一种体外构建三维立体组织的方法
【专利摘要】本发明提供了一种外构建三维立体组织的方法：分离培养上皮细胞和肌细胞；将小肠黏膜下层脱细胞基质支架置入肌细胞悬液中，震荡复合完成后，继续培养；将上皮细胞悬液滴在经步骤2处理得到后的支架的肌细胞层上，继续培养得到三维立体组织。该方法采用舌粘膜上皮细胞和肌细胞作为种子细胞，取材方便，能够在较短的时间内扩增较多的数量，满足应用的需要；采用震荡的方法使肌细胞与小肠黏膜下层脱细胞基质支架复合，能够使肌细胞大量浸润至支架内部且分布较均匀，同时在不明显破坏支架的前提下，可以使支架尽可能的松散，更利于养分渗入和新生血管生成；可以构建可用于组织工程化尿道的三维立体组织。
【专利说明】一种体外构建三维立体组织的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种组织工程【技术领域】，尤其涉及一种体外构建三维立体组织的方法，以及该方法构建的三维立体组织。
【背景技术】
[0002]先天性或获得性尿道疾病的手术修复是泌尿外科领域不断探索的难题之一。组织工程技术的发展为尿道狭窄的修复提供了新的理念。其中脱细胞基质作为细胞再生的支架是组织工程的一个重要内容。目前对于脱细胞基质研究最多的为小肠黏膜下脱细胞基质(SIS)，并应用于临床尿道修复，已取得较好效果。
[0003]小肠黏膜下脱细胞基质是一种取材于猪小肠的异体组织，制作时去除小肠的黏膜层、浆膜层以及肌层，从而形成厚0.1cm的膜状组织，其中含有胶原成分以及一些促进组织再生的生长因子，并且其与细胞外基质十分接近，而有利于细胞的粘附和生长，最大优点是没有免疫原性。以往研究已证实其可作为一种良好的支架材料促进尿道修补处的上皮再生以及新生血管的形成，目前已作为一种产业化的成品。利用SIS进行尿道修复重建时可以明显缩短手术时间并可避免自体取的一些并发症(Yue-Min Xu, Qiang Fu, Ying-LongSajJ1ngZhangjLu-Jie Song,Chao Feng.1nternat1nal Journal of Urology,2013，20:622-629)。
[0004]目前常选择4层交迭SIS作为支架。但是4层SIS支架目前修复长段尿道缺损效果不理想，究其原因为单纯的长段SIS在体内不能保证充足的血供，且新生血管不能快速形成。而将种子细胞在体外与支架复合能够促进新生血管的快速形成(H Orabi, TAbouShwarebj Y Zhang,JJ.Yooj A Atala.Cell-Seeded Tubularized Scaffolds forReconstruct1n of Long Urethral Defects:A Preclinical Study.2013，63，531 - 538)。
[0005]而对于应用于尿道组织工程的种子细胞，传统最常见的是采用尿路上皮细胞和平滑肌细胞，但是这种种子细胞的获取常常需要膀胱活检或切开获得，取材方式比较不方便。而干细胞作为种子细胞存在肿瘤形成或血管瘤等严重并发症。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种体外构建三维立体组织的方法。
[0007]本发明提供了一种体外构建三维立体组织的方法，包括以下步骤:
[0008]步骤1，分离培养上皮细胞和肌细胞；
[0009]步骤2，将小肠黏膜下层脱细胞基质支架置入肌细胞悬液中，震荡复合完成后，继续培养；
[0010]步骤3，将上皮细胞悬液滴在经步骤2处理得到后的支架的肌细胞层上，继续培养得到三维立体组织。
[0011]其中，所述肌细胞可以为人体的各种肌细胞，例如骨骼肌细胞、平滑肌细胞或心肌细胞等，优选为骨骼肌细胞。
[0012]其中，所述上皮细胞可以为人体各个部位的上皮细胞，例如口腔、喉部、鼻咽、器官、肺、胃、肠等的上皮细胞，优选为舌上皮细胞。
[0013]优选地，所述三维立体组织为三维立体尿道组织。
[0014]优选地，步骤2中的震荡复合在恒温震荡箱内进行，温度为25-40°C (优选30-390C，更优选 33-38°C，更优选 35_37°C )，速度为 50_150rpm/min (优选 60_120rpm/min，更优选 70-110rpm/min,更优选 75-95rpm/min),持续震荡 6_24h(优选 7_20h,更优选 8_16h,更优选10-14h)。
[0015]优选地，步骤2中所述肌细胞悬液由步骤I得到的肌细胞消化调整密度为(0.5-5) X 1VmL得到，其中，密度更优选为(0.8-4) X 107/mL，更优选为(1-3) X 10VmL,更优选为(1.5-2.5) X 1VmL0
[0016]优选地，步骤3中所述上皮细胞悬液由步骤I得到的上皮细胞消化调整密度为(0.2-3) X 1fVmL得到，其中，密度更优选为(0.4-2.5) X 106/mL，更优选为(0.6-2.2) X 16/mL,更优选为(0.8-1.6) X 106/mL，更优选为(0.9-1.2) X 106/mL。
[0017]优选地，步骤2中继续培养时间为2-6d，每天换液。
[0018]优选地，步骤3中继续培养时间为2-6d，每天换液。
[0019]优选地，步骤2中所述小肠黏膜下层脱细胞基质支架在使用前先进行消毒处理。
[0020]本发明还提供了一种上述方法构建的三维立体组织。
[0021 ] 优选地，所述三维立体组织为三维立体尿道组织。
[0022]本发明还提供了一种上述方法构建的三维立体组织在尿道组织工程中的应用。
[0023]本发明提供体外构建三维立体组织的方法采用舌粘膜上皮细胞和肌细胞作为种子细胞，取材方便，能够在较短的时间内扩增较多的数量，满足应用的需要；采用震荡的方法使肌细胞与小肠黏膜下层脱细胞基质支架复合，能够使肌细胞大量浸润至小肠黏膜下层脱细胞基质支架内部且分布较均匀，同时在不明显破坏小肠黏膜下层脱细胞基质支架的前提下，可以使小肠黏膜下层脱细胞基质支架尽可能的松散，更利于养分渗入和新生血管生成；可以构建可用于组织工程化尿道的三维立体组织。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为采用本发明提供的体外构建三维立体组织的方法构建的三维立体组织的HE染色(A)和免疫荧光染色(B)结果图。
【具体实施方式】
[0025]下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。
[0026]实施例14层小肠黏膜脱细胞基质(SIS)支架与舌上皮细胞和骨骼肌细胞体外复合构建三维立体尿道组织
[0027]1、支架消毒
[0028]将购自美国COOK公司的4层SIS支架，裁剪为大小2cmX3cm的小块，环氧乙烷消毒，分装室温保存备用。
[0029]2、取材
[0030]选取行舌粘膜代尿道成形术的前尿道狭窄患者，待其行舌粘膜代尿道成形术时，收集手术剩余舌粘膜组织。
[0031]3、种子细胞培养
[0032]I)舌黏膜上皮细胞的培养:将舌黏膜组织，去除浆膜层组织，置入含氯霉素的50ml离心管中振洗6-9次，PBS冲洗3次后转入含DISPASEII工作液的离心管中于4°C浸泡12-18h。PBS冲洗3次后将黏膜上皮层与其余组织分离。眼科剪剪碎后0.05%胰蛋白酶37°C恒温振荡消化20min。用含10%FBS的DMEM终止消化后吹打，200目滤网过滤，收集细胞悬液离心弃上清，用KSFM培养液重悬细胞后，加入10mm培养皿中，置入37°C、5%C02、95%空气的细胞培养箱内培养。每2天换液I次。第3代细胞采用免疫荧光技术，利用AEl/AE3抗体对细胞进行相关鉴定。
[0033]2)舌骨骼肌细胞培养及纯化:将去除舌粘膜层后残留的肌层组织充分清洗后，将组织条剪碎至Imm3大小后，应用0.5%1型胶原酶，37°C恒温振荡(120rpm/min)消化3h。用含10%FBS的DMEM终止消化后，吹打，200目滤网过滤，收集细胞悬液，离心(1500rpm, 1min),弃上清，用含20%FBS的高糖DMEM重悬细胞后，加入到10mm培养皿中，置入37°C、5%C02、95%空气的细胞培养箱内培养。每3天换液I次，传代后改用含10%FBS的DMEM进行继续培养。同时通过差速贴壁技术对3代内的肌细胞进行纯化处理。第3代细胞采用免疫荧光技术，利用抗α -横纹肌肌动蛋白(a -SCA)和抗结蛋白(DESMIN)抗体对细胞进行相关鉴定。
[0034]4、种植
[0035]收集体外培养的肌细胞，消化调整密度为2X107/ml后将悬液置于培养瓶中，将SIS支架置入上述含有肌细胞悬液的培养瓶中，37°C恒温震荡箱中80rpm/min条件下持续震荡12h，振荡复合完成后，用DMEM冲洗支架I次，置入10mm培养皿中继续培养，每天换液。
[0036]上述培养4d后，将舌黏膜上皮细胞消化离心后调整密度为IXlO6Ail后，将上皮细胞悬液滴在种植到肌细胞层，再体外培养4天，得到三维立体尿道组织。
[0037]5、组织学检查
[0038]所的三维立体尿道组织行H-E切片染色，结果如图1A所示；另外利用免疫荧光双标染色进一步评估复合效果，结果如图1B所示。染色可见肌细胞可浸润至支架内部且分布较均匀，骨骼肌层与支架表面的上皮细胞层分界清晰，同时振荡法使4层SIS支架变得疏松,这更有利于细胞-支架复合体回植体内后新生血管生成。
[0039]6、结果表明
[0040]舌粘膜上皮细胞和肌细胞取材方便，能够在较短的时间内扩增较多的数量，满足应用的需要。本发明的复合方法能够使肌细胞大量浸润至支架内部且分布较均匀，可以构建三维立体的组织工程化尿道。
[0041]以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【权利要求】
1.一种体外构建三维立体组织的方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤I，分离培养上皮细胞和肌细胞； 步骤2，将小肠黏膜下层脱细胞基质支架置入肌细胞悬液中，震荡复合完成后，继续培养; 步骤3，将上皮细胞悬液滴在经步骤2处理得到后的支架的肌细胞层上，继续培养得到三维立体组织。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肌细胞为骨骼肌细胞；所述上皮细胞为舌上皮细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述三维立体组织为三维立体尿道组织。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中的震荡复合在恒温震荡箱内进行，温度为25-40°C，速度为50-150rpm/min，持续震荡6_24h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述肌细胞悬液由步骤I得到的肌细胞消化调整密度为(0.5-5) X 1VmL得到；步骤3中所述上皮细胞悬液由步骤I得到的上皮细胞消化调整密度为(0.2-3) X 1VmL得到。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中继续培养时间为2-6d，每天换液；步骤3中继续培养时间为2-6d，每天换液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述小肠黏膜下层脱细胞基质支架在使用前先进行消毒处理。
8.—种如权利要求1所述的方法构建的三维立体组织。
9.根据权利要求8所述的三维立体组织，其特征在于，所述三维立体组织为三维立体尿道组织。
10.权利要求8所述三维立体组织在尿道组织工程中的应用。
【文档编号】A61L27/36GK104274864SQ201310291478
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月11日 优先权日:2013年7月11日
【发明者】徐月敏, 吕向国, 冯超 申请人:上海市第六人民医院