专利名称：一种含有TGF-β1 siRNA的细胞微泡的应用的制作方法
—种含有TGF-P IsiRNA的细胞微泡的应用技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种含有TGF-e IsiRNA的细胞微泡的应用。
背景技术：
转化生长因子P (transforming growth factor beta, TGF-P)属于一类多功能多肽性的生长因子超家族。该家族主要包括转化生长因子P (TGF-P)、骨形成蛋白(bone morphology protein,BMP)、生长转化因子(growth and differentiation factors,GDF)、缪氏抑制因子(Mullerian inhibitory factor, MIF)和激活素(Activins) / 抑制素(inhibins)等，其中在哺乳动物细胞中，TGF-P主要包括TGF-^ 1、TGF-3 2和TGF- ^ 3三种亚型，其中TGF-P I与肿瘤的发生发展密切相关。其主要表现为以下几个阶段:(I)在肿瘤发生的初期，由于TGF-P可使细胞停滞在Gl期或延长Gl期，进而可作为肿瘤抑制物抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的分化和凋亡；(2)在肿瘤发展的中期阶段，此时肿瘤细胞及肿瘤微环境中的基质细胞都可自分泌产生TGF-P，且TGF-P对肿瘤细胞的增殖抑制作用降低或消失，进而导致肿瘤细胞急剧分裂增殖；(3)到了肿瘤发生的晚期，此时微环境中的TGF-P含量增加，并且它作为一促进肿瘤的细胞因子发挥功能，即:可通过刺激血管生成、促进癌细胞扩散、逃避免疫细胞的监视及促进肌成纤维细胞的形成，进而合成细胞外基质等促进肿瘤细胞的生长、 浸润和转移。
此外，除了 TGF-P外，TGF-P信号通路中的受体及信号通路下游的smad蛋白复合物也都已成为近年来研究肿瘤的热点对象。鉴于TGF-P及其信号通路中的成员在致癌过程中的作用，目前它们已被作为有力的治疗靶点，用于治疗肿瘤。如:针对TPR的可溶性蛋白受体抑制剂、针对三种TGF- ^单体的抗体和siRNA抑制剂、针对TPRI激酶的小分子抑制剂及针对TGF-P 2的疫苗等。
上述的抑制剂虽在治疗肿瘤方面取得了突破性的进展，但运用TGF-P siRNA作为基因类药物在生物体内进行肿瘤治疗时，仍存在以下缺点，如:容易被核酸酶降解、稳定性较差、细胞内转染效率低、安全性不明确等。因而，运用TGF-P及其通路中的信号分子的寡聚核苷酸治疗肿瘤的方法还有待于进一步改进。
细胞微泡(Microvesicles (MVs))是一类在正常和病理状态下，机体细胞都可分泌的一种小囊泡，其直径约为30 lOOOnrn。该类微小囊泡大都是具双层膜结构的球状小泡，且除了在其膜表面有蛋白分布外，在球状小泡的内部也含有一些蛋白、mRNA、miRNA和细胞因子等物质。目前发现，micixwesicles不仅可与其周围的靶细胞相互作用，也可通过脉管系统作用于较远的组织细胞。当MVs与其靶细胞相互作用发生融合后，便可将其包裹转运的诸如细胞因子、趋化因子、酶、核酸、生长因子和信号分子等物质释放到受体细胞内部。这些生物分子在细胞的增殖、分化、凋亡等过程中发挥作用。发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种含有TGF-P IsiRNA的细胞微泡的应用。
本发明的另一目的是提供一种抑制肿瘤的药物。
本发明的目的可通过如下技术方案实现:
包裹TGF-P IsiRNA的细胞微泡在制备抑制肿瘤的药物中的应用。
其中，所述的肿瘤为TGF-P表达较高的肿瘤。
所述的TGF-@ IsiRNA 优选反义链序列为 SEQ ID N0.1 的 TGF-@ IsiRNA。
所述的细胞微泡来源于细胞或组织的分泌，优选来源于L929细胞的分泌。
一种抑制肿瘤的药物，所述的药物为包裹TGF-P IsiRNA的细胞微泡。
所述的肿瘤为TGF-P表达较高的肿瘤。
所述的TGF-P IsiRNA的反义链序列优选SEQ ID N0.1。
所述的细胞微泡来源于细胞或组织的分泌，优选来源于L929细胞的分泌。
本发明中所述的包裹TGF- P IsiRNA的细胞微泡(microvesicles)可通过将TGF-^ IsiRNA利用本领域常规手段转染细胞，并提取细胞培液中的microvesicles所得。microvesicles的提取也是本领域的常规技术手段。
有益效果:
本发明所述 的microvesicles是生物细胞自身分泌的、可作为运载体转运蛋白、核酸及其他物质的小囊泡。并且，尤为重要的是，Microvesicles作为TGF-P IsiRNA的运载工具，同其他运载体相比，在治疗肿瘤方面主要表现为以下几方面的优点:(1)由于microvesicles是机体细胞自身分泌的，因而相对于病毒、脂质体纳米颗粒和多聚纳米颗粒这些外源性运载体转运siRNA而言，microvesicles转运体在循环系统中不易被调理素(opsonins)、补体(complement)、凝集因子(coagulation factor)或抗体识别予以清除，从而保证TGF-0 IsiRNA在循环系统中的稳定性；(2)细胞分泌的microvesicles经膜融合或内吞作用将包裹转运的TGF-P IsiRNA释放到肿瘤细胞中，通过直接与目的基因TGF-^ I结合发挥功能，从而减少了 siRNA分子的突变，保证siRNA作用的有效发挥；优于TGF-P IsiRNA，本发明TGF-P IMVs在体内可明显抑制小鼠肿瘤的生长及提高小鼠的存活率；(3)同其他运载体相比，microvesicles转运体不易引起机体的免疫反应,具有更好的生物安全性。因而，运用microvesicles运载体进行物质转运有助于降低用其在临床上治疗疾病时对患者造成的一系列不良后果和伤咅。
图1本发明细胞分泌的MVs包裹TGF-P IsiRNA在体内外抑制肿瘤生长的主要流程。
图2显示鉴定TGF-P三种变体在小鼠纤维肉瘤细胞S180中的相对含量的结果。
图3显示以TGF-P I为靶标，合成其siRNA转染S180，筛选干扰效率较好的一种siRNA的结果。
图4显示以筛选出来的干扰效率较好的一种TGF-P IsiRNA转染L929细胞后，收取细胞的MVs (TGF-^ IMV)与S180细胞共培养24h，检测S180细胞中TGF-P I表达的结果。
图5显示TGF-P IMV与S180细胞共培养24h，检测S180细胞的凋亡和生长的结果。
图6显示给小鼠皮下植瘤，将肿瘤生长均一的小鼠进行分组，随后分别经尾静脉注射TGF-P IMV及其他对照组，于不同时间点检测小鼠血细胞及肿瘤组织中TGF-P IsiRNA含量的结果。
图7显示经尾静脉注射TGF-P IMV及其他对照组后，各组小鼠肿瘤组织的大小、生长速率及重量的结果。
图8显示经尾静脉注射TGF- ^ IMV及其他对照组后，各组小鼠肿瘤组织中TGF- ^ I表达的结果。
图9显示经上述处理小鼠后，各组小鼠血清中TGF- ^ I的含量及各组小鼠存活率的结果。
图10显示经上述处理小鼠后，各组小鼠肿瘤组织中TGF-P信号通路下游的磷酸化smad2蛋白表达的结果。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1以S180为研究对象，检测该细胞中TGF-P三种变体的表达水平
使用qRT-PCR和Western blot技术发现并证明了在小鼠纤维肉瘤S180 (购于中科院上海细胞库(所))中TGF-P I的表达最高。具体步骤为:
1.qRT-PCR
(I) Trizol法提取组织或细胞总RNA
a)将适量组织或细胞溶于Iml RNA提取试剂Trizol中，后加入200ul氯仿，充分震荡，室温静置5min后4°C、12，000g离心15min ；
b)小心吸取上清液加入到等体积的异丙醇中，充分混匀后_20°C静置30min，12，000g，4°C离心 20min ；
c)充分弃上清后，加入75%DEPC-乙醇Iml，轻柔颠倒数次，12，000g, 4 °C离心IOmin ；
d)充分弃上清，室温干燥后，加入适量的DEPC水溶解沉淀，得到RNA样品。
(2)制备cDNA样品:将上一步得到的RNA样品通过RNA逆转录反应得到cDNA:
逆转录的反应体系包括2 U 15 X AMV buffer、I U IlOmM each dNTP mixture(Takara 公司)、 0.1 AMV (Takara 公司)、0.25 y I RRI (Takara 公司)、3.75ul DEPC 水、0.5u I oligodT(Takara 公司)以及 2ul(lii g)RNA 样品。反应步骤为 42°C 反应 60min，72°C孵育 IOmin0 (3)qRT-PCR:用 20ii I 体系进行 qRT-PCR，体系包括 13.4u I H2O, 2 U 110 X PCRbuffer (Takara 公司)，1.6 u 125mM MgCl2 (Takara 公司)，0.4 u IlOmM each dNTP mixture(Takara 公司)，I u I SYBR Green (Takara 公司)0.2 U I Taq 酶(Takara 公司)，0.4 U I 正反向引物(分另Ij为TGF- P 1、TGF- P 2、TGF- P 3和P -actin的正反向引物，见表I)(Invitrogen公司)，lyl 00嫩。所用的仪器是481 Prism7300荧光定量PCR仪，PCR的反应条件是:95°C、5min进行I个循环一95°C、15s，58°C、30s，72°C、30s进行40个循环一融解曲线。
(4)数据分析与处理:扩增结束后根据扩增曲线设定统一的阈值，随后根据A ACT法处理数据，即:CT设为反应达到域值时的循环数，则TGF- ^ mRNA相对于标准内参3-actin的表达量可以用方程2-A CT表示，其中A CT=CT样品-CT内参，结果见图2-A。
2.Western blot
(I)蛋白样品的制备:
a)在细胞或组织块中加入适量的裂解液，若是组织则需在冰上研磨至组织破碎，然后在冰上适当超声，12，000g，4°C离心15min ；
b)小心吸取上清，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，加入SDS-PAGE上样缓冲液，100°C孵育5min，样品保存在-20°C或_70°C中。
(2)制胶与电泳:
a)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶；
b)按配方配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶，然后胶上加一层无水乙醇封胶；
c)当分离胶凝好后，按照配方配制浓缩胶，将剩余空间灌满浓缩胶然后插入梳子。待月父凝固后开始电泳。
(3)转膜与封闭:
a)将电泳完毕后的胶切割好，浸泡在转膜缓冲液中；
b)将PVDF膜剪好，用甲醇活化15s，浸泡在转膜缓冲液中；
c)按照(_)海绵一胶一膜一海绵(+ )的顺序，做好夹板，按照300mA电流转1.5h，整个过程要在冰上进行；
d)结束后取出膜，按照分子量大小将相应的条带剪下，在5%的脱脂牛奶中封闭Ih0
(4)免疫标记及显影:
a)按照1:1000的比例稀释抗体，与膜在4°C共孵过夜；
b)取出膜用清洗缓冲液清洗4遍,每遍10_15min ；
c)按照1:2000的比例稀释抗体，与膜在室温下共孵Ih ；
d)按照比例混合发光底物，与膜共孵lmin，将膜放入暗盒中进入暗室曝光，结果见图2-B。随后运用Bandscan软件对各个目的条带进行灰度分析，结果见图2-C。我们得出:在S180细胞中TGF-P I表达量最高。
表I
权利要求
1.包裹TGF-PIsiRNA的细胞微泡在制备抑制肿瘤的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为TGF-P表达较高的肿瘤。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的TGF-PIsiRNA的反义链序列为SEQID N0.1。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的细胞微泡来源于细胞或组织的分泌。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的细胞微泡来源于L929细胞的分泌。
6.一种抑制肿瘤的药物，其特征在于所述的药物为包裹TGF-P IsiRNA的细胞微泡。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于所述的肿瘤为TGF-P表达较高的肿瘤。
8.根据权利要求6所述的药物，其特征在于所述的TGF-PIsiRNA的反义链序列为SEQID N0.1。
9.根据权利要求6所述的药物，其特征在于所述的细胞微泡来源于细胞或组织的分泌。
10.根据权利要求 9所述的药物，其特征在于所述的细胞微泡来源于L929细胞的分泌。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及一种含有TGF-β1siRNA的细胞微泡的应用。一种抑制肿瘤的药物，所述的药物为包裹TGF-β1siRNA的细胞微泡。包裹TGF-β1siRNA的细胞微泡在制备抑制肿瘤的药物中的应用。本发明针对肿瘤中高表达的TGF-β1设计并合成其siRNA，转染细胞后通过提取细胞分泌的包裹siRNA的microvesicles，经静脉注射入皮下植瘤小鼠模型的体内，对小鼠肿瘤的生长具有明显的抑制作用，使得RNAi在体内功能有效发挥提供了帮助，同时也为临床上治疗肿瘤及其他疾病提供支持。
文档编号A61K47/46GK103212090SQ20131013709
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月18日 优先权日2013年4月18日
发明者曾科, 张亚琴, 李丽民, 顾宏伟, 朱地罕, 俞健雄, 张辰宇 申请人:南京大学