双重串联的嵌合基因或由BV#683、BRSV M和HRSV N基因组成的三重串联的嵌合基因的表达亦为本文中的实施方案。这些双重或三重串联的嵌合基因与共同感染相比会进一步改善VLP产生。
[0291]实施例10
[0292]小鼠中的RSV中和测定法和RSV攻击研究
[0293]为了测试包含经修饰的HRSV F蛋白BV#683的疫苗对于阻止RSV感染的效率，在小鼠中进行了中和测定法和RSV攻击研究。实验过程示于图17。
[0294]对各小鼠组(η= 10)在第O日和第21日肌肉内注射(生活RSV除外)安慰剂(PBS溶液)、生活RSV (鼻内给药)、福尔马林失活的RSV疫苗(F1-RSV)、lug纯化的F颗粒(PFP,经修饰的F蛋白BV#683)、lug经纯化的F颗粒与明矾(PFP+明矾)、1ug经纯化的F颗粒、1ug经纯化的F颗粒与明矾(PFP+明矾)或30ug经纯化的F颗粒。在第42日(第二次免疫接种之后21日)用生活RSV攻击每个经免疫接种的组。将来自每个组的小鼠血清在第O日、第31日(第二次免疫接种之后10日)和第46日(用生活RSV攻击之后的4日)收获。
[0295]将来自每个处理组的小鼠血清就抗RSV中和抗体的存在进行测定。将来自经免疫接种的小鼠的血清的稀释与感染性RSV在96孔微滴定板中进行温育。将血清从1:20稀释至1:2560。将50ul经稀释的血清与50ul生活RSV病毒(400pfu)在每个孔中进行混合。病毒/血清混合物在室温首先温育60分钟，然后与10ul HEp-2细胞混合，并温育4日。然后在用结晶紫染色之后对感染性病毒空斑的数量进行计数。每个血清样品的中和效价定义为产生100% RSV中和(例如，无空斑)的血清最大稀释的倒数，并对于每个动物进行确定。将第31日(增强接种之后10日)和第46日(用生活RSV攻击之后4日)的血清中和抗体效价的几何平均值对于每个疫苗组进行作图。图18显示了中和测定法的结果。该结果表明1ug或30ug经纯化的F蛋白产生远高于生活RSV的中和效价。此外，与明帆佐剂共同施用增强了 PFP的中和效价。
[0296]进行了 RSV攻击研究以确定免疫接种是否可在经免疫接种的动物的肺中预防和/或抑制RSV复制。在经免疫接种的小鼠的肺中的RSV的量通过空斑测定使用HEp-2细胞进行确定。上述提及的经免疫接种的小鼠组用IxlO6Pfu的感染性长RSV株在第42日(第二次免疫接种之后11日)进行鼻内感染。在第46日(RSV感染之后4日)，将小鼠肺移除、称重并匀浆。澄清经匀浆的肺组织。将经澄清的溶液的上清稀释并对其进行使用HEp-2细胞的空斑测定以确定肺组织中的RSV效价(计算为pfu/g肺组织)。结果示于图19，表明所有用重组RSV F蛋白BV#683免疫接种的小鼠在肺中具有无法检测到的RSV，而甚至Iug不含佐剂的经纯化的重组HRSV F蛋白BV#683也展示优异的抑制RSV复制的效力(与安慰剂相比减少超过1000倍)。
[0297]为了确定上述使用的RSV PFP疫苗的稳定性，将疫苗在2_8°C储藏0、1、2、4和5周，然后通过经考马斯染色的SDS-PAGE进行分析(图20)。结果显示该RSV PVP疫苗在2-8 °C非常稳定，且并无可检测的降解。
[0298]实施例U
[0299]在棉鼠中的重组RSV F微团活性
[0300]在该实施例中，动物组包括在第O日和第21日用生活RSV(RSV)、福尔马林失活的RSV (F1-RSV)，含和不含铝的RSV-F蛋白BV#683 (PFP和PFP+铝佐剂)和PBS对照进行的免疫接种。
[0301]如图21所示，用30ug的F微团疫苗(RSV-F蛋白BV#683，即F蛋白683，SEQ IDNO:8)的免疫接种，无论含不含铝，均在暴露于RSV A和RSV B两者之后产生了强烈的中和抗体应答。此外，观察到铝显著增强了抗体应答。而且，分别在RSV A和RSV B中在第46或第49日进行的增强免疫之后，中和抗体增加。
[0302]尽管在用福尔马林失活的RSV(F1-RSV)免疫接种的大鼠中观察到显著的肺部病理状况，用F微团疫苗未观察到疾病的增强(图22)。F微团疫苗和含佐剂的F微团疫苗的使用产生了比初次RSV感染(PBS+RSV攻击)对照组(5.8)低的炎症评分(分别为4.0和2.8)。如上所示，经F1-RSV处理的组具有与初次RSV感染(PBS+RSV攻击)对照组相比更高的炎症评分(9.0对5.8)。而且，经F1-RSV处理的组与未经攻击的安慰剂对照、生活RSV+RSV攻击、F微团+RSV攻击、和F微团+铝+RSV攻击相比具有显著较高的平均炎症评分(9.0)。
[0303]实施例12
[0304]大鼠中RSV F纳米颗粒的临床前效力
[0305]检测棉鼠中RSV F纳米颗粒疫苗的效力。
[0306]在用RSV F疫苗土明矾的棉鼠中评估对RSV-A的中和抗体应答。
[0307]在一项研究中，棉鼠用以下处理组的一种免疫:
[0308](I)PBS ；
[0309](2) RSV ；
[0310](3)福尔马林失活的-RSV(F1-RSV)；
[0311](4) RSV F纳米颗粒疫苗(I μ g+明矾)
[0312](5) RSV F纳米颗粒疫苗(6 μ g+明矾)
[0313](6) RSV F纳米颗粒疫苗(30 μ g+明矾)
[0314]大鼠随后在第21日和第49日放血。在通过利用空斑-减少中和检测的中和测定法中检测来自第49日血清的抗RSV-Α。该实验的结果提供于图23中。图23为显示对比每个各自处理组的中和效价的图。每个处理组的线表明100%中和RSV-A病毒的终点效价的几何平均数。所述结果指示本发明的疫苗比RSV和F1-RSV更大程度地中和RSV。
[0315]在另一项研究中，棉鼠用以下处理组的一种免疫:
[0316](I)PBS ；
[0317](2) RSV;
[0318](3) F1-RSV ；
[0319](4) RSV F纳米颗粒疫苗(I μ g)
[0320](5) RSV F纳米颗粒疫苗(I μ g+明矾)
[0321 ] (6) RSV F 纳米颗粒疫苗(10 μ g)
[0322](7) RSV F纳米颗粒疫苗(10 μ g+明矾)
[0323](8) RSV F 纳米颗粒疫苗(30 μ g)
[0324]在第O日和第21日以I用上述处理组的一种免疫棉鼠。大鼠随后在第31日放血。在CPE测定法中检测来自所有组的血清的抗RSV-Α。图24显示对比所述各个接种群(X轴)的棉鼠中抗RSV-A的中和抗体应答，表示为Log2效价。本发明的疫苗比RSV和F1-RSV更大程度地中和RSV。另外，与明矾一起施于的纳米颗粒疫苗产生比无明矾的纳米颗粒疫苗更大量的中和效价。
[0325]在另一项实验中，棉鼠用以下处理组的一种免疫:
[0326](I)PBS ；
[0327](2) RSV ；
[0328](3) F1-RSV ；
[0329](4) RSV F纳米颗粒疫苗(I μ g)
[0330](5) RSV F纳米颗粒疫苗(I μ g+明矾)
[0331 ] (6) RSV F纳米颗粒疫苗(6 μ g)
[0332](7) RSV F纳米颗粒疫苗(6 μ g+明矾)
[0333](8) RSV F 纳米颗粒疫苗(30 μ g)
[0334](9) RSV F纳米颗粒疫苗(30 μ g+明矾)
[0335]在第O日和第21日用疫苗处理组(1)-(9)的一种免疫棉鼠，且随后在第49日用RSV A株病毒攻击。
[0336]在第54日收集肺组织(η = 8/组)。组织随后均质化且利用Hep_2单层空斑测定法检测感染性病毒而评估RSV的存在。图25显示由RSV F纳米颗粒引发的中和抗体对防止被攻击动物肺中RSV病毒复制是有效的。图25中，RSV效价表示为1glOpfu/每克肺组织。
[0337]也对用上述九个接种组处理的大鼠的血清进行ELISA测定法以测定抗-RSV抗体的有无。合并每个组中的动物血清且经过ELISA测定法。如通过ELISA单位(在4个参数适当的稀释曲线上对应于50%效价；图26A)或RSV-FIgG效价(图26B)测定的结果提供于图26A和26B。用本发明疫苗处理的动物比用RSV或F1-RSV处理的动物产生更多可检测的抗-RSV抗体。另外，明矾增强所述抗体应答。
[0338]通过确定能够对HEp-2细胞单层抑制100% RSV细胞病变活性的抗血清的稀释倍数在RSV中和测定法中评估抗-RSV F抗体的功能活性。用无佐剂的RSV F纳米颗粒的所有剂量的免疫导致RSV中和抗体的发生(图26C)。与所述抗-RSV F IgG的结果一致，磷酸铝佐剂的共同-给药提高RSV中和抗体的效价3.5-18倍。用活的RSV诱导的中和抗体效价可与低剂量RSF F佐剂组相比，且很可能一种组分直接针对RSV G蛋白。来自用福尔马林失活的RSV(F1-RSV)免疫的棉鼠的血清不展现中和活性(图26C ；F1-RSV)。
[0339]RSV F蛋白上的抗原性位点II已证明为帕利珠单抗的靶标，其为用于预防防止RSV疾病的人源化RSV中和单克隆抗体。为了确定抗体直接针对抗原性位点II是否是通过用RSV F纳米颗粒免疫而诱导，利用来自每个组内单个动物的合并血清完成帕利珠单抗竞争性ELISA。获自活的RSV处理的动物，F1-RSV免疫的动物或PBS对照动物的血清均不抑制帕利珠单抗结合(图26D)。相反，获自用RSV F纳米颗粒免疫的动物的血清池具有高水平的抑制帕利珠单抗结合RSV F的抗体(图26D)。对来自有或无磷酸铝佐剂的所有剂量的池获得该结果。这些数据表明RSV F蛋白以如帕利珠单抗相同的特异性刺激抗体。
[0340]鉬织病理学
[0341]还研究了用RSV攻击的棉鼠的组织病理学。棉鼠用以下接种组在第O日和第21日免疫:
[0342](I) RSV F 纳米颗粒疫苗(I μ g，6 μ g 或 30 μ g ;+/_ 明矾)
[0343](2) F1-RSV
[0344](3) RSV
[0345](4) PBS
[0346](5) PBS
[0347]来自组(1)-(4)的大鼠随后用RSV A株病毒在第49日攻击。来自组(5)的大鼠没有用所述病毒攻击。攻击5天后分离肺组织。冷冻组织，切片且用苏木精和伊红染色。提供代表性的显微图以指示对照动物和30μ g+明矾疫苗组中的细支气管周炎病情(图27)。
[0348]玻片以使用O至4得分(O =无；1 =最低的；2 =温和的；3 =中等的；4 =最高的炎症)对每一下列5个参数依次提高严重程度的盲方式评估:a)细支气管炎；b)脉管炎；c)支气管炎；d)齿槽炎和e)空隙局部急性肺炎(如Prince GA,等.(1986) JVirol57:721-728中所述)。5个参数的每种的汇总值加一起以获得对每个动物的单个总得分。每个组的总得分用于获得表示为算术平均值土SEM的总平均得分/组。
[0349]对各个试验组的组织病理学分析(表1)表明在随后用活病毒攻击后F1-RSV加剧炎症。F1-RSV的总组织病理学得分比用RSV攻击的非免疫动物观察到的明显更高(均值
5.63 ；p<0.0001，t检验)。相对于对照组，在任何有或无明矾的RSV F免疫组未观察到病理的显著增加。用RSV感染且用RSV攻击的棉鼠具有0.75的平均得分。其次最低的组织病理学得分1.13和1.43在分别用6 μ g或30 μ gRSV F纳米颗粒免疫的佐剂疫苗组中(表I)。这些数据表明佐剂RSV F纳米颗粒疫苗抑制RSV攻击后的肺炎症。
[0350]表1.免疫的棉鼠中肺部的组织病理学参数
[0351]
【权利要求】
1.一种呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白，其包含至少一种增加所述RSV F蛋白在宿主细胞中的表达的修饰或突变。
2.—种RSV F蛋白，其包含至少一种减少所述RSV F蛋白在宿主细胞中的细胞毒性的修饰或突变。
3.一种RSV F蛋白，其包含至少一种与未经修饰的RSV F蛋白相比增强所述RSV F蛋白的免疫原性的修饰或突变。
4.权利要求1-3任一项的RSVF蛋白，其中所述F蛋白进一步在对应于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO:2)的脯氨酸102残基的氨基酸位置包含氨基酸取代。
5.权利要求4的RSVF蛋白，其中所述脯氨酸102残基由丙氨酸残基取代。
6.权利要求4-5任一项的RSVF蛋白，进一步在对应于野生型RSV F蛋白(SEQ IDNO:2)的异亮氨酸379残基的氨基酸位置包含氨基酸取代。
7.权利要求6的RSVF蛋白，其中所述异亮氨酸379残基由缬氨酸残基取代。
8.权利要求4-7任一项的RSVF蛋白，进一步包含在对应于野生型RSV F蛋白(SEQ IDNO:2)的甲硫氨酸447残基的氨基酸位置包含氨基酸取代。
9.权利要求8的RSVF蛋白，其中所述甲硫氨酸447残基由缬氨酸残基取代。
10.权利要求1-9任一项的RSVF蛋白，其中所述RSV F蛋白呈棒棒糖状的形态。
11.权利要求4-10任一项的RSVF蛋白，其包含失活至少一个弗林蛋白酶剪切位点的突变。
12.权利要求11的RSVF蛋白，其中所述弗林蛋白酶剪切位点是主要剪切位点。
13.权利要求11-12任一项的RSVF蛋白，其中所述至少一个弗林蛋白酶剪切位点的失活是通过在对应于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO: 2)的精氨酸133、精氨酸135和精氨酸136的位置导入至少一个氨基酸取代而实现的。
14.权利要求13的RSVF蛋白，其中在对应于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO:2)的精氨酸133、精氨酸135和精氨酸136的位置导入至少两个氨基酸取代。
15.权利要求14任一项的RSVF蛋白，其中在对应于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO: 2)的精氨酸133、精氨酸135和精氨酸136的位置导入三个氨基酸取代。
16.权利要求13-15任一项的RSVF蛋白，其中所述精氨酸133残基由谷氨酰胺取代。
17.权利要求13-16任一项的RSVF蛋白，其中所述精氨酸135残基由谷氨酰胺取代。
18.权利要求13-17任一项的RSVF蛋白，其中所述精氨酸136残基由谷氨酰胺取代。
19.权利要求4-18任一项的RSVF蛋白，其中所述RSV F蛋白进一步包含至少一个对F2的隐含多聚(A)位点的修饰。
20.权利要求4-19任一项的RSVF蛋白，其中所述RSV F蛋白进一步包含在对应于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO: 2)的约氨基酸137-146的融合域N端一半中的缺失。
21.权利要求1-3任一项的RSVF蛋白，其中所述修饰或突变选自下组: (i)至少一个弗林蛋白酶剪切位点的失活； (ii)F2的隐含多聚(A)位点的修饰；和 (iii)在对应于野生型RSVF蛋白(SEQ ID NO: 2)的约氨基酸137-146的融合域N端一半中的缺失。
22.权利要求1-3任一项的RSVF蛋白，其中所述RSV F蛋白携带至少两个选自下组的突变: (i)至少一个在对应于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO:2)的脯氨酸102、异亮氨酸379和甲硫氨酸447的位置的氨基酸取代； (?)至少一个弗林蛋白酶剪切位点的失活； (iii)F2的隐含多聚(A)位点的修饰；和 (iv)在对应于野生型RSVF蛋白(SEQ ID NO: 2)的约氨基酸137-146的融合域N端一半中的缺失。
23.权利要求1-3任一项的RSVF蛋白，其中所述RSV F蛋白携带至少三个选自下组的突变: (i)至少一个在对应于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO:2)的脯氨酸102、异亮氨酸379和甲硫氨酸447的位置的氨基酸取代； (?)至少一个弗林蛋白酶剪切位点的失活； (iii)F2的隐含多聚(A)位点的修饰；和 (iv)在对应于野生型RSVF蛋白(SEQ ID NO: 2)的约氨基酸137-146的融合域N端一半中的缺失。
24.权利要求1-3任一项的RSVF蛋白，其中所述RSV F蛋白携带四个选自下组的突变: (i)至少一个在对应于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO:2)的脯氨酸102、异亮氨酸379和甲硫氨酸447位置的氨基酸取代； (?)至少一个弗林蛋白酶剪切位点的失活； (iii)F2的隐含多聚(A)位点的修饰；和 (iv)在对应于野生型RSVF蛋白(SEQ ID NO: 2)的约氨基酸137-146的融合域N端一半中的缺失。
25.权利要求21-24任一项的RSVF蛋白，其中所述RSV F蛋白在对应于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO: 2)的脯氨酸102、异亮氨酸379和甲硫氨酸447的位置携带至少两个氨基酸取代。
26.权利要求21-25任一项的RSVF蛋白，其中所述RSV F蛋白在对应于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO: 2)的脯氨酸102、异亮氨酸379和甲硫氨酸447的位置携带三个氨基酸取代。
27.一种RSV F蛋白，由选自下组的核酸序列编码:SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ IDNO:7 和 SEQ ID NO:9。
28.—种RSV F蛋白，其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQID NO:8 和 SEQ ID NO:10。
29.权利要求1-28任一项的RSVF蛋白，其中所述RSV F蛋白在宿主细胞中与野生型RSV F蛋白相比展现表达增加。
30.权利要求1-29任一项的RSVF蛋白，其中所述RSV F蛋白与野生型RSV F蛋白相比展现增强的免疫原性。
31.权利要求1-30任一项的RSVF蛋白，其中所述宿主细胞是真核细胞。
32.权利要求31的RSVF蛋白，其中所述真核细胞是昆虫细胞。
33.权利要求32的RSVF蛋白，其中所述昆虫细胞是Sf9细胞。
34.权利要求1-33任一项的RSVF蛋白，其中所述RSV F蛋白来源于选自下组的RSV株:人RSV A株、人RSV B株、牛RSV株和禽RSV株。
35.一种纯化的微团，其包含一种或多种权利要求1-34任一项的RSV F蛋白。
36.一种病毒样颗粒(VLP)，其包含权利要求1-34任一项的RSV F蛋白。
37.权利要求36的VLP，进一步包含基质(M)蛋白。
38.权利要求37的VLP，其中所述M蛋白来源于人RSV株。
39.权利要求37的VLP，其中所述M蛋白来源于牛RSV株。
40.权利要求37的VLP，其中是M蛋白是来自流感病毒株的Ml。
41.权利要求40的VLP，其中所述流感病毒株是禽流感病毒株。
42.权利要求41的VLP，其中所述禽流感病毒株是H5N1株。
43.权利要求42的VLP，其中所述H5N1株是A/Indonesia/5/05。
44.权利要求37的VLP，其中所述M蛋白来源于新城疫病毒(NDV)株。
45.权利要求36-44任 一项的VLP，进一步包含RSV糖蛋白(G)。
46.权利要求36-45任一项的VLP，进一步包含RSV糖蛋白(SH)。
47.权利要求36-46任一项的VLP，进一步包含RSV核壳蛋白(N)。
48.权利要求36-47任一项的VLP，其中所述VLP在真核细胞中在允许VLP形成的条件下表达。
49.权利要求49的VLP，其中所述真核细胞选自下组:酵母、昆虫、两栖类、禽类、哺乳动物或植物细胞。
50.一种免疫原性组合物，其包含权利要求1-34任一项的RSV F蛋白。
51.一种免疫原性组合物，其包含权利要求35的纯化的微团。
52.一种免疫原性组合物，其包含权利要求36-49任一项的VLP。
53.—种药学上可接受的疫苗组合物，其包含权利要求1-34任一项的RSV F蛋白，其中所述RSV F蛋白能够在宿主中引发免疫应答。
54.一种药学上可接受的疫苗组合物，其包含权利要求35的纯化的微团，其中所述微团能够在宿主中引发免疫应答。
55.一种药学上可接受的疫苗组合物，其包含权利要求36-49任一项的VLP，其中所述VLP能够在宿主中引发免疫应答。
56.—种针对病毒感染对人受试者进行免疫接种的试剂盒，其包含权利要求1-34任一项的RSV F蛋白。
57.—种针对病毒感染对人受试者进行免疫接种的试剂盒，其包含权利要求35的纯化的微团。
58.—种针对病毒感染对人受试者进行免疫接种的试剂盒，其包含权利要求36-49任一项的VLP。
59.权利要求54-56任一项的试剂盒，其中所述病毒感染是RSV感染。
60.一种针对病毒感染对哺乳动物进行疫苗接种的方法，其包括将权利要求1-34任一项的RSV F蛋白在药学上可接受的配制物中施于人受试者。
61.—种针对病毒感染对哺乳动物进行疫苗接种的方法，其包括将权利要求35的纯化的微团在药学上可接受的配制物中施于人受试者。
62.—种针对病毒感染对哺乳动物进行疫苗接种的方法，其包括将权利要求36-49任一项的VLP在药学上可接受的配制物中施于人受试者。
63.权利要求60-62任一项的方法，其中所述药学上可接受的配制物包含佐剂。
64.权利要求63的方法，其中所述佐剂是非磷脂脂质体。
65.一种针对病毒感染产生免疫应答的方法，其包括将权利要求1-34任一项的RSV F蛋白在药学上可接受的配制物中施于人受试者。
66.一种针对病毒感染产生免疫应答的方法，其包括将权利要求35的纯化的微团在药学上可接受的配制物中施于人受试者。
67.一种针对病毒感染产生免疫应答的方法，其包括将权利要求36-49任一项的VLP在药学上可接受的配制物中施于人受试者。
68.一种分离的核酸，其编码权利要求1-30任一项的RSV F蛋白。
69.一种分离的细胞，其包含权利要求68的核酸。
70.—种载体,其包含权利要求68的核酸。
71.一种制备RSV F蛋白的方法，其包括: (a)转化宿主细胞以表达权利要求68的核酸；和 (b)在有助于所述RSVF蛋白产生的条件下培养所述宿主细胞。
72.—种制备RSV F蛋白微团的方法，其包括: (a)转化宿主细胞以表达权利要求68的核酸；和 (b)在有助于所述RSVF蛋白微团产生的条件下培养所述宿主细胞。
73.权利要求71-72任一项的方法，其中所述宿主细胞是昆虫细胞。
74.权利要求73的方法，其中所述昆虫细胞是用包含权利要求68的核酸的杆状病毒载体转染的昆虫细胞。
75.一种预防在动物肺中病毒复制的方法，包括将权利要求1-34任一项的RSV F蛋白施用至所述动物。
76.权利要求75的方法，其中所述RSVF蛋白肌内施用。
【文档编号】A61K39/155GK104080476SQ201280059282
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2012年9月27日 优先权日:2011年9月30日
【发明者】G.史密斯, 吴颖运, M.马萨尔, 刘晔 申请人:诺瓦瓦克斯股份有限公司