专利名称：一种组织工程神经移植用导管及其制备方法
技术领域：
本发明涉及高分子材料生物医学应用领域，具体涉及一种含有取向纳米纤维可梯度降解的神经移植导管及其制备方法。
背景技术：
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失神经支配会导致支配区域感觉和运动功能障碍，不同程度上影响患者的生活质量。自体神经移植是最基本、安全和有效的方法，临床上自体移植恢复率可达到80%。但自体移植属二次手术，供体来源有限，组织结构和尺寸难匹配，移植供区长期失神经支配，移植疗效存在差异等缺陷，极大限制了自体神经移植的广泛开展。
应用组织工程方法制备人工神经是理想的选择，人工神经移植物主要采用导管桥接神经断端，引导和支持神经再生。人工神经的结构、生物相容性、降解率和机械强度等对轴突再生能力产生重要影响，因此开发合适的引导神经再生的材料成为神经修复组织工程的研究重点。
通过静电纺丝技术构建的纳米纤维材料支架材料能够产生表明效应，其特有的高比表面积与高孔隙率能够模仿天然细胞外基质结构，保证细胞以高密度转载，促进细胞黏附与繁殖和基质的沉积，在制备人工神经方面显示出诸多优势。然而，由于静电纺丝的极高速分化拉伸和固化特点，致使纤维只能以无序状沉积，这种无序结构极大限制了其在神经组织工程中的应用。有研究表明静电纺丝的支架材料上纤维的取向对神经细胞的生长以及轴突的延伸都有很大的影响[S.Patel, K.Kurpinski, R.Quigley, et al.Bioactivenanofibers:synergistic effects of nanotopography and chemical signaling on cellguidance.Nano Lett, 2007, 7 (9):2122-2128.]。此外,研究还证明具有取向排列的纳米纤维上生长的轴突要比无规则排列的纤维上要长[Xiao Liu, Jun Chen, Kerry J.Gilmore,et al.Guidance of neurite outgrowth on aligned electrospun polypyrrole/poly (styrene-b-1sobutylene-b-styrene)fiber platforms, Journal of Biomedical MaterialsResearch Part A, 2010,94A: 1004-1011]。
传统静电纺丝将正极与金属针头相连，利用喷射流的不断分化拉伸获得纳米纤维，由于喷射流的相互排斥，导致了纳米纤维的杂乱无序状排列。目前，能够静电纺丝并用于组织工支架的生物材料主要有丝素、胶原、明胶、层粘连蛋白和壳聚糖等天然高聚物，以及外消旋聚乳酸O3DLA)、左旋聚乳酸(PLLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚己内酯(PCL)和不同共聚比例的PLGA等合成高聚物。上述材料均具有较好的生物相容性、更低的致免疫性(immunogenicity)和更高的细胞粘附性，因此利用上述材料进行静电纺丝构建组织工程神经导管，将满足人工神经的要求。
在材料组成满足静电纺丝及人工神经的基础上，尚面临另一技术难题，即所构建的神经导管的降解要与神经再生的速度匹配，神经再生的同时，导管材料要有次序和梯度的降解，这既有利于促进神经再生的正常进行 ，又能够提供神经再生的微环境，保护再生的神经组织。发明内容:
本发明的目的是提供一种组织工程神经移植用导管及其制备方法，它可以提高纤维取向、快速收集排列规整的纳米纤维，引导和促进轴突生长，提高神经修复能力，便于营养传输，能够保证神经修复的最终完成，可使神经再生速度与降解速度相匹配。
为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案:它由多层纤维膜组成，其最内层纤维膜是由平行排列的直径为40 300nm的纳米纤维组成，其余纤维膜均为无规排列的纳米到微米级纤维构成。
所述的多层纤维膜由内到外，其降解速度逐渐变慢，最内层纤维膜的降解速度为1-2周，最外层的降解速度为6-20周，中间层介于两者之间。
所述的多层纤维膜除内层外，均为外消旋聚乳酸(TOLA)、左旋聚乳酸(PLLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚己内酯(PCL)和不同共聚比例的PLGA中的一种或多种构成，内层纤维膜的材料由丝素、胶原、明胶、层粘连蛋白和纤维蛋白原中的一种或多种构成，也可由降解速度较快的外消旋聚乳酸O3DLA)、聚羟基乙酸(PGA)或含GA比例较高(GA比例大于70% )的羟基乙酸与羟基丙酸的共聚物(PLGA)中的一种或多种合成高聚物构成，按重量计，最内层纤维重量占5-10%。
本发明的制备方法为:
(I)制备取向纳米纤维层:
a.称取丝素、胶原、明胶、层粘连蛋白和纤维蛋白原中的一种或多种，采用甲酸、六氟异丙醇和六氟丙酮中的一种或多种溶剂溶解，获得9-15%的纺丝原液；也可采用左旋聚乳酸O3DLA)、聚羟基乙酸(PGA)或含GA比例较高的羟基乙酸与羟基丙酸的共聚物(PLGA)中的一种或多种合成高聚物溶解在2，2，2-三氟乙醇、六氟异丙醇、三氯甲烷、二氯甲烷、四氢呋喃(THF)、丙酮和二甲基甲酰胺中的一种或多种溶剂中，形成3-8%的纺丝原液。
b.将步骤a的纺丝原液吸入注射针管，注射针管放在微量泵中，由其控制纺丝液喂入速度，高压电源发生器正极连接针管金属针头，负极连接收集转辊表明平行排列的金属丝；在针头与收集转辊之间放置线圈，线圈连接另一台高压发生器正极，开启电源和微量泵，利用表明平行排列金属丝的收集辊收集取向纳米纤维。
(2)将步骤(I)制备的取向纳米纤维膜从转辊取下，经乙醇处理5-30min，再在水中浸泡30min,室温下晾干。
(3)将晾干后的取向纳米纤维膜包裹在直径为1_4_的金属转轴上，纤维取向与金属轴轴向平行，金属转轴与连接针头的高压发生器负极相连。
(4)从外消旋聚乳酸(I3DLA)、左旋聚乳酸(PLLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚己内酯(PCL)和不同共聚比例的PLGA中选取一种或多种合成高聚物，形成不同的材料组合，分别溶解在2，2，2_三氟乙醇、六氟异丙醇、三氯甲烷、二氯甲烷、四氢呋喃(THF)、丙酮和二甲基甲酰胺中的一种或多种溶剂中，制备质量分数为3 8%的合成高聚物纺丝原液，采用静电纺丝工艺，在上述包覆取向纳米纤维膜的金属轴上喷覆由不同材料组成的纤维层，逐层构建含有取向纳米纤维并可梯度降解的神经移植用导管。
所述的步骤b中的线圈为方框形、圆形或者其他形状的线圈。
所述的含有取向纳米纤维并可梯度降解的神经移植用导管，其口径为I 4_，长度4-7cm，导管管壁厚度为40 120 u m。
本发明技术方案中，导管最内层的取向纳米纤维能够引导神经再生，且其降解速度最快。除此之外，由内到外的纤维层是根据不同材料具有不同降解速度的特点，可通过改变合成高聚物的组成与比例，使其具有由快到慢的降解速度，满足梯度降解要求，与神经再生的速度相匹配。
本发明具有以下明显的有益效果:
1.本发明内层由平行排列的直径为40 300nm的纳米纤维组成，能够引导神经再生，促进轴突生长。
2.本发明由内到外的纤维层是根据不同材料具有不同降解速度的特点，通过改变合成高聚物的组成、比例与纺丝工艺，使其具有由快到慢的降解速度，满足梯度降解要求，与神经再生的速度相匹配。
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图1为本发明中神经移植用导管的结构示意图，
图2为本发明中神经移植用导管内层取向纳米纤维的结构示意图，
图3为本发明中神经移植用导管外层纳米到微米级纤维的结构示意图。
具体实施方式
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参照图1-图3，本具体实施方式
采用以下技术方案:它由多层纤维膜组成，其最内层纤维膜是由平行排列的直径为40 300nm的纳米纤维组成，其余纤维膜均为无规排列的纳米到微米级纤维构成。
所述的多层纤维膜由内到外，其降解速度逐渐变慢，最内层纤维膜的降解速度为1-2周，最外层的降解速度为6-20周，中间层介于两者之间。
所述的多层纤维膜除内层外，均为外消旋聚乳酸(TOLA)、左旋聚乳酸(PLLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚己内酯(PCL)和不同共聚比例的PLGA中的一种或多种构成，内层纤维膜的材料由丝素、胶原、明胶、层粘连蛋白和纤维蛋白原中的一种或多种构成，也可由降解速度较快的外消旋聚乳酸O3DLA)、聚羟基乙酸(PGA)或含GA比例较高(GA比例大于70% )的羟基乙酸与羟基丙酸的共聚物(PLGA)中的一种或多种合成高聚物构成，按重量计，最内层纤维重量占5-10%。
本具体实施方式
的制备方法为:
(I)制备取向纳米纤维层:
a.称取丝素、胶原、明胶、层粘连蛋白和纤维蛋白原中的一种或多种，采用甲酸、六氟异丙醇和六氟丙酮中的一种或多种溶剂溶解，获得9-15%的纺丝原液；也可采用左旋聚乳酸O3DLA)、聚羟基乙酸(PGA)或含GA比例较高的羟基乙酸与羟基丙酸的共聚物(PLGA)中的一种或多种合成高聚物溶解在2，2，2-三氟乙醇、六氟异丙醇、三氯甲烷、二氯甲烷、四氢呋喃(THF)、丙酮和二甲基甲酰胺中的一种或多种溶剂中，形成3-8%的纺丝原液。
b.将步骤a的纺丝原液吸入注射针管，注射针管放在微量泵中，由其控制纺丝液喂入速度，高压电源发生器正极连接针管金属针头，负极连接收集转辊表明平行排列的金属丝；在针头与收集转辊之间放置方框形或圆形线圈，线圈连接另一台高压发生器正极，开启电源和微量泵，利用表明平行排列金属丝的收集辊收集取向纳米纤维。
(2)将步骤(I)制备的取向纳米纤维膜从转辊取下，经乙醇处理5_30min，再在水中浸泡30min,室温下晾干。
(3)将晾干后的取向纳米纤维膜包裹在直径为l_4mm的金属转轴上，纤维取向与金属轴轴向平行，金属转轴与连接针头的高压发生器负极相连。
(4)从外消旋聚乳酸(I3DLA)、左旋聚乳酸(PLLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚己内酯(PCL)和不同共聚比例的PLGA中选取一种或多种合成高聚物，形成不同的材料组合，分别溶解在2，2，2_三氟乙醇、六氟异丙醇、三氯甲烷、二氯甲烷、四氢呋喃(THF)、丙酮和二甲基甲酰胺中的一种或多种溶剂中，制备质量分数为3 8%的合成高聚物纺丝原液，采用静电纺丝工艺，在上述包覆取向纳米纤维膜的金 属轴上喷覆由不同材料组成的纤维层，逐层构建含有取向纳米纤维并可梯度降解的神经移植用导管。
所述的含有取向纳米纤维并可梯度降解的神经移植用导管，其口径为I 4_，长度4-7cm，导管管壁厚度为40 120 u m。
本具体实施方式
技术方案中，导管最内层的取向纳米纤维能够引导神经再生，且其降解速度最快。除此之外，由内到外的纤维层是根据不同材料具有不同降解速度的特点，可通过改变合成高聚物的组成与比例，使其具有由快到慢的降解速度，满足梯度降解要求，与神经再生的速度相匹配。
本具体实施方式
设计了不同形状(方 形与圆形线圈)的喷射流分化控制器，在喷射流分化区施加与纺丝电极相同的电场，控制喷射流的“弯曲不稳定性”，以提高纤维取向。此外，以高速旋转的表面平行排列金属丝的转辊为收集装置，快速收集排列规整的纳米纤维。特别设计了以降解速度较快、具有高度取向的纳米级纤维形成导管内层，引导和促进轴突生长，提高神经修复能力。此外，由内到外，选取降解速度逐渐降低的高聚物或其组合，逐层构建由纳米到微米级纤维构成的纤维膜。通过该方法制备的神经导管，便于营养传输，能够保证神经修复的最终完成，可使神经再生速度与降解速度相匹配
实施例一:
1.称取4.4g再生丝素膜和2.1g医用明胶溶于无水甲酸中，获得11.5%的丝素/明胶共混纺丝液。称取2g聚羟基乙酸(PGA)和Ig左旋聚羟基丙酸(PLLA)，溶于四氢呋喃(THF)中，形成4%的纺丝液。将2.5g左旋聚羟基丙酸(PLLA)溶解在氯仿/丙酮(体积比I: I)混合溶剂中，获得4.9%纺丝液；
2.将步骤I制得的丝素/明胶纺丝液吸入针管，针管放在微量泵中，调节流速达到0.lml/h0高压发生器正极与针头相接，电压为15kV，负极与转辊表明平行排列的金属丝连接，金属丝排列方向与转辊轴向平行，转辊直径10cm，转速3500rpm。针头与收集辊间距为10cm，另一高压发生器连接方框型线圈，电压为10kV，线圈边长6cm，距离喷嘴3cm。开启静电发生器和微量注射泵，连续静电纺丝lOmin，在转辊上收集到丝素/明胶共混取向纳米纤维膜；
3.将步骤2所制得的丝素/明胶取向纳米纤维膜于IOOml无水乙醇中浸泡30分钟，再在水中浸泡30min，取出室温下晾干；
4.将步骤3制备的取向纳米纤维膜包裹在直径为3mm的金属轴上，纤维取向与金属轴轴向平行，金属轴转速为500rpm，连接高压发生器负极。将步骤I所制得的PGA/PLLA纺丝液吸入注射针管，针头连接高压发生器正极，电压为25kV，针头到金属轴距离13cm，纺丝液流速0.25ml/h。在包覆有取向纳米纤维纤维膜的金属轴上收集PGA/PLLA纳米到微米级纤维，静电纺丝IOmin ；
5.将步骤4中的纺丝液更换为步骤I制得的PLLA纺丝液，电压调整为26kV，针头到金属轴距离13cm,纺丝液流速0.30ml/ho继续静电纺丝15min,即可构建含有取向纳米纤维的神经移植导管。它的内层纤维直径为40nm 180nm,排列规整,壁厚为85 y m, 口径为3mm,最内层降解速度为1-2周，中间层为4_7周,最外层为8_13周。
实施例二:
1.称取2g外消旋聚乳酸(PDLA)，溶于2，2，2_三氟乙醇中，获得3%纺丝液。称取1.8g聚羟基乙酸(PGA)和1.2g PLGA(LA: GA = 60: 40)，溶解于四氢呋喃(THF)中，形成4.2%纺丝液。将2g PLGA(LA: GA = 85: 15)溶解在氯仿/丙酮(体积比2: I)混合溶剂中，获得5.0%的纺丝原液；
2.将步骤I制得的PDLA纺丝原液吸入针管内，针管放在微量泵中，调节流速达到0.13ml/h。高压发生器正极与针头相接，电压为15kV，负极与转辊表明平行排列的金属丝连接，金属丝排列方向与转辊轴向平行，转辊直径10cm，转速4000rpm。针头与收集辊间距为13cm，另一高压发生器连接圆形线圈，电压为10kV，线圈直径6cm，距离喷嘴3cm。开启静电发生器和微量注射泵，连续静电纺丝6min，在转辊上收集TOLA取向纳米纤维膜；
3.将步骤I所制得的I3DLA取向纳米纤维膜于IOOml无水乙醇中浸泡10分钟，再在水中浸泡30min,取出室温下晾干；
4.将步骤3制备的I3DLA取向纳米纤维膜包裹在直径为2mm的金属轴上，纤维取向与金属轴轴向平行，金属轴转速为300rpm，连接高压发生器负极。将步骤I所制得的PGA/PLGA纺丝液吸入注·射针管，针头连接高压发生器正极，电压为23kV，针头到金属轴距离15cm，纺丝液流速0.30ml/h。在包覆有取向纳米纤维纤维膜的金属轴上收集PGA/PLGA纳米到微米级纤维，静电纺丝8min ；
5.将步骤4中的纺丝液更换为步骤I制得的PLGA纺丝液，电压调整为25kV，针头到金属轴距离15cm,纺丝液流速0.40ml/ho继续静电纺丝IOmin,即可构建含有取向纳米纤维的神经移植导管。它的内层纤维直径为60nm 165nm,排列规整,壁厚为95 y m, 口径为2mm,最内层降解速度为1.5-2周，中间层为3_6周,最外层为7_11周降解。
实施例三:
1.称取Ig聚羟基乙酸(PGA)，溶于四氢呋喃中，获得3.5%纺丝液。称取2.0g聚羟基乙酸(PGA)和1.2g PLGA(LA: GA = 70: 30)，溶解于三氟乙醇中，形成4.0%纺丝液。称取2g PLGA (LA: GA = 85: 15)，溶解于三氟乙醇中，获得4.8%的纺丝液。称取2gPLLA溶解在氯仿/丙酮(体积比2: I)混合溶剂中，获得6.0%的纺丝原液；
2.将步骤I制得的PGA纺丝原液吸入针管内，针管放在微量泵中，调节流速达到0.10ml/h。高压发生器正极与金属喷嘴相接，电压为15kV，负极与转辊表明平行排列的金属丝连接，金属丝排列方向与转棍轴向平行，转棍直径IOcm,转速4500rpm。金属喷嘴头端与收集辊间距为15cm，另一高压发生器连接圆形线圈，电压为13kV，线圈直径6cm，距离喷嘴4cm。开启静电发生器和微量注射泵,连续静电纺丝5min,在转棍上收集PGA取向纳米纤维膜；
3.将步骤I所制得的PGA取向纳米纤维膜于IOOml无水乙醇中浸泡5分钟，再在水中浸泡30min,取出室温下晾干；
4.将步骤3制备的PGA取向纳米纤维膜包裹在直径为1.5mm的金属轴上，纤维取向与金属轴轴向平行，金属轴转速为500rpm，连接高压发生器负极。将步骤I所制得的PGA/PLGA纺丝液吸入注射针管，针头连接高压发生器正极，电压为20kV，针头到金属轴距离15cm，纺丝液流速0.25ml/h。在包覆有取向纳米纤维纤维膜的金属轴上收集PGA/PLGA纳米到微米级纤维，静电纺丝5min ；
5.将步骤4中的纺丝液更换为步骤I制得的PLGA纺丝液，电压调整为23kV，针头到金属轴距离15cm，纺丝液流速0.30ml/h,继续静电纺丝8min，收集PLGA纳米到微米级纤维。
6.将步骤5中的纺丝液更换为步骤I制得的PLLA纺丝液，电压调整为25kV，针头到金属轴距离15cm,纺丝液流速0.50ml/h,静电纺丝IOmin,即可构建含有取向纳米纤维的神经移植导管。
它的内层纤维直径为50nm 185nm,排列规整,壁厚为115 V- m, 口径为1.5mm,最内层降解速度为1-2周，由内到外，第二层为3-5周 ，第三层5-8周，最外层为8-15周降解。
权利要求
1.一种组织工程神经移植用导管及其制备方法，其特征在于它山多层纤维膜组成，其最内层纤维膜是由平行排列的直径为40 300nm的纳米纤维组成，其余纤维膜均为无规排列的纳米到微米级纤维构成；所述的多层纤维膜由内到外，其降解速度逐渐变慢，最内层纤维膜的降解速度为1-2周，最外层的降解速度为6-20周，中间层介于两者之间。
2.—种组织工程神经移植用导管及其制备方法，其特征在于它的制备方法为: (1)制备取向纳米纤维层: (a).称取丝素、胶原、明胶、层粘连蛋白和纤维蛋白原中的一种或多种，采用甲酸、六氟异丙醇和六氟丙酮中的一种或多种溶剂溶解，获得9-15%的纺丝原液； (b).将步骤(a)的纺丝原液吸入注射针管，注射针管放在微量泵中，由其控制纺丝液喂入速度，高压电源发生器正极连接针管金属针头，负极连接收集转辊表明平行排列的金属丝；在针头与收集转辊之间放置线圈，线圈连接另一台高压发生器正极，开启电源和微量泵，利用表明平行排列金属丝的收集辊收集取向纳米纤维； (2)将步骤(I)制备的取向纳米纤维膜从转辊取下，经乙醇处理5-30min，再在水中浸泡30min,室温下晾干； (3)将晾干后的取向纳米纤维膜包裹在直径为1-4_的金属转轴上，纤维取向与金属轴轴向平行，金属转轴与连接针头的高压发生器负极相连； (4)从外消旋聚乳酸、左旋聚乳酸、聚羟基乙酸、聚己内酯和不同共聚比例的PLGA中选取一种或多种合成高聚物，形成不同的材料组合，分别溶解在2，2，2-三氟乙醇、六氟异丙醇、三氯甲烷、二氯甲烷、四氢呋喃、丙酮和二甲基甲酰胺中的一种或多种溶剂中，制备质量分数为3 8%的合成高聚物纺丝原液，采用静电纺丝工艺，在上述包覆取向纳米纤维膜的金属轴上喷覆由不同材料组成的纤维层，逐层构建含有取向纳米纤维并可梯度降解的神经移植用导管。
3.根据权利要求2所述的一种组织工程神经移植用导管及其制备方法，其特征在于所述的步骤(a)替换为采用左旋聚乳酸、聚羟基乙酸或含GA比例较高的羟基乙酸与羟基丙酸的共聚物中的一种或多种合成高聚物溶解在2，2，2_三氟乙醇、六氟异丙醇、三氯甲烷、二氯甲烷、四氢呋喃、丙酮和二甲基甲酰胺中的一种或多种溶剂中，形成3-8%的纺丝原液。
4.根据权利要求1所述的一种组织工程神经移植用导管及其制备方法，其特征在于所述的多层纤维膜除内层外，均为外消旋聚乳酸、左旋聚乳酸、聚羟基乙酸、聚己内酯和不同共聚比例的PLGA中的一种或多种构成，内层纤维膜的材料由丝素、胶原、明胶、层粘连蛋白和纤维蛋白原中的一种或多种构成，也可由降解速度较快的外消旋聚乳酸、聚羟基乙酸或含GA比例较高的羟基 乙酸与羟基丙酸的共聚物中的一种或多种合成高聚物构成，按重量计，最内层纤维重量占5-10%。
5.根据权利要求1所述的一种组织工程神经移植用导管及其制备方法，其特征在于所述的神经移植用导管，其口径为I 4mm,长度4_7cm,导管管壁厚度为40 120 μ m。
全文摘要
一种组织工程神经移植用导管及其制备方法，它涉及高分子材料生物医学应用领域，它由多层纤维膜组成，其最内层纤维膜是由平行排列的直径为40～300nm的纳米纤维组成，其余纤维膜均为无规排列的纳米到微米级纤维构成；所述的多层纤维膜由内到外，其降解速度逐渐变慢，最内层纤维膜的降解速度为1-2周，最外层的降解速度为6-20周，中间层介于两者之间。它可以提高纤维取向、快速收集排列规整的纳米纤维，引导和促进轴突生长，提高神经修复能力，便于营养传输，能够保证神经修复的最终完成，可使神经再生速度与降解速度相匹配。
文档编号A61L27/18GK103230622SQ201310136659
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月19日 优先权日2013年4月19日
发明者尹桂波, 陈和春, 陈桂香, 郭立强, 金春奎 申请人:南通纺织职业技术学院