专利名称：山竹果皮花色苷的提取方法及其在制备抗炎药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于天然药物化学领域，特别是涉及到一种具有特异靶向性的天然抗炎药 物分子的分离提取及其应用。
背景技术：
炎症反应在人体防御外来病原体入侵以及修复自身损伤组织中，扮演着相当重要 的角色，它受到免疫系统高度精细的调控，一旦这种调节失控将会引起严重的炎症反应或 发展成慢性炎症，导致多种严重疾病，症状表现为从轻微的牛皮癣到哮喘和类风湿关节炎 等。另外，还与动脉粥样硬化、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎及急性心肌梗死等疾病有关，因 而被公认为当今危害人类健康的三大顽疾之一，预防和治疗炎症及相关综合症始终是医学 领域的难题。大量的研究表明P-选择素是参与炎症反应的重要粘附分子之一，它可以作为 抗炎药物研发的新靶点。炎症反应是一个多步骤的过程，其中白细胞在血管内皮细胞上的滚动、粘附和渗 出是炎症过程的重要环节，其分子基础在于白细胞与血管内皮细胞表面粘附分子之间的相 互作用。选择素家族是参与炎症反应起始过程的重要粘附分子。选择素家族包括三个成员 P-选择素、E-选择素和L-选择素。其中P-选择素主要分布于内皮细胞的Webel-Palade 小体中。当血管内皮受到炎症因子刺激后，P-选择素在几分钟之内就被转运到活化的内皮 表面。P-选择素糖蛋白配体-I(PSGL-I)是P-选择素的高亲和力配体，表达于所有的血源 性细胞表面，如中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等。在炎症反应过程中，内皮细胞表面的 P"选择素与白细胞表面的PSGL-I结合后，使白细胞在血管内皮细胞上发生起始粘附和滚 动，进而引发一系列炎症事件。资料表明，P-选择素参与了多种疾病的病理生理过程，其过 渡或持续表达已经成为某些组织炎症病变的标志。阻断P-选择素与配体的结合，可以抑制 白细胞与血管内皮的粘附作用，从而有效的阻断炎症反应的产生。筛选P-选择素的高效拮 抗剂，阻断白细胞粘附，可以为炎症及其相关重大疾病的治疗提供新的策略和手段。花色苷是植物天然色素，广泛存在于植物的花、果实和叶中。花色苷是一种高效的 抗氧化剂，有研究证明其抗氧自由基的能力是维生素E的50倍，是维生素C的20倍。花色 苷作为无毒、高效的天然抗氧化剂，在保健食品及饮料中广泛应用，成为美国天然植物提取 物十大畅销品种之一，有着广阔的市场。除了极强的抗氧化能力外，它还可以降低心脏病、 癌症、糖尿病的发病率，增强血管壁抵抗力，降低毛细血管脆性，保持毛细血管通透性，预防 并缓解静脉曲张，减轻水肿和腿部肿胀。同时还能增强机体免疫能力，抵御外来病原体入 侵。山竹是一种重要的热带水果，其果皮占果实总重量的70-80%左右，常常被作为废 弃物扔掉。充分利用这一废弃资源，研发抗炎新药，具有广阔的应用前景。目前有关山竹果皮中花色苷的提取及其药物用途未见报道。
发明内容
本项发明目的是提供一种从山竹果皮中分离提取出天然花色苷成分的方法，通过体内、体外炎症模型，确证针对P-选择素靶点，山竹果皮花色苷的抗炎效果，将其应用于制 备预防和治疗炎症及相关疾病的药物之中。本发明涉及到山竹果皮花色苷的分离提取方法、体内急性腹腔炎小鼠模型、体外 模拟毛细血管层流实验等相关内容。本发明采取山竹果皮花色苷的分离提取方法是先将山竹果皮风干后粉碎，利用酸性乙醇提取，提取液减压浓缩后，加水溶解加样 到XAD-7大孔树脂中，分别用水、乙醇洗脱，收集乙醇部分，浓缩后，加水冻干，得到总花色 苷成分，样品呈现紫红色粉末状。利用急性腹腔炎小鼠模型检测山竹果皮花色苷的抗炎活性，结果表明尾静脉注 射山竹果皮花色苷后能够有效抑制小鼠腹腔液中性粒细胞渗出，在剂量为0.01、0. Ulmg/ ml时，抑制率分别达到了 34%、77%、94%。此外，构建稳定转染P-选择素的CHO细胞系 (CHO-P)，利用体外模拟毛细血管的层流实验，模拟生理条件下炎症部位活化的血管内皮细 胞表面的P-选择素介导的白细胞与血管内皮的粘附作用。通过层流模型研究发现，0.01、 0. Ulmg/ml剂量的山竹果皮花色苷在层流条件下对中性粒细胞的粘附抑制率分别达到 45%,71%,89%o本发明在分子水平、细胞水平和整体水平上，确证了山竹果皮花色苷的抗炎活性， 山竹果皮花色苷作为新型抗炎药物有着良好的应用前景。
附图1为山竹果皮花色苷对小鼠急性腹腔炎的抑制作用示意图；附图2为山竹果皮花色苷对中性粒细胞与CHO-P在层流状态下结合的抑制作用示 意图。
具体实施例方式实施例1 山竹果皮花色苷的分离提取(1)花色苷粗提物的分离。将完全风干的山竹果皮粉碎，在20 70°C的条件下， 加入10 40倍体积的20% 90%乙醇，调节PH值为1 5，反复提取3 8次，每次提取 1 5h，过滤后合并提取液。将得到的提取液在30 70°C、真空度-0. 03 -0. 09MPa下减 压蒸馏回收醇溶剂，使滤液的醇浓度降至10%以下，经离心、过滤，得到山竹果皮花色苷浸 提液。(2)大孔树脂分离花色苷。XAD-7大孔树脂用乙醇/水充分清洗预处理后装柱，将 山竹果皮花色苷浸提液上样到树脂柱，在温度为5 50°C、流速为0. 5 3BV/h条件下，缓 慢在大孔树脂柱上进行花色苷的吸附。吸附结束后，用2 5倍柱体积的蒸馏水洗脱未结 合的杂质，注意不要洗掉色素物质，此时树脂柱颜色深红紫色。在温度为5 50°C、流速为 0. 5 3BV/h条件下，用30 100%乙醇洗脱大孔树脂上的花色苷，直至树脂柱变为无色， 收集洗脱液。在30 70°C、真空度-0. 03 -0. 09MPa下减压蒸馏回收醇溶剂，浓缩液冷冻干燥后得到山竹果皮花色苷成分，样品呈现紫红色粉末状。实施例2:山竹果皮花色苷对小鼠急性腹腔炎的抑制作用向雄性小鼠腹膜内注射1 5mL的1 10% Thioglycollate broth (Sigma)或者无菌生理盐水。5 30min后，于小鼠尾 静脉分别注射无菌生理盐水、0. 01,0. Ulmg/ml的山竹果皮花色苷的生理盐水溶液。1 5h 后处死小鼠，用1 5mL的生理盐水灌洗，收集腹腔液。500 2000rpm离心1 IOmin后， 一部分细胞用血球记数板进行总腹腔细胞的双盲(double blindly)记数；另一部分固定， 涂片和染色，记数每mL中性粒细胞的数目。上述实验重复三次，取平均值。结果显示，与阴 性对照组相比，山竹果皮花色苷能够显著的抑制模型小鼠腹腔中白细胞的渗出，其不同剂 量山竹果皮花色苷的抑制率分别达到了 34%、77%、94%，见附图1。实施例3:山竹果皮花色苷抑制中性粒细胞与CHO-P在层流状态下的结合用体外模拟毛细 血管的层流实验测定中性粒细胞与牢固贴壁的CHO-P的粘附作用。所有用于层流实验的单 细胞悬液密度均为1 5X 106cells/mL。将长满CHO-P的35mm培养皿装配于平行板流动小 室，然后放置在倒置显微镜的载物台上(在与中性粒细胞作用前，表达P-selectin的CHO-P 细胞分别与0. 01,0. Ulmg/ml的山竹果皮花色苷作用10 120分钟)。倒置显微镜连接有 彩色视频摄像装置，可以将视频图像传送到录像机，并可用相连的计算机显示器同步观察。 首先用注射泵(Cole-Parmer Instrument Co.)注入PBS冲洗平行板流动小室1 5min， 注入中性粒细胞单细胞悬液(1 5X 106cells/mL)，以适合的流速维持层壁剪切压0. 1 0. 5dyn/Cm2，模拟体外微循环和后毛细血管静脉的流体机械环境。整个系统保持在15 30°C，当中性粒细胞进入视野1 5min后，随机选定10 20个区域(0. 1266mm2)，记录粘 附于CHO-P表面的中性粒细胞，最后通过观看录像带人工计数。结果显示，山竹果皮花色苷 可以明显地抑制中性粒细胞与CHO-P在层流状态下的结合。与阳性对照相比，其抑制效果 分别达到45%、71%、89%，见附图2。
权利要求
山竹果皮花色苷的提取方法，其特征在于具体步骤是(1)花色苷粗提物的分离将完全风干的山竹果皮粉碎，在20～70℃的条件下，加入10～40倍体积的20％～90％乙醇，调节pH值为1～5，反复提取3～8次，每次提取1～5h，过滤后合并提取液，将得到的提取液在30～70℃、真空度-0.03～-0.09MPa下减压蒸馏回收醇溶剂，使滤液的醇浓度降至10％以下，经离心、过滤，得到山竹果皮花色苷浸提液；(2)大孔树脂分离花色苷XAD-7大孔树脂用乙醇/水充分清洗预处理后装柱，将山竹果皮花色苷浸提液上样到树脂柱，在温度为5～50℃、流速为0.5～3BV/h条件下，缓慢在大孔树脂柱上进行花色苷的吸附，结束后，用2～5倍柱体积的蒸馏水洗脱未结合的杂质，保持色素物质，此时树脂柱颜色深红紫色，在温度为5～50℃、流速为0.5～3BV/h条件下，用30～100％乙醇洗脱大孔树脂上的花色苷，至树脂柱变为无色，收集洗脱液，在30～70℃、真空度-0.03～-0.09MPa下减压蒸馏回收醇溶剂，浓缩液冷冻干燥后得到山竹果皮花色苷成分，呈现紫红色粉末状。
2.按权利要求1的方法提取的山竹果皮花色苷，其特征在于其为具有吸湿性的呈紫 红色粉末状物质，色苷含量到达60-95 %，水溶性好，易容于甲醇，微溶于三氯甲烷，不溶于 甲苯、乙醚、石油醚；在可见光区最大吸收波长为532nm;水溶液呈现的颜色，随溶液从酸到 碱，而呈现由深紫红一深红一浅红一浅黄一深黄的变化。
3.山竹果皮花色苷在制备针对P-选择素靶点的抗炎药物中的应用。
全文摘要
本发明属于天然药物化学领域，特别是涉及到一种天然抗炎药物分子的分离提取及其应用。本发明利用酸性乙醇提取，减压浓缩，加水溶解加样到XAD-7大孔树脂中，洗脱，收集浓缩，冻干等方法，提取山竹果皮花色苷。实验结果表明尾静脉注射山竹果皮花色苷后能够有效抑制小鼠腹腔液中性粒细胞渗出，在剂量为0.01、0.1、1mg/ml时，抑制率分别达到了34％、77％、94％。利用体外模拟毛细血管的层流实验，表明0.01、0.1、1mg/ml剂量的山竹果皮花色苷在层流条件下对中性粒细胞的粘附抑制率分别达到45％、71％、89％。确证了山竹果皮花色苷的抗炎活性，山竹果皮花色苷作为新型抗炎药物有着良好的应用前景。
文档编号A61P29/00GK101816687SQ20101013239
公开日2010年9月1日 申请日期2010年3月26日 优先权日2010年3月26日
发明者佟海滨, 曾宪录 申请人:东北师范大学