用于光动力疗法的新型光免疫偶联物的制作方法
【专利摘要】一种化合物，包括：·光敏剂，其共价结合于·选自下组的蛋白抗体或其衍生物或其片段、合成肽，如scFv、模拟表位·其结合于CD抗原、细胞因子受体、白介素受体、激素受体、生长因子受体，尤其是ErbB家族的酪氨酸激酶生长因子受体，其中·所述光敏剂与蛋白的结合通过O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(hAGTm)，其为经修饰的人DNA修复蛋白。
【专利说明】用于光动力疗法的新型光免疫偶联物 发明领域
[0001] 光动力疗法（PDT)是一种非常有前景的微创癌症治疗手段。引入改良的光敏剂以 及临床应用方案后，已有数个经FDA批准的PDT药物可用，而其他的（药物）则处于临床前 和临床开发1的多个阶段中。无害光线直接激活后，光敏药物可变得具有细胞毒性而发挥 其作用；或在非直接激活后，在原位启动产生毒性自由基或活性氧（R0S)从而发挥其作用。 这些过程能造成细胞的破坏，并最终通过凋亡或坏死 2诱导细胞的死亡。细胞破坏的部位 取决于光敏剂的种类、温育周期以及递送方式。疏水性光敏剂常常破坏细胞膜，而阳离子光 敏剂则在膜囊泡（如线粒体）中积聚并导致局部的破坏 3。
[0002] PDT的一个最大挑战在于其缺乏靶向特异性。在由光照激活后，光敏剂在破坏肿瘤 组织的同时也破坏健康组织，这会造成长期的皮肤光敏 4。为了提高PDT的特异性，将光敏 剂偶联于肿瘤特异性单克隆抗体或单链抗体片段（scFv)，从而产生了能够直接将光敏剂递 送到肿瘤组织的所谓光免疫偶联物。这个方法称作光免疫疗法（PIT) 5。标准的偶联反应并 不适用于光敏剂和抗体的偶联，因为尚无一个可靠的方式来确定抗体-光敏剂的偶联能以 最佳的化学计量比 6产生。此外，光敏剂的化学性质（例如，疏水性，以及带电基团的数量 和排列）能够改变抗体的药代动力学性质以及生物分布，并最终导致非特异性结合以及内 化行为。随机的偶联也可引发光敏剂激发态的自淬灭，从而降低光动力活性 5。因此，需要 更可控的偶联反应来克服这些限制。
[0003] PDT的一个主要缺陷在于经激活的光敏剂的非选择性效应，其常常同时破坏健康 细胞和肿瘤细胞。利用抗体的靶向疗法彻底改变了癌症治疗，数个结合于肿瘤细胞抗原的 抗体已经造成了轰动的效应。将额外的效应分子（例如，放射性核素、药物或毒素） 7共价 连接于治疗性抗体能增强其效果，因为这能实现选择性递送，并降低通常与小分子药物8相 关的全身性毒性反应。相同的理论也适用于光敏剂。效应分子通常利用半胱氨酸残基上的 还原巯基或赖氨酸侧链的氨基基团与抗体相连。然而，这两种方法都会产出异质性的产物， 包括在不同位点连接效应分子的偶链抗体混合物，以及连接各抗体的效应分子数量各异， 从而导致摩尔比是一范围，以及极为不同的药代动力学、效力以及安全性特征。
[0004] 通过纯化含有2、4、8个一甲基奥瑞他汀E(MMAE)偶联分子的三种抗体部分， Hamblett和其同事9研究了异质性抗体药偶联物的毒性、药代动力学性质以及治疗效率。含 有8个MMAE基团的部分较其他部分而言耐受性较差，清除较快，并显示出最低的效率。这 提示了抗体药偶联物的关键设计参数是连接于抗体的药物分子数量。然而，即使携带相同 数量药物分子的纯化抗体依然会构成复杂的混合物，因为具有许多不同的结合位点。例如， 通常一个抗体中约有40个赖氨酸残基，这可能导致大于一百万个不同的偶联抗体种类。相 似地，半胱氨酸残基有1-8个，通常会生成约100个不同的偶联变体。每一个抗体药偶联物 通常都会显现出独特的、不可预测的药代动力学特征 9。
[0005] 发明概述
[0006] 光敏性药物暴露在无害光线下所引起的毒性效应能够杀灭癌细胞，但这也会对周 围健康细胞造成巨大损伤。通过将光敏性药物偶联于特异性结合肿瘤相关细胞表面抗原的 抗体和抗体片段，能使光动力疗法的特异性有所提高。然而，标准偶联反应所产生的异质性 产物却削弱了其靶向特异性和（作用）谱特性。
[0007] 在本发明中，利用结合于表皮生长因子（EGFR)的抗体片段（scFv-425)作为模型 来研究采用SNAP-标签融合作为改良的偶联方法。scFv-425-SNAP-标签融合蛋白能够特异 性结合光敏剂，例如经节基鸟噪呤（〇6-benzylguanine)修饰的二氢卩卜吩e6(chlorin e6)， 从而生成特异性递送至EGFR+癌细胞并引起显著的肿瘤细胞特异性细胞毒的异质性产物。 (本文）讨论了我们的研究结果对光动力疗法发展的影响。
[0008] 本发明提供了一种化合物，其包括：共价结合于结合结构的光敏剂，所述结合结 构选自下组：抗体或其衍生物或其片段、合成肽（如scFv)、模拟表位（其结合结构结合 于CD抗原）、细胞因子受体、白介素受体、激素受体、生长因子受体、尤其是ErbB家族的酪 氨酸激酶生长因子受体，其中，所述光敏剂通过经修饰的人类DNA修复蛋白06-烷基鸟嘌 呤-DNA-烷基转移酶（hAGTm)而结合于内化受体结合蛋白。
[0009] 在本发明的一个实施例中，表皮生长因子受体结合蛋白是scFv抗体片段，尤其是 如SEQ ID NO. : 1所示的scFv抗体片段，编码其的多核苷酸序列如SEQ ID N0. :2所示。 [0010] 在本发明的另一实施例中，本发明化合物包括或具有氨基酸序列SEQ ID N0. :3， 编码其的多核苷酸序列如SEQ ID NO. :4所示。
[0011] 在本发明的又一实施例中，本发明化合物中光敏剂偶联于06-烷基鸟嘌呤-DNA烷 基转移酶的活性位点。
[0012] 在本发明的化合物中，所示的光敏剂选自下组：吓啉、叶绿素以及具有光敏能力的 染料。
[0013] 本发明的主题还在于一不含光敏剂的化合物。所示化合物包括选自下组的结合 蛋白：抗体或其衍生物、或其片段、合成多肽（如scFv)、模拟表位（其结合蛋白结合于CD 抗原）、细胞因子受体、白介素受体、激素受体、生长因子受体，尤其是ErbB家族的酪氨酸 激酶生长因子受体，其通过经修饰的人类DNA修复蛋白06-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶 (hAGTm)偶联于内化受体结合蛋白。
[0014] 特别地，所述结合蛋白是scFv抗体片段，尤其是如SEQ ID N0. :1和/或SEQ ID NO. :3所述的scFv抗体片段。该化合物可由SEQ ID NO. :2和/或SEQ ID NO. :4所示的多 核苷酸编码。具体的实施例即结合于ErbB家族的酪氨酸激酶生长因子受体。
[0015] 所述化合物的具体实施例即由核苷酸序列如SEQ ID N0. :5所示的多核苷酸编码。
[0016] 本发明的另一主题在于制备本发明化合物的方法，包括步骤：将06-鸟嘌呤-DNA 烷基转移酶（hAGTm)与选自下组的结合蛋白融合：抗体或其衍生物或其片段、合成肽如 scFv、模拟表位，其结合蛋白结合于CD抗原、细胞因子受体、白介素受体、激素受体、生长因 子受体，尤其是ErbB家族的酪氨酸激酶生长因子受体。具体地，将scFv-425 DNA序列插 入真核细胞表达载体PMS-SNAP中经SiFI和Notl消化的位点，从而提供N末端结合配体 (scFv-425)和C末端SNAP-标签序列。
[0017] 具体地，还将His6标签与蛋白相融合。融合蛋白可在人体细胞中表达，尤其是胚肾 细胞系中，例如HEK-293T细胞（ATCC:CRL-11268)，并利用该标签的亲和树脂（例如，Ni-NTA 修饰树脂）进行纯化。
[0018] 本发明的另一主题是下式所示的卟啉衍生物
[0019]
【权利要求】
1. 一种化合物，包括： ?光敏剂，其共价结合于 ?选自下组的蛋白 抗体或其衍生物或其片段、合成肽，如SCFv、模拟表位 ?其结合于CD抗原、细胞因子受体、白介素受体、激素受体、生长因子受体，尤其是ErbB 家族的酪氨酸激酶生长因子受体，其中 ?所述光敏剂与蛋白的结合通过 06-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶（hAGTm)，其为经修饰的人DNA修复蛋白。
2. 如权利要求1所述的化合物，特异性靶向于内化和疾病特异性细胞表面受体。
3. 如权利要求1或2所述的化合物，其特征在于，所述酪氨酸激酶生长因子受体结合 蛋白是scFv抗体片段，尤其是如SEQ ID N0. :1所示的scFv抗体片段，其由SEQ ID N0. :2 所示的多核苷酸序列编码。
4. 如权利要求1-3所述的化合物，氨基酸序列如SEQ ID N0. :3所示，其由SEQ ID NO. :4所示的多核苷酸序列编码。
5. 如权利要求1-4所述的化合物，其特征在于，所述的光敏剂偶联于06-烷基鸟嘌 呤-DNA烷基转移酶的活性位点。
6. 如权利要求1-4所述的化合物，其特征在于，光敏剂选自下组：吓啉、叶绿素和染料。
7. -种化合物，包括 选自下组的结合蛋白：抗体或其衍生物或其片段、合成肽，如scFv、模拟表位，其结合 于CD抗原、细胞因子受体、白介素受体、激素受体、生长因子受体，尤其是ErbB家族的酪氨 酸激酶生长因子受体，并共价结合于称为06-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶（hAGTm)的经修 饰的人DNA修复蛋白。
8. 如权利要求7所述的化合物，其特征在于，所述的结合蛋白是scFv抗体片段，尤其是 SEQ ID NO. : 1和/或SEQ ID N0. :3所示的scFv抗体片段。
9. 权利要求7所述化合物的编码多核苷酸序列，尤其包括SEQ ID N0. : 2和/或SEQ ID NO. :4.
10. 权利要求1所述化合物的编码多核苷酸，核苷酸序列如SEQ ID NO. :5所示。
11. 制备权利要求7所述化合物的方法，包括步骤：将06-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶 (hAGTm)与选自下组的蛋白融合：抗体或其衍生物或其片段、合成肽，如scFv、模拟表位，结 合蛋白结合于CD抗原、细胞因子受体、白介素受体、激素受体、生长因子受体，尤其是ErbB 家族的酪氨酸激酶生长因子受体。
12. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，将scfv-425 DNA序列插入真核表达载体 pMS-SNAP中经Sifl和Notl消化的位点，从而提供N-末端结合配体（scFv-425)和C-末端 SNAP-标签序列。
13. 如权利要求11或12所述的方法，其特征在于，在人胚肾细胞系，尤其是HEK-293T 细胞（ATCC:CRL-11268)中表达 scFv-425-SNAP 融合蛋白。
14. 如权利要求11-13中任一所述的方法，其特征在于，采用亲和层析，尤其是Ni-NTA 亲和层析自无细胞上清液中纯化所述scFv-425-SNAP融合蛋白。
15. 如下式所示的卟啉衍生物
并与权利要求7所述的化合物偶联。
16. 制备权利要求15所述化合物的方法，其特征在于，η卜啉光敏剂，如二氢η卜吩e6的羧 基至少部分与活化的酯反应，或通过偶联剂，然后与06-苄基鸟嘌呤、02-苄基胞嘧啶或辅 酶A(C 〇A)反应。
17. 如权利要求16所述的方法，其特征在于，06-苄基鸟嘌呤、02-苄基胞嘧啶或辅酶 A(C〇A)偶联于连接分子，例如PEG-24-NH2和/或通过琥珀酰亚胺，如NHS或偶联剂形成所 述活化的酯，所述偶联剂选自下组：碳化二亚胺，如EDC、EDAC和DCC。
18. -种药物，其含有权利要求1-8中至少一项所述的化合物，和药学上可接受的佐 齐U，以便改进光免疫疗法相关的药学效应或可能赋予这种效应。
19. 权利要求1-8中至少一项所述的化合物的用途，用于通过光免疫疗法治疗癌症。
【文档编号】A61K47/48GK104203286SQ201280071458
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2012年3月21日 优先权日:2012年3月21日
【发明者】S·巴思, M·K·图尔, A·哈辛 申请人:德国弗劳恩霍夫协会债权安格万特学术研究所, 亚琛工业大学