一种利用黑木耳防治血栓的实现方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用黑木耳防治血栓的实现方法。该方法包括：将500g黑木耳先冷水浸泡24小时，粉碎机粉碎后，水溶性或脂溶性提取黑木耳中的黑木耳多糖；以灌胃给药方式，对实验兔注入等量各实验黑木耳多糖成份组饲养，连续2个月；体外观察实验兔的生理指标；对实验兔生理指标进行统计分析，结果均以(x±S)表示，组间比较采用t检验法，P<0.05具有统计学差异。该方法利用黑木耳中的黑木耳多糖，通过实验延长新西兰兔特异性血栓及纤维蛋白血栓的形成时间，缩短体外血栓长度，并减轻血栓湿重和干重，降低血小板粘附率和血液粘度，并可明显缩短优球蛋白溶解时间，降低血桨纤维蛋白原含量，升高纤溶酶活性，具有明显抗血栓形成的作用。
【专利说明】一种利用黑木耳防治血栓的实现方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种利用黑木耳防治血栓的实现方法。
【背景技术】：
[0002] 众所周知，所谓血栓，就是在活体的心脏或血管腔内，血液发生凝固或血液中的某 些有形成分互相粘集，形成固体质块，在这个过程中所形成的固体质块称为血栓。在生理状 态下，血液中的凝血因子不断地被激活，从而产生凝血酶，形成微量纤维蛋白，沉着于血管 内膜上，但这些微量的纤维蛋白又不断地被激活了的纤维蛋白溶解系统所溶解，同时被激 活的凝血因子也不断地被单核吞噬细胞系统所吞噬。上述凝血系统和纤维蛋白溶解系统的 动态平衡，有时在某些能促进凝血过程的因素作用下，打破动态平衡，触发凝血过程，形成 血栓。
[0003] 对于血栓的影响如下：
[0004] (1)阻塞血管动脉血栓未完全阻塞管腔时，可引起局部器官缺血而萎缩，如完全阻 塞或引起必需的供血量不足而又缺乏有效的侧支循环时，可引起局部器官的缺血性坏死。 如脑动脉血栓引起脑梗死、心冠状动脉血栓引起心肌梗死，血栓闭塞性脉管炎引起患肢坏 疽等。静脉血栓形成后，若未能建立有效的侧支循环，则引起局部淤血、水肿、出血，甚至坏 死，如肠系膜静脉血栓可导致出血性梗死。肢体浅表静脉血栓，由于静脉有丰富的侧支循 环，通常不引起临床症状。
[0005] (2)栓塞。在血栓未和血管壁牢固粘着之前，血栓的整体或部分可以脱落，形成栓 子，随血流运行，引起栓塞。如栓子内含着细菌，可引起栓塞组织的败血性梗死或栓塞性脓 肿。
[0006] ( 3 )心瓣膜变形。心瓣膜血栓机化，可引起瓣膜粘连，造成瓣膜狭窄，如在机化过程 中纤维组织增生而后瘢痕收缩，可造成瓣膜关闭不全，见于风湿性心内膜炎和亚急性细菌 性心内膜炎。
[0007] (4)微循环的广泛性微血栓形成，即DIC，可引起全身性广泛出血和休克。
[0008] 目前主要的抗血栓药物有阿司匹林，它能够抑制血小板聚集，用于预防和治疗缺 血性心脏病、心绞痛、心肺梗塞、脑血栓形成，应用于血管形成术及旁路移植术也有效。但是 随着普及，不良反应也逐渐增多：胃肠道症状，过敏反应，中枢神经系统，肝损害，肾损害，对 血液的影响，心脏毒性，瑞士综合症等。有鉴于此，我们发明了 一种利用黑木耳来防治血栓 的实现方法。
【发明内容】
：
[0009] 鉴于上述技术问题，本发明提供了一种利用黑木耳防治血栓的实现方法。该方法 利用黑木耳中的黑木耳多糖，通过实验延长新西兰兔特异性血栓及纤维蛋白血栓的形成时 间，缩短体外血栓长度，并减轻血栓湿重和干重，降低血小板粘附率和血液粘度，并可明显 缩短优球蛋白溶解时间，降低血桨纤维蛋白原含量，升高纤溶酶活性，具有明显抗血栓形成 的作用。
[0010] 本发明的具体技术方案如下：
[0011] 一种利用黑木耳防治血栓的实现方法，该方法包括：
[0012] (1)将500g黑木耳先冷水浸泡24小时，粉碎机粉碎后，水溶性或脂溶性提取黑木 耳中的黑木耳多糖；
[0013] (2)将实验用的兔龄为2岁的新西兰大白兔进行高脂喂养，使得该实验兔血清总 胆固醇达到6. 5mMol / L，高密度脂蛋白（HDL)达到6. Og / L以上；
[0014] (3)以灌胃给药方式，对实验兔注入等量各实验黑木耳多糖成份组饲养，连续2个 月；
[0015] (4)体外观察实验兔的生理指标；
[0016] (5)对实验兔生理指标进行统计分析，结果均以（X土S)表示，组间比较采用t检验 法，P〈〇. 05具有统计学差异。
[0017] 上述方案中，所述水溶性提取黑木耳中的黑木耳多糖的具体过程为：称取黑木耳 500g，绞碎后加入水浸泡20min，于90°C搅拌6小时，离心，取上清液，浓缩至黏稠，加入95% 乙醇搅拌，离心，取沉淀，加入无水乙醇洗涤，离心，取沉淀，70°C烘箱内干燥，即得粗多糖， 等量分装，备用。
[0018] 上述方案中，所述脂溶性提取黑木耳中的黑木耳多糖的具体过程为：取黑木耳 5〇〇g用粉碎机粉碎，装入烧瓶中，先用石油醚90°C回流提取2小时，重复2次，抽滤后，减压 浓缩得浸膏，再用氯仿、甲醇按上述过程进行回流提取，减压浓缩后，分别得到浸膏。将甲醇 层浸膏，经常压硅胶柱层析，凝胶柱层析SephadexLH-20,反复柱层析，重结晶法，得到3种 化合物，等量分装，备用。
[0019] 上述方案中，所述体外观察实验兔的生理指标包括血栓长度和血栓湿重：具体过 程是将实验兔于末次给药后2小时，用普鲁卡因局麻，颈动脉插管放血2. OmL，加入盛有 0. 2mL，浓度3. 8 %枸橼酸钠抗凝剂的硅化试管中，混勻，血液置25 °C水浴待用。在体外模拟 状态下，在血栓检测装置中形成血栓，用滤纸吸去水份，卡尺测定血栓长度，用分析天平秤 血栓的湿重。
[0020] 上述方案中，所述体外观察实验兔的生理指标包括全血黏度和血浆黏度测定：具 体过程是先用NDJ-79型旋转式粘度计，测全血黏度。再将全血以3000r / min，离心IOmin 后，取血浆，然后再用旋转式粘度计测血浆粘度。
[0021] 上述方案中，所述体外观察实验兔的生理指标还包括血小板计数（PLT)、血小板聚 集率（％)、凝血酶原时间（PT)、活化部分凝血活酶时间（APTT)、甘油三脂（TG)、血清总胆固 醇（Ch )、高密度脂蛋白（HDL)，动物血管解剖等这些参数。
[0022] 本发明所述方法，通过兔子实验，证明黑木耳多糖可显著延长，缩短体外血栓长 度，并减轻血栓湿重，降低血栓形成的百分率，且可显著降低高切变率全血的黏度，从而提 示黑木耳多糖有一定的抗血栓形成的作用，对防治某些心脑血管栓塞性疾病有重要意义。 黑木耳多糖可明显延长家兔特异性血栓及纤维蛋白血栓的形成时间，使血栓长度缩短，减 轻血栓湿重和干重，减少血小板数，降低血小板粘附率和血液粘度，并可明显缩短豚鼠优球 蛋白溶解时间，降低血桨纤维蛋白原含量，升高纤溶酶活性，具有明显抗血栓形成的作用。
【专利附图】
【附图说明】：
[0023] 以下结合附图和【具体实施方式】来进一步说明本发明。
[0024] 图1为本发明方法对于不同剂量黑木耳对抗血栓效果的比较的流程图。
[0025] 图2为本发明方法对于最适剂量条件下不同成份提取物对抗血栓效果的观察的 流程图。
【具体实施方式】：
[0026] 为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结 合具体图示，进一步阐述本发明。
[0027] 本发明方法具体实现过程包括以下几部分：
[0028] 一、材料与仪器
[0029] 1.实验用黑木耳：购自超市3Kg，经鉴定为木耳科木耳属黑木耳 Auriculariaauircular 子实体。
[0030] 2.实验用雄性新西兰大白兔购自上海医学研究所动物中心，兔龄2岁，体重 (1. 8 - 2. 0) Kg,，身体健康、体温正常。动物实验条件：温度（22±2) °C，湿度50%?70%， 光照：150?200Lx，12h明暗交替，噪音<50dB，屏障系统温度、湿度、光照、压力梯度等设有 自动控制和显示系统。自来水均过滤灭菌，置于高压灭菌的饮水瓶中自由饮用。
[0031] 高脂血症兔模型(血清总胆固醇大于6. 50mMol / L，高密度脂蛋白大于6. OOg / L):灭菌高脂兔全价营养颗粒饲料，自由采食2个。经检测血液个观察指标与解剖观察冠状 动脉、颈动脉证实已达到高脂血症标准，再均衡分组，在日常高脂兔全价营养颗粒饲养的基 础上加入实验黑木耳各组分，再饲养2个月，取血检测各观察指标及解剖观察兔冠状动脉、 颈动脉的血管脉粥样硬化状况与程度。
[0032] 3仪器：血栓检测仪，分析天平，旋转式粘度计，柱层析硅胶、薄层层析硅胶；所用 实验用试剂均为分析纯。
[0033] 二、实验步骤：
[0034] 1?黑木耳成份的提取与分组：
[0035] ( 1)全效黑木耳粉末组：
[0036] 取黑木耳500g，冷水浸泡24h，粉碎机粉碎，等量分装，伴入兔食料中。
[0037] (2)黑木耳多糖提取(水溶性组）；
[0038] 称取黑木耳500g，绞碎后加入水浸泡20min，于90°C搅拌6h，离心，取上清液，浓缩 至黏稠，加入95%乙醇搅拌，离心，取沉淀，加入无水乙醇洗涤，离心，取沉淀，70°C烘箱内干 燥，即得粗多糖，等量分装，备用。
[0039] (3)黑木耳有机成份的提取与分离(脂溶性组）：
[0040] 取黑木耳500g用粉碎机粉碎，装入烧瓶中，先用石油醚90°C回流提取2h，重复2 次，抽滤后，减压浓缩得浸膏，再用氯仿、甲醇按上述过程进行回流提取，减压浓缩后，分别 得到浸膏。将甲醇层浸膏，经常压硅胶柱层析，凝胶柱层析SephadexLH-20,反复柱层析，重 结晶法，得到3种化合物，分别得A、B....等物质，等量分装，备用。
[0041] 2?动物准备与实验；
[0042] (1)购买动物实验型新西兰大白兔兔龄2岁，体重I. 8-2Kg，，身体健康、体温正 堂 巾。
[0043] (2)高脂血症兔动物模型制造：高脂喂养，血清总胆固醇达到6. 5mMol / L，高密度 脂蛋白（HDL)达到6. Og / L以上。高脂饲料购自。
[0044] (3)在高脂血症兔动物模型上，依据观察指标数据，进行均衡分配至各组，特殊状 况与异常数据动物剔除。
[0045] (4)除对照组正常饲养外，各实验组动物均以灌胃给药方式，注入等量各实验黑木 耳成份组饲养，连续2个月。
[0046] (5)于末次给药后2h，将兔背位固定于手术台上，用盐酸普鲁卡因局部麻醉，分离 一侧颈总动脉并作颈总动脉插管，自颈总动脉取血实验。各实验组分别随机抽取3只兔解 剖，观察兔冠状动脉、颈动脉的血管脉粥样硬化状况与程度。
[0047] 3体外各实验兔观察指标：
[0048] (1)血栓长度、血栓湿重：将实验兔于末次给药后2h，用普鲁卡因局麻，颈动脉插 管放血2. OmL，加入盛有0. 2mL，浓度3. 8 %枸橼酸钠抗凝剂的硅化试管中，混匀，血液置 25°C水浴待用。在体外模拟状态下，在血栓检测装置中形成血栓，用滤纸吸去水份，卡尺测 定血栓长度，用分析天平秤血栓的湿重。
[0049] (2)全血黏度、血浆黏度测定：先用NDJ-79型旋转式粘度计，测全血黏度。再将全 血以3000r / min,离心IOmin后，取血楽，然后再用旋转式粘度计测血楽粘度。
[0050] 其他检测项目：血小板计数（PLT)、血小板聚集率（％)、凝血酶原时间（PT)、活化部 分凝血活酶时间（APTT)、甘油三脂（TG)、血清总胆固醇（Ch)、高密度脂蛋白（HDL)，动物血 管解剖等，这些指标通过检测，并以实验报告形式汇报。
[0051] 4.数据统计分析方法；
[0052] 结果均以（X土 S)表示，组间比较采用t检验法，P〈0. 05具有统计学差异。
[0053] 如图1所示，该流程图是为了通过实验寻找黑木耳对抗血栓效果的最佳剂量。图 中，I 组剂量：100 (mg/Kg/ 天）；II组剂量：200 (mg/Kg/ 天）JII组剂量：500 (mg/Kg/ 天）； IV组剂量：1000 (mg/Kg/天）；V组：高脂饮食对照组(未加黑木耳成份)。
[0054] 观察指标：
[0055] 1.血栓状态评估指标：血栓长度、血栓湿重、全血黏滞度、血浆黏滞度。
[0056] 2.凝血状态评估指标：血小板计数（PLT)、血小板聚集率、凝血酶原时间（PT)、活 化部分凝血活酶时间（APTT)。
[0057] 3.血脂代谢评估指标：甘油三脂（TG)、血清总胆固醇（Ch)、高密度脂蛋白（HDL)。
[0058] 4.血管动脉粥样硬化：解剖观察兔冠状动脉、颈动脉的血管脉粥样硬化状况与程 度。
[0059] 实验结果参见如下表1，不同剂量全效黑木耳粉对抗血栓效果的比较(寻找最佳剂 量)。
[0060]
【权利要求】
1. 一种利用黑木耳防治血栓的实现方法，该方法包括： (1) 将500g黑木耳先冷水浸泡24小时，粉碎机粉碎后，水溶性或脂溶性提取黑木耳中 的黑木耳多糖； (2) 将实验用的兔龄为2岁的新西兰大白兔进行高脂喂养，使得该实验兔血清总胆固 醇达到6. 5mMol / L，高密度脂蛋白（HDL)达到6. Og / L以上； (3) 以灌胃给药方式，对实验兔注入等量各实验黑木耳多糖成份组饲养，连续2个月； (4) 体外观察实验兔的生理指标； (5) 对实验兔生理指标进行统计分析，结果均以（x土S)表示，组间比较采用t检验法， P〈0. 05具有统计学差异。
2. 根据权利要求1的利用黑木耳防治血栓的实现方法，其特征在于，所述水溶性提取 黑木耳中的黑木耳多糖的具体过程为：称取黑木耳500g，绞碎后加入水浸泡20min，于90°C 搅拌6小时，离心，取上清液，浓缩至黏稠，加入95%乙醇搅拌，离心，取沉淀，加入无水乙醇 洗涤，离心，取沉淀，70°C烘箱内干燥，即得粗多糖，等量分装，备用。
3. 根据权利要求1的利用黑木耳防治血栓的实现方法，其特征在于，所述脂溶性提取 黑木耳中的黑木耳多糖的具体过程为：取黑木耳500g用粉碎机粉碎，装入烧瓶中，先用石 油醚90°C回流提取2小时，重复2次，抽滤后，减压浓缩得浸膏，再用氯仿、甲醇按上述过程 进行回流提取，减压浓缩后，分别得到浸膏。将甲醇层浸膏，经常压硅胶柱层析，凝胶柱层析 SephadexLH-20,反复柱层析，重结晶法，得到3种化合物，等量分装，备用。
4. 根据权利要求1的利用黑木耳防治血栓的实现方法，其特征在于，所述体外观察实 验兔的生理指标包括血栓长度和血栓湿重：具体过程是将实验兔于末次给药后2小时，用 普鲁卡因局麻，颈动脉插管放血2. OmL，加入盛有0. 2mL，浓度3. 8%枸橼酸钠抗凝剂的硅化 试管中，混匀，血液置25°C水浴待用。在体外模拟状态下，在血栓检测装置中形成血栓，用滤 纸吸去水份，卡尺测定血栓长度，用分析天平秤血栓的湿重。
5. 根据权利要求1的利用黑木耳防治血栓的实现方法，其特征在于，所述体外观察实 验兔的生理指标包括全血黏度和血浆黏度测定：具体过程是先用NDJ-79型旋转式粘度计， 测全血黏度。再将全血以3000r / min,离心lOmin后，取血楽，然后再用旋转式粘度计测血 浆粘度。
6. 根据权利要求1的利用黑木耳防治血栓的实现方法，其特征在于，所述体外观察实 验兔的生理指标还包括血小板计数、血小板聚集率、凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时 间、甘油三脂、血清总胆固醇、高密度脂蛋白，动物血管解剖这些参数。
【文档编号】A61P7/02GK104415048SQ201310363145
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月19日 优先权日:2013年8月19日
【发明者】柳弈诚 申请人:上海市建青实验学校