长效干扰素及其制备方法和用途

长效干扰素及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明属生物制药领域，涉及一种长效干扰素及制备方法和用途；所述长效干扰素包括多聚唾液酸修饰的干扰素和长效干扰素重组融合蛋白；其中所述多聚唾液酸采用高碘酸钠进行激活，活化的多聚唾液酸在氰基硼氢化钠存在的情况下与干扰素进行反应形成偶联物；所述重组融合蛋白由N-端的干扰素和C-端的天然存在的亲水性无重复序列的多肽组成，该融合蛋白可在大肠杆菌中高效表达，且制备工艺简单，可用于大规模的药物级融合蛋白的生产制备。本发明的长效干扰素可用于肝炎病毒、SARS、单纯疱疹病毒等病毒感染性疾病的治疗，和用于恶性神经胶质瘤、肺癌等恶性肿瘤及其他细胞增殖性疾病的治疗。
【专利说明】长效干扰素及其制备方法和用途

【技术领域】
[0001] 本发明属生物制药领域，涉及长效干扰素及制备方法和用途，具体涉及用于抗病 毒、抗感染、抗肿瘤和免疫调节的长效干扰素及制备方法和用途。

【背景技术】
[0002] 现有技术公开了干扰素（Interferon)是人和动物的细胞在受细菌、病毒感染或 核苷酸等刺激物的诱导下分泌的一组具有抗病毒等活性的多功能糖蛋白；是最早用于疾病 临床治疗的细胞因子（Pestka S, Langer JA, Fisher PB, Weinstein IB, Ortaldo J， Herberman RB: Symp Fundam Cancer Res 1984, 37:261-281;Gutterman JU: Cytokine therapeutics: yfei/ Jcat/ 5bi " 51 J 1994, 91(4) :1198-1205)。所述干扰素主要 有α干扰素、β干扰素、Y干扰素和ω干扰素等类型，根据干扰素产生的细胞来源、受体、 氨基酸结构及对酸耐受程度的不同，可将干扰素分为I型干扰素和II型干扰素，其中I型 干扰素包括α干扰素、β干扰素和ω干扰素；I型干扰素被称为抗病毒干扰素，其生物学 效应主要以抗病毒为主，同时具有抑制细胞生长，抗肿瘤，免疫调节等生物活性。所述Υ干 扰素属于II型干扰素，抗病毒活性较I型干扰素弱，其生物学活性主要表现为免疫调节和 参与组织相容性抗原的表达，又称为免疫干扰素 （Stewart WE, 2nd, Wiranowska-Stewart M, Koistinen V，Cantell K: 1979, 97(2):473-476·)。
[0003] 研究公开了 β干扰素是由成纤维细胞产生的，与α干扰素识别相同受体且具有 类似生物学效应的蛋白质；天然人β干扰素是由第9号染色体上单一基因编码的分子量 约为23千道尔顿的糖蛋白；其前体分子由21个氨基酸的信号肽序列和166个氨基酸的β 干扰素分子组成，含有3个半胱氨酸和一个糖基链，其中位于第31、141位的半胱氨酸可形 成二硫键，对于β干扰素生物活性的维持具有重要作用（Mark DF，Lu SD，Creasey ΑΑ， Yamamoto R, Lin LS: Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81 (18) :5662-5666) 〇
[0004] 研究显示，β干扰素具有广谱的抗病毒活性，但其抑制病毒增殖的作用机理因 病毒种类的不同而有所差异，如β干扰素可抑制口炎疱疹病毒对细胞的吸附而发挥抗病 毒效用；通过抑制病毒脱衣壳和病毒核酸的转录而抑制单纯疱疹病毒和流感病毒的增殖 (Kumar Μ, Liu Η, Rice AP: 2012，7(7) :e41251);通过阻断病毒蛋白的合成而 抗疱疹病毒；通过抑制逆转录病毒单纯疱疹病毒成熟病毒颗粒的释放而行使抗病毒功能； β干扰素还可通过诱导组织细胞产生蛋白激酶、磷酸二酯酶等抗病毒蛋白而抑制病毒复制 和增殖，通过诱导单核巨噬细胞和自然杀伤细胞等免疫细胞的活化来增强对病毒的吞噬作 用。有研究发现，β干扰素还具有抗SARS病毒的活性，是唯一一种在感染后仍具有抗病毒 效用的干扰素 （Subramanian GM, Moore PA, Gowen ΒΒ, Olsen AL, Barnard DL, Paragas J, Hogan RJ, Sidwell RW: aewoiAeraAF 2008, 54(3) : 176-180);此外，β 干扰素还广 泛应用于乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒所引起的病毒性肝炎、流行性病毒性脑炎、单纯疱 疹病毒角膜炎和病毒性心肌炎等病毒性感染疾病的治疗（Morikawa H，Kozuka R，Fujii H, Iwai S, Enomoto M, Tamori A, Saito S, Kawada N: Hepatol Res 2013)。
[0005] 有研究显示，β干扰素具有抗肿瘤的生物学效应；其对恶性神经胶质瘤、乳腺 癌、结肠癌、肾癌、非小细胞肺癌、喉癌、胰腺癌、恶性黑色素瘤、多发性骨髓瘤等多种肿瘤 具有抑制和杀伤效果。β干扰素抗肿瘤的作用机理主要包括直接抑制肿瘤细胞增殖；作 用于机体的免疫系统，提高单核巨噬细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤 能力，诱导肿瘤细胞发生细胞凋亡；抑制肿瘤微环境血管的生成而发挥抗肿瘤的作用等 (Okazaki T, Kageji T, Kuwayama K, Kitazato KT, Mure H, Hara K, Morigaki R, Mizobuchi Y, Matsuzaki K, Nagahiro S: Cancer Lett 2012, 323 (2):199-207;Park MY, Kim DR, Jung Hff, Yoon HI, Lee JH, Lee CT: Cancer Gene Ther 2010, 17(5):356-364;Vitale G, Zappavigna S, Marra M, Dicitore A, Meschini S, Condello M, Arancia G, Castiglioni S, Mar on i P, Bendinelli P et ah Biotechnol Adv 2012, 30(1):169-184;Olson MV, Lee J, Zhang F, Wang A, Dong Z: Cancer Gene Ther 2006, 13 (7):676-685;van Koetsveld PM, Vitale G, Feelders RA, ffaaijers MM, Sprij-Mooij D, de Krijger RR, Speel EJ, Hofland J, Lamberts Sff, de Herder ffff et ah Endocr Relat Cancer 2013;Roh MR, Zheng Z, Kim HS, Jeung HC, Rha SY, Chung KY: Melanoma Res 2013, 23(2):114-124;Naik S, Nace R, Barber GN, Russell SJ: Cancer Gene Ther 2012, 19 (7): 443-450)。
[0006] 1993年β干扰素作为治疗多发性硬化的推荐用药在美国和欧洲被批准上市，至 今仍是FDA批准的用于多发性硬化治疗唯一的生物制品类药物，也是目前治疗多发性硬化 最有效的药物（Paty DW, Li DK: 1993，43 (4): 662-667)。
[0007] 目前已上市的β干扰素主要有三种来源，分别为由人成纤维细胞经适度 刺激分泌产生的天然人β干扰素、由大肠杆菌表达的非糖基化重组突变型人β干 扰素和由中国仓鼠卵巢细胞表达的重组天然人β干扰素 （Rodriguez J, Spearman M, Tharmalingam T, Sunley K, Lodewyks C, Huzel N, Butler M: J Biotechnol 2010, 150(4) :509-518; Singh AB, Sharma AK, Mukherjee KJ: Mol Biosyst 2012, 8(2) :615-628)。从人成纤维细胞中分离的天然人β干扰素十分有限，产量很低，价格昂 贵，无法满足日益增长的临床需求；而利用哺乳动物细胞生产的β干扰素虽具有同天然人 β干扰素相同的结构功能，但其生产成本高、周期长、条件苛刻且蛋白表达量低，同样严重 制约了其在临床治疗中的广泛应用。相比较而言，大肠杆菌作为首个用于生产重组蛋白的 工程菌，不仅具有生产成本低、生产周期短、转化效率高、培养条件简单、操作容易等优点， 且其遗传背景清楚，表达外源基因产物的水平远高于其他表达系统。研究发现，胞内表达的 β干扰素蛋白可占菌体总蛋白的109Γ70%，且在大肠杆菌中表达的人β干扰素经纯化、复 性后具有与天然β干扰素相同的生物学活性；可以满足β干扰素大量生产的需求。
[0008] 多年以前国内诸多研究机构就开始了对β干扰素的研制，陈国友等构建了 pLCM182-17Ser重组人β干扰素表达载体，将其转化大肠杆菌丽294,实现了 β干扰素的 热诱导表达，并探索了一种适于中试生产的发酵和纯化方法（陈国友，蒋应明，张意，黄欣， 厉永健，施群英，王全兴，张明徽，何龙，曹雪涛，基因工程人β干扰素的原核表达及纯化研 究.中国肿瘤生物治疗杂志，2001，8(2) :130-133);中国疾病预防控制中心的李武平等使 用大肠杆菌偏爱密码子人工合成了 β干扰素 lb基因，构建pBV220-IFN-i3 1b表达载体， 转化大肠杆菌DH5ci，实现了 β干扰素的表达并进行了纯化（李武平，吕宏亮，段招军，张 丽萍，刘永清，吴斌文，陈勇，张成海，衣作安，魏开坤，侯云德，干扰素 -β lb的高效表达、纯 化及抗病毒活性研究.病毒学报，2002, 18(3) :240-244);北京生物制品研究所研制的注 射用重组人干扰素 β lb是国内第一个获得临床研究批件的β干扰素生物制品（刘建源， 张振龙，杨云凯，张琰平，邓宛明，樊晓翔，重组人干扰素 -β的中试研究.生物技术通讯， 2001，12(4) :270-272)，目前正在进行临床II期研究，但是到现在为止尚没有任何国产的 β干扰素上市。
[0009] 此外，由于β干扰素的分子量小、易被肾小球的滤过作用清除，在体内的半衰期 很短(皮下给药或肌肉注射的半衰期只有4-6小时)，为了维持体内有效的血药浓度，需多 次用药或采用蛋白质长效修饰技术延长β干扰素的半衰期。蛋白质的长效化修饰手段主 要包括利用PEG、葡聚糖等进行化学手段修饰和采用基因工程手段表达融合蛋白进行修饰 (Nairn Nff, Shanebeck KD, Wang A, Graddis TJ, VanBrunt MP, Thornton KC, Grabstein K:沿oco/u·收·泛￡? 2012, 23(10) :2087-2097)。目前已上市的长效β干扰素主要是PEG 化学修饰产物（Hu X, Miller L, Richman S, Hitchman S, Glick G, Liu S, Zhu Y, Crossman M, Nestorov I，Gronke RS ei 2012，52 (6): 798-808)。 尽管PEG修饰能有效延长β干扰素的半衰期，但由于PEG修饰为化学反应，可能导致β干 扰素部分活性丧失；据报道PEG在体内不能有效降解，部分人群产生抗PEG抗体，进一步限 制了 PEG 长效修饰 β 干扰素的应用（Garay RP, El-Gewely R, Armstrong JK, Garratty G, Richette P: φΥ/?价收· ifehV 2012, 9 (11) : 1319-1323)。此外采用重叠 PCR 技术将β干扰素 cDNA与人血清白蛋白cDNA进行连接，得到融合基因整合到酵母表达宿主 的染色体进行表达，可得到长效化的融合蛋白；利用β干扰素与人免疫球蛋白IgG的Fc片 段进行融合表达，可获得β干扰素 -Fc融合蛋白，延长β干扰素的半衰期，但由于人IgG存 在同种异型，多次用药可导致患者体内产生抗体而降低融合蛋白的治疗效果（Dumont JA， Low SC, Peters RT, Bitonti AJ: BioDrugs 2006, 20(3):151-160;Vallee S, Rakhe S, Reidy T, Walker S, Lu Q, Sakorafas P, Low S, Bitonti A: J Interferon Cytokine Res 2012, 32 (4) : 178-184; Zhang Q, Lei J, Ding Y, Chen Y, Qu L, Chen S, Jin J: Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao 2QQ9，2b {U) ..Um-UW'}。
[0010] 所述多聚唾液酸是N-乙酰神经氨酸通过N-连接糖苷键多聚形成的独特碳水 化合物，研究发现多聚唾液酸化多肽或蛋白质在保持活性的前提下，修饰后可显著降低 肽类化合物水解，延长半衰期，降低免疫原性（Gregoriadis G, Fernandes A, Mital M, McCormack B: #〇/ Zi/e 5bi 2000, 57 (13-14): 1964-1969)。Fernandes 等利用多 聚唾液酸对L-天冬酰胺酶进行修饰，修饰后酶的抗原性和免疫原性均低于天冬酰胺酶，但 修饰后酶抗胰蛋白酶的水解能力和体外半衰期明显增强（Fernandes AI, Gregoriadis G: 2001，217(1-2):215-224);林怡等对铜锌超氧化物歧化酶进行多聚唾液酸 修饰，修饰后产物的稳定性实验结果表明，多聚唾液酸修饰可提高铜锌超氧化物歧化酶的 酸碱稳定性、热稳定性和抗酶降解能力（Wu JR，Lin Y，Zheng ZY，Lin CC，Zhan XB，Shen YQ: Biotechnol Lett 2010, 32 (12) : 1939-1945)。此外，所述多聚唾液酸通过改变神经 系统神经黏附分子的黏附性调节神经细胞发育，对神经细胞功能的维持起重要作用（Weber M, Modemann S, Schipper P, Trauer H, Franke H, Illes P, Geiger KD, Hengstler JG, Kleemann WJ: Neuroscience 2006, 138 (4):1215-1223;Angata K, Huckaby V, Ranscht B，Terskikh A, Marth JD, Fukuda Μ: #〇/ 2007，27(19):6659-6668)。 toon]目前已知，重组多肽的氨基酸序列由天然存在的亲水性氨基酸组成，因而可生物 降解且没有免疫原性，采用分子遗传操作将重组多肽与治疗性目的蛋白进行融合表达，可 显著延长治疗性蛋白的半衰期（Schellenberger V，Wang CW, Geething NC, Spink BJ, Campbell A, To ff, Scholle MD, Yin Y, Yao Y, Bogin 0 et al\ Nat Biotechnol 2009, 27 (12) : 1186-1190)。目前已有研究证实重组多肽与人生长激素形成的融合蛋白、与胰高血 糖素形成的蛋白均能有效延长目的蛋白的半衰期；与胰高血糖素样肽2相比，重组多肽与 其融合形成的重组蛋白在小鼠、大鼠及猴子体内的半衰期分别为34h、38h和120h(Cleland JL, Geething NC, Moore JA, Rogers BC, Spink BJ, Wang CW, Alters SE, Stemmer WP, Schellenberger V: J Pharm Sci 2012, 101 (8):2744-2754;Alters SE, McLaughlin B, Spink B, Lachinyan T, Wang CW, Podust V, Schellenberger V, Stemmer WP: PLoS One 2012，7(11) :e50630)。此外，重组多肽与治疗性蛋白融合基因可通过大肠杆菌工程菌实 现原核表达，与人血清白蛋白和人免疫球蛋白IgG Fc片段真核表达相比，更具有产业化优 势；由于其生物相容性及生物可降解性优异，重组多肽有望成为延长药物蛋白半衰期最理 想的修饰工具（Geething NC, To W, Spink BJ, Scholle MD, Wang CW, Yin Y, Yao Y， Schellenberger V, Cleland JL, Stemmer WP ei 2010，5 (4) : el0175)。


【发明内容】

[0012] 本发明的目的是提供一种长效干扰素及制备方法和用途，具体涉及一种用于抗病 毒、抗感染、抗肿瘤和免疫调节的长效干扰素及制备方法和用途；所述的长效干扰素能减少 干扰素的免疫原性，延长干扰素在体内的半衰期。
[0013] 本发明所述的长效干扰素包括多聚唾液酸修饰的干扰素和长效干扰素重组融合 蛋白，其中， 所述多聚唾液酸修饰的干扰素，由活化的多聚唾液酸末端第7位的单醛基在氰基硼氢 化钠存在的情况下与干扰素反应而成的偶联物；其中，所述多聚唾液酸采用高碘酸钠进行 激活；所述的干扰素包括但不限于α干扰素、β干扰素等I型干扰素及 Y干扰素等II型 干扰素及其同源类型；所述β干扰素的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0014] 所述长效干扰素重组融合蛋白为，由N-端干扰素与c-端天然存在的亲水性非重 复序列多肽融合而成的重组蛋白；其中，所述的干扰素包括但不限于α干扰素、β干扰素 等I型干扰素及Υ干扰素等II型干扰素及其同源类型，优选β干扰素；所述天然存在的 亲水性非重复序列多肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示： Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gin Arg Ser Ser Asn Phe Gin Ser Gin Lys Leu Leu Trp Gin Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp lie Pro Glu Glu lie Lys Gin Leu Gin Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr lie Tyr Glu Met Leu Gin Asn lie Phe Ala lie Phe Arg Gin Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr lie Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gin lie Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg lie Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr lie Val Arg Val Glu lie Leu Arg Asn Phe Tyr Phe lie Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn (SEQ ID No. 1)； 所述长效干扰素重组融合蛋白中，β干扰素的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示： MSYNLLGFLQRSSNFQSQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQ DSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVE ILRNFYFINRLTGYLRN (SEQ ID No. 2)〇
[0015] 本发明还提供了编码所述长效干扰素重组融合蛋白的亲水性非重复序列多肽的 核苷酸序列，如SEQ ID No. 3所示： Atgagctacaacttgcttggattcctacaaagaagcagcaattttcagagtcagaagctcctgtggcaattg aatgggaggcttgaatattgcctcaaggacaggatgaactttgacatccctgaggagattaagcagctgcagcagtt ccagaaggaggacgccgcattgaccatctatgagatgctccagaacatctttgctattttcagacaagattcatcta gcactggctggaatgagactattgttgagaacctcctggctaatgtctatcatcagataaaccatctgaagacagtc ctggaagaaaaactggagaaagaagatttcaccaggggaaaactcatgagcagtctgcacctgaaaagatattatgg gaggattctgcattacctgaaggccaaggagtacagtcactgtgcctggaccatagtcagagtggaaatcctaagga acttttacttcattaacagacttacaggttacctccgaaac (SEQ ID No. 3)； 本发明中，编码所述长效干扰素重组融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示： atgagctacaacttgcttggattcctacaaagaagcagcaattttcagagtcagaagctcctgtggcaattg aatgggaggcttgaatattgcctcaaggacaggatgaactttgacatccctgaggagattaagcagctgcagcagtt ccagaaggaggacgccgcattgaccatctatgagatgctccagaacatctttgctattttcagacaagattcatcta gcactggctggaatgagactattgttgagaacctcctggctaatgtctatcatcagataaaccatctgaagacagtc ctggaagaaaaactggagaaagaagatttcaccaggggaaaactcatgagcagtctgcacctgaaaagatattatgg gaggattctgcattacctgaaggccaaggagtacagtcactgtgcctggaccatagtcagagtggaaatcctaagga acttttacttcattaacagacttacaggttacctccgaaacGGTACTTCTACTCCGGAAAGCGGTTCCGCATCTCCA GGTACTTCTCCTAGCGGTGAATCTTCTACTGCTCCAGGTACCTCTCCTAGCGGCGAATCTTCTACTGCTCCAGGTTC TACCAGCTCTACCGCTGAATCTCCTGGCCCAGGTTCTACCAGCGAATCCCCGTCTGGCACCGCACCAGGTTCTACTA GCTCTACCGCAGAATCTCCGGGTCCAGGTACTTCCCCTAGCGGTGAATCTTCTACTGCTCCAGGTACCTCTACTCCG GAAAGCGGCTCCGCATCTCCAGGTTCTACTAGCTCTACTGCTGAATCTCCTGGTCCAGGTACCTCCCCTAGCGGCGA ATCTTCTACTGCTCCAGGTACCTCTCCTAGCGGCGAATCTTCTACCGCTCCAGGTACCTCCCCTAGCGGTGAATCTT CTACCGCACCATGActcgag (SEQ ID No. 4)〇
[0016] 本发明所述长效干扰素重组融合蛋白中，所述多肽以SEQ ID No. 1所示的氨基酸 序列为单位进行重复组合，与干扰素的N-端或C-端进行融合；其组合方式包括但不限于 N-端干扰素和C-端亲水性无重复序列多肽的组合。
[0017] 本发明还提供了一种含有如SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 4所示核苷酸序列的载体； 一种含有如SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 4所示核苷酸序列的宿主细胞。
[0018] 本发明所述长效干扰素能延长干扰素的体内半衰期、同时保持干扰素的活性、降 低其免疫原性； 本发明的长效干扰素进一步可制备治疗抗病毒药物、抗感染药物、抗肿瘤药物或免疫 调节性的药物；用于肝炎病毒、SARS、单纯疱疹病毒等病毒感染性疾病的治疗，同时也可用 于恶性神经胶质瘤、肺癌等恶性肿瘤及其他细胞增殖性疾病的治疗。
[0019] 本发明的长效干扰素重组融合蛋白可在大肠杆菌中高效表达，且制备工艺简单， 可用于大规模的药物级融合蛋白的生产制备。

【专利附图】

【附图说明】
[0020] 图1为β干扰素的多聚唾液酸修饰SDS-PAGE图谱，其中， M Marker; 1-2 β干扰素 interferon-β ; 3 PSA 修饰后的β干扰素 interferon-β modified by PSA〇
[0021] 图2为β干扰素 -XTEN目的基因的PCR产物凝胶电泳图谱，其中， 1 marker ; 2-3 PCR 产物 PCR product ;4 marker。
[0022] 图3为本发明中所述亲水性非重复序列多肽与β干扰素融合蛋白编码基因序列。
[0023] 图4为本发明中所述重组质粒的酶切鉴定图谱，其中， 1 marker ;2 pMD19-T-IFNP-XTENAfco/+ZAoJ双酶切 pMD19-T-IFNP-XTENAfco/+ZAoJ digestion ;3 pET22b AfcoJ+ZSoJ 双酶切 pET24b AfcoJ+ZSoJ digestion ;4 marker。
[0024] 图5为本发明中所述重组表达载体的酶切鉴定图谱，其中， 1 marker ;2-5 pET22b-IFNP-XTEN AfcoJ+ZAoJ双酶切 pET22b-IFNP-XTENAfco/+ZAoJ digestion ;6 marker。
[0025] 图6为本发明中采用PCR方法克隆含有AfcoJ和ZAoJ酶切位点的融合蛋白编码基 因序列，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测图谱，其中， Μ为DL5000 ;1为pET24b双酶切回收产物；2为融合蛋白编码基因双酶切回收产物。
[0026] 图7为本发明实施例3中酶切产物观察图，其中， Μ为DL5000 ;1为pET24b-融合蛋白编码基因双酶切产物。
[0027] 图8图8 β干扰素 -XTEN融合蛋白诱导表达的SDS-PAGE图谱，其中， M marker ;1 未诱导的对照 untreated control ;2_5 诱导产物 induced product。

【具体实施方式】
[0028] 以下结合附图通过具体实施例进一步说明但不限定本发明。
[0029] 实施例1多聚唾液酸对重组人β干扰素的化学修饰 (1) 多聚唾液酸的活化 ① 将多聚唾液酸按l〇mg多聚唾液酸/ml高碘酸钠的比例与新鲜配制的100mM高碘酸 钠混合，置于20°C暗处搅拌5min ; ② 加入两倍体积的乙二醇中和过量的高碘酸钠，置于20°C暗处继续搅拌30min ; ③ 将氧化的多聚唾液酸置于〇. 01%碳酸铵缓冲液（PH7. 4)中4°C透析24h，透析袋应能 截留3. 5KDa的分子； ④ 以分子量为8KDa的干燥聚乙二醇覆盖反相透析浓缩多聚唾液酸溶液； ⑤ 将透析液冻干，置于_40°C保存备用； (2) 多聚唾液酸修饰β干扰素的反应 ① β干扰素采用含〇. 1%SDS pH7. 4 10mM的磷酸盐缓冲液稀释成浓度为0. 2mg/ml的 溶液； ② 在4mg/ml氰基硼氢化钠存在的情况下，活化的多聚唾液酸与β干扰素摩尔比按 50:1进行混合； ③ 将反应容器置于35°C的环境中密闭搅拌反应48h ; ④ 反应结束后用70%硫酸铵沉淀蛋白，4°C搅拌lh后离心收集沉淀； ⑤ 将沉淀用pH7. 4 10mM的磷酸盐缓冲液溶解并在相同的缓冲液中4°C透析24h。
[0030] 取活化的多聚唾液酸与纯化的β干扰素按摩尔比50:1进行反应，控制氰基硼氢 化钠的用量为4mg/ml，蛋白浓度为0. 2mg/ml，反应体系为5ml，35°C密闭搅拌反应48h。对 反应后的产物与10mM PBS pH7. 4溶液中透析24h，浓缩反应产物并进行SDS-PAGE凝胶电泳 分析；实验结果如图1所示，与未反应的β干扰素相比，经多聚唾液酸修饰的β干扰素分 子量明显增加，一单位的多聚唾液酸的分子量为30KDa，反应后产物的分子量约为50KDa， 与预期分子量大小一致。
[0031] 实施例2获得亲水性非重复序列多肽与β干扰素融合蛋白编码基因及构建含有 信号肽表达载体 人工化学合成亲水性非重复序列多肽与β干扰素融合蛋白编码基因序列，并将其克 隆至pUC57 simple质粒载体中，得到含有融合蛋白编码基因的质粒； 首先以该质粒中的融合蛋白编码基因序列为模板，采用Primer设计引物，上游引物 为：5' actgCCATGGCCAGCTACAACTTGCTTGGAT 3'，其中加下划线处为AfcoJ酶切位点；下游引 物：5' agtCTCGAGTCATGGTGCGGTAGAAGAT 3'，其中加下划线处为沿〇/酶切位点；引物由上 海生工生物工程公司合成； 采用PCR方法克隆含有AfcoJ和通〇/酶切位点的融合蛋白编码基因序列，并用1%琼脂 糖凝胶电泳检测，实验结果如图2所示，PCR产物在1000bp左右，与β干扰素-XTEN目的 基因预期大小（942bp)相符。
[0032] PCR反应I :在0. 2ml的PCR管中加入以下成分并混合均匀： 2X 7? Mix 25μ 1 ;上游引物2μ 1 ;下游引物2μ 1 ;pUC57-融合蛋白编码基因质粒 1 μ 1 ;超纯水20 μ 1。
[0033] PCR 反应程序为：94°C，5min ;94°C，lmin ;55°C，lmin ;72°C，2min ;72°C，30min。一 共进行30个循环反应。
[0034] 将克隆到的PCR产物连接pMD19-T simple载体，挑取阳性克隆，送至上海英骏贸 易有限公司进行测序，测序结果如图3所示，经比对与人工化学合成的核苷酸序列一致。
[0035] 取pET22b表达载体及pMD19-融合蛋白编码基因质粒，采用AfcoJ及XhoJ限制性 核酸内切酶进行双酶切。双酶切的反应体系为20ul，其中质粒10ul，AfcoJlul，XhoJlul，10X buffer H 2ul，无菌水6ul。37°C酶切5h。酶切产物采用1%琼脂糖凝胶电泳分离，实验结 果如图4所示。采用胶回收试剂盒回收目的片段，其中pET22b表达载体回收5000bp左右 的片段，pMD19-IFN@回收ΙΟΟΟρ的片段。
[0036] 连接反应在T4 DNA连接酶催化下进行，pET22b表达载体酶切片段与IFN0目的 片段的摩尔数比约为1:3。连接反应体系为25ul，其中T4连接酶lul，10X T4 DNA连接酶 缓冲液2. 5ul，16°C连接过夜。
[0037] 连接产物转化感受态大肠杆菌DH5 α，涂布于氨苄青霉素抗性LB平板上，37°C培 养过夜，挑取单克隆，扩大培养后抽提质粒，采用AfcoJ及XhoJ双酶切。酶切产物采用1%琼 脂糖凝胶电泳分离，观察酶切产物的大小，实验结果如图5所示。将扩大培养的菌液采用 PET载体通用引物测序，测序反应由上海英潍捷基贸易有限公司完成。
[0038] 实施例3构建不含信号肽的亲水性非重复序列多肽与β干扰素融合蛋白编码基 因表达载体 人工化学合成亲水性非重复序列多肽与β干扰素融合蛋白编码基因序列，并将其克 隆至pUC57 simple质粒载体中，得到含有融合蛋白编码基因的质粒。
[0039] 首先以该质粒中的融合蛋白编码基因序列为模板，采用Primer设计引物，上游引 物为：5' CATATGAGCTACAACTTGCTTGGAT 3'，其中加下划线处为M/eJ酶切位点；下游引物： 5' agtCTCGAGTCATGGTGCGGTAGAAGAT 3'，其中加下划线处为沿〇/酶切位点；引物由上海生 工生物工程公司合成。
[0040] 采用PCR方法克隆含有AfcoJ和通〇/酶切位点的融合蛋白编码基因序列，并用1% 琼脂糖凝胶电泳检测，实验结果如图6所示：PCR产物在lOOObp左右，与β干扰素-XTEN目 的基因预期大小（942bp)相符。
[0041] PCR反应I :在0. 2ml的PCR管中加入以下成分并混合均匀： 2X 7? Mix 25μ 1 ;上游引物2μ 1 ;下游引物2μ 1 ;pUC57-融合蛋白编码基因质粒 1 μ 1 ;超纯水20 μ 1。
[0042] PCR 反应程序为：94°C，5min ;94°C，lmin ;55°C，lmin ;72°C，2min ;72°C，30min。一 共进行30个循环反应。
[0043] 将克隆到的PCR产物连接pMD19-T simple载体，挑取阳性克隆，送至上海英骏贸 易有限公司进行测序，测序结果经比对与人工化学合成的核苷酸序列一致。
[0044] 取pET24b表达载体及pMD19-融合蛋白编码基因质粒，采用及沿〇/限制性 核酸内切酶进行双酶切。双酶切的反应体系为20ul，其中质粒10ul，MfeJlul，ZAoJlul，10X buffer H 2ul，无菌水6ul。37°C酶切5h。酶切产物采用1%琼脂糖凝胶电泳分离，采用胶 回收试剂盒回收目的片段，其中pET24b表达载体回收5000bp左右的片段，pMD19-IFNi3回 收1000P的片段。
[0045] 连接反应在T4 DNA连接酶催化下进行，pET24b表达载体酶切片段与IFN0目的 片段的摩尔数比约为1:3。连接反应体系为25ul，其中T4连接酶lul，10X T4 DNA连接酶 缓冲液2. 5ul，16°C连接过夜。
[0046] 连接产物转化感受态大肠杆菌DH5 α，涂布于氨苄青霉素抗性LB平板上，37°C培 养过夜，挑取单克隆，扩大培养后抽提质粒，采用及通〇/双酶切。酶切产物采用1%琼 脂糖凝胶电泳分离，观察酶切产物的大小，实验结果如图7所示。将扩大培养的菌液采用 PET载体通用引物测序，测序反应由上海英潍捷基贸易有限公司完成。
[0047] 实施例4亲水性非重复序列多肽与β干扰素融合蛋白的表达 将测序正确的pET22b-融合蛋白编码基因质粒转化感受态大肠杆菌TransB (DE3)，涂布于氨苄青霉素、硫酸卡那霉素和四环霉素三抗性LB平板，37°C培养过夜。随机 挑取平板上4个单菌落，扩大培养，按1%的比例转接至3ml新鲜LB试管中，37°C震荡培养 至0D 6(KI ~ 0. 6时，分别取样加入终浓度为0. 5mM和ImM的IPTG，继续震荡培养3h，取lml菌 液离心收集菌体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析；实验结果如图8所示，与未经IPTG诱 导对照组相比，IPTG诱导的实验组在30KDa附近有目的蛋白表达，大小与预期相符。
【权利要求】
1. 一种长效干扰素，其特征在于，其为多聚唾液酸修饰的干扰素或长效干扰素重组融 合蛋白，其中， 所述的多聚唾液酸修饰的干扰素，由活化的多聚唾液酸末端第7位的单醛基在氰基硼 氢化钠存在的情况下与干扰素反应而成； 所述的长效干扰素重组融合蛋白，由N-端干扰素与C-端天然存在的亲水性非重复序 列多肽融合而成。
2. 按权利要求1所述的长效干扰素，其特征在于，所述的干扰素选自α干扰素、β干 扰素或Υ干扰素及同源类型干扰素。
3. 按权利要求2所述的长效干扰素，其特征在于，所述β干扰素的氨基酸序列如SEQ ID No. 2 所示。
4. 按权利要求1所述的长效干扰素，其特征在于，所述多聚唾液酸采用高碘酸钠进行 激活。
5. 按权利要求1所述长效干扰素，其特征在于，所述长效干扰素重组融合蛋白中，天然 存在的亲水性非重复序列多肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
6. 按权利要求1所述长效干扰素，其特征在于，编码所述长效干扰素重组融合蛋白的 亲水性非重复序列多肽的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
7. 按权利要求1所述长效干扰素，其特征在于，编码所述长效干扰素重组融合蛋白的 核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。
8. 按权利要求1所述长效干扰素，其特征在于，所述多肽以SEQ ID No. 1所示的氨基酸 序列为单位进行重复组合，与干扰素的N-端或C-端进行融合；其组合方式为N-端干扰素 和C-端亲水性无重复序列多肽的组合。
9. 一种载体，含有如SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 4所示核苷酸序列。
10. -种宿主细胞，含有如SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 4所示核苷酸序列。
11. 权利要求1~8中任一项所述的长效干扰素在制备治疗抗病毒药物、抗感染药物、抗 肿瘤药物或免疫调节性药物中的用途。
12. 按权利要求11所述的用途，其特征在于，所述药物为治疗肝炎病毒药物、治疗SARS 药物、治疗单纯疱疹病毒药物、治疗恶性神经胶质瘤药物、治疗肺癌药物或治疗其他细胞增 殖性疾病的药物。
【文档编号】A61P31/14GK104151420SQ201310177111
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年5月15日 优先权日:2013年5月15日
【发明者】鞠佃文, 李玉彬, 曾贤, 钱晓璐, 范佳君, 王子玉, 王绍飞 申请人:复旦大学