与多个分子的抗原反复结合的抗原结合分子的制作方法

专利名称：与多个分子的抗原反复结合的抗原结合分子的制作方法
技术领域：
本发明涉及提高抗原结合分子的药物动力学的方法、增加抗原结合分子与抗原的结合次数的方法、药物动力学提高的抗原结合分子、抗原结合分子与抗原的结合次数增加的抗原结合分子、以及它们的制备方法等。
背景技术：
抗体在血浆中的稳定性高、副作用也少，因此作为药品而受到关注。其中，有多种IgG型抗体药物已上市，目前还有多种抗体药物正在开发中(非专利文献1、非专利文献2)。另一方面，作为可适用于第2代抗体药物的技术，人们开发了各种技术，有人报道了提高效应子功能、抗原结合能力、药物动力学、稳定性的技术或降低免疫原性风险的技术等(非专利文献3)。认为问题在于:由于抗体药物通常给药量非常大，所以难以制备皮下给药制剂；以及制造成本高等。作为减少抗体药物的给药量的方法，人们在考虑提高抗体的药物动力学的方法和提高抗体与抗原的亲和性(亲和力)的方法。作为提高抗体的药物动力学的方法，有人报道了恒定区的人工氨基酸取代(非专利文献4、5)。作为增强抗原结合能力、抗原中和能力的技术，有人报道了亲和力成熟技术(非专利文献6)，通过向可变区的CDR区等的氨基酸中导入突变，可以增强与抗原的结合活性。通过增强抗原结合能力，可以提 高在体外的生物活性、或者减少给药量，还可以进一步提高在体内的药效(非专利文献7)。另一方面，每I分子的抗体能够中和的抗原量依赖于亲和力，通过增强亲和力，可以以少的抗体量中和抗原，可以通过各种方法来增强抗体的亲和力。并且，只要与抗原进行共价键结合、使亲和力无限大，就可以用I分子的抗体中和I分子的抗原(抗体为二价时中和两分子的抗原)。但在现有方法中，用I分子的抗体中和I分子的抗原(抗体为二价时中和两分子的抗原)的化学量论的中和反应是界限，以抗原量以下的抗体量无法完全中和抗原。即，在增强亲和力的效果方面存在界限(非专利文献9)。当抗体为中和抗体时，为了使其中和效果持续一定期间，必需给予该期间内在体内产生的抗原量以上的抗体量，仅凭提高上述抗体的药物动力学或亲和力成熟技术，在减少必需的抗体给药量方面存在界限。因此，为了以抗原量以下的抗体量目标期间持续抗原的中和效果，必需用I个抗体中和多个抗原。作为用I个抗体中和多个抗原的方法，有利用赋予抗体催化功能的催化抗体进行的抗原的灭活。当为蛋白抗原时，认为通过水解抗原的肽键可以将抗原灭活，通过抗体催化该水解反应，可以反复中和(失活)抗原(非专利文献8)。迄今为止，报道了许多有关催化抗体和催化抗体制作技术，但作为药品具有足够的催化活性的催化抗体则未见报道。即，在抗某抗原的抗体的体内试验中，与普通的不具有催化功能的中和抗体相比，以低剂量发挥同等以上的效果、或者以相同的给药量可以更持续地发挥效果的催化抗体迄今为止未见报道。这样，没有关于用I分子的抗体中和多个抗原、可以发挥优于普通中和抗体的体内效果的抗体的报道，为了减少给药量以及延长持续性，人们希望开发用I个抗体中和多个抗原、在体内较普通的中和抗体更能发挥效果的新型抗体制作技术。本发明的现有技术文献如下所示。现有技术文献 非专利文献非专利文献1:Monoclonal antibody successes in the clinic， JaniceMReichert, Clark J Rosensweig， Laura B Faden & Matthew C Dewitz, NatureBiotechnology23，1073-1078(2005).
非专利文献2:Pavlou AK，Belsey MJ.The therapeutic antibodies marketto2008.Eur J Pharm Biopharm.2005Apr ；59(3):389-96.
非专利文献3 ；Kim SJ, Park Y，Hong HJ.Antibody engineering for thedevelopment of therapeutic antibodies.Mol Cells.2005Aug31 ；20(1):17-29.Review.
非专利文献4 ；Hinton PR，Xiong JM, Johlfs MG，Tang MT，Keller S，Tsurushita N.An engineered human IgGlantibody with longer serum half-life.JImmunol.2006Janl ; 176(I):346-56.
非专利文献5 ；Ghetie V，Popov S，Borvak J，Radu C，Matesoi D，Medesan C，Ober RJ, Ward ES.1ncreasing the serum persistence of an IgG fragment by randommutagenesis.Nat Biotechnol.1997Jul ；15(7):637-40.
非专利文献6:Proc Natl Acad Sci U S A.2005Junl4 ; 102 (24):8466-71.Epub2005Jun6.A general method for greatly improving the affinity of antibodiesby using combinatorial libraries.Rajpal A，Beyaz N，Haber L，Cappuccilli G，Yee H，Bhatt RR, Takeuchi T，Lerner RA，Crea R.
非专利文献7:Wu H，Pfarr DS，Johnson S，Brewah YA，Woods RM，Patel NK，WhiteWI, Young JF，Kiener PA.Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody forthe Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and LowerRespiratory Tract.J Mol Biol.2007，368，652-665.
非专利文献8:Hanson CV, Nishiyama Y，Paul S.Catalytic antibodies andtheir applications.Curr Opin Biotechnol.2005Dec ；16(6):631-6.
非专利文献9 ；Rathanaswami P，Roalstad S，Roskos L, Su QJ, Lackie S，Babcook J.Demonstration of an in vivo generated sub-picomolar affinity fullyhuman monoclonal antibody to interleukin-8.Biochem Biophys ResCommun.2005Sep9 ；334(4):1004-13.

发明内容
发明所要解决的课题本发明鉴于上述状况而设，其目的在于提供:抗原结合分子与抗原多次结合的方法、提高抗原结合分子的药物动力学的方法、可以多次与抗原结合的抗原结合分子、药物动力学得到改善的抗原结合分子、含有该抗原结合分子的药物组合物、以及它们的制备方法。解决课题的方法本发明人等对抗原结合分子等具有抗原结合能力的多肽与抗原多次结合的方法、改善血浆中半衰期(血中半衰期)(提高药物动力学)的方法进行了深入研究。其结果，本发明人等发现:与在血浆中(血中)的PH下的抗原结合活性相比，在早期核内体内的pH下的抗原结合活性弱的抗原结合分子与抗原多次结合，血浆中半衰期长。本发明涉及抗原结合分子与抗原多次结合的方法、提高抗原结合分子的药物动力学的方法、能够多次与抗原结合的抗原结合分子、药物动力学提高的抗原结合分子、药物动力学提高的抗原结合分子的制备方法等，更具体而言，本发明提供下述[I] [50]。[I]抗原结合分子，其对于抗原的在pH5.8下的KD与在pH7.4下的KD之比、SPKD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值为 2 以上。[2] [I]所述的抗原结合分子，其中KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值为10以上。[3] [I]所述的抗原结合分子，其中KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值为40以上。[4] [I] [3]中任一项所述的抗原结合分子，其特征在于:至少I个氨基酸被组氨酸取代、或者插入至少I个组氨酸。[5] [I] [4]中任一项所述的抗原结合分子，其特征在于:该抗原结合分子具有拮抗活性。[6] [I] [5]中任一项所述的抗原结合分子，其特征在于:该抗原结合分子与膜抗原或可溶型抗原结合。[7] [I] [6]中任一项所述的抗原结合分子，其特征在于:抗原结合分子为抗体。[8]药物组合物，其中含有[I] [7]中任一项所述的抗原结合分子。[9]提高抗原结合分子的药物动力学的方法，该方法通过使抗原结合分子在PH5.8下的抗原结合活性弱于在pH7.4下的抗原结合活性来进行。[10]增加抗原结合分子与抗原的结合次数的方法，该方法通过使抗原结合分子在PH5.8下的抗原结合活性弱于在pH7.4下的抗原结合活性来进行。[11]增加抗原结合分子所能结合的抗原数目的方法，该方法通过使抗原结合分子在pH5.8下的抗原结合活性弱于在pH7.4下的抗原结合活性来进行。[12]使在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子上解离的方法，该方法通过使抗原结合分子在pH5.8下的抗原结合活性弱于在pH7.4下的抗原结合活性来进行。[13]使以与抗原结合的状态摄入细胞内的抗原结合分子以未与抗原结合的状态被释放到细胞外的 方法，该方法通过使抗原结合分子在PH5.8下的抗原结合活性弱于在PH7.4下的抗原结合活性来进行。[14]增加抗原结合分子的血浆中抗原消除能力的方法，该方法通过使抗原结合分子在pH5.8下的抗原结合活性弱于在pH7.4下的抗原结合活性来进行。[15] [9] [14]中任一项所述的方法，其特征在于:对于抗原的在pH5.8下的KD与在ρΗ7.4下的KD之比、即KD (pH5.8) /KD (ρΗ7.4)的值为2以上。[16] [9] [14]中任一项所述的方法，其特征在于:使KD(pH5.8) /KD (pH7.4)的值为10以上。[17] [9] [14]中任一项所述的方法，其特征在于:使KD(pH5.8) /KD (pH7.4)的值为40以上。[18]提高药物动力学的方法，该方法通过用组氨酸取代抗原结合分子的至少I个氨基酸或插入至少I个组氨酸来进行。[19]增加抗原结合分子与抗原的结合次数的方法，该方法通过用组氨酸取代抗原结合分子的至少I个氨基酸或插入至少I个组氨酸来进行。[20]增加抗原结合分子所能结合的抗原数目的方法，该方法通过用组氨酸取代抗原结合分子的至少I个氨基酸或插入至少I个组氨酸来进行。[21]使在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子上解离的方法，该方法通过用组氨酸取代抗原结合分子的至少I个氨基酸或插入至少I个组氨酸来进行。[22]使以与抗原结合的状态摄入细胞内的抗原结合分子以未与抗原结合的状态被释放到细胞外的方法，该方法通过用组氨酸取代抗原结合分子的至少I个氨基酸或插入至少I个组氨酸来进行。[23]增加抗原结合分子的血浆中抗原消除能力的方法，该方法通过用组氨酸取代抗原结合分子的至少I个氨基酸或插入至少I个组氨酸来进行。[24] [18] [23]中任一项所述的方法，其特征在于:通过取代成组氨酸或插入组氨酸，使pH5.8下的抗原结 合活性与在pH7.4下的抗原结合活性之比即KD(pH5.8)/KD (pH7.4)的值与组氨酸取代或插入前相比变大。[25] [9] [24]中任一项所述的方法，其特征在于:抗原结合分子具有拮抗活性。[26] [9] [25]中任一项所述的方法，其特征在于:抗原结合分子与膜抗原或可溶型抗原结合。[27] [9] [26]中任一项所述的方法，其特征在于:抗原结合分子为抗体。[28]抗原结合分子的筛选方法，该方法包括以下步骤:(a)获得ρΗ6.7 ρΗ10.0下的抗原结合分子的抗原结合活性的步骤；(b)获得ρΗ4.0 ρΗ6.5下的抗原结合分子的抗原结合活性的步骤；(c)选择ρΗ6.7 ρΗ10.0下的抗原结合活性高于ρΗ4.0 ρΗ6.5下的抗原结合活性的抗原结合分子的步骤。[29] [28]所述的筛选方法，其特征在于:选择ρΗ6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原结合活性为pH4.0 pH6.5下的抗原结合活性的两倍以上的抗体。[30]抗原结合分子的筛选方法，该方法包括以下步骤:(a)在ρΗ6.7 ρΗΙΟ.0的条件下使抗原结合分子与抗原结合的步骤；(b)将(a)的与抗原结合的抗原结合分子置于ρΗ4.0 ρΗ6.5的条件下的步骤；(c)获得在ρΗ4.0 ρΗ6.5的条件下解离的抗原结合分子的步骤。[31]第一 pH下的结合活性高于第二 pH下的结合活性的抗原结合分子的筛选方法，该方法包括以下步骤:(a)在第一 pH条件下使抗原结合分子与固定有抗原的柱结合的步骤；(b)在第二 pH条件下从柱上洗脱在第一 pH条件下与柱结合的抗原结合分子的步骤；(c)获得被洗脱的抗原结合分子的步骤。[32]第一 pH下的结合活性高于第二 pH下的结合活性的抗原结合分子的筛选方法，该方法包括以下步骤:(a)在第一 pH条件下使抗原结合分子文库与固定有抗原的柱结合的步骤；(b)在第二 pH条件下从柱上洗脱抗原结合分子的步骤；(c)扩增编码被洗脱的抗原结合分子的基因的步骤；(d)获得被洗脱的抗原结合分子的步骤。

[33] [31]或[32]所述的筛选方法，其特征在于:第一 pH为ρΗ6.7 ρΗΙΟ.0，第二pH 为 ρΗ4.0 ρΗ6.5。[34] [28] [33]中任一项所述的筛选方法，其中抗原结合分子是抗原结合分子中的至少I个以上的氨基酸被组氨酸取代或插入至少I个组氨酸的抗原结合分子。[35] [28] [33]中任一项所述的筛选方法，该方法以获得血浆中滞留性优异的抗原结合分子为目的。[36] [28] [33]中任一项所述的筛选方法，该方法以获得能够与抗原进行两次以上结合的抗原结合分子为目的。[37] [28] [33]中任一项所述的筛选方法，该方法以获得可结合的抗原数多于抗原结合位点的抗原结合分子为目的。[38] [28] [33]中任一项所述的筛选方法，该方法以获得在细胞内解离在细胞外结合的抗原的抗原结合分子为目的。[39] [28] [33]中任一项所述的筛选方法，该方法以获得以与抗原结合的状态摄入细胞内、以未与抗原结合的状态被释放到细胞外的抗原结合分子为目的。[40] [28] [33]中任一项所述的筛选方法，该方法以获得血浆中抗原消除能力增加的抗原结合分子为目的。[41] [28] [40]中任一项所述的筛选方法，其中抗原结合分子是用作药物组合物的抗原结合分子。[42] [28] [41]中任一项所述的筛选方法，其特征在于:抗原结合分子为抗体。[43]抗原结合分子的制备方法，该制备方法包括以下步骤:(a)获得pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原结合分子的抗原结合活性的步骤；(b)获得ρΗ4.0 ρΗ6.5下的抗原结合分子的抗原结合活性的步骤；(c)选择ρΗ6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原结合活性高于ρΗ4.0 ρΗ6.5下的抗原结合活性的抗原结合分子的步骤；(d)获得编码(C)中所选择的抗原结合分子的基因的步骤；(e)使用(d)中得到的基因制备抗原结合分子的步骤。[44]抗原结合分子的制备方法，该制备方法包括以下步骤:(a)在ρΗ6.7 ρΗΙΟ.0的条件下使抗原结合分子与抗原结合的步骤；(b)将(a)的与抗原结合的抗原结合分子置于ρΗ4.0 ρΗ6.5的条件下的步骤；(c)获得在ρΗ4.0 ρΗ6.5的条件下解离的抗原结合分子的步骤；(d)获得编码(C)中取得的抗原结合分子的基因的步骤；
(e)使用(d)中得到的基因制备抗原结合分子的步骤。[45]第一 pH下的结合活性高于第二 pH下的结合活性的抗原结合分子的制备方法，该制备方法包括以下步骤:(a)在第一 pH条件下使抗原结合分子与固定有抗原的柱结合的步骤；(b)在第二 pH条件下从柱上洗脱在第一 pH条件下与柱结合的抗原结合分子的步骤；(c)获得被洗脱的抗原结合分子的步骤；(d)获得编码(C)中取得的抗原结合分子的基因的步骤；(e)使用(d)中得到的基因制备抗原结合分子的步骤。[46]第一 pH下的结合活性高于第二 pH下的结合活性的抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下步骤:(a)在第一 pH条件下使抗原结合分子文库与固定有抗原的柱结合的步骤；(b)在第二 pH条件下从柱上洗脱抗原结合分子的步骤；(c)扩增编码被洗脱的抗原结合分子的基因的步骤；(d)获得被洗脱的抗原结合分子的步骤；(e)获得编码(d)中取得的抗原结合分子的基因的步骤；(f)使用(e)中得到的基`因制备抗原结合分子的步骤。[47] [45]或[46]所述的制备方法，其特征在于:第一 pH为ρΗ6.7 ρΗΙΟ.0，第二pH 为 ρΗ4.0 ρΗ6.5。[48] [43] [47]中任一项所述的制备方法，该制备方法进一步包括:用组氨酸取代抗原结合分子中的至少I个以上的氨基酸或插入至少I个组氨酸的步骤。[49] [43] [48]中任一项所述的制备方法，其特征在于:抗原结合分子为抗体。[50]药物组合物，其中含有利用[43] [49]中任一项所述的制备方法制备的抗原结合分子。发明效果根据本发明，提供使I分子的抗原结合分子与多个抗原反复结合的方法。I分子的抗原结合分子通过与多个抗原结合，可以提高抗原结合分子的药物动力学，且可以在体内发挥优于普通的抗原结合分子的效果。


图1是显示与膜型抗原结合的抗体的分解路径的图。图2是显示基于FcRn的IgG分子的补救机制的图。图3是显示IgG分子在核内体内从膜型抗原上解离，从而再次与新的抗原结合的示意图。图4是显示IgG分子在核内体内从可溶型抗原上解离，从而再次与新的抗原结合的示意图。图5是显示固定有抗原的柱淘选的图。图6是显示由柱淘选获得的克隆的噬菌体ELISA的结果的曲线图。上段是WT，下段是CL5。
图7是显示pH依赖性结合抗IL-6受体抗体的生物学中和活性的曲线图。图8是显示pH依赖性结合抗IL-6受体抗体在pH7.4下与可溶型IL_6受体结合的Biacore传感图的结果的图。最上的是WT，上起第2位是H3pl/L73，上起第3位是Hl70/L82，最下的是 CLH5/L73。图9是显示pH依赖性结合抗IL-6受体抗体在pH5.8下与可溶型IL_6受体结合的Biacore传感图的结果的图。最上的是WT，上起第2位是H3pl/L73，上起第3位是Hl70/L82，最下的是 CLH5/L73。图10是显示pH依赖性结合抗IL-6受体抗体与膜型IL-6受体结合(pH7.4)和解离(pH5.8)的Biacore传感图的结果的图。最上的是WT，上起第2位是H3pl/L73，上起第3 位是 H170/L82，最下的是 CLH5/L73。图11是显示pH依赖性结合抗IL-6受体抗体与SR344反复结合的Biacore的传感图。图12是显示在pH依赖性结合抗IL-6受体抗体与SR344反复结合试验中的总抗原结合量的曲线图。图13是显示pH依赖性结合抗IL-6受体抗体在人IL_6受体转基因小鼠体内的血浆中抗体浓度变化的曲线图。图14是显示pH依赖性结合抗IL-6受体抗体在食蟹猴体内的血浆中抗体浓度变化的曲线图。图15是显示pH依赖性结合抗IL-6受体抗体在食蟹猴体内的CRP浓度变化的曲线图。图16是显示pH依赖性结合抗IL-6受体抗体在食蟹猴体内的非结合型食蟹猴IL-6受体浓度变化的曲线图。图17是显示pH依赖性结合抗IL-6受体抗体与膜型IL_6受体结合(pH7.4)和解离(ρΗ5.8)的Biacore传感图的结果的图。上起依次为WT、H3pI/L73_IgGl、Fv2_IgGl、Fv4-1gGlo图18是显示pH依赖性结合抗IL-6受体抗体在人IL_6受体转基因小鼠体内的WT、H3pI/L73-1gGl、Fv2-1gGl、Fv4-1gGl的血浆中抗体浓度变化的曲线图。图19是显示pH依赖性结合抗IL-6受体抗体与膜型IL_6受体的结合(pH7.4)和解离(ρΗ5.8)的Biacore传感图的结果的图。上起依次为WT、Fv4-1gGl、Fv4-1gG2、Fv4-M58。图20是显示pH依赖性结合抗IL-6受体抗体在人IL_6受体转基因小鼠体内的WT、Fv4-1gGl、Fv4-1gG2、Fv4_M58的血浆中抗体浓度变化的曲线图。图21是显示pH依赖性结合抗IL-6受体抗体与膜型IL_6受体的结合(pH7.4)和解离(pH5.8)的Biacore传感图的结果的图。上起依次为Fvl_M71、Fvl_M73、Fv3_M71、Fv3-M73。图22 是显示在食蟹猴体内以 0.5mg/kg 给予 H3pI/L73_IgGl、Fvl_M71、Fvl_M73、Fv2-1gGl、Fv3-M73、Fv4-M73和以1.0mg/kg给予高亲和性抗体时，pH依赖性结合抗IL-6受体抗体的血浆中抗体浓度变化的曲线图。图23是显示在食蟹猴体内pH依赖性结合抗IL-6受体抗体的H3pI/L73_IgGl、Fvl-M71、Fvl-M73、Fv2_Ig Gl、Fv3_M73、Fv4_M73、高亲和性 Ab 给药组的 CRP 浓度变化的曲线图。图24是显示在食蟹猴体内pH依赖性结合抗IL-6受体抗体的H3pI/L73_IgGl、Fvl-M71、Fvl-M73、Fv2_IgGl、Fv3_M73、Fv4_M73、高亲和性Ab给药组的非结合型食蟹猴IL-6受体浓度变化的曲线图。图 25 是显示重链(VH1、VH2、VH3、VH4)和轻链(VL1、VL2、VL3)的 FR1、FR2、FR3、FR4和⑶R1、⑶R2、⑶R3的图。星号显示排比序列中存在氨基酸突变的位点。图26是显示作为pH依赖性结合抗IL-6抗体的抗IL6克隆2在pH7.4和pH5.5下与IL-6结合的Biacore传感图的结果的图。pH7.4的图从上起依次显示100、50、25、12.5、6.25ng/mL 的 IL-6。图27是显示作为pH依赖性结合抗IL-31受体抗体的抗IL31R克隆I在pH7.4和pH5.5下与IL-31受体结合的Biacore传感图的结果的图。pH5.5的图从上起依次显示100、50,25,12.5ng/mL 的 IL-31 受体。图28是显示对小鼠静脉内给予SR344和抗人IL_6受体抗体的混合溶液后的血浆中抗体浓度变化的图。图29是显示对小鼠静脉内给予SR344和抗人IL_6受体抗体的混合溶液后的血浆中SR344浓度变化的图。
具体实施例方式本发明提供增加抗原结合分子与抗原的结合次数的方法。更具体而言，提供通过使抗原结合分子在酸性PH下的抗原结合能力弱于在中性pH下的抗原结合能力，来增加抗原结合分子与抗原的结合次数的方法。本发明还提供增加抗原结合分子与抗原的结合次数的方法，其特征在于:将抗原结合分子的至少I个氨基酸取代成组氨酸或插入至少I个组氨酸。本发明还提供增加抗原结 合分子与抗原的结合次数的方法，其特征在于:取代、缺失、添加和/或插入抗原结合分子所含的抗体恒定区中的氨基酸。本发明还提供增加抗原结合分子所能结合的抗原数的方法。更具体而言，提供通过使抗原结合分子在酸性PH下的抗原结合能力弱于在中性pH下的抗原结合能力，来增加抗原结合分子所能结合的抗原数的方法。本发明还提供增加抗原结合分子所能结合的抗原数的方法，其特征在于:将抗原结合分子中的至少I个氨基酸取代成组氨酸或插入至少I个组氨酸。本发明还提供增加抗原结合分子所能结合的抗原数的方法，其特征在于:取代、缺失、添加和/或插入抗原结合分子所含的抗体恒定区中的氨基酸。本发明还提供使在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子上解离的方法。更具体而言，提供通过使抗原结合分子在酸性PH下的抗原结合能力弱于在中性PH下的抗原结合能力，使在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子上解离的方法。本发明还提供使在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子上解离的方法，其特征在于:将抗原结合分子的至少I个氨基酸取代成组氨酸或插入至少I个组氨酸。本发明还提供使在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子上解离的方法，其特征在于:取代、缺失、添加和/或插入抗原结合分子所含的抗体恒定区中的氨基酸。本发明还提供使以与抗原结合的状态摄入细胞内的抗原结合分子以未与抗原结合的状态被释放到细胞外的方法。更具体而言，提供通过使抗原结合分子在酸性PH下的抗原结合能力弱于在中性PH下的抗原结合能力，使以与抗原结合的状态摄入细胞内的抗原结合分子以未与抗原结合的状态被释放到细胞外的方法。本发明还提供使以与抗原结合的状态摄入细胞内的抗原结合分子以未与抗原结合的状态被释放到细胞外的方法，其特征在于:将抗原结合分子的至少I个氨基酸取代成组氨酸或插入至少I个组氨酸。本发明还提供使以与抗原结合的状态摄入细胞内的抗原结合分子以未与抗原结合的状态被释放到细胞外的方法，其特征在于:取代、缺失、添加和/或插入抗原结合分子所含的抗体恒定区中的氨基酸。本发明还提供增加抗原结合分子的血浆中抗原消除能力的方法。更具体而言，本发明提供通过使抗原结合分子在酸性PH下的抗原结合能力弱于在中性pH下的抗原结合能力，来增加抗原结合分子的血浆中抗原消除能力的方法。本发明还提供增加抗原结合分子的血浆中抗原消除能力的方法，其特征在于:将抗原结合分子的至少I个氨基酸取代成组氨酸或插入至少I个组氨酸。本发明还提供增加抗原结合分子的血浆中抗原消除能力的方法，其特征在于:取代、缺失、添加和/或插入抗原结合分子所含的抗体恒定区中的氨基酸。本发明还提供提高抗原结合分子的药物动力学的方法。更具体而言，提供通过使抗原结合分子在酸性PH下的抗原结合能力弱于在中性PH下的抗原结合能力，来提高抗原结合分子的药物动力学(延长血浆中滞留性)的方法。本发明还提供提高药物动力学的方法，其特征在于:将抗原结合分子的至少I个氨基酸取代成组氨酸或插入至少I个组氨酸。本发明还提供提高药物动力学的方法，其特征在于:取代、缺失、添加和/或插入抗原结合分子所含的抗体恒定区中的氨基酸。本发明还提供增加抗原结合分子的血浆中抗原消除能力的方法。更具体而言，提供通过使抗原结合分子在酸性PH下的抗原结合能力弱于在中性pH下的抗原结合能力，来增加抗原结合分子的血浆中抗原消除能力的方法。本发明还提供增加抗原结合分子的血浆中抗原消除能力的方法，其特征在于:将抗原结合分子的至少I个氨基酸取代成组氨酸或插入至少I个组氨酸。本发明还提供增加抗原结合分子的血浆中抗原消除能力的方法，其特征在于:取代、缺失、添加·和/或插入抗原结合分子所含的抗体恒定区中的氨基酸。本发明中，“药物动力学的提高”、“药物动力学的改善”或“优异的药物动力学”可以改称“血浆中(血中)滞留性的提高”、“血浆中(血中)滞留性的改善”、“优异的血浆中(血中)滞留性”，这些语句以相同的意义使用。本发明中，使酸性pH下的抗原结合能力弱于中性pH下的抗原结合能力，是指使抗原结合分子在pH4.0 pH6.5下的抗原结合活性弱于在pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原结合活性。优选使抗原结合分子在pH5.5 pH6.5下的抗原结合活性弱于在pH7.0 pH8.0下的抗原结合活性，特别优选使抗原结合分子在pH5.8下的抗原结合活性弱于在pH7.4下的抗原结合活性。因此，本发明中酸性pH通常是指pH4.0 pH6.5，优选为pH5.5 pH6.5，特别优选为ρΗ5.8。本发明中，中性pH通常是指ρΗ6.7 ρΗΙΟ.0，优选为ρΗ7.0 ρΗ8.0，特别优选为ΡΗ7.4。本发明中，“使抗原结合分子在酸性pH下的抗原结合能力弱于在中性pH下的抗原结合能力”的描述还可以描述成使抗原结合分子在中性下的抗原结合能力高于在酸性PH下的抗原结合能力。即，本发明中，只要增大抗原结合分子在酸性PH下的抗原结合能力与在中性pH下的抗原结合能力之差即可(例如象后述那样，只要增大KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值即可)。为了增大抗原结合分子在酸性PH下的抗原结合能力与在中性pH下的抗原结合能力之差，例如可以降低酸性PH下的抗原结合能力，也可以提高中性pH下的抗原结合能力，或者可以是两者。测定抗原的结合活性时，除pH以外的条件可以由本领域技术人员适当选择，没有特别限定，例如，如实施例所述，可以在MES缓冲液中、37°C的条件下进行测定。抗原结合分子的抗原结合活性的测定可以利用本领域技术人员所公知的方法进行，例如，如实施例所述，可以使用Biacore (GE Healthcare)等进行测定。当抗原为可溶型抗原时,通过使抗原以分析物的形式流经固定有抗原结合分子的芯片(chip)，可以评价抗原结合分子与可溶型抗原的结合能力；当抗原为膜型抗原时，通过使抗原结合分子以分析物的形式流经固定有抗原的芯片，可以评价抗原结合分子与膜型抗原的结合能力。本发明中， 只要酸性pH下的抗原结合活性弱于中性pH下的抗原结合活性，对酸性PH下的抗原结合活性与中性pH下的抗原结合活性之差没有特别限定，优选对于抗原的在pH5.8 下的 KD 与在ρΗ7.4 下的 KD (Dissociation constant:解离常数)之比即 KD (pH5.8)/KD(pH7.4)的值为2以上，进一步优选1 ( 册.8)/1(0( !17.4)的值为10以上，更进一步优选KD (pH5.8) /KD (ρΗ7.4)的值为40以上。对KD (pH5.8) /KD (ρΗ7.4)的值的上限没有特别限定，只要在本领域技术人员的技术中能够制作，可以是400、1000、10000等任何值。作为抗原结合活性的值，当抗原为可溶型抗原时，可以使用KD(解离常数)；当抗原为膜型抗原时，可以使用表观H) (Apparent dissociation constant:表观解离常数)。KD (解离常数)和表观KD(表观解离常数)可以按照本领域技术人员公知的方法进行测定，例如可以使用Biacore (GE healthcare)、斯卡恰特作图法(Scatchard plot)、FACS 等。本发明中，作为表示酸性pH下的抗原结合活性与中性pH下的抗原结合活性之差的其他指标，例如还可以使用解离速度常数kd(Dissociation rate constant:解离速度常数)。作为表示结合活性之差的指标，当使用kd(解离速度常数)来代替KD (解离常数)时，对于抗原的在PH5.8下的kd(解离速度常数)与在PH7.4下的kd(解离速度常数)之比即kd(pH5.8)/kd(pH7.4)的值优选为2以上，进一步优选为5以上，更进一步优选为10以上，更优选为30以上。对匕( 册.8)/\( !17.4)的值的上限没有特别限定，只要在本领域技术人员的技术常识内能够制作，可以是50、100、200等任何值。作为抗原结合活性的值，当抗原为可溶型抗原时，可以使用kd(解离速度常数)；当抗原为膜型抗原时，可以使用表观kd(Apparent dissociation rate constant:表观解离速度常数)。kd(解离速度常数)和表观kd(表观解离速度常数)可以按照本领域技术人员公知的方法进行测定，例如可以使用Biacore (GE healthcare)、FACS等。本发明中，在不同pH下测定抗原结合分子的抗原结合活性时，优选除pH以外的条件相同。对使抗原结合分子在pH5.8下的抗原结合活性弱于在pH7.4下的抗原结合活性的方法(赋予pH依赖性结合能力的方法)没有特别限定，可以通过任何方法来进行。可以列举:例如通过将抗原结合分子中的氨基酸取代成组氨酸、或在抗原结合分子中插入组氨酸，使pH5.8下的抗原结合活性弱于pH7.4下的抗原结合活性的方法。已知通过用组氨酸取代抗体中的氨基酸，可以赋予抗体PH依赖性的抗原结合活性(FEBS Letter, 309 (I)，85-88，(1992))。对导入(进行)组氨酸突变(取代)或插入的位点没有特别限定，只要与突变或插入前相比在PH5.8下的抗原结合活性弱于在pH7.4下的抗原结合活性(KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值变大)，可以是任何位点。例如，当抗原结合分子为抗体时，可以列举抗体的可变区等。导入(进行)组氨酸突变或插入的数可以由本领域技术人员适当确定，可以用组氨酸只取代I个位点，或者只在I个位点插入组氨酸，也可以用组氨酸取代2个位点以上的多个位点，或者在2个位点以上的多个位点插入组氨酸。还可以同时导入除组氨酸突变以外的突变(突变成组氨酸以外的氨基酸)。还可以同时进行组氨酸突变和组氨酸插入。组氨酸取代或组氨酸插入可以利用本领域技术人员所公知的、将丙氨酸分区(scanning)的丙氨酸取代成组氨酸的组氨酸分区等方法随机进行，可以从随机导入组氨酸突变或插入的抗原结合分子文库中选择与突变前相比KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值变大的抗原结合分子。将抗原结合分子的氨基酸取代成组氨酸或在抗原结合分子的氨基酸中插入组氨酸时，虽然没有特别限定，但优选组氨酸取代或插入后的抗原结合分子在PH7.4下的抗原结合活性与组氨酸取代或插入前的抗原结合分子在PH7.4下的抗原结合活性同等。这里，组氨酸取代或插入后的抗原结合分子在PH7.4下的抗原结合活性与组氨酸取代或插入前的抗原结合分子在PH7.4下的抗原结合活性同等，是指组氨酸取代或插入后的抗原结合分子维持着组氨酸取代或插入前的抗原结合分子所具有的抗原结合活性的10%以上、优选50%以上、进一步优选80%以上、更优选90%以上。通过组氨酸取代或插入，抗原结合分子的抗原结合活性变低时，通过抗原结合分子中的I或多个氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等，可以使抗原结合活性与组氨酸取代或插入前的抗原结合活性同等。本发明中，还包括这样的在组氨酸取代或插入后通过进行I个或多个氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入使结合活性同等的抗原结合分子。作为使抗原结合分子在pH5.8下的抗原结合活性弱于在pH7.4下的抗原结合活性的其他方法，可以列举 :将抗原结合分子中的氨基酸取代成非天然型氨基酸或在抗原结合分子中的氨基酸中插入非天然型氨基酸的方法。已知可以人为地控制非天然氨基酸的pKa(Angew.Chem.1nt.Ed.2005,44,34、Chem Soc Rev.2004Sepl0 ；33 (7):422_30、AminoAcids.1999 ； 16 (3-4):345-79)。因此，在本发明中，可以使用非天然型氨基酸来代替上述组氨酸。另外，上述组氨酸取代和/或插入以及非天然型氨基酸的取代和/或插入可以同时进行。本发明中使用的非天然型氨基酸可以是任何非天然型氨基酸，可以使用本领域技术人员所公知的非天然型氨基酸等。并且，当抗原结合分子是包含抗体恒定区的物质时，作为使抗原结合分子在pH5.8下的抗原结合活性弱于在PH7.4下的抗原结合活性的其他方法，可以列举:修饰抗原结合分子所含的抗体恒定区的方法。这样的抗体恒定区的修饰的具体例子有:例如实施例中所述的取代成恒定区的方法。作为抗体恒定区的修饰方法，可以列举:例如研究恒定区的多个同种型(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)，选择在pH5.8下的抗原结合活性降低(在pH5.8下的解离速度变快)的同种型的方法。还可以列举:通过向野生型同种型的氨基酸序列(野生型IgGl、IgG2、IgG3、IgG4氨基酸序列)中导入氨基酸取代，使在pH5.8下的抗原结合活性降低(在pH5.8下的解离速度变快)的方法。根据同种型(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)，抗体恒定区的铰链区的序列大不相同，由于铰链区的氨基酸序列的不同对抗原结合活性影响很大，所以通过根据抗原或表位的种类来选择适当的同种型，可以选择pH5.8下抗原结合活性降低的(pH5.8下的解离速度加快)同种型。由于铰链区的氨基酸序列的不同对抗原结合活性影响很大，所以作为野生型同种型的氨基酸序列的氨基酸取代位点，认为优选铰链区。利用上述方法等使抗原结合物质在pH5.8下的抗原结合活性弱于在pH7.4下的抗原结合活性(KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值变大)时，虽然没有特别限定，但优选与原始抗体相比，KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值通常为2倍以上，优选5倍以上，进一步优选10倍以上。本发明中，“药物动力学提高”不仅包括抗原结合分子从对人、小鼠、大鼠、猴、兔、狗等动物给药到从血浆中消除(例如，直至形成抗原结合分子在细胞内被分解等而无法返回到血浆中的状态)的时间变长，还包含抗原结合分子从给药起到从血浆中消除这一期间以能够与抗原结合的状态(例如，抗原结合分子未与抗原结合的状态)滞留在血浆中的时间变长。即使抗原结合分子存在于血浆中，当抗原已经与该抗原结合分子结合时，该抗原结合分子也无法与新的抗原结合。因此，若抗原结合分子未与抗原结合的时间变长，则能够与新的抗原结合的时间变长(能够与新的抗原结合的机会增多)，可以减少在体内抗原未与抗原结合分子结合的时间(换言之，可以延长抗原结合分子与抗原结合的时间)。例如，相对于存在于血浆中等体内的抗原(与抗原结合分子结合的分子和未与抗原结合分子结合的抗原的总量)，与抗原结合分子结合的抗原的比例，通常在给予抗原结合分子后经过一定时间即减少。但是，若抗原结合分子以能够与抗原结合的状态滞留的时间变长，则可以抑制(例如减少其减少的程度等)其减少，结果，自给予抗体起经过一定期间后，相对于体内存在的抗原，与抗原结合分子结合的抗原的比例变高。S卩，本发明的“药物动力学的提高”，未必是指从给予抗原结合分子到抗原结合分子消除的时间延长(变长)。下述情形也均包含在本发明的“药物动力学的提高”中:即使抗原结合分子从给药起到消除的时间没有变化，但抗原结合分子以能够与抗原结合的状态(例如抗原结合分子未与抗原结合的状态)滞留于血浆中的时间变长的情形；以及体内的抗原未与抗原结合分子结合的时间减少(换言之，抗原结合分子与抗原结合的时间变长)的情形；或者相对于体内存在的抗原，与抗原结合分子结合的抗原的比例变高的情形。因此，本发明的“药物动力学的提高”至少`包含以下(I) (4)。(I)从给予抗原结合分子到抗原结合分子从血浆中消除的时间延长。(2)给予抗原结合分子后，抗原结合分子以能够与抗原结合的状态存在于血浆中的时间延长。(3)给予抗原结合分子后，体内的抗原未与抗原结合分子结合的时间减少(抗原结合分子与体内的抗原结合的时间延长)。(4)相对于体内存在的抗原，与抗原结合分子结合的抗原的比例增加。当抗原为存在于血浆中的可溶型抗原时，即使抗原结合分子的药物动力学(从血浆中消除的速度)同等，有时抗原结合分子所结合的抗原的消除也变快。这与通过降低抗原的药物动力学(从血浆中的消除变快)，使相对于抗原的相对的抗原结合分子的药物动力学提高有关，即、与抗原结合分子以可与抗原结合的状态存在于血浆中的时间延长有关。因此，作为本发明的抗原结合分子的“药物动力学提高”的一种方式，还包含给予抗原结合分子后可溶型抗原从血浆中消除的速度(抗原结合分子的血浆中抗原消除能力)加快。本发明中，I分子的抗原结合分子是否与多个抗原结合，当抗原为膜型抗原时，可以根据抗原结合分子的药物动力学是否提高来判断。是否“药物动力学提高了”可以如下判断。例如，从给予抗原结合分子到抗原结合分子消除的时间是否延长，这可以通过测定抗原结合分子的血浆中半衰期、平均血浆中滞留时间、血浆中清除率等任意一个参数(7 7 —V 2今木于4夕7演習(二石理解(南山堂))来判断。例如，对小鼠、大鼠、猴、兔、狗、人等给予抗原结合分子时，当为血浆中半衰期变长或平均血浆中滞留时间变长的情况等时，可以说抗原结合分子的药物动力学提高。上述参数可以利用本领域技术人员所公知的方法来测定，例如使用药物动力学分析软件WinNonlin(Pharsight),按照附录的操作指南进行无区室分析(noncompartmental analysis),由此可以适当评价。抗原结合分子从给药到消除这一期间以可与抗原结合的状态存在于血浆中的时间是否被延长，这可以通过测定未与抗原结合的抗原结合分子的血浆中浓度，并测定未与抗原结合的抗原结合分子的血浆中半衰期、平均血浆中滞留时间、血浆中清除率等任一个参数来判断。未与抗原结合的抗原结合分子的血浆中浓度的测定可以按照本领域技术人员公知的方法进行，例如按照Clin Pharmacol.2008Apr ；48 (4):406-17中所述的方法进行测定。给予抗原结合分子后体内的抗原未与抗原结合分子结合的时间是否减少(抗原结合分子与抗原结合的时间变长)，这可以通过测定抗原结合分子未结合的非结合型抗原的血浆中浓度，根据非结合型抗原的血浆中浓度、或非 结合型抗原量相对于总抗原量的比例维持在低水平的期间来判断。非结合型抗原的血浆中浓度或非结合型抗原的抗原量相对于总抗原量的比例的测定可以按照本领域技术人员公知的方法进行，例如按照PharmRes.2006Jan ；23(1) =95-103中所述的方法进行测定。当抗原在体内显示出任何功能时，抗原是否被中和抗原的功能的抗原结合分子(拮抗分子，antagonistic molecule)结合，这还可以根据该抗原的功能是否被中和来评价。抗原的功能是否被中和，这可以通过测定反映抗原的功能的任何体内的标志物来评价。抗原是否被激活抗原的功能的抗原结合分子(激动分子，agonistic molecule)结合,这可以通过测定反映抗原的功能的任何体内的标志物来评价。对非结合型抗原的血浆中浓度的测定、非结合型抗原的抗原量相对于总抗原量的比例的测定、体内标志物的测定等测定没有特别限定，优选自给予抗原结合物质起经过一定时间后进行测定。本发明中，对自给予抗原结合物质起经过一定时间后没有特别限定，根据所给予的抗原结合物质的性质等，本领域技术人员可以适时确定，例如自给予抗原结合物质起经过I天后、自给予抗原结合物质起经过3天后、自给予抗原结合物质起经过7天后、自给予抗原结合物质起经过14天后、自给予抗原结合物质起经过28天后等。本发明中，优选在人体内的药物动力学提高。当难以测定在人体内的血浆中滞留性时，可以根据在小鼠(例如正常小鼠、人抗原表达转基因小鼠、人FcRn表达转基因小鼠等)或猴(例如食蟹猴等)体内的血浆中滞留性，预测在人体内的血浆中滞留性。对血浆中滞留性的测定方法没有特别限定，例如可以按照实施例所述的方法进行。抗原结合分子能否与抗原多次结合，这可以通过测定在与血浆中相同的中性条件下与抗原结合分子结合的抗原是否在与核内体内相同的酸性条件下解离、再次在中性条件下能够与多少抗原结合来评价。具体而言，使用Biacore这样的评价抗原结合分子_抗原反应的仪器，在中性条件下使抗原结合分子-抗原复合体作用，之后暴露于酸性条件下一定时间，之后再次在中性条件下测定抗原结合分子能否与抗原结合，由此可以进行评价。与修饰前的抗原结合分子相比，赋予了 PH依赖性结合能力的抗原结合分子的抗原结合量提高两倍时，可以说与修饰前的抗原结合分子相比，赋予了 PH依赖性结合能力的抗原结合分子的结合次数提高两倍。当抗原为膜型抗原，与抗原结合的抗原结合分子经由抗原被摄入并被溶酶体分解，从而从血浆中消除时，通过评价与修饰前的抗原结合分子相比，赋予了 PH依赖性结合能力的抗原结合分子的药物动力学或与抗原的结合期间是否提高或提高了多少，可以评价与修饰前的抗原结合分子相比，赋予了 PH依赖性结合能力的抗原结合分子的结合次数是否增加。例如，与修饰前的抗原结合分子相比，赋予了 PH依赖性结合能力的抗原结合分子与抗原的结合期间提高两倍时，可以说与修饰前的抗原结合分子相比，赋予了PH依赖性结合能力的抗原结合分子的结合次数提高两倍。另外，测定抗原结合分子未结合的非结合型抗原的血浆中浓度，当非结合型抗原的血浆中浓度、或非结合型抗原的抗原量相对于总抗原量的比例维持在低水平的时间延长两倍时，可以说与修饰前的抗原结合分子相比，赋予了 PH依赖性结合能力的抗原结合分子的结合次数提高两倍。当抗原为可溶型抗原时，在血浆中的中性条件下与抗原结合分子结合的抗原在核内体内解离，抗原结合分子返回血浆中时，抗原结合分子可以在血浆中的中性条件下再次与抗原结合，所以具有在核内体内的酸性条件下解离抗原的性质的抗原结合分子可以与抗原多次结合。和与抗原结合分子结合的抗原在核内体内未解离的情形(抗原维持着与抗原结合分子结合的状态返回血浆中)相比，与抗原结合分子结合的抗原在核内体内解离时，抗原被运送到溶酶体中被分解，所以抗原从血浆中消除的速度增加。即，以抗原从血浆中消除的速度为指标，还可以判断抗原结合分子能否与抗原多次结合。抗原从血浆中消除的速度的测定，例如还可以通过对体内给予抗原(例如膜抗原)和抗原结合分子，测定给药后血浆中的抗原浓度来进行。当抗原(例如膜抗原)在体内产生(分泌)时，若抗原从血浆中的消除速度增加，则血浆中抗原浓度降低，因此也可以以血浆中抗原浓度为指标，判断抗原结合分子能否与抗原多次结合。本发明中 ，“增加抗原结合分子与抗原的结合次数”是指，对人、小鼠、猴等给予抗原结合分子时，以抗原结合分子与抗原结合并摄入细胞内的步骤为I次，增加该步骤。即，在本发明中，“抗原结合分子两次与抗原结合”是指，抗原结合分子以与抗原结合的状态摄入细胞内，之后以解离了抗原的状态被释放到细胞外，被释放的抗原结合分子再次与抗原结合并摄入细胞内。抗原结合分子摄入细胞内时，抗原结合分子可以以结合I个抗原的状态摄入，也可以以结合2个或2个以上的抗原的状态摄入。本发明中，“抗原结合分子与抗原的结合次数增加”是指，不必所有抗原结合分子的抗原结合次数都增加，例如可以是抗原结合分子组合物所含的抗原结合分子中，两次以上与抗原结合的抗原结合分子的比例上升、或抗原结合分子组合物所含的抗原结合分子的结合次数的平均值上升等。本发明中，优选对人给予抗原结合分子时抗原结合分子与抗原的结合次数增加，但在难以测定在人体内的抗原结合次数时，根据体外的测定结果、在小鼠(例如表达抗原的转基因小鼠、表达人FcRn的转基因小鼠等)或猴(例如食蟹猴等)等体内的测定结果，可以预测在人体内的抗原结合次数。本发明中，优选抗原结合分子两次以上与抗原结合，例如优选抗原结合分子组合物中所含的抗原结合分子的至少10%以上、优选30%以上、进一步优选50%以上、更优选80%以上(例如90%以上、95%以上等)的抗原结合分子两次以上与抗原结合。本发明中，“增加抗原结合分子所能结合的抗原数”是指，在对人、小鼠、猴等动物给予抗原结合分子起到抗原结合分子被细胞内的溶酶体分解这一期间，增加抗原结合分子所能结合的抗原数。通常，IgG等抗体具有2个结合位点，所以I个抗体最多与2个抗原结合，与抗原结合的抗体摄入细胞内，与抗原一同被溶酶体分解。因此，通常IgG等抗体最多可以与2个抗原结合。利用本发明的方法，通过使抗体等抗原结合分子在核内体内的PH下的抗原结合活性弱于在血浆中的PH下的抗原结合活性，摄入细胞内的抗体等抗原结合分子在细胞内解离抗原，被释放到细胞外，能够再次与抗原结合。即，利用本发明的方法，可以与多于抗原结合分子的抗原结合位点数的数目 的抗原结合。具体而言，例如当为具有2个结合位点的IgG时，通过采用本发明的方法，在给予抗体到抗体被分解这一期间可以与3个以上、优选4个以上的抗原结合。例如，当抗体为中和抗体时，“增加抗原结合分子所能结合的抗原数”还可以是指增加抗原结合分子所能中和的抗原数。因此，当抗体为中和抗体时，还可以将“结合”与“中和”互换。本发明中，“增加抗原结合分子所能结合的抗原数”是指，不必所有抗原结合分子所能结合的抗原数都增加，例如可以是抗原结合分子组合物中所含的抗原结合分子所能结合的抗原数的平均值增加，还可以是能够与多于抗原结合分子的抗原结合位点数的抗原结合的抗原结合分子的比例增加等。本发明中，优选将抗原结合分子给予人时抗原结合分子所能结合的抗原数增加，当难以测定人体内的抗原数时，根据体外的测定结果、小鼠(例如表达抗原的转基因小鼠、表达人FcRn的转基因小鼠等)或猴(例如食蟹猴等)等的测定结果，可以预测人体内的可结合的抗原数。通常，当抗体为中和抗体时，认为上述抗原结合分子与抗原的结合次数与抗原结合分子所能中和的抗原数相关，因此抗原结合分子所能中和的抗原数的测定可以和上述抗原结合分子与抗原的结合次数的测定同样进行。本发明还提供:通过给予酸性pH下的抗原结合活性低于中性pH下的抗原结合活性的抗原结合分子，使抗原结合分子在体内两次以上与抗原结合的方法。本发明还涉及:在具有中和活性的抗原结合分子中，通过给予酸性pH下的抗原结合活性低于中性PH下的抗原结合活性的抗原结合分子，中和多于抗原结合分子的抗原结合位点数的数目的抗原的方法。优选涉及通过给予酸性PH下的抗原结合活性低于中性pH下的抗原结合活性的IgG，中和3个以上、优选4个以上的抗原的方法。本发明还涉及:通过使抗原结合分子在酸性pH下的抗原结合能力弱于在中性pH下的抗原结合能力，使在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子上解离的方法。本发明中，抗原从抗原结合分子上解离的位置只要是细胞内即可，可以是任何位置，优选为早期核内体内。本发明中，“在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子上解离”是指，未必与抗原结合分子结合摄入细胞内的抗原全部在细胞内从抗原结合分子上解离，只要与使抗原结合分子在酸性PH下的抗原结合能力低于在中性pH下的抗原结合能力之前相比，在细胞内从抗原结合分子上解离的抗原的比例增加即可。本发明还涉及:通过使抗原结合分子在酸性pH下的抗原结合能力弱于在中性pH下的抗原结合能力，促进细胞内的未与抗原结合的抗原结合分子与FcRn的结合的方法。通常，FcRn在核内体内与抗原结合分子结合，当抗原结合分子与膜型抗原结合时，认为其无法与FcRn结合，因此，作为本发明的优选方案，当抗原为膜型抗原时，可以列举下述方法:通过使抗原结合分子在核内体内的PH(酸性pH)下的抗原结合能力弱于在血浆中的pH(中性pH)下的抗原结合能力，促进核内体内的抗原结合分子从抗原上解离，促进抗原结合分子与FcRn的结合。当抗原为可溶型抗原时，可以列举下述方法:无论是否存在抗原的结合，抗原结合分子可以与FcRn结合，但若通过使抗原结合分子在核内体内的pH(酸性pH)下的抗原结合能力弱于在血浆中的pH(中性pH)下的抗原结合能力，在核内体内可以促进抗原从抗原结合分子上解离，则会促进“未与抗原结合”的抗原结合分子与FcRn的结合。无论抗原是膜型还是可溶型，只要未与抗原结合的抗原结合分子可以通过FcRn返回到血浆中，就可以再次与抗原结合，因此通过重复此过程，抗原结合分子可以多次与抗原结合。本发明中，“促进细胞内的抗原结合分子与FcRn的结合”是指，不必所有抗原结合分子都与FcRn结合，只要与使抗原结合分子在核内体内的pH下的抗原结合能力弱于在血浆中的PH下的抗原结合能力之前相比，细胞内与FcRn结合而未与抗原结合的抗原结合分子的比例增加即可。在本发明的促进细胞内的抗原结合分子与FcRn的结合的方法中，优选的抗原结合分子的例子有:与膜蛋白等膜型抗原(膜抗原)结合的抗原结合分子。其他优选的抗原结合分子的例子有:与可溶型蛋白等可溶型抗原结合的抗原结合分子。促进细胞内的抗原结合分子与FcRn的结合的方法，还可称作是增强抗原结合分子与细胞内(例如核内体内)的FcRn的结合活性的方法。本发明还涉及:通过使抗原结合分子在酸性pH下的抗原结合能力弱于在中性pH下的抗原结合能力，使以与抗原结合的状态摄入细胞内的抗原结合分子以未与抗原结合的状态被释放到细胞外的方法。本发明中，“使以与抗原结合的状态摄入细胞内的抗原结合分子以未与抗原结合的状态被释放到细胞外”是指，不必所有以与抗原结合的状态摄入细胞内的抗原结合分子都以未与抗原结合的状态被释放到细胞外，只要与使抗原结合分子在酸性pH下的抗原结合能力低于在中性pH下的抗原结合能力之前相比，被释放到细胞外的抗原结合分子的比例增加即可。优选被释放到细胞外的抗原结合分子维持抗原结合能力。使以与抗原结合的状态摄入细胞内的抗原结合分子以未与抗原结合的状态被释放到细胞外的方法，在抗原结合分子与抗原结合摄入细胞内的情况下，也可说成是赋予抗原结合分子以未与抗原结合的状态容易被释放到细胞外的性质的方法。本发明还涉及:通过使抗原结合分子在酸性pH下的抗原结合能力弱于在中性pH下的抗原结合能力，来增加抗原结合分子的血浆中抗原消除能力的方法。本发明中，“血浆中抗原消除能力”是指，对体内给予抗原结合分子或机体分泌时，使存在于血浆中的抗原从血浆中消除的能力。因此，本发明中，“抗原结合分子的血浆中抗原消除能力增加”是指，对体内给予抗原结合分子时，只要与使抗原结合分子在酸性PH下的抗原结合能力低于在中性PH下的抗原结合能力之前相比，抗原从血浆中消除的速度加快即可。抗原结合分子的血浆中抗原消除能力是否增加，例如可以通过对体内给予可溶型抗原和抗原结合分子，测定给药后的可溶型抗原的血浆中 浓度来判断。通过使抗原结合分子在酸性PH下的抗原结合能力低于在中性pH下的抗原结合能力，给予可溶型抗原和抗原结合分子后血浆中的可溶型抗原的浓度降低时，可以判断抗原结合分子的血浆中抗原消除能力增加。本发明还涉及:通过用组氨酸或非天然氨基酸取代抗原结合分子的至少I个氨基酸、或插入组氨酸或非天然氨基酸来提高抗原结合分子的药物动力学的方法。本发明还提供:通过用组氨酸或非天然氨基酸取代抗原结合分子的至少I个氨基酸、或插入组氨酸或非天然氨基酸来增加抗原结合分子与抗原的结合次数的方法。本发明还涉及:通过用组氨酸或非天然氨基酸取代抗原结合分子的至少I个氨基酸、或插入组氨酸或非天然氨基酸来增加抗原结合分子所能结合的抗原数的方法。本发明还提供:通过用组氨酸或非天然氨基酸取代抗原结合分子的至少I个氨基酸、或插入组氨酸或非天然氨基酸，使在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子上解离的方法。本发明还提供:通过用组氨酸或非天然氨基酸取代抗原结合分子的至少I个氨基酸、或插入组氨酸或非天然氨基酸，使以与抗原结合的状态摄入细胞内的抗原结合分子以未与抗原结合的状态被释放到细胞外的方法。本发明还提供:通过用组氨酸或非天然氨基酸取代抗原结合分子的至少I个氨基酸、或插入组氨酸或非天然氨基酸，使抗原结合分子的血浆中抗原消除能力增加的方法。对导入组氨酸或非天然氨基酸突变(取代、插入等)的位点没有特别限定，任何位点均可取代成组氨酸或非天然氨基酸，或者可以在任何位点插入组氨酸或非天然氨基酸。取代成组氨酸或非天然氨基酸或插入组氨酸或非天然氨基酸的位点的优选例子有:影响抗原结合分子的抗原结合能力的区。例如，当抗原结合分子为抗体时，可以列举抗体的可变区或CDR等。对导入组氨酸或非天然氨基酸突变的数没有特别限定，可以用组氨酸或非天然氨基酸只取代I个位点，或只在I个位点插入组氨酸或非天然氨基酸。或者，可以用组氨酸或非天然氨基酸取代2个位点以上的多个 位点，或者在多个位点插入组氨酸或非天然氨基酸。除了用组氨酸或非天然氨基酸取代或插入以外，可以同时进行其他氨基酸的缺失、添力口、插入和/或取代等。本发明中，作为取代成组氨酸或非天然氨基酸的位点的例子，当抗原结合分子为抗体时，考虑抗体的CDR序列或决定CDR的结构的序列作为修饰位点，可以列举例如以下位点。氨基酸位点以 Kabat 编号(Kabat EA 等人.1991.Sequences of Proteins ofImmunological Interest.NIH)表不。重链:H27、H31、H32、H33、H35、H50、H58、H59、H61、H62、H63、H64、H65、H99、HlOOb、H102轻链:L24、L27、L28、L32、L53、L54、L56、L90、L92、L94这些修饰位点中，认为H32、H61、L53、L90、L94是普遍性高的修饰位点。虽然没有特别限定，但在作为抗原为IL-6受体(例如人IL-6受体)时的优选的修饰位点，可以列举以下位点。重链:H27、H31、H32、H35、H50、H58、H61、H62、H63、H64、H65、HlOOb、H102轻链:L24、L27、L28、L32、L53、L56、L90、L92、L94组合多个位点并取代成组氨酸或非天然氨基酸时，优选的组合的具体例子有:例如 H27、H31、H35 的组合；H27、H31、H32、H35、H58、H62、H102 的组合;L32、L53 的组合；L28、L32、L53的组合等。并且，作为重链与轻链的取代位点的优选组合的例子，可以列举:H27、H31、L32、L53 的组合。虽然没有特别限定，但在抗原为IL_6(例如人IL-6)的情况下，作为优选的修饰位点，可以列举以下位点。重链:!132、昍9、册1、!199轻链:L53、L54、L90、L94虽然没有特别限定，但在抗原为IL-31受体(例如人IL-31受体)的情况下，优选的修饰位点有H33。这些位点中，可以只将I个位点用组氨酸或非天然氨基酸取代，也可以将多个位点用组氨酸或非天然氨基酸取代。本发明的方法可适用于不依赖靶抗原的种类的任意抗原结合分子。本发明中，抗原结合分子只要是与作为对象的抗原具有特异性的结合活性的物质即可，没有特别限定，抗原结合分子的优选的例子有:具有抗体的抗原结合区的物质。抗体的抗原结合区的例子有:CDR或可变区。当抗体的抗原结合区为CDR时，可以包含全长抗体所含的全部6个⑶R，也可以包含I个或2个以上的⑶R。当包含⑶R作为抗体的结合区时，所含的CDR可以进行氨基酸的缺失、取代、添加和/或插入等，或者可以是CDR的一部分。当抗原结合分子中包含抗体恒定区时，本发明还涉及:通过修饰(氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等)抗原结合分子中所含的抗体恒定区，来提高抗原结合分子的药物动力学的方法。

当抗原结合分子中包含抗体恒定区时，本发明还提供:通过修饰(氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等)抗原结合分子中所含的抗体恒定区，来增加抗原结合分子与抗原的结合次数的方法。当抗原结合分子中包含抗体恒定区时，本发明还涉及:通过修饰(氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等)抗原结合分子中所含的抗体恒定区，来增加抗原结合分子所能结合的抗原数的方法。当抗原结合分子中包含抗体恒定区时，本发明还涉及:通过修饰(氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等)抗原结合分子中所含的抗体恒定区，使在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子上解离的方法。当抗原结合分子中包含抗体恒定区时，本发明还涉及:通过修饰(氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等)抗原结合分子中所含的抗体恒定区，使以与抗原结合的状态摄入细胞内的抗原结合分子以未与抗原结合的状态被释放到细胞外的方法。当抗原结合分子中包含抗体恒定区时，本发明还涉及:通过修饰(氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等)抗原结合分子中所含的抗体恒定区，使抗原结合分子的血浆中抗原消除能力增加的方法。作为本发明的抗原结合物质的优选方案，可以列举包含FcRn结合区的抗原结合物质。包含FcRn结合区的抗原结合物质可以通过FcRn的补救路径摄入细胞内，之后再次返回到血浆中。FcRn结合区优选为直接与FcRn结合的区。FcRn结合区的优选的例子有:抗体的Fe区。但是，白蛋白或IgG等的能够和与FcRn具有结合能力的多肽结合的区，可以经由白蛋白或IgG等间接地与FcRn结合，因此，本发明中的FcRn结合区可以是和与这样的FcRn具有结合能力的多肽结合的区。对作为本发明的方法的对象的抗体等的抗原结合分子所识别的抗原没有特别限定，可以以识别任何抗原的抗体作为对象。利用本发明的方法提高药物动力学的抗体的例子有:例如识别受体蛋白(膜结合型受体、可溶型受体)或细胞表面标志物等膜抗原的抗体、识别细胞因子等可溶型抗原的抗体等。本发明中，膜抗原的优选的例子有:膜蛋白。本发明中，可溶型抗原的例子有:可溶型蛋白。利用本发明的方法使药物动力学提高的抗体所识别的抗原的具体例子有:例如 IL-1、IL-2、IL-3、IL_4、IL_5、IL_6、IL_7、IL_8、IL-9、IL-10、IL-1U IL-12、IL-15、IL-31、IL-23、IL-2 受体、IL-6 受体、OSM 受体、gpl30、IL-5受体、CD40、CD4、Fas、骨桥蛋白、CRTH2、CD26、PDGF-D、CD20、单核细胞趋化活化因子、CD23、TNF-a ,HMGB-U α 4 整合素、ICAM_l、CCR2、CDlla、CD3、IFN Y、BLyS、HLA_DR、TGF_ β、CD52、IL-31受体等。特别优选的抗原有IL-6受体。作为本发明的方法的对象的抗原结合分子，可以列举:具有拮抗活性的抗原结合分子(拮抗抗原结合分子)、具有激动活性的抗原结合分子(激动抗原结合分子)等，作为优选方案，可以列举:拮抗抗原结合分子、特别是识别受体等的膜抗原或细胞因子等的可溶型抗原的拮抗抗原结合分子。例如，识别受体的拮抗抗原结合分子是与受体结合，阻碍受体与其配体的结合，抑制由受体介导的信号传递的抗原结合分子。本发明中，对作为对象的抗原结合分子没有特别限定，可以是任何的抗原结合分子。本发明中使用的抗原结合分子优选具有抗原结合活性(抗原结合区)和FcRn结合区。本发明中，特别优选为包含人FcRn结合区的抗原结合分子。具有抗原结合活性和FcRn结合区的抗原结合分子的例子有抗体。本发明的抗体的优选例子有IgG抗体。使用IgG抗体作为抗体时，对其种类没有限定，可以使用IgGl、IgG2、IgG3、IgG4等同种型(亚纲)的IgG0对于这些同种型的IgG的恒定区，可以象M73那样，向恒定区部分导入氨基酸突变。导入的氨基酸突变可以列举:例如增大或减少与Fe Y受体的结合的氨基酸突变(Proc NatlAcad Sci U S A.2006Mar l4 ； 103 (I I):4005-10)、增大或减少与FcRn的结合的氨基酸突变(J Biol Chem.2001Mar2 ；276(9) =6591-604)等，但并不限于这些。另外，通过选择IgG2等的适当的恒定区，也可以改变pH依赖性结合。当作为本发明的对象的抗原结合分子为抗体时，抗体可以是小鼠抗体、人抗体、大鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、骆驼抗体等来源于任一种动物的抗体。而且，可以是例如嵌合抗体、其中人源化抗体等取代了氨基酸序列的修饰抗体。还可以是双重特异性抗体、结合有各种分子的抗体修饰物、包含抗体片段的多肽等。“嵌合抗体”是指将来源于不同动物的序列组合而制作的抗体。嵌合抗体的具体例子有:例如包括小鼠抗体的重链、轻链的可变(V)区和人抗体的重链、轻链的恒定(C)区的抗体。“人源化抗体”也称作重构(reshaped)人抗体，是将来源于人以外的哺乳动物的抗体、例如小鼠抗体的互补性决定区(⑶R，complementarity determining region)移植到人抗体的⑶R中而得到的抗体。用于鉴定⑶R的方法是公知的(Kabat等人，Sequenceof Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health,Bethesda, Md.;Chothia等人，Nature (1989) 342:877)。另外，其通常的基因重组方法也是公知的(参照欧洲专利申请公开号EP125023号公报、W096/02576号公报)。
双重特异性抗体是指在同一抗体分子内具有识别不同表位的可变区的抗体。双重特异性抗体可以是识别2个以上不同抗原的抗体，也可以是识别同一抗原上的不同的2个以上表位的抗体。作为包含抗体片段的多肽，例如有Fab片段、F (ab’)2片段、scFv (NatBiotechnol.2005Sep ;23 (9):1126-36)结构域抗体(dAb) (W02004/058821，W02003/002609)、scFv_Fc (W02005037989)、dAb_Fc、Fc 融合蛋白等。这些分子中，特别是包含Fe区的分子具有与FcRn的结合活性，所以适于采用本发明中发现的方法。并且，本发明可以使用的抗原结合分子可以是抗体样分子。抗体样分子是指通过与祀分子结合来发挥作用的分子(Current Opinion in Biotechnology2006,17:653_658、Current Opinion in Biotechnology 2007,18:1-10、Current Opinionin Structural Biologyl997,7:463-469> Protein Science2006,15:14-27),例如有DARPins(W02002/020565)、Affibody (亲和体)(WOl995A)Ol937)、Avimer (冊2004/044011，W02005/040229) ,Adnectin(W02002/032925)等。即使是这些抗体样分子，只要其能够与靶分子进行PH依赖性结合，就可以以I分子与多个靶分子结合。抗原结合分子可以是进行靶向结合的受体蛋白和受体Fe融合蛋白，例如有TNFR-Fc融合蛋白、ILlR-Fc融合蛋白、VEGFR-Fc融合蛋白、CTLA4_Fc融合蛋白等(NatMed.2003Jan ；9(1):47-52, BioDrugs.2006 ；20(3):151-60)。即使是这些受体蛋白和受体Fe融合蛋白，只要其能够与靶分子进行pH依赖性结合，就可以以I分子与多个靶分子结合。抗原结合分子还可以是与靶向结合具有中和效果的人工配体蛋白和人工配体融合蛋白，例如有突变IL-6(EMB0 J.1994Decl5 ；13(24):5863-70)等。即使是这些人工配体蛋白和人工配体融合蛋白，只要其能够与靶分子进行pH依赖性结合，就可以以I分子与多个革El分子结合。并且，本发明的抗体可以是糖链被修饰的抗体。糖链被修饰的抗体的例子有:例如糖苷化修饰的抗体(W099/54342等)、糖链中添加的岩藻糖缺失的抗体(W000/61739、W002/31140, W02006/067·847, W02006/067913 等)、具有含二等分(bisecting)GlcNAc 的糖链的抗体(W002/79255等)等。本发明的方法不受特定理论的限定，例如使酸性pH下的抗原结合能力弱于中性PH下的抗原结合能力、提高药物动力学、以及多次与抗原结合的关系可以如下说明。例如，当抗体是与膜抗原结合的抗体时，给予体内的抗体与抗原结合，之后抗体保持着与抗原结合的状态和抗原一起通过内化作用摄入细胞内的核内体中。之后，抗体保持着与抗原结合的状态向溶酶体移动，抗体与抗原一起被溶酶体分解。由内化作用介导的从血浆中的消除被称作抗原依赖性消除，在大多数抗体分子中有报道(Drug DiscovToday.2006Jan ;11(1_2):81-8)。当I分子的IgG抗体以二价与抗原结合时，以I分子的抗体与2分子的抗原结合的状态被内化，直接被溶酶体分解。因此，当为普通抗体时，I分子的IgG抗体无法与3分子以上的抗原结合。例如，当为具有中和活性的I分子的IgG抗体时，无法中和3分子以上的抗原。IgG分子的血浆中滞留性较长(消除慢)，这是由于作为IgG分子的补救受体而已知的FcRn在起作用。通过胞饮作用摄入核内体中的IgG分子，其在核内体内的酸性条件下与在核内体内表达的FcRn结合。无法与FcRn结合的IgG分子摄入溶酶体内，被溶酶体分解，但与FcRn结合的IgG分子向细胞表面移动，在血浆中的中性条件下自FcRn上解离，又返回到血浆中。当抗体是与可溶型抗原结合的抗体时，给予体内的抗体与抗原结合，之后抗体保持着与抗原结合的状态摄入细胞内。摄入细胞内的抗体多半通过FcRn被释放到细胞外，但由于是保持着与抗原结合的状态被释放到细胞外，因此无法再次与抗原结合。因此，和与膜抗原结合的抗体一样，当为普通抗体时，I分子的IgG抗体无法与3分子以上的抗原结合。本发明人等认为:通过内化作用与膜抗原等抗原结合的抗体摄入细胞内的核内体中时，与抗原结合着的抗体移动到溶酶体中被分解，相对于此，在核内体内抗原已解离的IgG抗体可以与在核内体内表达的FcRn结合。即，本发明人等发现:在血浆中与抗原强力结合、在核内体内与抗原微弱结合的抗体，在血浆中与抗原结合，与抗原形成复合体，在此状态下通过内化作 用摄入细胞内的核内体内，在核内体内与抗原解离后，与FcRn结合并向细胞表面移动，以未与抗原结合的状态再次返回到血浆中，可以中和多个膜型抗原。进一步发现:具有在血浆中与抗原强力结合、在核内体内与抗原微弱结合的性质的抗体，即使在与可溶型抗原等抗原结合的情况下，在核内体内也与抗原解离，因此以未与抗原结合的状态再次被释放到血浆中，可以中和多个可溶型抗原。特别是本发明人等着眼于血浆中的pH与核内体内的pH不同，发现在血浆中的pH条件下与抗原强力结合、在核内体内的pH条件下与抗原微弱结合的抗体，I个抗体分子可以与多个抗原结合，血浆中滞留性优异。核内体是膜小胞之一，在真核细胞的细胞质内形成网络，在从细胞膜到溶酶体的过程中掌管高分子的代谢。据报道，核内体内的pH通常为pH5.5 pH6.0的酸性(Nat RevMol Cell Biol.2004Feb ；5(2):121-32)，又已知血浆中的pH几乎为中性(通常为ρΗ7.4)。因此，酸性pH下的抗原结合活性弱于中性pH下的抗原结合活性的抗原结合分子在中性pH的血浆中与抗原结合摄入细胞内，之后在酸性pH的核内体内与抗原解离。与抗原解离的抗原结合分子与FcRn结合并向细胞表面移动，以未与抗原结合的状态再次返回到血浆中，结果，可以与抗原多次结合，药物动力学提高。<抗原结合分子物质>本发明还提供在pH4.0 pH6.5下的抗原结合活性低于在pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原结合活性的抗原结合分子、优选在pH5.0 pH6.0下的抗原结合活性低于在pH7.0
8.0下的抗原结合活性的抗原结合分子。在pH4.0 pH6.5下的抗原结合活性低于在pH6.7 10.0下的抗原结合活性的抗原结合分子的具体例子有:pH5.8下的抗原结合活性低于PH7.4下的抗原结合活性的抗原结合分子。pH5.8下的抗原结合活性低于pH7.4下的抗原结合活性的抗原结合分子还可称作PH7.4下的抗原结合活性高于pH5.8下的抗原结合活性的抗原结合分子。本发明的pH5.8下的抗原结合活性低于pH7.4下的抗原结合活性的抗原结合分子，只要其在PH5.8下的抗原结合活性低于在pH7.4下的结合即可，对其结合活性之差没有限定，即使差别甚微但只要PH5.8下的抗原结合活性低即可。作为本发明的pH5.8下的抗原结合活性低于pH7.4下的抗原结合活性的抗原结合分子的优选方案，可以列举PH7.4下的抗原结合活性为pH5.8下的抗原结合活性的两倍以上的抗原结合分子；作为进一步优选的方案，可以列举PH7.4下的抗原结合活性为pH5.8下的抗原结合活性的10倍以上的抗原结合分子；作为更优选的方案，可以列举pH7.4下的抗原结合活性为pH5.8下的抗原结合活性的40倍以上的抗原结合分子。具体而言，作为本发明的pH5.8下的抗原结合活性低于pH7.4下的抗原结合活性的抗原结合分子的优选方案，对于抗原的在PH5.8下的KD与在pH7.4下的KD之比、SPKD (pH5.8) /KD (pH7.4)的值为2以上，进一步优选KD (pH5.8) /KD (pH7.4)的值为10以上，更进一步优选KD (pH5.8) /KD (ρΗ7.4)的值为40以上。对KD (pH5.8) /KD (ρΗ7.4)的值的上限没有特别限定，只要在本领域技术人员的技术中可以制作，可以是400、1000、10000等任何值。并且，作为本发明的在ρΗ5.8下的抗原结合活性低于在ρΗ7.4下的抗原结合活性的抗原结合分子的其他优选方案，对于抗原在ΡΗ5.8下的kd与在pH7.4下的kd之比、SPkd(pH5.8)/kd(pH7.4)的值为2以上，优选kd(pH5.8)/kd(pH7.4)的值为5以上，进一步优选kd(pH5.8)/kd(pH7.4)的值为10以上，更进一步优选kd (pH5.8)/kd(pH7.4)的值为30以上。对&( !15.8)/\1( !17.4)的值的上限没有特别限定，只要在本领域技术人员的技术中可以制作，可以是50、100、200等任何值。测定抗原的结合活性时，除pH以外的条件可以由本领域技术人员适当选择，没有特别限定，例如，如实施例所述，可以在MES缓冲液中、37°C的条件下进行测定。另外，抗原结合分子的抗原结合活性的测定可以利用本领域技术人员所公知的方法进行，例如，如实施例所述，可以使用Biacore TlOO (GE Healthcare)等进行测定。认为这样的在酸性pH下与抗原微弱结合的抗原结合分子在核内体内的酸性条件下容易自抗原上解离，认为其在细胞内被内化后与FcRn结合，容易被释放到细胞外。在细胞内未被分解而被释放到细胞外的抗原结合分子可以再次与抗原结合。因此，例如当抗原结合分子为中和抗原结合分子时，在核内体内的酸性条件下容易自抗原上解离的抗原结合分子可以多次与 抗原结合并中和抗原。结果，PH4.0 pH6.5下的抗原结合活性低于PH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原结合活性的抗原结合分子成为血浆中滞留性优异的抗原结合分子。作为在pH5.8下的抗原结合活性低于在pH7.4下的抗原结合活性的抗原结合分子的优选方案，可以列举抗原结合分子中的至少I个氨基酸被取代成组氨酸或非天然氨基酸、或插入有至少I个组氨酸或非天然氨基酸的抗原结合分子。对导入组氨酸或非天然氨基酸突变的位点没有特别限定，只要与取代前相比PH5.8下的抗原结合活性弱于pH7.4下的抗原结合活性(KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值变大、或kd(pH5.8)/kd(pH7.4)的值变大)，可以是任何位点。例如，当抗原结合分子为抗体时，可以是抗体的可变区或CDR等。被取代成组氨酸或非天然氨基酸的氨基酸的数或插入的氨基酸的数可以由本领域技术人员适当确定，可以用组氨酸或非天然氨基酸取代I个氨基酸，也可以插入I个氨基酸，还可以用组氨酸或非天然氨基酸取代2个以上的多个氨基酸，也可以插入2个以上的氨基酸。另外，除取代成组氨酸或非天然氨基酸、或者插入组氨酸或非天然氨基酸以外，还可以同时进行其他氨基酸的缺失、添加、插入和/或取代等。取代成组氨酸或非天然氨基酸、或者插入组氨酸或非天然氨基酸，这可以利用本领域技术人员公知的将丙氨酸分区的丙氨酸取代成组氨酸的组氨酸分区等方法随机进行，也可以从随机导入了组氨酸或非天然氨基酸突变的抗原结合分子中选择与突变前相比KD(pH5.8)/KD(pH7.4)或kd(pH5.8)/kd(pH7.4)的值变大的抗原结合分子。作为如此地突变成组氨酸或非天然氨基酸、且在pH5.8下的抗原结合活性低于在PH7.4下的抗原结合活性的抗原结合分子的优选例子，可以列举如:突变成组氨酸或非天然氨基酸后在PH7.4下的抗原结合活性与突变成组氨酸或非天然氨基酸之前在pH7.4下的抗原结合活性同等的抗原结合分子。本发明中，组氨酸或非天然氨基酸突变后的抗原结合分子与组氨酸或非天然氨基酸突变前的抗原结合分子具有同等的抗原结合活性，是指以组氨酸或非天然氨基酸突变前的抗原结合分子的抗原结合活性为100%时，组氨酸或非天然氨基酸突变后的抗原结合分子的抗原结合活性至少为10%以上、优选50%以上、进一步优选80%以上、更优选为90%以上。组氨酸或非天然氨基酸突变后在pH7.4下的抗原结合活性可以高于组氨酸或非天然氨基酸突变前在PH7.4下的抗原结合活性。通过组氨酸或非天然氨基酸的取代或插入，抗原结合分子的抗原结合活性变低时，可以通过取代、缺失、添加和/或插入抗原结合分子中的I个或多个氨基酸等，使抗原结合活性与组氨酸取代或插入前的抗原结合活性同等。本发明还包含:在这样的组氨酸取代或插入后，通过进行I个或多个氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入，使结合活性同等的抗原结合分子。并且，当抗原结合分子为包含抗体恒定区的物质时，在pH5.8下的抗原结合活性低于在PH7.4下的抗原结合活性的抗原结合分子的其他优选方案有:修饰抗原结合分子中所含的抗体恒定区的方法。修饰后的抗体恒定区的具体例子有:例如实施例中记载的恒定区。利用上述方法等使抗原结合物质的pH5.8下的抗原结合活性弱于pH7.4下的抗原结合活性(KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值变大)时，虽然没有特别限定，但优选与原始抗体相t匕，KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值通常为2倍以上、优选5倍以上、进一步优选10倍以上。本发明的抗原结合分子，只要其在pH4.0 pH6.5下的抗原结合活性低于在PH6.7 10.0下的抗原结合活性，除此之外可以具有任何性质，例如可以是激动抗原结合分子或拮抗抗原结合分子等。本发明的优选的抗原结合分子的例子有:拮抗抗原结合分子。拮抗抗原结合分子通常是抑制配体(激动剂)与受体的结合、抑制受体介导的向细胞内传递信号的抗原结合分子。本发明还提供:以下的至少I个位点的氨基酸被取代成组氨酸或非天然氨基酸的抗体。氨基酸位点以 Kabat 编号(Kabat EA 等人.1991.Sequences of Proteins ofImmunological Interest.NIH)表不。重链:H27、H31、H32、H33、H35、H50、H58、H59、H61、H62、H63、H64、H65、H99、HlOOb、H102轻链:L24、L27、L28、L32、L53、L54、L56、L90、L92、L94这些修饰位点中，认为H32、H61、L53、L90、L94是普遍性高的修饰位点。虽然没有特别限定，但在抗原为IL-6受体(例如人IL-6受体)的情况下，优选的修饰位点有以下位点。重链:H27、H31、H32、H35、H50、H58、H61、H62、H63、H64、H65、HlOOb、H102轻链:L24、L27、L28、L32、L53、L56、L90、L92、L94将多个位点组合起来取代成组氨 酸或非天然氨基酸时，优选的组合的具体例子有:例如 H27、H31、H35 的组合，H27、H31、H32、H35、H58、H62、H102 的组合，L32、L53 的组合，L28、L32、L53的组合等。并且，重链与轻链的取代位点的优选组合的例子有:H27、H31、L32、L53的组合。虽然没有特别限定，但在抗原为IL-6 (例如人IL-6)的情况下，优选的修饰位点有以下位点。重链:!132、昍9、册1、!199轻链:L53、L54、L90、L94虽然没有特别限定，但在抗原为IL-31受体(例如人IL-31受体)的情况下，优选的修饰位点有H33。本发明的抗原结合分子所识别的抗原可以是任何抗原。本发明的抗体所识别的抗原的具体例子有:上述受体蛋白(膜结合型受体、可溶型受体)、细胞表面标志物等膜抗原或细胞因子等可溶型抗原、例如 IL-1、IL-2、IL-3、IL_4、IL_5、IL_6、IL_7、IL_8、IL-9、IL-10、IL-1U IL- 12、IL-15、IL-31、IL-23、IL-2 受体、IL-6 受体、OSM 受体、gpl30、IL-5受体、CD40、CD4、Fas、骨桥蛋白、CRTH2、CD26、PDGF-D, CD20、单细胞趋化活化因子、CD23、TNF-a ,HMGB-U α 4 整合素、ICAM-1、CCR2、CDlla、CD3、IFN Y、BLyS、HLA_DR、TGF_ β、CD52、IL-31受体等。特别优选的抗原例如有:IL_6受体。本发明的抗原结合分子如上所述。本发明中，作为抗原结合分子的优选的方案，可以列举抗体。具有抗原结合活性和FcRn结合区的抗体的例子有:IgG抗体。使用IgG抗体作为抗体时，对其种类没有限定，可以使用 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4 等。对本发明的抗体的来源没有特别限定，可以是任何来源的抗体，可以使用例如小鼠抗体、人抗体、大鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、骆驼抗体等。而且，可以是例如上述嵌合抗体、其中人源化抗体等取代了氨基酸序列的修饰抗体。还可以是上述的双重特异性抗体、结合有各种分子的抗体修饰物、包含抗体片段的多肽、糖链修饰抗体等。嵌合抗体的制作是公知的，例如，当为人-小鼠嵌合抗体时，连接编码抗体V区的DNA和编码人抗体C区的DNA，将其插入表达载体中并导入到宿主中产生抗体，从而可以得到嵌合抗体。“人源化抗体”也称作重构(reshaped)人抗体，是将来源于人以外的哺乳动物的抗体例如小鼠抗体的互补性决定区(CDR)移植到人抗体的CDR中而得到的抗体。用于鉴定 CDR 的方法是公知的(Kabat 等人，Sequence of Proteins of ImmunologicalInterest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.；Chothia 等人，Nature (1989) 342:877)。另外，其通常的基因重组方法也是公知的(参照欧洲专利申请公开号EP125023号公报、W096/02576号公报)。人源化抗体可以利用公知的方法如下产生:例如，确定小鼠抗体的CDR，将该CDR和人抗体的构架区(FR)连接得到抗体，获取编码所得抗体的DNA，之后通过使用通常的表达载体的系统产生人源化抗体。上述DNA可以使用多个寡核苷酸作为引物，通过PCR法来合成，上述寡核苷酸制作成在CDR和FR的末端区均具有重叠部分(参照W098/13388号公报中记载的方法)。选择经由⑶R连接的人抗体的FR，使CDR形成良好的抗原结合位点。根据需要，可以修饰抗体可变区中FR的氨基酸，使重构人抗体的CDR形成合适的抗原结合位点(Sato等人，Cancer Res.(1993)53:10.01-6)。在可修饰的FR中的氨基酸残基中，包括通过非共价键直接与抗原结合的部分(Amit等人，Science (1986) 233:747-53)、影响或作用于 CDR 结构的部分(Chothia 等人，J.Mol.Biol.(1987) 196 =901-17)以及与VH-VL相互作用有关的部分(EP239400号专利公报)。当本发明中的抗体为嵌合抗体或人源化抗体时，上述抗体的C区优选使用来源于人抗体的C区。例如，在H链中可以使用Cy 1、Cy2、Cy3、Cy4等；在L链中可以使用Ck、CA等。为了增大或降低与Fcy受体或FcRn的结合、为了改善抗体的稳定性或抗体的产生，根据需要可以向人抗体C区中导入氨基酸突变。本发明中的嵌合抗体优选包含来源于人以外的哺乳动物的抗体的可变区和来源于人抗体的恒定区。而人源化抗体优选包含来源于人以外的哺乳动物的抗体的CDR和来源于人抗体的FR和C区。来源于人抗体的恒定区优选包含FcRn结合区，这样的抗体的例子有:IgG(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)。本发明中的人源化抗体所使用的恒定区可以是属于任意同种型的抗体的恒定区。优选使用人IgG的恒定区，但并不受限于此。对用于人源化抗体的来源于人抗体的FR也没有特别限定，可以是属于任意同种型的抗体的FR。本发明中的嵌合抗体和人源化抗体的可变区和恒定区，只要显示出原始抗体的结合特异性即可，可以通过缺失、取代、插入和/或添加等进行修饰。使用来源于人的序列得到的嵌合抗体和人源化抗体，由于其在人体内的免疫原性降低，所以当为了治疗目的等对人进行给药时有用。本发明的抗体可以利用任何方法而得到，例如，对于本来在pH5.8下的抗原结合活性高于在PH7.4下的抗原结合活性的抗体或抗原结合活性为相同程度的抗体，通过上述的组氨酸取代等，可以人为地使在PH5.8下的抗原结合活性低于在pH7.4下的抗原结合活性，还可以从由以下所示的抗体文库或杂交瘤得到的多个抗体中筛选在PH5.8下的抗原结合活性低于在PH7.4下的抗原结合活性的抗体，从而选择本发明的抗体。将抗体中的氨基酸取代成组氨酸时，导入组氨酸突变之前的抗体的H链或L链的氨基酸序列还可以使用已知的序列，还可以使用按照本领域技术人员所公知的方法新获得的抗体的氨基酸序列。例如，抗体既可以由抗体文库获得，也可以由产生单克隆抗体的杂交瘤克隆编码抗体的基因而获得。关于抗体文库，已经有多个抗体文库为人所公知，另外抗体文库的制作方法也是公知的，所以本领域技术人员可以获取适当的抗体文库。例如，关于抗体噬菌体文库，可以参照 Clackson 等人，Naturel991, 352:624-8 ；Marks 等人，J.Mol.Biol.1991,222:581-97 ；ffaterhouses 等人，Nucleic Acids Res.1993,21:2265-6 !Griffiths 等人，EMBOJ.1994,13:324.0-60 ；Vaughan 等人，Nature Biotechno logy 1996,14:309-14 和日本特表平20-504970号公报等文献。此外，可以使用以真核细胞作为文库的方法(W095/15393号小册子)或核糖体提示法等公知方法。而且，还已知使用人抗体文库，通过淘选获得人抗体的技术。例如，可以以人抗体的可变区作为单链抗体(scFv)，通过噬菌体展示法使之在噬菌体表面表达，来选择与抗原结合的曬菌体。分析所选择的曬菌体的基因，可以确定编码与抗原结合的人抗体可变区的DNA序列。一旦清楚了与抗原结合的scFv的DNA序列，就可以根据该序列制作适当的表达载体，获得人抗体。上述方法已经众所周知，可以参考W092/01047、W092/20791、W093/06213、W093/11236、W093/19172、W095/01438、W095/15388。由杂交瘤获得编码 抗体的基因的方法，基本上使用公知技术，使用所需抗原或表达所需抗原的细胞作为致敏抗原，按照通常的免疫方法对其进行免疫，利用通常的细胞融合法使所得的免疫细胞与公知的亲本细胞融合，再利用通常的筛选法筛选产生单克隆抗体的细胞(杂交瘤)，并使用逆转录酶由所得杂交瘤的mRNA合成抗体可变区(V区)的cDNA，将该cDNA和编码所需抗体恒定区(C区)的DNA连接而得到。更具体而言，并不特别限于以下例子，用于得到上述的编码H链和L链的抗体基因的致敏抗原包括:具免疫原性的完全抗原和不具免疫原性的不完全抗原两者，上述不完全抗原包括半抗原等。例如，可以使用目标蛋白的全长蛋白或部分肽等。此外，已知由多糖类、核酸、脂质等构成的物质能够成为抗原，对本发明抗体的抗原并没有特别限定。抗原的制备可以按照本领域技术人员所公知的方法进行，例如可以按照使用杆状病毒的方法(例如W098/46777等)等进行制备。杂交瘤的制作，例如可以按照Milstein等人的方法(G.Kohler 和 C.Milstein, Methods Enzymol.1981,73:3_46)等来进行。当抗原的免疫原性低时，可以使之与白蛋白等具免疫原性的大分子结合来进行免疫。根据需要，还可以使抗原与其他分子结合，从而成为可溶性抗原。当使用膜抗原(例如受体等)这样的跨膜分子作为抗原时，可以使用膜抗原的胞外区部分作为片段，或者使用在细胞表面上表达跨膜分子的细胞作为免疫原。产生抗体的细胞可以通过使用上述适当的致敏抗原，对动物进行免疫而得到。或者,在体外对能够产生抗体的淋巴细胞进行免疫而成为产生抗体的细胞。进行免疫的动物可以使用各种哺乳动物，但通常使用啮齿类、兔形目、灵长类动物。可以例示:小鼠、大鼠、仓鼠等啮齿类；兔等兔形目；食蟹猴、恒河猴、狒狒、黑猩猩等的猴等的灵长类动物。此外，还已知具有人抗体基因的所有组成部分(repertories)的转基因动物，通过使用这样的动物，也可以得到人抗体(参照 W096/34096 ;Mendez 等人，Nat.Genet.1997，15:146-56)。不使用上述转基因动物，例如，通过在体外用所需抗原或表达所需抗原的细胞致敏人淋巴细胞，并使致敏淋巴细胞与人骨髓瘤细胞例如U266融合，也可以得到具抗原结合活性的所需人抗体(参照日本特公平1-59878号公报)。还可以通过用所需抗原对具有人抗体基因的全部的所有组成成分的转基因动物进行免疫得到所需的人抗体(参照W093/12227、W092/03918、W094/02602、W096/34096,W096/33735)。动物的免疫可如下进行:将致敏抗原用磷酸盐缓冲液(PBS)或生理盐水等适当稀释并悬浮，根据需要混合佐剂并进行乳化，然后注射到动物的腹腔内或皮下来进行免疫。之后，优选每4 21天给予数次和弗式不完全佐剂混合的致敏抗原。确认抗体的产生可以通过常规方法测定动物血清中目标抗体的效价来进行。杂交瘤可如下制备:使用常用融合剂(例如聚乙二醇)，使自利用所需抗原免疫的动物或淋巴细胞得到的产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合来制备(Golding，MonoclonalAntibodies (单克隆抗体):Principles and Practice, Academic Press, 1986, 59-103)。根据需要培养、增殖杂交瘤细胞，通过免疫沉淀、放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)等公知的分析方法，测定由该杂交瘤产生的抗体的结合特异性。之后，根据需要可以利用有限稀释法等方法亚克隆产生抗体的杂交瘤，上述抗体的目标特异性、亲和性或活性已测定。接下来 ，可以使用能够与抗体特异性结合的探针(例如，与编码抗体恒定区的序列互补的寡核苷酸等)，由杂交瘤或产生抗体的细胞(致敏淋巴细胞等)克隆编码所选择的抗体的基因。还可以通过RT-PCR由mRNA进行克隆。免疫球蛋白分为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM五个不同类别。这些类别又进一步分成几个亚类(同种型)(例如IgG-l、IgG-2、IgG-3和IgG-4 ；IgA-1和IgA-2等)。本发明中，对抗体制备中使用的H链和L链没有特别限定，可以来源于属于上述任一类别和亚类的抗体，特别优选为IgG。这里，还可以通过基因工程技术修饰编码H链和L链的基因。例如，对于小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、仓鼠抗体、山羊抗体、骆驼抗体等抗体，为了减弱其对人的异种抗原性等，可以适当制作人工修饰的基因重组型抗体，例如嵌合抗体、人源化抗体等。嵌合抗体是包含除人以外的哺乳动物例如小鼠抗体的H链、L链的可变区和人抗体的H链、L链的恒定区的抗体，可以通过将编码小鼠抗体可变区的DNA和编码人抗体恒定区的DNA连接，将其插入到表达载体中，并导入到宿主中产生抗体，从而得到嵌合抗体。人源化抗体也称作重构(reshaped)人抗体,可通过PCR法由多个寡核苷酸合成,上述寡核苷酸制作成在DNA序列的末端具有重叠部分，上述DNA序列设计成连接除人以外的哺乳动物例如小鼠抗体的互补性决定区(⑶R)。将所得DNA和编码人抗体恒定区的DNA连接，然后插入到表达载体中，并将其导入到宿主中而产生人源化抗体(参照EP239400、W096/02576)。经由⑶R连接的人抗体的FR，选择互补性决定区形成良好的抗原结合位点的FR。根据需要，可以取代抗体可变区的构架区的氨基酸，使重构人抗体的互补性决定区形成适当的抗原结合位点(K.Sato等人，Cancer Res.1993,53: 10.01-10.06)。除上述的人源化以外，认为还为了改善例如与抗原的结合性等抗体的生物学特性而进行修饰。本发明中的修饰可以通过位点特异性突变(参照例如Kunkel (1910.0)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA82:488)、PCR突变、盒式突变等方法来进行。通常，生物学特性得到改善的抗体突变体，其相对于原始抗体可变区的氨基酸序列，具有70%以上、更优选80%以上、进一步优选90%以上(例如95%以上、97%、98%、99%等)的氨基酸序列同源性和/或相似性。本说明书中，序列同源性和/或相似性定义为:根据需要进行序列排比和间隙导入，使序列同源性最大化之后，与原始抗体残基相同(相同残基)或相似(根据一般的氨基酸侧链的特性分类为同一组的氨基酸残基)的氨基酸残基的比例。通常，天然氨基酸残基根据其侧链的性质分为以 下几组:(I)疏水性:丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸和亮氨酸；(2)中性亲水性:天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、苏氨酸和丝氨酸；(3)酸性:天冬氨酸和谷氨酸；(4)碱性:精氨酸、组氨酸和赖氨酸；(5)影响链取向的残基:甘氨酸和脯氨酸；以及(6)芳族性:酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。通常，存在于H链和L链的可变区中的共6个互补性决定区(超可变区KDR)相互作用，形成抗体的抗原结合位点。已知即使是其中一个可变区，尽管与包括所有结合位点时相比亲和性低，但也具有识别并结合抗原的能力。因此，本发明的编码H链和L链的抗体基因，可以编码包括H链和L链的各抗原结合位点的片段部分，只要由该基因所编码的多肽维持与所需抗原的结合性即可。如上所述，重链可变区通常由3个⑶R区和4个FR区构成。在本发明的优选方案中，作为供于“修饰”的氨基酸残基，例如可以从位于CDR区或FR区的氨基酸残基中适当选择。通常，修饰CDR区的氨基酸残基，有时会降低与抗原的结合能力。因此，本发明中对供于“修饰”的氨基酸残基没有特别限定，优选从位于FR区的氨基酸残基中适当选择。即使是CDR，当确认通过修饰其结合能力并没有降低时，可以选择该位点。另外，本领域技术人员可以利用公共数据库等适当获得在人或小鼠等生物中可用作抗体可变区的FR的序列。本发明还提供编码本发明的抗体的基因。编码本发明的抗体的基因可以是任何基因，还可以是DNA、RNA、其他核酸类似体等。本发明还提供携带上述基因的宿主细胞。对该宿主细胞没有特别限定，例如有大肠杆菌或各种动物细胞等。宿主细胞可以用作例如用于制备或表达本发明的抗体的产生系统。用于制备多肽的产生系统包括:体外(in vitro)和体内(in vivo)产生系统。体外产生系统例如有:使用真核细胞的产生系统 和使用原核细胞的产生系统。可用作宿主细胞的真核细胞例如有:动物细胞、植物细胞、真菌细胞。动物细胞包括:哺乳动物细胞、例如 CHO (J.Exp.Med.(1995) 108:94.0)、COS、HEK293、3T3、骨髓瘤细胞、BHK(幼仓鼠肾)、HeLa、Vero等；两栖动物细胞、例如非洲爪蟾卵母细胞(Xenopuslaevis oocytes) (Valle 等人，Nature (1981) 291:338-340)；以及昆虫细胞、例如 Sf9>Sf21、Tn5。在本发明的抗体的表达中适合使用CH0-DG44、CH0-DX11B、C0S7细胞、HEK293细胞、BHK细胞。动物细胞中，以大量表达为目的时，特别优选CHO细胞。关于向宿主细胞内导入载体，例如可以通过以下方法来进行:磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、使用正离子脂质体DOTAP (Boehringer Mannheim制)的方法、电穿孔法、脂质转染法(Iipofection法)等。作为植物细胞，例如有来源于烟草的细胞和浮萍(Lemna minor),它们作为蛋白生产系统而已知，利用愈伤组织培养该细胞的方法可以产生本发明的抗体。使用真菌细胞的蛋白表达系统是公知的，这些真菌细胞可以用作产生本发明的抗体的宿主，上述真菌细胞例如有:酵母，例如酵母菌(Saccharomyces)属的细胞(啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Saccharmyces pombe)等)；以及丝状菌，例如曲霉属(Aspergillus)的细胞(黑曲霉(Aspergillus niger)等)。使用原核细胞时，有使用细菌细胞的产生系统。作为细菌细胞，除上述大肠杆菌(E.coli)外，已知还有使用枯草杆菌的产生系统，这些细菌细胞可用于产生本发明的抗体。〈筛选方法〉本发明提供筛选抗原结合分子在酸性pH下的抗原结合活性低于在中性pH下的抗原结合活性的抗原结合分子的方法。本发明还提供可以以I分子与多个抗原结合的抗原结合分子的筛选方法。本发明还提供血浆中滞留性优异的抗原结合分子的筛选方法。本发明还提供在细胞内解离在细胞外与抗原结合分子结合的抗原的抗原结合分子的筛选方法。本发明还提供以与抗原结合的状态摄入细胞内、以未与抗原结合的状态被释放到细胞外的抗原结合分子的筛选方法。本发明还提供血浆中抗原消除能力增加的抗原结合分子的筛选方法。本发明还提供用作药物组合物时特别有用的抗原结合分子的筛选方法。具体而言，本发明提供抗原结合分子的筛选方法，该筛选方法包括以下步骤。(a)获得pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原结合分子的抗原结合活性的步骤、(b)获得pH4.0 pH6.5下的抗原结合分子的抗原结合活性的步骤、(c)选择ρΗ6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原结合活性高于ρΗ4.0 ρΗ6.5下的抗原结合活性的抗原结合分子的步骤。
在本发明的筛选方法中，只要pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原结合分子的抗原结合活性是PH6.7 ρΗΙΟ.0之间的抗原结合活性即可，没有特别限定，作为优选的抗原结合活性，例如有PH7.0 pH8.0之间的抗原结合活性；作为更优选的抗原结合活性，例如有pH7.4下的抗原结合活性。另外，pH4.0 pH6.5下的抗原结合分子的抗原结合活性只要是pH4.0 pH6.5之间的抗原结合活性即可，没有特别限定，作为优选的抗原结合活性，例如有pH5.5 pH6.5之间的抗原结合活性；作为更优选的抗原结合活性，例如有pH5.8或pH5.5下的抗原结合活性。抗原结合分子的抗原结合活性可以利用本领域技术人员所公知的方法进行测定，有关除PH以外的条件，本领域技术人员可以适当确定。抗原结合分子的抗原结合活性可以以 KD (Dissociation constant:角军离常数)、表观 KD (Apparent dissociation constant:表观解离常数)、解离速度kd(Dissociation rate:解离速度)或表观kd(Apparentdissociation:表观解离速度)等形式进行评价。这些参数可以按照本领域技术人员公知的方法进行测定，例如可以使用Biacore (GE healthcare)、斯卡恰特作图法、FACS等。本发明中，选择pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原结合活性高于pH4.0 pH6.5下的抗原结合活性的抗原结合分子的步骤，与选择pH4.0 pH6.5下的抗原结合活性低于pH6.7 PH10.0下的抗原结合活性的抗原结合分子的步骤意思相同。只要pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原结合活性高于pH4.0 pH6.5下的抗原结合活性，对pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原结合活性与pH4.0 pH6.5下的抗原结合活性之差没有特别限定，优选PH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原结合活性为pH4.0 pH6.5下的抗原结合活性的2倍以上，进一步优选为10倍以上，更优选为40倍以上。本发明还提供抗 原结合分子的筛选方法，该筛选方法包括以下步骤:(a)在pH6.7 ρΗΙΟ.0的条件下使抗原结合分子与抗原结合的步骤、(b)将(a)的与抗原结合的抗原结合分子置于pH4.0 pH6.5的条件下的步骤、(c)获得在ρΗ4.0 ρΗ6.5的条件下解离的抗原结合分子的步骤。本发明还提供抗原结合分子的筛选方法，该筛选方法包括以下步骤:(a)选择在pH4.0 pH6.5的条件下未与抗原结合的抗原结合分子的步骤、(b)在pH6.7 ρΗΙΟ.0的条件下使(a)中选择的抗原结合分子与抗原结合的步骤、(c)获得在pH6.7 ρΗΙΟ.0的条件下与抗原结合的抗原结合分子的步骤。本发明还提供抗原结合分子的筛选方法，该筛选方法包括以下步骤:(a)在pH6.7 ρΗΙΟ.0的条件下使抗原结合分子与抗原结合的步骤、(b)将(a)的与抗原结合的抗原结合分子置于pH4.0 pH6.5的条件下的步骤、(c)获得在pH4.0 pH6.5的条件下解离的抗原结合分子的步骤、(d)扩增编码解离的抗原结合分子的基因的步骤、(e)获得被洗脱的抗原结合分子的步骤。步骤(a) (d)可以重复两次以上。因此，本发明提供在上述方法中进一步包括重复两次以上步骤(a) (d)的步骤的方法。对步骤(a) (d)的重复次数没有特别限定，通常为10次以内。本发明还提供抗原结合分子的筛选方法，该筛选方法包括以下步骤:
(a)选择在pH4.0 pH6.5的条件下未与抗原结合的抗原结合分子的步骤、(b)在pH6.7 ρΗΙΟ.0的条件下使(a)中选择的抗原结合分子与抗原结合的步骤、(c)获得在PH6.7 ρΗΙΟ.0的条件下与抗原结合的抗原结合分子的步骤、(d)扩增编码解离的抗原结合分子的基因的步骤、(e)获得被洗脱的抗原结合分子的步骤。步骤(a) (d)可以重复两次以上。因此，本发明提供在上述方法中进一步包括重复两次以上步骤(a) (d)的步骤的方法。对步骤(a) (d)的重复次数没有特别限定，通常为10次以内。在本发明的筛选方法中，当使用噬菌体文库等时，扩增编码抗原结合分子的基因的步骤还可以作为扩增噬菌体的步骤。在本发明的方法中，抗原与抗原结合分子的结合可以以任何状态进行，没有特别限定。例如，通过使抗原与固定化的抗原结合分子接触，可以使抗原结合分子与抗原结合；通过使抗原结合分子与固定化的抗原接触，可以使抗原结合分子与抗原结合。另外，通过使抗原结合分子与抗原在溶液中接触，可以使抗原结合分子与抗原结合。本发明还提供抗原结合分子在第一 pH下的结合活性高于在第二 pH下的结合活性的抗原结合分子的筛选方法，该筛选方法包括以下步骤:(a)在第一 pH条件下使抗原结合分子与固定有抗原的柱结合的步骤、(b)在第二 pH条件下从柱上 洗脱在第一 pH条件下与柱结合的抗原结合分子的步骤、(C)获得被洗脱的抗原结合分子的步骤。本发明还提供抗原结合分子在第一 pH下的结合活性低于在第二 pH下的结合活性的抗原结合分子的筛选方法，该筛选方法包括以下步骤:(a)在第一 pH条件下使抗原结合分子通过固定有抗原的柱的步骤、(b)回收在步骤(a)中未与柱结合而洗脱的抗原结合分子的步骤、(c)在第二 pH条件下使(b)中回收的抗原结合分子与柱结合的步骤、(d)获得在步骤(C)中与柱结合的抗原结合分子的步骤。本发明还提供第一 pH下的结合活性高于第二 pH下的结合活性的抗原结合分子的筛选方法，该筛选方法包括以下步骤。(a)在第一 pH条件下使抗原结合分子文库与固定有抗原的柱结合的步骤、(b)在第二 pH条件下从柱上洗脱抗原结合分子的步骤、(C)扩增编码被洗脱的抗原结合分子的基因的步骤、(d)获得被洗脱的抗原结合分子的步骤。步骤(a) (C)可以重复两次以上。因此，本发明提供在上述方法中进一步包括重复两次以上步骤(a) (C)的步骤的方法。对步骤(a) (C)的重复次数没有特别限定，通常为10次以内。本发明中，只要第一pH和第二pH各自不是相同的pH即可，可以是任何pH。优选的第一 pH与第二 pH的组合的例子有:第一 pH为pH6.7 10.0之间的pH、第二 pH为pH4.0 PH6.5之间的pH的组合；更优选的组合的例子有:第一 pH为pH7.0 pH8.0之间的pH、第二 pH为pH5.5 pH6.5之间的pH的组合；进一步优选的组合的例子有:第一 pH为pH7.4、第二 pH为ρΗ5.8或ρΗ5.5的组合。其他优选的第一pH与第二pH的组合的例子有:第一pH为pH4.0 6.5之间的pH、第二 pH为pH6.7 ρΗΙΟ.0之间的pH的组合；更优选的组合的例子有:第一 pH为pH5.5 PH6.5之间的pH、第二 pH为pH7.0 pH8.0之间的pH的组合；进一步优选的组合的例子有:第一 pH为ρΗ5.8或ρΗ5.5、第二 pH为ρΗ7.4的组合。利用本发明的方法筛选的抗原结合分子可以是任何抗原结合分子，例如可以将上述的抗原结合分子用于本发明的筛选。例如，可以筛选具有天然序列的抗原结合分子，也可以筛选氨基酸序列被取代的抗原结合分子。本发明中筛选的抗原结合分子的优选例子有:例如抗原结合分子的至少I个氨基酸被组氨酸取代或插入至少I个组氨酸的抗原结合分子。对导入组氨酸取代或插入的位点没有特别限定，可以在任何位点导入。可以向I个位点导入组氨酸取代或插入，也可以向2个位点以上的多个位点中导入。本发明中筛选的抗原结合分子的优选例子有:例如包含被修饰的抗体恒定区的抗原结合分子。利用本发明的方法筛选的抗原结合分子，例如可以是通过组氨酸分区等方法向不同位点导入组氨酸取代或插入的多个不同的抗原结合分子。因此，本发明的筛选方法可以进一步包括:将抗原结合分子的至少I个氨基酸取代成组氨酸或插入至少I个组氨酸的步骤。本发明的筛选方法可以使用非天然氨基酸来代替组氨酸。因此，也可以将上述组氨酸与非天然氨基酸互换来理解本发明。本发明的筛选方法可以进一步包括修饰抗体恒定区的氨基酸的步骤。通过本发明的筛选方法筛选的抗原结合物质可以以任何方式进行制备，例如可以使用:事先存在的抗体、事先存 在的文库(噬菌体文库等)、对动物进行免疫而得到的杂交瘤或由来自免疫动物的B细胞制作的抗体或文库、向这些抗体或文库中导入组氨酸或非天然氨基酸突变而得到的抗体或文库(提高组氨酸或非天然氨基酸的含有率的文库或在特定位点导入了组氨酸或非天然氨基酸突变的文库等)等。利用本发明的筛选方法，可以得到多次与抗原结合、血浆中滞留性优异的抗原结合分子。因此，本发明的筛选方法可以用作用于得到血浆中滞留性优异的抗原结合分子的筛选方法。利用本发明的筛选方法，对人、小鼠、猴等动物给药时，还可以得到能够与抗原进行两次以上结合的抗原结合分子。因此，本发明的筛选方法可以用作用于得到能够两次以上与抗原结合的抗原结合分子的筛选方法。利用本发明的筛选方法，对人、小鼠、猴等动物给药时，还可以得到能够与多于抗原结合分子的抗原结合位点数的数目的抗原结合的抗原结合分子。因此，本发明的筛选方法可以用作用于得到能够与多于抗原结合分子的抗原结合位点数的数目的抗原结合的抗原结合分子的筛选方法。例如，当抗体为中和抗体时，可以用作用于得到能够中和多于抗原结合分子的抗原结合位点数的数目的抗原的抗原结合分子的筛选方法。利用本发明的筛选方法，对人、小鼠、猴等动物给药时，还可以得到能够在细胞内解离在细胞外结合的抗原的抗原结合分子。因此，本发明的筛选方法可以用作用于得到在细胞内解离在细胞外结合的抗原的抗原结合分子的筛选方法。
利用本发明的筛选方法，对人、小鼠、猴等动物给药时，还可以得到以与抗原结合的状态摄入细胞内、以未与抗原结合的状态被释放到细胞外的抗原结合分子。因此，本发明的筛选方法可以用作用于得到以与抗原结合的状态摄入细胞内、以未与抗原结合的状态被释放到细胞外的抗原结合分子的筛选方法。利用本发明的筛选方法，对人、小鼠、猴等动物给药时，还可以得到可以使抗原从血浆中快速消除的抗原结合分子。因此，本发明的筛选方法可以用作用于得到血浆中抗原消除能力增加(高)的抗原结合分子的筛选方法。这些抗原结合分子可以减少对患者的给药量或给药频率，结果，可以减少总给药量，因此认为其作为药品特别优异。因此，本发明的筛选方法可以用作作为药物组合物的抗原结合分子的筛选方法。本发明还提供与原始文库相比组氨酸的含有比例增加的文库。文库中所含的抗原结合分子所具有的组氨酸的比例增加的文库可用于上述的筛选方法或后述的制备方法。提高了组氨酸的含有比例的文库的制作方法可以利用本领域技术人员所公知的方法来制作，例如有以下方法。合成用于制作文库的核酸时，利用三核苷酸法(J MolBiol.2008Feb29 ；376(4) =1182-200)，以相等的概率含有编码20种氨基酸的20种的3碱基密码子(三核苷酸)，从而可以在文库化的位点以相等的概率含有20种氨基酸。此时，20种氨基酸中，通过使编码组氨酸的三核苷酸的比例高于其他氨基酸的比例，可以提高在文库化的位点出现组氨酸的可能性。<抗原结合分子制备方法>本发明提供抗原结合分子在核内体内的pH下的抗原结合活性低于在血浆中的pH下的抗原结合活性的抗原结合分子的制备方法。本发明还提供血浆中滞留性优异的抗原结合分子的制备方法。本发明还提供用作药物组合物时特别有用的抗原结合分子的制备方 法。具体而言，本发明提供抗原结合分子的制备方法，该制备方法包括以下步骤:(a)获得在pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原结合分子的抗原结合活性的步骤、(b)获得在pH4.0 pH6.5下的抗原结合分子的抗原结合活性的步骤、(c)选择在pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原结合活性高于在pH4.0 pH6.5下的抗原结合活性的抗原结合分子的步骤、(d)获得编码(C)中选择的抗原结合分子的基因的步骤、(e)使用(d)中得到的基因制备抗原结合分子的步骤。本发明还提供抗原结合分子的制备方法，该制备方法包括以下步骤:(a)在pH6.7 ρΗΙΟ.0的条件下使抗原结合分子与抗原结合的步骤、(b)将(a)的与抗原结合的抗原结合分子置于pH4.0 pH6.5的条件下的步骤、(c)获得在pH4.0 pH6.5的条件下解离的抗原结合分子的步骤、(d)获得编码(C)中取得的抗原结合分子的基因的步骤、(e)使用(d)中得到的基因制备抗原结合分子的步骤。本发明还提供抗原结合分子的制备方法，该制备方法包括以下步骤:(a)选择在pH4.0 pH6.5的条件下不与抗原结合的抗原结合分子的步骤、(b)在pH6.7 ρΗΙΟ.0的条件下使(a)中选择的抗原结合分子与抗原结合的步骤、(c)获得在PH6.7 ρΗΙΟ.0的条件下与抗原结合的抗原结合分子的步骤、(d)获得编码(C)中取得的抗原结合分子的基因的步骤、(e)使用(d)中得到的基因制备抗原结合分子的步骤。本发明还提供抗原结合分子的制备方法，该制备方法包括以下步骤:(a)在pH6.7 10.0的条件下使抗原结合分子与抗原结合的步骤、(b)将(a)的与抗原结合的抗原结合分子置于pH4.0 pH6.5的条件下的步骤、(c)获得在pH4.0 pH6.5的条件下解离的抗原结合分子的步骤、(d)扩增编码解离的抗原结合分子的基因的步骤、(e)获得被洗脱的抗原结合分子的步骤、(f)获得编码(e)中取得的抗原结合分子的基因的步骤、(g)使用(f)中得到的基因制备抗原结合分子的步骤。步骤(a) (d)可以重复两次以上。因此，本发明提供在上述方法中进一步包括重复两次以上步骤(a) (d)的步骤的方法。对步骤(a) (d)的重复次数没有特别限定，通常为10次以内。

本发明还提供抗原结合分子的筛选方法，该筛选方法包括以下步骤:(a)选择 在pH4.0 pH6.5的条件下不与抗原结合的抗原结合分子的步骤、(b)在pH6.7 ρΗΙΟ.0的条件下使(a)中选择的抗原结合分子与抗原结合的步骤、(c)获得在pH6.7 ρΗΙΟ.0的条件下与抗原结合的抗原结合分子的步骤、(d)扩增编码解离的抗原结合分子的基因的步骤、(e)获得被洗脱的抗原结合分子的步骤、(f)获得编码(e)中取得的抗原结合分子的基因的步骤、(g)使用(f)中得到的基因制备抗原结合分子的步骤。步骤(a) (d)可以重复两次以上。因此，本发明提供在上述方法中进一步包括重复两次以上步骤(a) (d)的步骤的方法。对步骤(a) (d)的重复次数没有特别限定，通常为10次以内。本发明还提供第一 pH下的结合活性高于第二 pH下的结合活性的抗原结合分子的制备方法，该制备 方法包括以下步骤:(a)在第一 pH条件下使抗原结合分子与固定有抗原的柱结合的步骤、(b)在第二 pH条件下从柱上洗脱在第一 pH条件下与柱结合的抗原结合分子的步骤、(C)获得被洗脱的抗原结合分子的步骤、(d)获得编码(C)中取得的抗原结合分子的基因的步骤、(e)使用(d)中得到的基因制备抗原结合分子的步骤。本发明还提供第一 pH下的结合活性高于第二 pH下的结合活性的抗原结合分子的制备方法，该制备方法包括以下步骤:(a)在第一 pH条件下使抗原结合分子文库与固定有抗原的柱结合的步骤、(b)在第二 pH条件下从柱上洗脱抗原结合分子的步骤、
(c)扩增编码被洗脱的抗原结合分子的基因的步骤、(d)获得被洗脱的抗原结合分子的步骤、(e)获得编码(d)中取得的抗原结合分子的基因的步骤、(f)使用(e)中得到的基因制备抗原结合分子的步骤。 步骤(a) (C)可以重复两次以上。因此，本发明提供在上述方法中进一步包括重复两次以上步骤(a) (C)的步骤的方法。对步骤(a) (C)的重复次数没有特别限定，通常为10次以内。在本发明的制备方法中，使用噬菌体文库等时，扩增编码抗原结合分子的基因的步骤还可以作为扩增噬菌体的步骤。本发明的制备方法中使用的抗原结合物质可以按照任何方式来制备，例如可以使用:事先存在的抗体、事先存在的文库(噬菌体文库等)、由对动物进行免疫得到的杂交瘤或由来自免疫动物的B细胞制作的抗体或文库、向这些抗体或文库中导入组氨酸或非天然氨基酸突变而得到的抗体或文库(提高了组氨酸或非天然氨基酸的含量的文库或向特定位点导入了组氨酸或非天然氨基酸突变的文库等)等。上述制备方法中，pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原结合分子的抗原结合活性只要是PH6.7 ρΗΙΟ.0之间的抗原结合活性即可，没有特别限定，作为优选的抗原结合活性，例如有pH7.0 pH8.0之间的抗原结合活性；作为进一步优选的抗原结合活性，例如有pH7.4下的抗原结合活性。另外，PH4.0 pH6.5下的抗原结合分子的抗原结合活性只要是PH4.0 pH6.5之间的抗原结合活性即可，没有特别限定，作为优选的抗原结合活性，例如有pH5.5 pH6.5之间的抗原结合活性；作为进一步优选的抗原结合活性，例如有pH5.8或pH5.5下的抗原结合活性。抗原结合分子的抗原结合活性可以利用本领域技术人员所公知的方法进行测定，关于除PH以外的条件，本领域技术人员可以适当确定。选择pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原结合活性高于pH4.0 pH6.5下的抗原结合活性的抗原结合分子的步骤，与选择pH4.0 pH6.5下的抗原结合活性低于pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原结合活性的抗原结合分子的步骤意思相同。只要pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原结合活性高于pH4.0 pH6.5下的抗原结合活性即可，对pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原结合活性与pH4.0 pH6.5下的抗原结合活性之差没有特别限定，但优选pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原结合活性为pH4.0 pH6.5下的抗原结合活性的2倍以上，进一步优选为10倍以上，更优选为40倍以上。在上述制备方法中，抗原与抗原结合分子的结合可以以任何状态进行，没有特别限定。例如，通过使抗原与固定化的抗原结合分子接触，可以使抗原结合分子与抗原结合；通过使抗原结合分子与固定化的抗原接触，也可以使抗原结合分子与抗原结合。另外，通过使抗原结合分子与抗原在溶液中接触，也可以使抗原结合分子与抗原结合。上述制备方法中，只要第一 pH与第二 pH各自是不同的pH即可，可以是任何的pH。优选的第一 PH与第二 pH的组合的例子有:第一 pH为pH6.7 10.0之间的pH、第二 pH为PH4.0 pH6.5之间的pH的组合；更优选的组合的例子有:第一 pH为pH7.0 pH8.0之间的pH、第二 pH为pH5.5 pH6.5之间的pH的组合；进一步优选的组合的例子有:第一 pH为ρΗ7.4、第二 pH为ρΗ5.8或ρΗ5.5的组合。
其他优选的第一 pH与第二 pH的组合的例子有:第一 pH为pH4.0 pH6.5之间的pH、第二 pH为pH6.7 ρΗΙΟ.0之间的pH的组合；更优选的组合的例子有:第一 pH为pH5.5 pH6.5之间的pH、第二 pH为pH7.0 pH8.0之间的pH的组合；进一步优选的组合的例子有:第一 PH为pH5.8或pH5.5、第二 pH为pH7.4的组合。利用上述制备方法制备的抗原结合分子可以是任何的抗原结合分子，例如优选的例子有:抗原结合分子的至少I个氨基酸被组氨酸取代或插入至少I个组氨酸的抗原结合分子。对导入这样的组氨酸突变的位点没有特别限定，可以在任何位点导入。可以向I个位点导入组氨酸突变，也可以向2个位点以上的多个位点导入组氨酸突变。因此，在本发明的制备方法中，可以进一步包括将抗原结合分子的至少I个氨基酸取代成组氨酸或插入组氨酸的步骤。在本发明的制备方法中，可以使用非天然氨基酸来代替组氨酸。因此，还可以将上述组氨酸与非天然氨基酸互换来理解本发明。作为利用上述制备方法制备的抗原结合分子的其他方案，例如有包含被修饰的抗体恒定区的抗原结合分子，因此，在本发明的制备方法中，可以进一步包括修饰抗体恒定区中的氨基酸的步骤。利用本发明的制备方法制备的抗原结合分子是血浆中滞留性优异的抗原结合分子。因此，本发明的制备方法可以用作血浆中滞留性优异的抗原结合分子的制备方法。利用本发明的制备方法制备的抗原结合分子，将其对人、小鼠、猴等动物给药时，认为其可以两次以上与抗原结合。因此，本发明的制备方法可以用作能够两次以上与抗原结合的抗原结合分子的制备方法。并且，利用本发明的制备方法制备的抗原结合分子，将其对人、小鼠、猴等动物给药时，认为其可以与多于抗原结合分子的抗原结合位点数的数目的抗原结合。因此，本发明的制备方法可以用作能够与多于抗原结合分子的抗原结合位点数的数目的抗原结合的抗原结合分子的制备方法。并且，利用本发明的制备方法制备的抗原结合分子，将其对人、小鼠、猴等动物给药时，认为其可以使在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内自抗原结合分子上解离。因此，本发明的制备方法可以用作能够在细胞内解离在细胞外结合的抗原的抗原结合分子的制备方法。并且，利用本发明的制备方法制备的抗原结合分子，将其对人、小鼠、猴等动物给药时，认为其可以使以与抗原结合的状态摄入细胞内的抗原结合分子以未与抗原结合的状态被释放到细胞外。因此，本发明的制备方法可以用作以与抗原结合的状态摄入细胞内、以未与抗原结合的状态被释放到细胞外的抗原结合分子的制备方法。并且，利用本发明的制备方法制备的抗原结合分子，将其对人、小鼠、猴等动物给药时，认为其可以使抗原从血浆中快速消除。因此，本发明的制备方法可以用作血浆中抗原消除能力增加(高)的抗原结合分子的制备方法。这些抗原结合分子可以减少对患者的给药次数，认为其作为药品特别优异。因此，本发明的制备方法可以用作作为药物组合物的抗原结合分子的制备方法。本发明的制备方法中得到的基因，通常将其负载(插入)到适当的载体上，并导入宿主细胞中。对该载体没有特别限定， 只要是稳定保持插入的核酸的载体即可，例如使用大肠杆菌作为宿主时，作为克隆用载体，优选pBluescript载体(Stratagene公司制)等，但也可以使用各种市售载体。当为了生产本发明的抗原结合分子而使用载体时，表达载体特别实用。对表达载体没有特别限定，只要是在试管内、大肠杆菌内、培养细胞内、生物个体内表达抗原结合分子的载体即可，例如，在试管内表达抗原结合分子时，优选PBEST载体(Promega公司制)；在大肠杆菌内表达抗原结合分子时,优选pET载体(Invitrogen公司制)；在培养细胞内表达抗原结合分子时，优选PME18S-FL3载体(GenBank检索号AB009864);在生物个体内表达抗原结合分子时，优选pME18S载体(Mol Cell Biol.8:466-472(1988))等。向载体中插入本发明的DNA，可以利用常规方法、例如通过使用限制酶切位点的连接酶反应来进行(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel等人(1987)出版.John Wiley & Sons.Sectionll.4-11.11)。对上述宿主细胞没有特别限定，根据目的使用各种宿主细胞。作为用于表达抗原结合分子的细胞，可以例示:细菌细胞(例如:链球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、大肠杆菌(E.coli)、链霉菌(Streptomyces)、枯草杆菌(Bacillussubtilis));真菌细胞(例如:酵母(Yeast)、曲霉(Aspergillus));昆虫细胞(例如:果蝇S2 (Drosophila S2)、草地夜蛾 SF9 (Spodoptera SF9));动物细胞(例如:CH0、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes黑色素瘤细胞)和植物细胞。向宿主细胞中导入载体，例如可以通过憐酸I丐沉淀法、电脉冲穿孔法(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel 等人.(1987)出版.John Wiley & Sons.Section9.1-9.9)、脂质转染法、显微注射法等公知方法来进行。宿主细胞的培养可以按照公知方法进行。例如，以动物细胞作为宿主时，培养液可以使用例如DMEM、MEM、RPMI1640、MDM。此时，可以结合使用FBS、胎牛血清(FCS)等血清补充液，也可以通过无血清培养来培养细胞。培养时的PH优选为约6 8。通常是在约30 40°C下培养约15 200小时，根据需要可以交换培养基或进行通气、搅拌。可以向目标多肽中插入适当的分泌信号，以使在宿主细胞中表达的抗原结合分子分泌到内质网的内腔、周质间隙或胞外环境中。相对于目标抗原结合分子而言，上述信号可以是内源性信号，也可以是·异源信号。另一方面，作为在体内产生多肽的系统，例如有使用动物的产生系统或使用植物的产生系统。向这些动物或植物中导入目标多核苷酸，使在动物或植物体内产生多肽并回收。本发明中的“宿主”包括这些动物和植物。使用动物时，有使用哺乳动物和昆虫的产生系统。作为哺乳动物，可以使用山羊、猪、绵羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications (1993))。使用哺乳动物时，可以使用转基因动物。例如，制备编码本发明的抗原结合分子的多核苷酸，将其作为和山羊β_酪素等乳汁中固有产生的编码多肽的基因的融合基因。然后，将包括该融合基因的多核苷酸片段注入到山羊胚胎中，将该胚胎移植到雌山羊体内。接受了胚胎的山羊生出转基因山羊，从该转基因山羊或其后代产生的乳汁中可以得到目标抗原结合分子。为了使转基因山羊产生的含有抗原结合分子的乳汁量增加，可以给予转基因山羊适当的激素(Ebert等人，Bio/Technology(1994)12:699-702)。作为产生本发明的抗原结合分子的昆虫，例如可以使用蚕。使用蚕时，通过使蚕感染插入有编码目标抗原结合分子的多核苷酸的杆状病毒，可以从该蚕的体液中得到目标抗原结合分子。并且，在本发明的抗原结合分子产生中使用植物时，例如可以使用烟草。使用烟草时，将编码目标抗原结合分子的多核苷酸插入到植物表达用载体例如PM0N530中，将该载体导入根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)这样的细菌中。用该细菌感染烟草例如烟草(Nicotiana tabacum),可以从该烟草的叶中得到所期望的抗原结合分子(Ma等人，Eur.J.1mmunol.(1994) 24:131-8)。用同样的细菌感染浮萍(Lemna minor),克隆化后可以从浮萍的细胞中得到所期望的抗原结合分子(Cox KM等人.Nat.Biotechnol.2006Dec ；24(12):1591-1597)。如此操作得到的抗原结合分子，可以将其从宿主细胞内或细胞外(培养基、乳汁等)分离，纯化成实质上纯粹且均匀的抗原结合分子。抗原结合分子的分离、纯化可以使用通常多肽的纯化中所使用的分离、纯化方法，但没有任何限制。例如，可以适当选择组合层析柱、滤器、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳法、透析、重结晶等来分离、纯化抗原结合分子。

层析例如有:亲合层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析等(Strategies for Protein Purification and Characterization (蛋白质纯化与鉴定实验指南):A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshark 等人.(I996)ColdSpring Harbor Laboratory Press)。上述层析可以使用液相层析、例如HPLC、FPLC等液相层析来进行。用于亲合层析的柱例如有:蛋白A柱、蛋白G柱。蛋白A柱例如有:Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacia 制)等。根据需要，可以在纯化抗原结合分子之前或之后，使适当的蛋白修饰酶与抗原结合分子作用，以任意地进行修饰或部分性地去除肽。作为蛋白修饰酶，例如可以使用胰蛋白酶、糜蛋白酶、赖氨酰内肽酶、蛋白激酶、糖苷酶等。〈抗IL-6受体抗体〉本发明还提供以下(a) (m)中任一项所述的抗IL_6受体抗体。(a)抗体，该抗体包含具有下述氨基酸序列的重链可变区:在SEQ ID NO:1(H53可变区)的氨基酸序列中第27位的Tyr、第31位的Asp、第32位的Asp、第35位的Trp、第51位的Tyr、第59位的Asn、第63位的Ser、第106位的Met、第108位的Tyr中的至少I个被取代成His的氨基酸序列；(b)抗体(H3pl)，该抗体包含具有下述氨基酸序列的重链可变区:在SEQ ID NO:I (H53可变区)的氨基酸序列中第27位的Tyr、第31位的Asp和第35位的Trp被取代成His的氨基酸序列；(c)抗体，该抗体包含具有下述氨基酸序列的重链可变区:在SEQ ID NO:1(H53可变区)的氨基酸序列中第27位的Tyr、第31位的Asp、第32位的Asp、第35位的Trp、第59位的Asn、第63位的Ser、第108位的Tyr被取代成His的氨基酸序列；(d)抗体(H170)，该抗体包含具有下述氨基酸序列的重链可变区:在SEQ ID NO:
I(H53可变区)的氨基酸序列中第27位的Tyr、第31位的Asp、第32位的Asp、第35位的Trp、第59位的Asn、第63位的Ser、第108位的Tyr被取代成His、且第99位的Ser被取代成Val、第103位的Thr被取代成Ile的氨基酸序列；
(e)抗体，该抗体包含具有下述氨基酸序列的重链可变区:在SEQ ID NO:1 (H53可变区)的氨基酸序列中第31位的Asp、第51位的Tyr、第63位的Ser、第106位的Met和第108位的Tyr被取代成His的氨基酸序列；(f)抗体(CLH5)，该抗体包含具有下述氨基酸序列的重链可变区:在SEQ ID NO:
1(H53可变区)的氨基酸序列中第31位的Asp、第51位的Tyr、第63位的Ser、第106位的Met和第108位的Tyr被取代成HiS、且第99位的Ser被取代成Phe、第103位的Thr被取代成Ile的氨基酸序列；(g)抗体，该抗体包含具有下述氨基酸序列的轻链可变区:在SEQ ID N0:2(PF1L可变区)的氨基酸序列中第28位的Asp、第32位的Tyr、第53位的Glu、第56位的Ser、第92位的Asn中的至少一个被取代成His的氨基酸序列；(h)抗体(L73)，该抗体包含具有下述氨基酸序列的轻链可变区:在SEQ ID NO:
2(PF1L可变区)的氨基酸序列中第28位的Asp、第32位的Tyr和第53位的Glu被取代成His的氨基酸序列；(i)抗体(L82)，该抗体包含具有下述氨基酸序列的轻链可变区:在SEQ ID NO:I (H53可变区)的氨基酸序列中第32位的Tyr和第53位的Glu被取代成His的氨基酸序列；(j)抗体(CLL5)，该抗体包含具有下述氨基酸序列的轻链可变区:在SEQ ID NO:2(PF1L可变区)的氨基酸序列中第32位的Tyr、第53位的Glu、第56位的Ser和第92位的Asn被取代成His的氨基酸序列；(k)抗体，该抗体包含(b)的重链可变区和(h)的轻链可变区；(I)抗体，该抗体包含(d)的重链可变区和(i)的轻链可变区；(m)抗体，该抗体包含(f)的重链可变区和(h)的轻链可变区。作为具有在SEQ ID N0:1(H53可变区)的氨基酸序列中第27位的Tyr、第31位的Asp、第32位的Asp、第35位的Trp、第51位的Tyr、第59位的Asn、第63位的Ser、第106位的Met、第108位的Tyr中的至少I个被取代成His的氨基酸序列的重链可变区的具体例子，例如有以下的重链可变区:重链可变区，其中具有SEQ ID NO:3(H3pI)的氨基酸序列重链可变区，其中具有SEQ ID NO:4(H170)的氨基酸序列重链可变区，其中具有SEQ ID NO:5(CLH5)的氨基酸序列作为具有在SEQ ID NO:2 (PF1L可变区)的氨基酸序列中第28位的Asp、第32位的Tyr、第53位的Glu、第56位的Ser、第92位的Asn中的至少I个被取代成His的氨基酸序列的轻链可变区的具体例子，例如有以下的轻链可变区:轻链可变区，其中具有SEQ ID NO:6(L73)的氨基酸序列轻链可变区，其中具有SEQ ID NO:7(L82)的氨基酸序列轻链可变区，其中具有SEQ ID NO:8(CLL5)的氨基酸序列上述H3pl、H170、CLH5、L73、L82和CLL5的各抗体中的氨基酸位点和氨基酸取代见下表I。氨基酸位点根据Kabat编号来表不。[表 1]
权利要求
1.药品的制备方法，该制备方法包括以下步骤 (a)测定ρΗ6.7-ρΗΙΟ. O下的抗体的抗原结合活性的步骤； (b)测定pH4.0-pH6. 5下的抗体的抗原结合活性的步骤； (c)选择pH6.7-pH10. O下的抗原结合活性高于pH4. 0_pH6. 5下的抗原结合活性的抗体的步骤； (d)获得编码(c)中所选择的抗体的基因的步骤；和 (e)使用(d)中得到的基因制备抗体的步骤， 其中所述药品包括以下中的任一种 (i)血浆中滞留性优异的抗体； ( )当在包含表达FcRn的细胞的动物中测量时能够两次以上与抗原结合的抗体； (iii)当在包含表达FcRn的细胞的动物中测量时能结合的抗原数多于其抗原结合位点的抗体； (iv)在细胞内解离在细胞外结合的抗原的抗体； (v)与抗原结合并摄入细胞内、并且以未与抗原结合的形式被释放到细胞外的抗体；或 (vi)在血浆中抗原消除能力增加的抗体。
2.药品的制备方法，该制备方法包括以下步骤 (a)在pH6.7-pH10. O的条件下使抗体与抗原结合的步骤； (b)将(a)的与抗原结合的抗体置于pH4.0-pH6. 5的条件下的步骤； (c)收集在pH4.0-pH6. 5的条件下解离的抗体的步骤； (d)获得编码(C)中取得的抗体的基因的步骤；和 (e)使用(d)中得到的基因制备抗体的步骤 其中所述药品包括以下中的任一种 (i)血浆中滞留性优异的抗体； ( )当在包含表达FcRn的细胞的动物中测量时能够两次以上与抗原结合的抗体； (iii)当在包含表达FcRn的细胞的动物中测量时能结合的抗原数多于其抗原结合位点的抗体； (iv)在细胞内解离在细胞外结合的抗原的抗体； (v)与抗原结合并摄入细胞内、并且以未与抗原结合的形式被释放到细胞外的抗体；或 (vi)在血浆中抗原消除能力增加的抗体。
3.药品的制备方法，该制备方法包括以下步骤 (a)在第一pH条件下使抗体与固定有抗原的柱结合的步骤； (b)在第二pH条件下从柱上洗脱在第一 pH条件下与柱结合的抗体的步骤； (c)收集被洗脱的抗体的步骤； (d)获得编码(C)中取得的抗体的基因的步骤； (e)使用(d)中得到的基因制备抗体的步骤， 其中所述药品包括其在第一 PH下的结合活性高于第二 PH下的结合活性的抗体，其中第一 pH为6. 7-10. O和第二 pH为4. 0-6. 5，并且所述抗体为以下中的任一种(i)血浆中滞留性优异的抗体； ( )当在包含表达FcRn的细胞的动物中测量时能够两次以上与抗原结合的抗体； (iii)当在包含表达FcRn的细胞的动物中测量时能结合的抗原数多于其抗原结合位点的抗体； (iv)在细胞内解离在细胞外结合的抗原的抗体； (v)与抗原结合并摄入细胞内、并且以未与抗原结合的形式被释放到细胞外的抗体；或 (vi)在血浆中抗原消除能力增加的抗体。
4.药品的制备方法，该制备方法包括以下步骤 (a)在第一pH条件下使抗体文库与固定有抗原的柱结合的步骤； (b)在第二pH条件下从柱上洗脱抗体的步骤； (c)扩增编码被洗脱的抗体的基因的步骤； (d)收集被洗脱的抗体的步骤； (e)获得编码(d)中取得的抗体的基因的步骤；和 (f)使用(e)中得到的基因制备抗体的步骤， 其中所述药品包括其在第一 PH下的结合活性高于第二 pH下的结合活性的抗体，其中第一 pH为6. 7-10. O和第二 pH为4. 0-6. 5，并且所述抗体为以下中的任一种 (i)血浆中滞留性优异的抗体； ( )当在包含表达FcRn的细胞的动物中测量时能够两次以上与抗原结合的抗体； (iii)当在包含表达FcRn的细胞的动物中测量时能结合的抗原数多于其抗原结合位点的抗体； (iv)在细胞内解离在细胞外结合的抗原的抗体； (v)与抗原结合并摄入细胞内、并且以未与抗原结合的形式被释放到细胞外的抗体；或 (vi)在血浆中抗原消除能力增加的抗体。
5.权利要求1-4中任一项所述的制备方法，该制备方法进一步包括用组氨酸取代抗体中的至少I个氨基酸或插入至少I个组氨酸到抗体中的步骤。
全文摘要
本发明是与多个分子的抗原反复结合的抗原结合分子。发明人等发现与在血浆中的pH下的抗原结合活性相比在早期核内体内的pH下的抗原结合活性弱的抗体，其能够以1分子的抗体与多个分子的抗原结合，血浆中半衰期长，可与抗原结合的期间得到改善。
文档编号A61K39/395GK103251948SQ20131016063
公开日2013年8月21日 申请日期2009年4月10日 优先权日2008年4月11日
发明者井川智之, 石井慎也, 前田敦彦, 中井贵士 申请人:中外制药株式会社