专利名称：一种治疗乙型肝炎的重组质粒dna疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗乙肝疾病的重组质粒DNA疫苗，属于生物医学领域。
背景技术：
乙型肝炎严重危害人类健康，目前尚无特效治疗手段，乙肝慢性化的主要原因是乙肝病毒(HBV)感染后机体缺乏持久的特异性细胞免疫及体液免疫。HBV外壳蛋白是有大蛋白LS(S1S2S抗原，由前Sl-前S2-S基因编码)、中蛋白MS(S2S抗原，由前S2-S基因编码)、小蛋白S(S抗原，由S基因编码)三种分子构成，其中，前S2抗原分子量小，抗原性强， 涉及乙肝病毒对宿主细胞的吸附，因而含前S抗原的疫苗最被接种者的保护作用应更为有效，在HBV感染后的病毒清除方面发挥重要作用。重组质粒DNA疫苗是把外源基因克隆到真核表达载体上，然后将重组质粒直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反应。 与传统的疫苗相比，重组质粒DNA疫苗不仅能有效诱导体液免疫，还能诱导细胞免疫，DNA 质粒疫苗(基因疫苗)已经在许多疾病的治疗和预防方面显示出广泛的应用前景。近年来， 国内外学者在乙型肝炎病毒DNA疫苗的构建和免疫效果方面进行了大量的研究，由于载体大小不同以及载体DNA结构中，有无免疫刺激序列均会影响DNA疫苗引发的免疫效果。在现阶段的研究中，构建的乙型肝炎病毒DNA疫苗所用的质粒所用的载体中大都缺乏免疫增强的成分，如所用的载体PCDNA3. 1、pVAXl、pHBV α等，载体分子量较小，缺乏免疫刺激序列， 当用这些载体构建的重组DNA疫苗对人体进行免疫治疗时，所起得的免疫治疗效果也相对较低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的治疗乙肝的重组质粒DNA疫苗，本发明所述的重组质粒DNA疫苗在传统DNA疫苗载体基础上加入了一些提高外源抗原蛋白表达及刺激机体免疫反应的功能元件，在动物实验免疫时，可获得更好的细胞免疫和体液免疫效果。具体地，本发明所述的治疗乙肝的重组质粒DNA疫苗携带乙肝病毒(HBV)蛋白编码基因，并含有大肠杆菌复制起始点ColEl、卡那抗性基因序列Kan、来源于SV40的增强子元件Enhancer、转录调控元件内含子Intronl和外显子Exonl、来源于HBV的转录后调节元件HPRE及免疫调节序列CpG等元件，其中乙肝病毒蛋白基因受增强子、巨细胞病毒启动子、 转录调控元件Intronl和Exonl及转录后调节元件HPRE和牛生长激素基因的聚腺苷酸信号调控。本发明中，所述的重组质粒DNA疫苗还可携带有多克隆位点区MCS，所述的多克隆位点区包括SwaI、KpnI、SaII、EcoRv, BgI11等酶切位点。本发明中，质粒中所含的HBV蛋白编码基因可以是S1S2S或S2S或S蛋白编码基因中的任意一种，优选HBV包膜中S2S蛋白编码基因。本发明中S2S编码基因可以是HBV蛋白中的B亚型的preS2S编码基因，也可以是C亚型的preS2S编码基因，优选C亚型的preS2S编码基因。本发明的再一目的在于提供一种构建本发明所述的重组疫苗质粒的方法，具体包括(1)先构建重组质粒载体骨架P0E-EKS，其核苷酸序列为kq No. 1所标示的核苷酸序列以pDRVISVl. 0为模板，以Primerl与Primer2为引物，其中引物2为5，末端磷酸化的引物，扩增获得大小为748bp的复制子区域(Ori)，同时引入Ec0RI、KpnI及SwaI酶切位点；Primerl :5’ -GGAATTCGGGGTACCATTTAAATTTGAACGTTCGCAAtATGTGAGCAAAAGGCCAG C-3，Primer2 :5’ -CGGCGCGCGCCGAAAACGACGATTGCGAACGTTCAACCCGTAGAAAAGATCAAAG G-3，以pDRVISVl. 0为模板，以Primerf与Primer4为引物，其中引物3为5，末端磷酸化的引物，扩增获得大小为1056bp的卡那抗性标记基因(Kan)，同时引入EcoRI酶切位点，Primer3 :5’ -tcgtcgttttcggcgcgcgccgTTGAACGTTCGCAAtTCAAGTCAGCGTAATGCT C-3，Primer4 5’ -GGAATTCGGCGCGCGCCGAAAACGACGATGCGAACGTTCAAGAAAGCCACGTTGTGTC T-3，将上述两个片段分别以EcoRI进行单酶切，连接后构建重组克隆pOK-EKS ；(2)构建重组质粒 DNA 疫苗 pRec2. 0_cPreS2. S将合成基因cl^reSZS通过Xhol+Xbal双酶切与&ilI+XbaI双酶切的载体pHPRE连接，构建获得重组克隆pHPRE-cI^reSZS ；以pDRVISVl. 0为模板，以I^rimerS与I^rimere为引物，扩增获得大小为271bp的 BGHpolyA区，同时在上游引入BamHI酶切位点，下游引入Bglll-EcoRV-SalI-KpnI酶切位点；通过BamHI+Kpnl双酶切后克隆入Bglll+Kpnl双酶切的pHPRE-cI^reSZS载体中，获得重组质粒 pHPRE，-cPreS2S ；Primer5 :5，_CGGGATCCgctgtgccttctagttgccag_3，Primer6 :5’ -GGGGTACCGTCGACAACGTTGATATCAACGTTAGATCTCATAGAGCCCACCGCATC C-3，通过EcoRI+Kpnl将重组质粒pHPRE，-cPreS2S的cl^reSZS表达盒克隆入载体 pOK-EKS中，构建重组质粒pRec2. 0_cPreS2S，其核苷酸序列为kq No. 2所标示的核苷酸序列。在上述方法中，所用的合成基因cPreS2S委托北京雷默生物科技有限公司合成， 其核苷酸序列为CCGCTCGAGCCGCCACCatgcagtggaactctaccacattccatcaggctctgctggaccctagagtga ggggactctatttccccgccggaggaagctcctctggcatgtgaacccagtgcccacaaccgcaagccctattcctc tatctttagccggaccggagaccccgctccta atATGGAAAACACTACCTCCGGCTTTCTGGGTCCACTGCTCGTC CTGCAGGCCGGCTTCTTCCTGCTCACCAGAATCCTGACAATCCCCCAGAGCCTGGACTCTTGGTGGACATCCCTGAA CTTCCTCGGAGGCGCACCCACTTGTCCTGGTCAGAATAGCCAGTCCCCAACCAGCAACCACTCCCCTACATCTTGTC
4CCCCAATTTGCCCTGGCTACAGGTGGATGTGTCTGAGACGCTTTATCATTTTCCTGTTTATCCTGCTCCTGTGCCTG ATTTTCCTGCTCGTGCTGCTGGACTACCAGGGAATGCTCCCCGTGTGTCCACTGCTCCCCGGAACCAGCACCACTTC CACCGGTCCTTGTAAGACATGCACAATCCCCGCTCAGGGCACCAGCATGTTTCCATCCTGTTGCTGTACCAAACCCA GCGACGGCAACTGCACTTGTATTCCCATCCCTTCTTCCTGGGCCTTCGCCAGATTCCTGTGGGAATGGGCAAGCGTC AGGTTCTCCTGGCTGAGCCTGCTCGTGCCCTTTGTGCAGTGGTTTGTCGGCCTGTCTCCCACAGTGTGGCTGAGCGT GATTTGGATGATGTGGTATTGGGGACCATCCCTGTATAATATCCTCTCTCCCTTCCTGCCTCTGCTCCCAATTTTCT TTTGCCTGTGGGTTTACATCTGATTCTAGAGC在上核苷酸序列中，以小写字母表示的一序列核苷酸为一段Kozak序列，核苷酸序列起始端一段序列CTCGAG为引入的B10I酶切位点，核苷酸末端一段序列TCTAGA为引入 W XbaI酶切位点。本发明的还一目的在于提供一种含本发明所述重组质粒DNA疫苗的组合物，本发明所述的组合物，除含有重组质粒疫苗pRec2. 0-preS2S外，还包括其它可用于预防和治疗乙肝病毒的药物，如可以是一些干扰素、白介素类药物，还可以是一些抗病毒的药物，如核苷类药物，包括拉米呋啶、齐多呋啶等，还可以是一些天然药物提取成功，如灵芝多糖、香菇多糖、黄芪多糖等。本发明的还一目的在于提供一种本发明所述的重组质粒DNA疫苗及本发明所述的含本发明所述重组质粒DNA疫苗的组合物在制备具有预防和治疗乙型肝炎疾病药物中的用途，将本发明的重组疫苗质粒pRec2. 0-preS2S注射给予Balb/c小鼠，可明显增强小鼠 HBsAg的体液免疫和细胞免疫水平。
图1为重组质粒载体疫苗骨架pOE-EKS的结构示意2为重组质粒pRec2. 0-cPreS2. S的结构示意3为重组质粒pRec2. 0_cPreS2. S的酶切鉴定图，Ml为marker DL15000 ；M2为 marker DL2000 ；泳道1标示质粒经Ncol+Xbal双酶切后的电泳片段，切出三条带，分别为 900bp、1200bp、3000bp，以验证启动子和目的基因序列的大小；泳道2标示质粒经EcoRI单切后的电泳片段，大小约为5100bp。具体是实施例下列实施例中所用的材料大肠杆菌DH5 α购自hvitrogen公司；携带转录后调节元件(HPRE)的DNA疫苗质粒ρ^ιΗ、质粒pDRVISVl. O由中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心病毒免疫室惠赠；真核表达质粒pVAX-l、pcDNA3. 1购自hvitrogen公司；真核表达载体pHPRE由中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心病毒免疫室构建；携带内部核糖体进入位点 (IRES)的双顺反子表达质粒pIRESneo购自Clontech公司J93T、C0S_7细胞购自于ATCC ； 小鼠脾细胞以1640完全培养基培养(10%胎牛血清，^witrogen公司)；各种限制新内切酶、Pfu聚合酶、DNA连接试剂Sol I均购自NEB公司；质粒抽提纯化试剂盒购自TIANGEN公司；乙肝表面抗原及表面抗体定量ELISA检测试剂盒(化学发光法)购自北京源德生物科技有限公司。小鼠IFN-Y的ELISP0T检测试剂盒购自BD公司。抗原刺激肽由北京赛百盛生物技术有限公司合成。基因合成及基因测序工作委托北京英峻生物科技有限公司进行。
实施例1质粒pRec2. 0_cPreS2S的构建(1)先构建重组疫苗质粒载体骨架pOE-EKS以pDRVISVl. 0为模板，以I^rimerl与I^rimerf为引物，扩增获得大小为748bp的复制子区域(Ori)，同时引入EcoRI、KpnI及SwaI酶切位点；Primerl :5，-GGMTTCGGGGTACCATTTMATTTGMCGTTCGCMtATGTGAGCMMGGCCAGC-3，Primer2 :5，-CGGCGCGCGCCGMMCGACGATTGCGMCGTTCMCCCGTAGMMGATCMAGG-3，以pDRVISVl. 0为模板，以Primer3与Primer4为引物，扩增获得大小为1056bp的卡那抗性标记基因(Kan)，同时引入EcoRI酶切位点，Primerf :5，-tcgtcgttttcggcgcgcgccgTTGMCGTTCGCMtTCMGTCAGCGTMTGCTC-3，Primer4 :5，-GGAATTCGGCGCGCGCCGAAAACGACGATGCGAACGTTCAAGAAAGCCACGTTGTGTCT-3'将上述两个片段分别以EcoRI进行单酶切，连接后构建重组克隆pOK-EKS ；(2)构建重组疫苗质粒 pRec2· 0-cPreS2. S将合成基因cl^reSZS通过Xhol+Xbal双酶切与&ilI+XbaI双酶切的载体pHPRE连接，构建获得重组克隆pHPRE-cI^reSZS ；以pDRVISVl. O为模板，以I^rimerS与I^rimere为引物，扩增获得大小为271bp的 BGHpo 1 yA区，同时在上游引入BamHI酶切位点，下游引入BglII-EcoRV-SalI-KpnI酶切位点；通过BamHI+Kpnl双酶切后克隆入Bglll+Kpnl双酶切的pHPRE-cI^reSZS载体中，获得重组质粒 pHPRE，-cPreS2S ；Primer5 :5， _CGGGATCCgctgtgccttctagttgccag_3，Primer6 :5，-GGGGTACCGTCGACMCGTTGATATCMCGTTAGATCTCATAGAGCCCACCGCATCC-3，通过EcoRI+Kpnl将重组质粒pHPRE，-cPreS2S的cl^reSZS表达盒克隆入载体 pOK-EKS中，构建重组质粒pRec2. 0_cPreS2S。重组质粒的测序结果见附录，测序对应于质粒的位置见表1。表1测序结果对应于重组质粒pRec2. 0-cPreS2S的位置表
权利要求
1.一种用于治疗乙肝的重组质粒DNA疫苗，其特征在于所述重组疫苗质粒DNA疫苗携带乙肝病毒蛋白编码基因，并含有大肠杆菌复制起始点ColEl、卡那霉素抗性基因序列 Kan、以及来源于SV40的增强子元件Enhancer、转录调控元件内含子htronl、来源于HBV 转录后调节元件HPRE及免疫调节元件CpG，所述乙肝病毒蛋白编码基因受增强子、巨细胞病毒启动子、转录调控元件htronl及转录后调节元件HPRE和牛生长激素基因的聚腺苷酸信号调控。
2.根据权利要求1所述的重组质粒DNA疫苗，其特征是所述的乙肝病毒蛋白编码基因为乙肝病毒包膜中蛋白S2S蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的重组质粒DNA疫苗，其特征是所述的S2S蛋白编码基因是指 HBV包膜蛋白中的C亚型preS2S蛋白的编码基因。
4.一种制备权利要求1-3中任意一权利要求所述的重组质粒DNA疫苗的方法，其特征在于包括如下步骤(1)先构建重组质粒载体骨架P0E-EKS，其核苷酸序列为kqNo. 1所标示的核苷酸序列以pDRVISVl. 0为模板，以Primerl与Primer2为引物，其中引物2为5，末端磷酸化的引物，扩增获得大小为748bp的复制子区域(Ori)，同时引入Ec0RI、KpnI及SwaI酶切位点； Primer 1:5’ -GGAATTCGGGGTACCATTTAAATTTGAACGTTCGCAAtATGTGAGCAAAAGGCCAGC-3’ Primer2 5’ -CGGCGCGCGCCGAAAACGACGATTGCGAACGTTCAACCCGTAGAAAAGATCAAAGG-3’ 以pDRVISVl. 0为模板，以Primerf与Primer4为引物，其中引物3为5，末端磷酸化的引物，扩增获得大小为1056bp的卡那抗性标记基因(Kan)，同时引入EcoRI酶切位点； Primerf :5’ -tcgtcgttttcggcgcgcgccgTTGAACGTTCGCAAtTCAAGTCAGCGTAATGCTC-3' Primer4 :5，-GGAATTCGGCGCGCGCCGAAAACGACGATGCGAACGTTCAAGAAAGCCACGTTGTGTCT-3’ 将上述两个片段分别以EcoRI进行单酶切，连接后构建重组克隆pOK-EKS ；(2)构建重组质粒DNA疫苗pRec2.0-cPreS2. S将合成基因cl^reSZS通过Xhol+Xbal双酶切与Mll+Xbal双酶切的载体pHPRE连接， 构建获得重组克隆pHPRE-cI^reSZS ；以pDRVISVl. O为模板，以I^rimerS与I^rimere为引物，扩增获得大小为271bp的 BGHpolyA区，同时在上游引入BamHI酶切位点，下游引入Bglll-EcoRV-SalI-KpnI酶切位点；通过BamHI+Kpnl双酶切后克隆入Bglll+Kpnl双酶切的pHPRE-cI^reSZS载体中，获得重组质粒 pHPRE，-cPreS2S ；Primer5 5' -CGGGATCCgctgtgcct tctagttgccag-3‘Primer6 :5’ -GGGGTACCGTCGACAACGTTGATATCAACGTTAGATCTCATAGAGCCCACCGCATCC-3’ 通过EcoRI+Kpnl将重组质粒pHPRE，_cPreS2S的cl^reSZS表达盒克隆入载体pOK_EKS 中，构建重组质粒pRec2. 0-cPreS2S，其核苷酸序列为kq No. 2所标示的核苷酸序列。
5.一种含有权利要求1-3中任一权利要求所述重组质粒DNA疫苗的组合物。
6.权利要求1-3中任意一权利要求所述重组质粒DNA疫苗在制备具有预防和治疗乙型病毒性肝炎药物中的应用。
7.权利要求5所述的组合物在制备具有预防和治疗乙型病毒性肝炎药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种重组质粒DNA疫苗，本发明重组质粒DNA疫苗传统DNA疫苗载体基础上加入了一些提高外源抗原蛋白表达及刺激机体免疫反应的功能元件，在动物实验免疫时，可获得更好的细胞免疫和体液免疫效果。
文档编号A61K48/00GK102198275SQ20101013264
公开日2011年9月28日 申请日期2010年3月26日 优先权日2010年3月26日
发明者刘勇, 周德胜, 张春丽, 李鼎峰 申请人:北京凯因生物技术有限公司, 北京凯因科技股份有限公司