蜂王浆分解酶含有物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及蜂王浆分解酶含有物、蜂王浆分解酶、蜂王浆分解物和蜂王浆的分解方法。所述蜂王浆分解酶含有物通过包括下述工序的方法由西方蜜蜂（Apis?mellifera）的2～3日龄蜂王幼虫制备：（a）在6℃以下对所述蜂王幼虫的体组织悬浮物进行离心处理，从而分离为三层，即白色固体上层、溶液中层、沉淀下层的工序；以及（b）回收所述中层作为蜂王浆分解酶含有物的工序。所述蜂王浆分解酶的特征在于，包含在所述蜂王浆分解酶含有物中。所述蜂王浆分解物使用所述蜂王浆分解酶含有物或所述蜂王浆分解酶制备。所述蜂王浆的分解方法的特征在于，使用所述蜂王浆分解酶含有物或所述蜂王浆分解酶。
【专利说明】蜂王浆分解酶含有物
[0001]本申请是针对申请日为2008年2月22日、申请号为200810007986.X、发明名称为
“蜂王浆分解酶含有物”的发明专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及由西方蜜蜂(Apis mellifera)的2~3日龄蜂王幼虫制备的蜂王衆分解酶含有物、上述蜂王浆分解酶含有物中所含有的蜂王浆分解酶、以使用上述蜂王浆分解酶含有物或上述蜂王浆分解酶进行制备为特征的蜂王浆分解物、以及使用上述蜂王浆分解酶含有物或上述蜂王浆分解酶的蜂王浆的分解方法。
【背景技术】
[0003]蜂王浆是为了使蜂王幼虫生长，工蜂从咽下腺和上颚(mandible)腺分泌的乳白色胶状的营养物质。由于蜂王与工蜂在遗传上是同质的，因此认为蜂王浆中包含某些诱导向蜂王分化的控制因子，但上述物质尚未明确。上述控制因子以及向蜂王分化的诱导机理的阐明对于提高蜂王的人工生产效率等是有用的，因此正由世界上的研究者进行研究。
[0004]蜂王浆根据蜂群、品种、蜜蜂采花蜜或花粉等的花的种类等而变化，但是通常鲜重的约2/3为水分，且以蛋白质、糖类和脂肪酸为主要成分。此外，也含有大量的维生素或矿物质等，营养价值非常优异。此外，虽然未在科学上得到证实，但是一直认为具有疲劳恢复作用、抗过敏作用、抗癌作用、免疫增强作用等大量的药理作用。因此，广泛用于营养辅助食品或药品原料。
[0005]近年，约占蜂王浆干燥重量的40%的蛋白质作为蜂王浆的主要生理活性物质而备受瞩目。特别是，大量报告了利用蜂王浆蛋白质分解物的生理活性的发明。例如，报告了(I)涉及感染防御机能增强剂的发明，其特征在于，含有作为有效成分的、通过蛋白酶分解蜂王浆中的蛋白质而得到的分子量为3000以下的肽(例如，参照专利文献I。)。上述发明是基于下述知识而提出的发明:即，通过蛋白酶产生的蜂王浆蛋白质分解物，与未分解的蜂王浆蛋白质相比，感染防御机能优异，而且粘度低且为水溶性，稳定性优异，所以容易添加到食品中以及口服摄取。此外，还报告了( 2)涉及用胰蛋白酶处理蜂王浆原料而得到的具有血管紧张素转换酶抑制作用的蛋白分解物的发明(例如，参照专利文献2。)。
[0006]此外，作为涉及用作食品的蜂王浆分解物的发明，还报告了(3)低过敏原蜂王浆，该低过敏原蜂王浆为降低了过敏性的低过敏原蜂王浆，其特征在于，含有10-羟基癸烯酸和来自蜂王浆的肽性成分，所述肽性成分由分子量4.5kDa以下的成分构成(例如，参照专利文献3。)。上述发明是基于下述知识而提出 的发明:即，通过蛋白质分解酶处理和使用β -甘露糖苷酶的糖分解酶处理，在来自蜂王浆的肽性成分中分解除去易引起过敏的分子量超过4.5kDa的成分，从而容易降低过敏性。
[0007]如此，对于蜂王浆分解物、特别是对蜂王浆蛋白质分解物所具有的各种各样的生理活性有很多报告，但是阐明具体的生理活性物质、以至其具体的作用机理的报告非常少。生理活性物质的特定和作用机理的阐明有助于蜜蜂的分化机理的阐明、对人等动物更有效的药品或机能性食品等的开发，所以强烈期望对蜂王浆分解物进行进一步的研究、研究。而且，为了有效地进行蜂王浆分解物的研究等，重要的是得到含有丰富的机能性肽等生理活性高的分解物的蜂王浆分解物。
[0008]专利文献1:日本特开平8-59499号公报
[0009]专利文献2:日本特开2005-255670号公报
[0010]专利文献3:日本特开2005-287411号公报
[0011] 但是，以上述(I)方法为代表的现在使用的方法大多只是使用通用的蛋白酶等来适当地分解蜂王浆蛋白质而已。上述通用蛋白酶等由于不以蜂王浆作为本来的基质，因此在不适当的部位分解，有可能使本来有用的肽的机能失去活性。通过使用以蜂王浆作为基质的蛋白酶等，可以解决上述问题，但是尚未发现这种酶。
【发明内容】
[0012]本发明的目的在于，提供最佳的蜂王浆分解酶以及上述蜂王浆分解酶含有物，用于从蜂王浆中有效地得到机能性肽等生理活性高的分解物。
[0013]此外，本发明的目的在于，提供以使用上述蜂王浆分解酶含有物等进行制备为特征的蜂王浆分解物、以及使用上述蜂王浆分解酶含有物等的蜂王浆的分解方法。
[0014]本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果认为，以蜂王浆为主食、且通过摄食蜂王浆来控制向蜂王分化的蜂王幼虫先天具有最适于分解蜂王浆的分解酶，从而，通过从蜂王幼虫的幼虫体液提取物中分离含有具有蜂王浆蛋白质的分解活性的酶的馏分来完成本发明。
[0015]即，本发明提供蜂王浆分解酶含有物，通过包括下述工序的方法由西方蜜蜂(Apismellifera)的2~3日龄蜂王幼虫制备:
[0016](a)在6°C以下对上述蜂王幼虫的体组织悬浮物进行离心处理，从而分离为三层，即固体上层、溶液中层、沉淀下层的工序；
[0017](b)回收上述中层作为蜂王浆分解酶含有物的工序。
[0018]此外，本发明提供蜂王浆分解酶含有物，其特征在于，上述离心处理为8000~12000Xg、5分钟以上的离心处理。
[0019]此外，本发明提供蜂王浆分解酶含有物，通过包括下述工序的方法由西方蜜蜂的2~3日龄蜂王幼虫制备:
[0020](a’ )将上述蜂王幼虫用冰冷却生理盐水洗涤后过滤，从而制备体组织悬浮物的工序;
[0021](b’)使用pH7的50mM磷酸缓冲液稀释上述体组织悬浮物后，在10000Xg、5°C下进行10分钟的离心处理，从而分离为三层，即固体上层、悬浮溶液中层、沉淀下层的工序。
[0022](c’)回收上述中层作为蜂王浆分解酶含有物的工序。
[0023]此外，本发明提供蜂王浆分解物，使用上述任意一项记载的蜂王浆分解酶含有物制备。
[0024]此外，本发明提供蜂王浆分解物，通过使用上述任意一项记载的蜂王浆分解酶含有物，在PH9下对蜂王浆进行酶处理而得到，并且，其具有下述特点:
[0025]( I)对神经细胞的非特异性的细胞变性作用，与未进行酶处理的蜂王浆水溶性馏分相比降低；
[0026](2)对由淀粉样蛋白所诱导的神经细胞死亡的抑制作用，与未进行酶处理的蜂王浆水溶性馏分相等；
[0027](3)对神经胶质细胞的细胞增殖作用，与未进行酶处理的蜂王浆水溶性馏分相比增大；
[0028](4)对人轮状病毒感染的感染抑制作用，与未进行酶处理的蜂王浆水溶性馏分相比增大。
[0029]此外，本发明提供抗氧化剂，将通过使用上述任意一项记载的蜂王浆分解酶含有物，在PH9下对蜂王浆进行酶处理而得到的蜂王浆分解物作为有效成分。
[0030]此外，本发明提供细胞增殖剂，将通过使用上述任意一项记载的蜂王浆分解酶含有物，在PH9下对蜂王浆进行酶处理而得到的蜂王浆分解物作为有效成分。
[0031]此外，本发明提供感染抑制剂，将通过使用上述任意一项记载的蜂王浆分解酶含有物，在PH9下对蜂王浆进行酶处理而得到的蜂王浆分解物作为有效成分。
[0032]此外，本发明提供神经细胞死亡诱导抑制剂，将通过使用上述任意一项记载的蜂王浆分解酶含有物，在PH9下对蜂王浆进行酶处理而得到的蜂王浆分解物作为有效成分。
[0033]此外，本发明提供蜂王浆的分解方法，其特征在于，使用上述任意一项记载的蜂王浆分解酶含有物。
[0034]此外，本发明提 供蜂王浆分解酶，其特征在于，包含在上述任意一项记载的蜂王浆分解酶含有物中。
[0035]此外，本发明提供蜂王浆分解酶，其特征在于，酶活性的最佳pH为7或9。
[0036]此外，本发明提供蜂王浆分解物，使用上述任意一项记载的蜂王浆分解酶制备。
[0037]此外，本发明提供蜂王浆的分解方法，其特征在于，使用上述任意一项记载的蜂王浆分解酶。
[0038]通过本发明的蜂王浆分解酶含有物和蜂王浆分解酶，可以不损害蜂王浆中所含有的机能性肽等所具有的生理活性而将蜂王浆分解。
[0039]此外，通过本发明的蜂王浆分解酶含有物等分解的蜂王浆分解物由于含有丰富的生理活性高的机能性肽等，在蜂王浆的生理活性的研究、研究中，可以提供非常有效的样品。进一步地，通过使用本发明的蜂王浆分解物，可以提供与以往食用的含有蜂王浆的食品等相比，机能性和消化吸收性优异的食品等。
[0040]此外，通过本发明的蜂王浆分解方法，可以有效地分解蜂王浆。
【专利附图】
【附图说明】
[0041]图1为对添加混合有蜂王浆蛋白质和含有蜂王浆分解酶的溶液的酶反应液在37°C下进行反应后，为了分离酶反应液中的蜂王浆蛋白质而进行SDS-PAGE的结果得到的染色像按照pH表示的图。图1A中pH为4、图1B中pH为5、图1C中pH为6、图1D中pH为6.5、图1E中pH为7、图1F中pH为7.5、图1G中pH为8、以及图1H中pH为9。各图的泳道上的数字表示各自的反应时间。此外，M表示分子量标记(marker)。箭头a表示约51kDa的带，箭头b表示约46kDa的带。
[0042]图2为对实施例1的SDS-PAGE结果按照pH表示的图。图2A为pH7的染色像、图2B为pH9的染色像。各图的泳道上的数字表示各自的反应时间、M表示分子量标记。箭头a表示约51kDa的带、箭头b表示约46kDa的带、箭头c表示约33kDa的带、以及箭头d表示约25kDa的带。
[0043]图3为在实施例1中对图2的染色像的带的强度进行测定，以反应开始时间O下的带强度为1，表示随着反应时间的推移带强度变化的图。图3A表示约51kDa的带的强度t匕，图3B表示约46kDa的带的强度比，图3C表示约33kDa和约25kDa的带的强度比。图3A和图3B中的?表示pH7的带，〇表示pH9的带。此外，图3C中的Λ表示ρΗ7下约33kDa的带，▲表示pH7下约25kDa的带。
[0044]图4为表示在实施例2中pH9的条件下分解蜂王浆蛋白质的结果的图。图4A表示由SDS-PAGE的结果得到的凝胶的染色像、图4B表示约46kDa的带的强度比。图4A中的泳道上的数字表示各自的反应时间、M表示分子量标记。此外,箭头a表示约51kDa、箭头b表不约46kDa。
[0045]图5为表示实施例3中测定的280nm的吸光度的结果的图。图5A为反应开始前的结果、图5B为反应开始后8小时的结果、图5C为反应开始后16小时的结果、以及图为反应开始后24小时的结果。此外，图中的箭头a表示约350kDa的蛋白质的馏分、箭头b表示约60kDa的蛋白质的懼分、箭头c表示约5kDa的蛋白质的懼分、箭头d表示约3kDa的蛋白质的馏分、以及范围e表示数百Da的蛋白质的馏分。
[0046]图6为实施例8的使用HiTrap? Desalting色谱柱的柱色谱中，测定吸光度(280nm)和传导率的结果得到的图。实线表示蜂王浆分解物(pH9)的吸光度、虚线表示蜂王浆分解物(PH7)的吸光度、双点划线表示蜂王浆分解物(pH9)的传导率、点划线表示蜂王浆分解物(PH7)的传导率。图 中，“D1”为作为馏分Dl取出的馏分，“D2”为作为馏分D2取出的馏分。
[0047]图7为表示实施例8中使用各培养液培养时的细胞增殖量的图。图7A为添加含有馏分Dl (pH9)的培养液时的结果，图7B为添加含有馏分Dl (pH7)的培养液时的结果。图中，“NC”表示对照培养液、“PC”表示含有10%FCS的培养液。此外，各浓度表示各培养液中的来自馏分Dl的蛋白质浓度。
[0048]图8为实施例9的使用Cosmosil (注册商标)5C18_AR色谱柱的柱色谱中，测定吸光度(215nm)和传导率的结果得到的图。实线表示馏分D2 (pH9)的吸光度、虚线表示馏分D2 (pH7)的吸光度、双点划线表示馏分D2 (pH9)的传导率、点划线表示馏分D2 (pH7)的传导率。图中，“Cl (pH7)”为作为馏分Cl (pH7)取出的馏分、“Cl (pH9)”为作为馏分Cl(PH9)取出的馏分、“C2 (pH7)”为作为馏分C2 (pH7)取出的馏分、“C2 (pH9)”为作为馏分C2 (pH9)取出的馏分。
[0049]图9为表不实施例9中使用各培养液培养时的细胞增殖量的图。图9A为添加含有馏分Cl (pH9)的培养液时的结果，图9B为添加含有馏分Cl (pH7)的培养液时的结果。图中，“NC”表示对照培养液、“PC”表示含有10%FCS的培养液。
[0050]图10为表示实施例9中使用各培养液培养时的细胞增殖量的图。图1OA为添加含有馏分C2 (pH9)的培养液时的结果，图1OB为添加含有馏分C2 (pH7)的培养液时的结果。图中，“NC”表不对照培养液。此外,各浓度表不各培养液中的来自懼分C2的蛋白质浓度。[0051]图11为表示实施例10中各PBS样品溶液的BSA浓度结果的图。图1lA为添加蜂王浆分解物时的结果、图1lB为添加抗坏血酸时的结果、图1lC为添加肌肽时的结果。
[0052]图12为表示实施例7中蜂王浆分解物的细胞增殖活性的图。图12A为在pH7下对蜂王浆分解酶含有物进行处理时的结果，图12B为在pH9下对蜂王浆分解酶含有物进行处理时的结果。
[0053]图13为表示实施例11中SDS-PAGE结果的图。箭头a表示约55kDa的带、箭头b表示约46kDa的带。
【具体实施方式】
[0054]本发明中的蜂王幼虫若为西方蜜蜂的2~3日龄的蜂王幼虫则不特别限定。可以为活着的新鲜幼虫或冷冻保存后的幼虫。由于认为蜂王浆(下文简称为RJ。)分解酶等的活性高，优选使用活着的新鲜幼虫。幼虫的冷冻保存可以通过常规方法进行，但是为了防止RJ分解酶失去活性，优选使用液氮等急速冷却后，在一 80°C下保存。
[0055]本发明中的体组织悬浮物是指幼虫的体组织、主要是内脏和体液的悬浮物。对上述内脏等不特别限定，但是优选为幼虫个体的全部体组织的悬浮物。
[0056]由幼虫制备体组织悬浮物的方法若为通常由动物等制备组织悬浮液的方法则不特别限定。例如，可以使用筛等过滤幼虫的全部体组织或内脏或者体液，也可以使用研钵、混合器、均化器等制备。由于可以在缓和的条件下制备体组织悬浮物，优选使用筛等进行过滤。上述筛优选筛眼的尺寸为80目~120目。使用混合器等时，为了防止产生过量的热，优选添加生理盐水等进行。而且，为了防止混入杂质，幼虫优选在制备体组织悬浮物之前，在冷冻保存时在保存之前，预先用生理盐水等洗涤。
[0057]为了制备本发明的RJ分解酶含有物，首先，作为工序(a)，通过在6°C以下对蜂王幼虫的体组织悬浮物进行离心处理，分离为白色固体的上层、黄白色混浊溶液的中层、含有白色到稍褐色的沉淀的下层三层。进行离心处理前，优选使用中性且低浓度的缓冲液等进行稀释，从而适当对体组织悬浮物的粘度或浓度进行调整。这是由于体组织悬浮物的粘性或浓度高时，有可能降低RJ分解酶的提取效率、使操作性恶化。作为上述缓冲液，例如有磷酸缓冲液(50mM、pH7.0)或生理盐水等。而且，推定上述上层为脂质成分、上述下层为体组织的不溶性成分。
[0058]对于上述离心处理的条件若可以将体组织悬浮物离心分离为三层则不特别限定，但是优选在8000~12000 X g、6°C以下进行5分钟以上的离心处理。特别优选在10000 X g、5°C下进行10分钟的离心处理。离心速度低的情况或者离心时间短的情况下，有可能不能顺利地分离为三层。
[0059]然后，作为工序(b)，将三层中的中层作为蜂王浆分解酶含有物进行回收，从而可以制备本发明的RJ分解酶含有物。上述回收方法可以通过常规方法进行。为了提高提取精度，优选在与工序(a)相同的条件下对上述中层再次进行离心处理。
[0060]在工序(b)之后，为了除去混入到上述中层中的不溶性的组织片等不溶物，优选对上述中层进行过滤。由于可以防止因微生物所导致的污染，优选在上述过滤中使用0.2μπι的过滤器等。
[0061]而且，由于制备幼虫体液提取物或从幼虫体液提取物制备蜂王浆分解酶含有物中，幼虫体液提取物中所含有的酶有可能失去活性，离心处理优选在3~6°C下进行。此外，其它的操作优选在冰冷却下进行。
[0062]本发明的RJ分解物可以通过本发明的RJ的分解方法、即使用本发明的RJ分解酶含有物来制备。上述RJ可以为新鲜的RJ或将干燥粉末RJ还原得到的RJ。此外，上述RJ可以为任意产地的RJ，可以为任意蜂种产生的RJ。进一步地，上述RJ也可以为通过常规方法由RJ通过常规方法分离得到的蛋白质。特别优选为RJ的水溶性蛋白质。这是由于可以期待含有大量的具有生理活性的物质。[0063]RJ的水溶性蛋白质的分离若为可以分离水溶性蛋白质和疏水性蛋白质的方法则可以使用任意方法。作为上述方法，例如有用乙酸乙酯或丁醇等有机溶剂对混合有水溶性溶剂和RJ的悬浮液进行分配处理而萃取纯化的方法、通过将上述悬浮液静置后进行离心处理得到上清液的方法等。
[0064]例如，可以通过向RJ或RJ的水溶性蛋白质中添加本发明的RJ分解酶含有物进行培养的方法制备RJ分解物。RJ等也可以预先使用磷酸缓冲液等进行稀释。此外，也可以使用用磷酸缓冲液等调节蛋白质浓度或粘度的RJ分解酶含有物。
[0065]上述培养的温度或时间，若为不抑制本发明的RJ分解酶含有物的RJ分解活性的条件则不特别限定，但是反应温度条件优选为30~40°C、特别优选为34~38°C。此外，pH优选为6.5~10，pH特别优选为7~9.5。在pH为7~7.5的反应条件下进行时，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中，约51kDa的位置上以带的形式表示的蛋白质主要被分解，在pH为8.5~9的反应条件下进行时，在SDS-PAGE中，约46kDa的位置上以带的形式表示的蛋白质主要被分解。
[0066]以下对本发明的RJ的分解方法进行更具体的说明。
[0067]首先，使用Lowry法以BSA为标准物质对通过后述实施例1中记载的方法制备的RJ分解酶含有物的蛋白质浓度进行测定后，使用PH7的50mM磷酸缓冲液进行稀释，由此制备6mg/mL的含有RJ分解酶的溶液。
[0068]接着，向8mL的缓冲液中添加ImL的通过后述参考例2中记载的方法制备的RJ蛋白质溶液(30mg/mL)和ImL的上述含有RJ分解酶的溶液(6mg/mL),进行混合制备酶反应液。使上述酶反应液在37 °C下反应，冰冷却、停止反应后，通过SDS-PAGE确认RJ蛋白质的变化。对于分离的RJ蛋白质使用CBB R-250染色。缓冲液分别使用pH为4、5和5.5的50mM的乙酸缓冲液，pH为6、6.5、7和7.5的50mM的磷酸缓冲液，pH8和pH9的50mM的Tr1-HCl缓冲液。
[0069]图1为按照pH表示SDS-PAGE的结果的图。图1A中pH为4、图1B中pH为5、图1C中pH为6、图1D中pH为6.5、图1E中pH为7、图1F中pH为7.5、图1G中pH为8、以及图1H中pH为9。各图的泳道上的数字表示各自的反应时间。此外，M表示分子量标记。若将通过后述参考例2中记载的方法制备的RJ蛋白质溶液进行SDS-PAGE，在约51kDa和约46kDa的位置上检测出较强的带。箭头a表示约51kDa的带,箭头b表示约46kDa的带。结果可知，在pH6~9下RJ蛋白质通过由含有RJ分解酶的溶液进行的处理而减少，以及随着pH的增大分解速度加快。特别是，确认了在pH7~7.5的反应条件下,约51kDa的蛋白质主要被分解，在PH8.5~9的反应条件下，约46kDa的蛋白质主要被分解。即，由图1的结果可知，通过后述实施例1中记载的方法制备的RJ分解酶含有物中，含有分解RJ蛋白质的酶。此外，中性条件和碱性条件下通过上述RJ分解酶含有物进行的RJ蛋白质分解的图案不同，因此上述RJ分解酶含有物中至少含有两种分解酶。即，上述RJ分解酶含有物中含有酶活性的最佳pH为6.5~7.5、优选pH为7~7.5、更优选pH为7的RJ分解酶和酶活性的最佳pH为8~9、优选pH为9的RJ分解酶。
[0070]通过使用本发明的RJ分解酶含有物，在pH9下对RJ优选进行2小时以上、更优选4小时以上、更进一步优选4小时~30小时、特别优选4小时~24小时的酶处理而得到的RJ分解物具有各种生理活性。上述生理活性，与未进行酶处理的RJ水溶性馏分所具有的生理活性相比，具有几个特征。
[0071]例如，上述RJ分解物，对于由淀粉样蛋白所诱导的神经细胞死亡的抑制作用，与未进行酶处理的RJ水溶性馏分相等，但是对于神经细胞的非特异性的细胞变性作用，与未进行酶处理的蜂王浆水溶性馏分相比降低。更具体地说，蛋白质浓度为30~125 μ g/ml的上述RJ分解物和2mg/ml的淀粉样蛋白肽共存时的神经细胞存活率，与相同蛋白质浓度的未进行酶处理的RJ水溶性馏分和2mg/ml的淀粉样蛋白肽共存时的神经细胞存活率大致相同，即两者之比(RJ分解物/未进行酶处理的RJ水溶性馏分)为I左右，优选为0.9~1.1。另一方面，蛋白质浓度为60~1000 μ g/ml的上述RJ分解物和2mg/ml的淀粉样蛋白肽共存时，与相同蛋白质浓度的未进行酶处理的RJ水溶性馏分和2mg/ml的淀粉样蛋白肽共存时相比，减少呈现出细胞变形的神经细胞数目。
[0072]此外，上述RJ分解物对于神经胶质细胞的细胞增殖作用，与未进行酶处理的蜂王浆水溶性馏分相比增大。更具体地说，蛋白质浓度为60~1000 μ g/ml的上述RJ分解物和2mg/ml的淀粉样蛋白肽共存时，与相同蛋白质浓度的未进行酶处理的RJ水溶性馏分和2mg/ml的淀粉样蛋白肽共存时相比，神经胶质细胞数目增加。
[0073]此外，上述RJ分解物对于人轮状病毒感染的感染抑制作用，与未进行酶处理的蜂王浆水溶性馏分相比增大。更具体地说，在人轮状病毒和上述RJ分解物的存在下进行细胞培养时，与在人轮状病毒和未 进行酶处理的RJ水溶性馏分存在下进行细胞培养时相比，轮状病毒感染细胞数目减少。
[0074]通过使用本发明的RJ分解酶含有物，在pH9下对RJ进行优选2小时以上、更优选4小时以上、更进一步优选4小时~30小时、特别优选4小时~24小时的酶处理而得到的RJ分解物也具有抗氧化活性。因此，上述RJ分解物可以用作抗氧化剂。例如，上述RJ分解物通过其抗氧化活性可以抑制由于一氧化氯(C10.)等自由基所导致的蛋白质分解。RJ由于自古以来为摄食的食品，所以上述RJ分解物也非常安全，与抗坏血酸等同样地，可以期待用作添加到饮食品中的抗氧化剂或者以保护生物体不受氧化应激为目的而摄食的增补剂的有效成分等。
[0075]通过使用本发明的RJ分解酶含有物，在pH9下对RJ进行优选2小时以上、更优选4小时以上、更进一步优选4小时~30小时、特别优选4小时~24小时的酶处理而得到的RJ分解物由于具有上述生理活性，所以可以作为抗氧化剂、细胞增殖剂、(病毒)感染抑制剂、诱导神经细胞死亡抑制剂等的有效成分而存在。上述细胞增殖剂中的上述RJ分解酶含有物的蛋白质浓度优选为0.5mg/ml~lmg/ml。这些生理活性剂可以作为增补剂等饮食品单独摄食，也可以与其它的饮食用组合物或药用组合物同样地用作饮食品或药品中的添加剂。[0076]将上述RJ分解物作为有效成分的这些生理活性剂的制备方法若为不抑制上述RJ分解物的生理活性的方法则不特别限定，通常可以使用制备含有RJ或RJ分解物的饮食用组合物或药用组合物时所使用的方法进行制备。对这些生理活性剂的剂型不特别限定，但是优选为适于口服剂的剂型。例如，可以为软胶囊剂、硬胶囊剂、片剂或糖浆剂等。此外，这些生理活性剂中所含有的上述RJ分解物量若为上述RJ分解物的生理活性可以发挥作用效果的量则不特别限定，可以考虑作为原料的RJ的种类、所需的上述RJ分解物的生理活性、剂型等来适当决定。
[0077]将上述RJ分解物作为有效成分的这些生理活性剂的摄取量若为上述RJ分解物的生理活性可以发挥作用效果的量则不特别限定，可以根据摄取的人或动物的体重、年龄、性别等来适当决定。例如，优选每天I次或分成数次摄取300mg~3g。
[0078]实施例
[0079]以下举出实施例对本发明进行更具体的说明，但是本发明并不限定于以下实施例。
[0080][参考例I]幼虫悬浮物的制备
[0081]采集约15g的3日龄西方蜜蜂的蜂王幼虫后，用冰冷却的生理盐水洗涤。然后,通过使用聚酯制的平均100目的布(“^卜口 、东P社制)过滤蜂王幼虫，破坏幼虫的表皮，榨出体液和内脏。由此制备乳白色的幼虫悬浮物。
[0082][参考例2]RJ蛋白质溶液的制备
[0083]向RJ (中国产:浙江省江山恒亮蜂产品有限公司制)10ml中加入pH7.0的5OmM磷酸缓冲液20mL进行混合，制备RJ稀释溶液。将上述RJ稀释溶液在25000 X g、5°C下离心20分钟后，除去不溶性成分，回收上清液。然后，用pH7.0的50mM磷酸缓冲液稀释上述上清液，制备30mg/mL的RJ蛋白质溶液。
[0084][实施例1]
[0085]1.RJ分解酶含有物的制备
[0086]将通过参考例I中记载的方法制备的幼虫悬浮物用pH7的50mM磷酸缓冲液稀释2倍后，在10000Xg、5°C下离心10分钟。通过上述离心处理，分离为白色固体的上层、黄白色混浊溶液的中层、含有白色到稍褐色的沉淀的下层三层。推定上述上层为脂质成分、上述下层为不溶性的体组织等。回收上述中层后，进一步在10000Xg、5°C下离心10分钟分离成三层，回收中层作为RJ分解酶含有物。对 于上述RJ分解酶含有物，为了除去未除尽的不溶性组织片且进行灭菌，使用0.2 μ m的纤维素乙酸酯类过滤器(DISMIC-25CS、ADVANTEC公司制)进行过滤。由此，得到黄色透明的RJ分解酶含有物。
[0087]2.RJ蛋白质的分解
[0088]使用Lowry法以BSA为标准物质对上述RJ分解酶含有物的蛋白质浓度进行测定，使用PH7的50mM磷酸缓冲液制备3mg/mL的含有RJ分解酶的溶液。
[0089]向8mL的缓冲液中添加ImL的通过上述参考例2中记载的方法制备的RJ蛋白质溶液(30mg/mL)和通过上述实施例1中记载的方法制备的ImL的含有RJ分解酶的溶液(6mg/mL)，进行混合制备酶反应液。上述缓冲液使用pH7的50mM的磷酸缓冲液或者pH9的50mM的Tr1-HCl缓冲液。使上述酶反应液在37°C下反应，冰冷却、停止反应后，通过SDS-PAGE分离RJ蛋白质。干燥使用CBB R-250染色的凝胶后，使用荧光扫描仪TyphOOn9400 (7 D\ Λ /SM才寸4工> 7社制)得到染色像。
[0090]图2为按照pH表示SDS-PAGE的结果的图。图2A为pH7的染色像、图2B为pH9的染色像。各图的泳道上的数字表示各自的反应时间、M表示分子量标记。箭头a表示约5IkDa的带、箭头b表示约46kDa的带、箭头c表示约33kDa的带、以及箭头d表示约25kDa的带。其结果，确认了在pH7和pH9两者下,约51kDa和约46kDa的蛋白质被分解。特别是可知，在PH9下，在反应开始后4小时的短时间内，约46kDa的蛋白质被分解成无法检测出的程度。此外，在pH7下，随着反应时间的推移，检测出约33kDa和约25kDa的蛋白质。
[0091]使用图像分析软件Image Quant (GE ^ ^ T 才寸4工> > 社制),对图2的染色像的各带的带强度进行定量。图3以反应开始时间O下的带强度为1，表示了随着反应时间的推移带强度的变化。图3A表示约51kDa的带的强度比，图3B表示约46kDa的带的强度比，图3C表示约33kDa和约25kDa的带的强度比。图3A和图3B中的?表示pH7的带，〇表示pH9的带。此外，图3C中的Λ表示ρΗ7下约33kDa的带，▲表示pH7下约25kDa的带。
[0092]如图3A和图3B所示，可以定量地确认在pH7和pH9两者下，约51kDa和约46kDa的蛋白质被分解。此外，由图3C的结果确认了在pH7下，直至反应开始后16小时，约33kDa和约25kDa的蛋白质增加。该结果暗示了约33kDa和约25kDa的蛋白质有可能是约51kDa或约46kDa的蛋白质通过含有RJ分解酶的溶液中所含有的RJ分解酶分解得到的分解物。
[0093][实施例2]
[0094]除了使反应时间为60分钟之外，全部与实施例1的pH9条件下的反应同样地操作，分解RJ蛋白质，通过SDS-PAGE分离RJ蛋白质，对各带的强度进行定量。图4A表示凝胶的染色像、图4B表示约46kDa的带的强度比。图中的泳道上的数字表示各自的反应时间、M表示分子量标记。此外,箭头a表示约51kDa、箭头b表示约46kDa。
[0095]结果确认了约46kDa的蛋白质通过含有RJ分解酶的溶液中所含有的RJ分解酶，在反应开始后I小时的短时间内分解大约80%。而且，由图4B可知，在反应开始后5分钟的时刻得到了几乎未产生分解的结果，但是推测这是因为在开始由RJ分解酶进行酶反应之前，在37°C下不预先培养RJ蛋白质溶液，因此直至开始酶反应发生了时间滞后。
[0096][实施例3]
[0097]除了使反应时间为24小时之外，全部与实施例1的pH7条件下的反应同样地操作，分解RJ蛋白质。然后，对冰冷却、停止反应的酶反应液使用Super dex200HR10/30 (7了 7社制)实施凝胶渗透色谱法，分离上述酶反应溶液中所含有的蛋白质。凝胶渗透色谱，使用含有0.15M氯化钠的50mM的磷酸缓冲液(pH7)作为洗脱液，在流速0.5mL/min,5°C的条件下进行。为了检测分离的蛋白质，使用UV检测器测定280nm的吸光度。
[0098]图5为表示实施例3中测定的280nm的吸光度结果的图。图5A为反应开始前的结果、图5B为反应开始后8小时的结果、图5C为反应开始后16小时的结果、以及图为反应开始后24小时的结果。此外，图中的箭头a表示约350kDa的蛋白质的馏分、箭头b表示约60kDa的蛋白质的懼分、箭头c表示约5kDa的蛋白质的懼分、箭头d表示约3kDa的蛋白质的馏分、以及范围e表示数百Da的蛋白质的馏分。
[0099]由图5的结果可知，随着反应时间的推移，约350kDa和约60kDa的蛋白质减少的同时，约5kDa、约3kDa以及数百Da的蛋白质增加。由此推测增加的约5kDa等的蛋白质为约350kDa等的蛋白质的分解物。换而言之，由通过凝胶渗透色谱分离的结果可以确认，通过本发明的RJ分解酶含有物，RJ的高分子蛋白质被分解。
[0100][实施例4]
[0101]与参考例2同样地制备RJ蛋白质溶液(30mg/mL)。此外，除了使稀释后的浓度为3mg/mL之外全部与实施例1同样地操作制备了含有RJ分解酶的溶液(3mg/mL)。
[0102]向8mL的缓冲液中添加ImL的上述RJ蛋白质溶液(30mg/mL)和ImL的上述含有RJ分解酶的溶液(3mg/mL)，进行混合制备了酶反应液。上述缓冲液使用pH7的50mM的磷酸缓冲液或者PH9的50mM的Tr1-HCl缓冲液。使上述反应液分别在4、20、37以及50°C下反应，冰冷却、停止反应。将在各温度的恒温槽中混合上述酶反应液的时刻作为反应开始时亥1J，使反应时间为4、16、24小时。通过对冰冷却后的上述酶反应液与实施例1同样地分离RJ蛋白质，观察反应温度的影响。
[0103]其结果，在37°C下与实施例2同样地，在pH7和pH9两者下，观察到约51kDa和约46kDa的蛋白质的分解。特别是在pH9下,在反应开始4小时的时刻约46kDa的蛋白质被分解至检测限以下，约51kDa的蛋白质在反应开始16小时的时刻也被分解至检测限以下。
[0104]与此相对地，4°C下、在pH7和pH9两者下，几乎未观察到约51kDa和约46kDa的蛋白质的分解。20°C下与37°C的情况相比，虽然分解反应进行缓慢，但是观察到约51kDa和约46kDa的蛋白质的分解。另一方面，50°C下，与37°C相比分解反应进一步加快，在pH7和PH9两者下，确认了在反应开始4小时的时刻大部分的蛋白质被分解。
[0105]总之可知，在20~50°C的温度范围内，本发明的RJ分解酶含有物可以分解RJ，以及在上述温度范围内，温度越高则通过本发明的RJ分解酶含有物进行的RJ的分解反应越快。但是，通常在50°C下， 有可能引起RJ的发褐或RJ蛋白质的变性等。因此，通过本发明的RJ分解酶含有物分解RJ时，优选在37 °C附近温度下进行。
[0106][实施例5]
[0107]研究了使用本发明的RJ分解酶含有物得到的RJ分解物所具有的针对脑神经细胞的生理活性。具体地说，研究了针对初代培养的小鼠胚胎海马神经细胞的、由淀粉样蛋白诱导的神经细胞死亡的RJ分解物的影响。而且，小鼠胚胎海马神经细胞是在37°C、5%C02气氛下,将通过常规方法从小鼠胚胎中采取的海马神经细胞以4.0X104cells/well接种在培养了神经胶质细胞的96孔多孔板上，从而进行培养。作为细胞培养液，使用含有B27增补剂的二 Λ 一口 K一寸> J于.] ^ Λ (￥ 7' ^社制)。实验中使用培养后经过一周后的细胞。
[0108]首先，向RJ(中国产:浙江省江山恒亮蜂产品有限公司制)5mL中加入pH7.0的50mM磷酸缓冲液15mL进行混合，制备RJ稀释溶液。将上述RJ稀释溶液在25000 X g、5°C下离心20分钟后，除去不溶性成分，回收上清液。然后，通过将上述上清液冷冻干燥，得到RJ水溶性粗馏分。使用PH7.0的50mM磷酸缓冲液稀释上述RJ水溶性粗馏分，制备30mg/mL的RJ水溶性粗馏分溶液。
[0109]然后除了使用上述RJ水溶性粗馏分溶液来替代通过上述参考例2中记载的方法制备的RJ蛋白质溶液、以及使反应时间为4小时之外，全部与实施例1同样地操作，分解上述RJ水溶性粗馏分溶液中所含有的RJ蛋白质，得到RJ分解物。
[0110]向培养小鼠胚胎海马神经细胞的96孔多孔板中添加淀粉样蛋白肽(~7十F研究所制)和RJ水溶性粗馏分溶液或RJ分解物后，培养48小时。淀粉样蛋白肽以2mg/mL的浓度在37°C下保温48小时后，添加成最终浓度为20 μ g/mL。此外，RJ水溶性粗馏分溶液、PH7下分解得到的RJ分解物、或者pH9下分解得到的RJ分解物添加成各蛋白质的细胞培养液中的最终浓度分别为0、31.25,62.5、125、250、500或ΙΟΟΟμ g/mL。作为对照使用不添加淀粉样蛋白肽和RJ分解物等的任意一种、添加等量的细胞培养液而得到样品。
[0111]然后，通过使用了抗Map2抗体(Sigma公司制、Cat N0.B2261)的免疫染色或赫希斯特(Hoechst) 33342色素(Sigma公司制、Cat N0.M4403)染色识别死亡细胞，分别对各培养皿中的小鼠胚胎海马神经细胞的存活数目、神经胶质细胞的存活数目进行测定。进一步地，通过显微镜观察对观察到细胞变形的小鼠胚胎海马神经细胞数目进行测定。而且，细胞变形是指神经细胞从具有树突的细胞体和轴突构成的神经细胞特有的形态发生变化。上述变化中，例如有，形成突起、轴突的萎缩、多轴突化、神经细胞之间的凝聚、神经细胞的死亡
坐寸ο
[0112][表1]
[0113]
【权利要求】
1.一种蜂王浆分解物在制备抗氧化剂中的应用，其中，所述蜂王浆分解物是使用通过包括下述工序(a)和(b)或者包括下述工序(a’)、(b’)和(c’)的方法由西方蜜蜂的2~3日龄蜂王幼虫制备的蜂王浆分解酶含有物，并在PH9下对蜂王浆进行酶处理来得到， Ca)在6°C以下对所述蜂王幼虫的体组织悬浮物进行离心处理，从而分离为三层，即固体上层、溶液中层、沉淀下层的工序； (b)回收所述中层作为蜂王浆分解酶含有物的工序， (a’ )将所述蜂王幼虫用冰冷却生理盐水洗涤后过滤，从而制备体组织悬浮物的工序；(b’)使用pH7的50mM磷酸缓冲液稀释所述体组织悬浮物后，在10000 X g、5°C下进行10分钟的离心处理，从而分离为三层，即固体上层、悬浮溶液中层、沉淀下层的工序； (c’)回收所述中层作为蜂王浆分解酶含有物的工序。
2.—种蜂王浆分解物在制备细胞增殖剂中的应用，其中，所述蜂王浆分解物是使用通过包括下述工序(a)和(b )或者包括下述工序(a’)、(b ’)和(c ’)的方法由西方蜜蜂的2~3日龄蜂王幼虫制备的蜂王浆分解酶含有物，并在pH9下对蜂王浆进行酶处理来得到， Ca)在6°C以下对所述蜂王幼虫的体组织悬浮物进行离心处理，从而分离为三层，即固体上层、溶液中层、沉淀下层的工序； (b)回收所述中层作为蜂王浆分解酶含有物的工序， (a’ )将所述蜂王幼虫用冰冷却生理盐水洗涤后过滤，从而制备体组织悬浮物的工序；(b’)使用pH7的50mM磷酸缓冲液稀释所述体组织悬浮物后，在10000 X g、5°C下进行10分钟的离心处理，从而分离为三层，即固体上层、悬浮溶液中层、沉淀下层的工序； (c’)回收所述中层作为蜂王浆分解酶含有物的工序。
3.—种蜂王浆分解物在制备感染抑制剂中的应用，其中，所述蜂王浆分解物是使用通过包括下述工序(a)和(b)或者包括下述工序(a’)、(b’)和(c’)的方法由西方蜜蜂的2~3日龄蜂王幼虫制备的蜂王浆分解酶含有物，并在pH9下对蜂王浆进行酶处理来得到， Ca)在6°C以下对所述蜂王幼虫的体组织悬浮物进行离心处理，从而分离为三层，即固体上层、溶液中层、沉淀下层的工序； (b)回收所述中层作为蜂王浆分解酶含有物的工序， (a’ )将所述蜂王幼虫用冰冷却生理盐水洗涤后过滤，从而制备体组织悬浮物的工序；(b’)使用pH7的50mM磷酸缓冲液稀释所述体组织悬浮物后，在10000 X g、5°C下进行10分钟的离心处理，从而分离为三层，即固体上层、悬浮溶液中层、沉淀下层的工序； (c’)回收所述中层作为蜂王浆分解酶含有物的工序。
4.一种蜂王浆分解物在制备神经细胞死亡诱导抑制剂中的应用，其中，所述蜂王浆分解物是使用通过包括下述工序(a)和(b )或者包括下述工序(a’)、(b ’)和(c ’)的方法由西方蜜蜂的2~3日龄蜂王幼虫制备的蜂王浆分解酶含有物，并在pH9下对蜂王浆进行酶处理来得到， Ca)在6°C以下对所述蜂王幼虫的体组织悬浮物进行离心处理，从而分离为三层，即固体上层、溶液中层、沉淀下层的工序； (b)回收所述中层作为蜂王浆分解酶含有物的工序， (a’ )将所述蜂王幼虫用冰冷却生理盐水洗涤后过滤，从而制备体组织悬浮物的工序； (b’)使用pH7的50mM磷酸缓冲液稀释所述体组织悬浮物后，在10000 X g、5°C下进行10分钟的离心处理，从而分离为三层，即固体上层、悬浮溶液中层、沉淀下层的工序； (c’)回收所述中层 作为蜂王浆分解酶含有物的工序。
【文档编号】A61K38/46GK103463133SQ201310329017
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2008年2月22日 优先权日:2007年2月23日
【发明者】松冈拓磨, 渡边铃代, 川岛拓司, 中村正, 金丸义敬, 稻垣瑞穗, 林要喜知, 铃木寿, 三嶋智之 申请人:株式会社秋田屋本店