一种双向梯度血管内皮生长因子的神经导管制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于神经再生组织工程以及血管组织工程技术领域，尤其涉及一种双向梯度血管内皮生长因子的神经导管制备方法。
【背景技术】
[0002]神经损伤后，雪旺细胞激活，迀移形成Bungner带，引导再生轴突向受损远端延伸，通过受损部位。在神经挫伤，由于神经内膜结构完整，雪旺细胞以其为支架进行迀移。但是，最新的研究发现，在神经横断后，神经内膜连接结构破坏，雪旺细胞迀移是通过再生的血管为支架。并且血管的方向生长对于引导雪旺细胞方向性迀移和轴突方向性生长至关重要。
[0003]在神经损伤长节段神经缺损时，必须通过导管桥接，实现其结构连接。因此，如何实现神经导管快速方向性血管化，并引导雪旺细胞分别由受损远端和近端快速方向性迀移入神经导管内，成为加速轴突快速通过桥接部位，促进功能恢复的关键。
[0004]VEGF具有趋化内皮细胞迀移并促进血管生成作用。大量研究发现，通过基因工程高表达VEGF具有神经保护作用，并促进神经再生。但是这些研究没有解决如何加速神经导管血管化，促进神经快速通过桥接部位的问题。马福凯等研究发现通过与普通胶原导管相比，VEGF功能化的导管能够显著的促进神经再生。有研究发现，度梯度的引导，不能实现快速的向神经导管中央方向性的血管化，限制内皮细胞能够向高浓度极化，并加速向高VEGF浓度方向性迀移成血管。因此，不具有浓度梯度神经导管促进神经导管，由于没有方向性浓弓I导雪旺细胞迀移入导管内速度，进而限制VEGF通过神经导管的速度。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种双向梯度血管内皮生长因子的神经导管制备方法，旨在通过制备具有双向梯度的VEGF的导管，可以加速神经导管方向性血管化，引导雪旺细胞由受损两端快速方向性迀移如神经导管内，从而促进神经再生，解决无浓度梯度VEGF导管促进血管化不具有方向性问题。
[0006]本发明是这样实现的，一种双向梯度血管内皮生长因子的神经导管制备方法，该双向梯度血管内皮生长因子的神经导管制备方法包括以下步骤:
[0007]步骤一，静电纺丝PCL导管的制备:将PCL溶于10%的甲醇/氯仿的混合溶液制备静电纺丝溶液，通过微量注射栗控制电纺溶液的流速为2ml /h-4ml /h，静电纺丝装置两极间电压设定为20kV，注射器和接收器之间的距离为15cm，应用21-G针形喷嘴，接收器为直径1.5mm的钢棒，制备内径为1.5mm，长度为1.5cm的PCL导管，在真空干燥箱中干燥，除去残余溶剂，得到PCL导管；
[0008]步骤二，PCL导管双向梯度氨解:将PCL导管用细铁丝穿过，弯曲对折垂直放入2mlEP管中，加入200ul，0.1M的乙二胺溶液，反应5min-20min，然后微量注射栗以lml/h_3ml/h速度向EP管中加入蒸馏水，当浸没导管后停止加水，继续反应5min-10min;之后用PBS洗去未反应的乙二胺;得到中央部-NH2密度高，向两端-NH2密度逐渐减低的梯度导管；
[0009]步骤三，肝素偶联反应制备双向梯度的肝素化导管:将步骤二所得具有双向梯度-NH2的PCL导管放入吗啉乙磺酸缓冲体30min，移除吗啉乙磺酸，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺/N-羟基丁二酰亚胺/肝素溶液，避光脱色摇床过夜，将肝素共价结合到携带氨基的导管上，PBS洗去未结合的肝素，超净台晾干，制得具有双向梯度的肝素化导管；
[0010]步骤四，双向梯度VEGF导管制备:双向梯度的肝素化导管，放入2mlEP管中，加入2ml 100ng/ml的VEGF溶液，4 °C浸泡过夜，吸出VEGF溶液，加入PBS溶液润洗，超净台晾干，制得具有双向梯度的VEGF功能化的导管。
[0011 ] 进一步，所述步骤一中将PCL溶于10 %的甲醇/氯仿的混合溶液中甲醇/氯仿按体积质量比占混合溶液的10%，按体积比甲醇:氯仿=1:5。
[0012]进一步，所述步骤二中，将1.5cmPCL导管用细铁丝穿过，弯曲对折垂直放入2mlEP管中，加入200ul，0.1M的乙二胺溶液，反应5min-20min，然后微量注射栗以lml/h_3ml/h速度向EP管中加入蒸馏水，当浸没导管后停止加水，继续反应5min-10min。
[0013]本发明另一目的在于提供一种PCL导管双向氨解装置，该PCL导管双向氨解装置包括2ml EP管、细铁丝、PCL导管和微量注射栗。所述PCL导管设置在内部盛有乙二胺溶液2mlEP管内部，所述细铁丝穿过PCL导管，所述内部装有蒸馏水的微量注射栗与2ml EP管连接。
[0014]进一步，所述PCL导管通过弯曲对折垂直设置在2ml EP管内部。
[0015]本发明另一目的在于提供一种双向梯度的VEGF功能化的神经导管促进神经再生方法，该双向梯度的VEGF功能化的神经导管促进神经再生方法包括:
[0016]双向梯度的VEGF功能化的神经导管中央部释放高浓度的VEGF，通过趋化作用，加速受损神经两端的内皮细胞向双向梯度的VEGF功能化的神经导管中央高浓度处迀移;加速神经导管由两端向中央方向性血管化，生成的血管作为支架，引导雪旺细胞快速方向性迀移进入神经导管，从而加速神经再生并沿雪旺细胞向远端延伸。
[0017]进一步，所述双向梯度的VEGF功能化的神经导管，其中央所负载的VEGF量高，而两端所负载的VEGF量相对较少
[0018]本发明提供的双向梯度的VEGF功能化的神经导管，其中央所负载的VEGF量高，而两端所负载的VEGF量相对较少，能够通过趋化作用受损神经两端的内皮细胞向导管中央高浓度处迀移，加速神经导管由两端向中央方向性血管化。同时生成的血管能够作为支架引导雪旺细胞快速迀移进入神经导管，从而促进神经的再生并沿雪旺细胞向远端延伸。但是本发明中VEGF在整个神经导管中结合均一，不具有浓度梯度。
【附图说明】
[0019]图1是本发明实施例提供的双向梯度血管内皮生长因子的神经导管制备方法流程图；
[0020]图2是本发明实施例提供的PCL导管双向氨解装置示意图；
[0021]图中:l、2mlEP管;2、细铁丝;3、PCL导管;4、微量注射栗。
[0022]图3是本发明实施例提供的神经修复4周后导管中央雪旺细胞迀移及神经再生情况图；
[0023]图中:A-C、单纯PCL神经导管组;D-F、PCL神经导管复合VEGF，没有梯度;G-1、PCL神经导管复合VEGF，具有双向梯度。
[0024]图4是本发明实施例提供的感觉神经及运动神经再生情况图。
[0025]图中:(A_C，G)、检测的背根神经节中感觉神经元情况；(D_F，H)、检测的脊髓中运动神经再生情况。
【具体实施方式】
[0026]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0027]下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
[0028]如图1，所示，本发明实施例的双向梯度血管内皮生长因子的神经导管制备方法包括以下步骤:
[0029 ] S11:静电纺丝PCL导管的制备:将PCL溶于1 %的甲醇/氯仿的混合溶液制备静电纺丝溶液，通过微量注射栗控制电纺溶液的流速为2ml/h-4ml/h，静电纺丝装置两极间电压设定为20kV，注射器和接收器之间的距离为15cm，应用21-G针形喷嘴，接收器为直径1.5mm的钢棒，制备内径为1.5mm，长度为1.5cm的PCL导管，在真空干燥箱中干燥，除去残余溶剂，得到PCL导管；
[0030]5102:?(^导管双向梯度氨解:将1.5(^ PCL导管用细铁丝穿过，弯曲对折垂直放入2ml EP管中，加入200ul，0.1M的乙二胺溶液，反应5min-20min，然后微量注射栗以lml/h-3ml/h速度向EP管中加入蒸馏水，当浸没导管后停止加水，继续反应5min-10min;之后用PBS洗去未反应的乙二胺;得到中央部-NH2密度高，向两端-NH2密度逐渐减低的梯度导管；
[0031]S103:肝素偶联反应制备双向梯度的肝素化导管:将S102所得具有双向梯度-NH2的PCL导管放入吗啉乙磺酸缓冲体30min，移除吗啉乙磺酸，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺/N-羟基丁二酰亚胺/肝素溶液，避光脱色摇床过夜，将肝素共价结合到携带氨基的导管上，PBS洗去未结合的肝素，超净台晾干，制得具有双向梯度的肝素化导管；
[0032]S104:双向梯度VEGF导管制备:双向梯度的肝素化导管，放入2mlEP管中，加入2mll00ng/ml的VEGF溶液，4 °C浸泡过夜，吸出VEGF溶液，加入I3BS溶液润洗，超净台晾干，制得具有双向梯度的VEGF功能化的导管。
[0033]所述SlOl中将PCL溶于10%的甲醇/氯仿的混合溶液中甲醇/氯仿按体积质量比占混合溶液的10%，按体积比甲醇:氯仿=1:5。
[0034]所述S102中，将PCL导管用细铁丝穿过，弯曲对折垂直放入2ml EP管中，加入200ul，0.1M的乙二胺溶液，反应5min-20min，然后微量注射栗以lml/h_3ml/h速度向EP管中加