猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型锌离子结合蛋白a缺失株及其构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型锌离子结合蛋白A（znuA）缺失株及其构建方法和应用，其微生物保藏号是CCTCC?NO：M2012476，分类命名：Actinobacillus?pleuropneumoniae?APP-1（ΔznuA），保藏时间是：2012年11月23日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学。本发明将znuA基因缺失突变菌株与亲本株进行比较，研究其生物学特性和致病性免疫原性，发现表明该基因缺失株的致病性比亲本株APP明显要弱，可用于研制APP的基因缺失灭活疫苗，为更加安全而有效地防治猪传染性胸膜肺炎提供有效的技术和方法。
【专利说明】猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型锌离子结合蛋白A缺失株及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体的是涉及猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型锌离子结合蛋白A (znuA)缺失株及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002]猪传染性胸膜肺炎(porcinecontagious pleuropneumonia, PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)引起的一种高度接触传染性呼吸道疾病。本病主要引起猪发生伴有胸膜炎的出血性、坏死性肺炎，多呈最急性或急性病程而迅速致死。该病可发生于任何年龄的猪只，且流行于世界各地，一旦爆发，经济损失巨大。当前国内猪胸膜肺炎的控制主要依赖灭活疫苗免疫和抗生素治疗。灭活疫苗虽然可以有效地控制同源菌株的感染，但由于血清型众多且抗原成分复杂，对异源菌株的控制效果差强人意。抗生素的滥用已导致了我国大量耐药菌株的出现，增加了多重耐药的危险，使得疾病的预防和治疗更加困难，并且易导致猪肉产品中药物残留超标而引发公共卫生问题。
[0003]APP是一种革兰氏阴性菌，分为2个生物型，共15种血清型(1-15型)，毒力因子有溶血外毒素(Αρχ)、荚膜多糖(Capsular Polysaccharide, CP)等。此外，Sheehan等运用信号标签诱变技术(Signature tagged mutagenesis, STM)对猪胸膜肺炎放线杆菌进行研究，发现znuA基因对其在猪体内存活非常重要(Sheehan et al.，2003)。znuA基因的缺失在一些致病菌中被证实能导致毒力明显下降(Ammendola et al., 2008;Dahiya andStevenson, 2010; Gunasekera et al.，2009),表明 znuA 在致病过程中发挥了重要作用。
[0004]鉴于此，着手于猪传染性胸膜肺炎放线杆菌新型基因工程疫苗的研究，通过同源重组的原理构建了 znuA基因缺失突变菌株，研究其遗传特性、生长特性、对动物致病性等，发现其毒力较亲本菌株大大降低，并且保留有良好的免疫原性，这为更加安全而有效的防控猪传染性胸膜肺炎提供技术方法。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术而提出一种适用于猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型锌离子结合蛋白A缺失株及其构建方法和应用，其安全性更强、免疫原性更好。
[0006]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是:猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型锌离子结合蛋白A缺失株，其微生物保藏号是CCTCC NO:M2012476，分类命名:Actinobacillus pleuropneumoniae APP-1 ( ΔζηιιΑ),保藏时间是:2012 年 11 月 23 日；保藏单位:中国典型培养物保藏中心；保藏地址:中国.武汉.武汉大学。
[0007]猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型锌离子结合蛋白A缺失株的构建方法是:首先将锌离子结合蛋白A基因的上游同源臂基因znuAs和下游同源臂基因znuAx进行PCR扩增，然后再分别克隆入PMD18-T载体，测序后酶切，回收目的片段再克隆入经相同酶切的pEM0C2载体中，最后获得重组转移质粒ρΕ Δ znuA ;将重组质粒ρΕ Δ znuA转化到大肠杆菌β 2155中，挑选其中的阳性克隆，用得到的阳性克隆与亲本菌株以混合培养，然后采用TSB进行洗涤两次后均匀涂于含NAD和氯霉素(Cm)的TSA平皿培养24h，挑取单菌落，并用引物P5/P6进行PCR扩增，可以扩增出一条约lOOObp，另一条约250bp共两个片段的菌落，进一步用氯霉素基因(Cm)引物P9/P10能扩增出约750bp的带有截短片段的菌落，即可判断为单交换子克隆子，将单交换子克隆子接种不含氯霉素抗性的TSB培养基，培养8h后，连续10倍稀释，涂于含10%蔗糖的TSA平皿，挑取蔗糖抗性的克隆，用引物P5/P6和P9/P10同时进行PCR扩增，只能扩增得到一段截短片段的菌落即可初步判断为znuA基因缺失突变菌株，挑选阳性克隆子进一步用引物P7/P8进行RT-PCR，如果仅能扩增出一段约250bp片段，即可断定为znuA基因缺失突变菌株，命名为(APP-1 ( Δ znuA))。
[0008]按上述方案，所述的引物P5的序列为:TTCCGCCATTTCAAGATAAG ;所述的引物P6的序列为CTATGCCTTTTATCTGCCGA ;所述的引物P7的序列为:GTGCCGAATAAATTACAC ;所述的引物 P8 的序列为:ATACCGCAGTTGCTCCTA。
[0009]按上述方案，所述的混合培养的方法是:用得到的阳性克隆与亲本菌以1:3的比例混合培养5h。
[0010]所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型锌离子结合蛋白A缺失株在制备防治猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗中的应用。
[0011]本发明的有益效果在于:将本发明的ZnuA基因缺失突变菌株与亲本株进行比较，研究其生物学特性和致病性免疫原性，发现表明该基因缺失株的致病性比亲本株APP明显要弱，可用于研制APP的基因缺失灭活疫苗，为更加安全而有效地防治猪传染性胸膜肺炎提供有效的技术和方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为本发明使用的pMD18-T质粒限制性图谱；
[0013]图2为本发明使用的PEM0C2质粒限制性图谱；
[0014]图3为猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型znuA的上游同源臂znuAs的PCR扩增产物，其中 M:DNA Ladder (DL2000) ；1:znuAs ；2:阴性对照；
[0015]图4为猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型znuA的下游同源臂znuAx的PCR扩增产物，其中 M:DNA Ladder (DL2000) ；1:阴性对照；2:znuAx ；
[0016]图5为本发明制备的重组质粒ρΕΜ Δ znuA的酶切鉴定结果，其中Ml、M2:DNALadder (DL15000) ；1:NotI/SalI 酶切；2:NotI/XbaI 酶切；3:SalI/XbaI 酶切；
[0017]图6为引物P3和P4鉴定单交换子，其中1:阴性对照；2、3、4:单交换子；5:亲本株；M =Marker DL2000 ；
[0018]图7为扩增Cm基因鉴定单交换子，其中M:Marker DL2000 ;1:亲本株；2、3、4:单交换子；5:阴性对照；
[0019]图8为引物P5和P6鉴定znuA基因缺失株(APP-l(AznuA))，其中1:亲本株；2:Δ znuA突变株；3:阴性对照；
[0020]图9为本发明中的猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型znuA基因缺失突变菌株的生长特性实验结果；[0021]图10本发明的APP-1 ( Δ znuA)与商品化灭活苗对小鼠免疫保护试验结果图。【具体实施方式】
[0022]以下结合具体实施例和说明书附图对本发明作进一步的说明。
[0023]实施例:
[0024]一、材料
[0025]1、工具酶和试剂
[0026]各种限制性内切酶、Ex/LA Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、Klenow片段等工具酶、DNA Marker、RNase酶均购自大连宝生物公司。
[0027]DNA回收试剂盒购自Tiangen公司。
[0028]胰蛋白大豆琼脂(Tryptic Soy Agar, TSA)、胰蛋白大豆肉汤(Tryptic SoyBroth, TSB)购自美国 Becton Dickinson and Company 公司。
[0029]二氨基庚二酸(Diaminopimelic acid, DAP)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide, NAD+)、HRP 标记的羊抗鼠 / 猪 IgG 二抗以及负向筛选用鹿糖购自美国Sigma公司。
[0030]新生牛血清购自杭州四季青材料有限公司，使用前经56°C灭活30min。
[0031]氨节青霉素(Ampicillin，Amp)、卡那霉素(kanamycin，Kan)、氯霉素(Chloramphenicol, Cm)、溶菌酶、蛋白酶 K 均购自 Invitrogen 公司。
[0032]2、培养基、抗生素及缓冲液
[0033]培养基:
[0034]TSB(Tryptic Soy Broth)液体培养基:6g培养基溶于180mL水中，121°C高压蒸气灭菌20min。使用时加入终溶度为10 μ g/mL的NAD和10%小牛血清。
[0035]TSA(Tryptic Soy Agar)固体培养基:8g培养基溶于180mL水中，121°C高压蒸气灭菌30min。使用时加入终溶度为10 μ g/mL的NAD和10%小牛血清。
[0036]LB液体培养基:胰蛋白胨10g，酵母浸出物5g，NaCllOg，溶于ddH20中，完全溶解后用5mol/L NaOH调pH值至7.0~7.2，定容至lOOOmL，121°C高压蒸气灭菌20min，室温保存。
[0037]LB固体培养基:在LB液体培养基中加入1.5%的琼脂粉，121°C高压蒸气灭菌20min。待培养基温度降至50°C左右，加入相应的抗生素后，铺制平板，待培养基凝固后，于4 °C保存备用。
[0038]抗生素:
[0039]氨苄青霉素(Amp):用灭菌ddH20配成贮存浓度50mg/mL，_20°C备用。
[0040]卡那霉素(Kan):用灭菌ddH20配成C存浓度25mg/mL, _20°C备用。
[0041]氯霉素(Cmp):用无水乙醇配成忙存浓度25mg/mL,-20°C备用。
[0042]细菌基因组DNA提取溶液:
[0043]TE: 10mmol /T, Tris.HCl (pH8.5), lmmol/L EDTA, 50mg/mL 的溶菌酶，2mol/LNaCl, 10%SDS，20mg/mL的蛋白酶K，酚:氯仿:异戊醇(100:99:1)，异丙醇，75%的乙醇。
[0044]质粒抽提相关溶液
[0045]溶液1:50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA, 25mmol/L Tris-Cl (ρΗ8.0),高压灭菌后置4 °C保存备用。
[0046]溶液II:0.2mol/L NaOH, 1%SDS,现配现用。
[0047]溶液II1:3mol/L乙酸钾，冰醋酸调pH值至4.8。
[0048]50XTAE 缓冲液:Tris base242g 加入到 700mL ddH20 中，再加入冰醋酸 5.7mL,0.5mol/LEDTA (pH8.0) lOOmL，用 ddH20 定容至 lOOOmL，室温保存备用。
[0049]0.8%琼脂糖凝胶:2.0mL50 X TAE缓冲液，98mL ddH20，琼脂糖0.8g，加热完全溶解。
[0050]7.5mol/L 醋酸铵(NH4Ac)溶液:57.8g NH4Ac 溶于少量 ddH20，然后用 ddH20 定容至 10OmT, η
[0051]TE 缓冲液(ρΗ8.0):1.0mmoI/L EDTA (ρΗ8.0)，10.0mmoI/L Tris-Cl (ρΗ8.0)。
[0052]酚:氯仿:异戊醇(25:24:1):用吸管分别吸取饱和酚25.0mL、氯仿24.0mL和异戊醇1.0mL于已装有适量TE(pH8.0)的棕色瓶底部，轻轻混匀。
[0053]氯仿:异戊醇(24:1):氯仿48.0mL,异戊醇2.0mL, TE(pH8.0)覆盖，储存于棕色瓶备用。其他缓冲液和试剂:
[0054]TE(pH8.0):10.0mmol/L Tris-HCl, 1.0mmol/L EDTA。
[0055]50 X TAE:242.0g Tris 碱，57.1mL冰乙酸，100.0mL0.5mol/L EDTA，pH8.0，加 ddH20定容至1，OOOrnL。
[0056]0.lmol/L CaCl2溶液:取11.1g CaCl2溶于去离子水中并定容至1，OOOmL,过滤除杂，高温灭菌，用于大肠杆菌感受态细胞的制备。
[0057]3、引物设计与合成
[0058]应用引物设计软件Primer5.0，设计了引物(表1)，引物由上海生工生物技术有限公司合成。
[0059]表1:本发明所用的引物
[0060]
【权利要求】
1.猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型锌离子结合蛋白A缺失株，其微生物保藏号是CCTCC NO:M2012476,分类命名:Actinobacillus p leuropneumoniae APP-1 (ΔζηιιΑ),保藏时间是:2012年11月23日；保藏单位:中国典型培养物保藏中心；保藏地址:中国.武汉.武汉大学。
2.猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型锌离子结合蛋白A缺失株的构建方法是:首先将锌离子结合蛋白A基因的上游同源臂基因znuAs和下游同源臂基因znuAx进行PCR扩增，再分别克隆入PMD18-T载体，测序后酶切，回收目的片段再克隆入经相同酶切的PEM0C2载体中，最后获得重组转移质粒ρΕ Δ znuA ;将重组质粒ρΕ Δ znuA转化到大肠杆菌β 2155中，挑选其中的阳性克隆，用得到的阳性克隆与亲本菌株混合培养，然后用TSB洗涤两次后均匀涂于含NAD和氯霉素的TSA平皿培养24h，挑取单菌落，并用引物P5和P6进行PCR扩增检测，扩增结果中带有截短片段即可判断为单交换子克隆子，将单交换子克隆子接种不含氯霉素抗性的TSB培养基，培养8h后，连续10倍稀释，涂于含10%蔗糖的TSA平皿，挑取蔗糖抗性的克隆，用引物P5和P6进行PCR扩增，克隆即可初步判断为znuA基因缺失突变菌株，挑取阳性克隆子进一步用引物P7/P8进行RT-PCR，如果仅能扩增出一段约250bp的片段，即可断定为znuA基因缺失突变菌株，命名为APP-1 ( Δ znuA)。
3.按权利要求2所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型锌离子结合蛋白A缺失株的构建方法，其特征在于所述的引物P5的序列为:TTCCGCCATTTCAAGATAAG ;所述的引物P6的序列为CTATGCCTTTTATCTGCCGA ;所述的引物P7的序列为:GTGCCGAATAAATTACAC ;所述的引物 P8 的序列为:ATACCGCAGTTGCTCCTA。
4.按权利要求2或3所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型锌离子结合蛋白A缺失株的构建方法，其特征在于所述的混合培养的方法是:用得到的阳性克隆与亲本菌以1:3的比例混合培养5h。
5.权利要求1所述的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型锌离子结合蛋白A缺失株在免疫防治猪传染性胸膜肺炎中的应用。
【文档编号】A61P31/04GK103589656SQ201310203118
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年5月28日 优先权日:2013年5月28日
【发明者】袁芳艳, 田永祥, 刘泽文, 周丹娜, 杨克礼, 段正赢, 郭锐 申请人:湖北省农业科学院畜牧兽医研究所