用于治疗肺癌的cd8毒性t淋巴细胞及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及用于治疗肺癌的CD8毒性T淋巴细胞（CTL）及其制备方法，用人工抗原提呈细胞（artificial?antigen?presenting?cell，aAPC）668株负载抗原肽后在体外高效活化用磁珠法分选HLA-A2阳性肿瘤患者外周血而来的CD8T细胞，CD8T细胞经激活，分化成具为具有杀伤肿瘤细胞的CD8毒性细胞(CTL),诱导的CTL分泌IFN-γ，且体外对人肿瘤細胞株和体内对自体肿瘤细胞具有明显的杀伤作用，CTL回输给病人后可用来治愈肿瘤患者或延长患者的生命。
【专利说明】用于治疗肺癌的CD8毒性T淋巴细胞及其制备方法
[【技术领域】]
[0001]本发明涉及⑶8毒性T淋巴细胞(CTL)及其制备方法，具体涉及用于治疗肺癌的⑶8毒性T淋巴细胞(CTL)及其制备方法。
[【背景技术】]
[0002](I)自体细胞的过继免疫治疗
[0003]自体细胞免疫治疗的出现，弥补了三大传统肿瘤治疗一放疗、化疗和手术治疗难以彻底抹杀肿瘤细胞的缺陷，它是用自己的细胞治自己的病，通过提高病人自身的免疫系统的功能，增强特异性肿瘤杀伤细胞的分化能力，在没有任何副作用的前提下，可以在细胞水平上杀灭肿瘤。这项实现患者自身机体的“自主抗癌”疗法，有望达到完全消灭体内癌细胞并根治的目的，将成为未来癌症治疗的一个主要方向。这项技术被认为是“二十一世纪最有希望攻克肿瘤的治疗技术”，也是世界上目前唯一有希望完全消灭肿瘤细胞的治疗手段。肿瘤自体细胞免疫疗法适用于多种实体肿瘤，包括恶性黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、喉癌、鼻咽癌、胰腺癌、肝癌、胃癌等实体瘤手术后防止复发，也可以用于多发性骨髓瘤、B淋巴瘤和白血病等血液系统恶性肿瘤的复发，对于大多数细胞免疫治疗的适应人群还可以用于上述肿瘤的进一步巩固治疗，达到延长生存期、提高生活质量和抑制肿瘤恶化的目的。美国FDA于2010年4月29日批准了第一支基于该技术的治疗产品上市，中国也已立法规定此技术作为第三类医疗技术，允许有资质的医院开展。
[0004](2)第二代过继免疫细胞治疗一⑶8T细胞免疫治疗的优势
[0005]第一代过继自体细胞免疫疗法主要包括三种免疫细胞的疗法一 DC、CIK、DCCIK，疗法优点突显在:通过采集人体自身免疫细胞，经由体外培养使其数量成千上万倍增多，进而使免疫细胞的靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体以杀灭血液及组织中的病原体、修复机体受损组织细胞，以及调节和增强机体的免疫功能。这项技术在国内若干家公立医院已经开展，广大的医疗机构尚处在待开发状态。但是，肿瘤杀伤的特异性低而且杀伤机理不是很清楚。CD8T细胞治疗是第二代免疫细胞治疗，CD8T细胞是癌细胞最原始的天敌，具有肿瘤特异性抗原识别和有效杀伤癌细胞的效果。作为第二代免疫细胞治疗技术，CD8T细胞技术属于近几年获得重大突破的最新技术。除具有第一代自体细胞免疫疗法的优点外，与第一代免疫细胞治疗技术DC\CIK技术相比，不仅在安全性上得到了更好的保证，对癌细胞的杀伤性和靶向性上更是得到了显著提升，有效改善了 DC\CIK技术肿瘤杀伤效果有限的局限性，是真正有望根治癌症的最新技术
[
【发明内容】
]
[0006] 为了解决现有技术中的上述不足和缺陷，本发明提供一种用人工抗原提呈细胞制备治疗肺癌的CD8毒性T淋巴细胞(CTL)及其制备方法。
[0007]为了实现上述目的，设计一种用于治疗肺癌的⑶8毒性T淋巴细胞(CTL)的制备方法，其特征在于用人工抗原提呈细胞负载抗原肽后在体外高效活化用磁珠法分选HLA-A2阳性肿瘤患者外周血而来的CD8T细胞，CD8T细胞经激活，分化成具为具有杀伤肿瘤细胞的⑶8毒性T淋巴细胞(CTL)。
[0008]通过果蝇细胞制备所述的人工抗原提呈细胞，通过在果蝇细胞表面共表达MHC I和T细胞共刺激分子，使果蝇细胞具有抗原递呈的功能。
[0009]所述的人工抗原提呈细胞是由编码HLA-A2和两个共刺激分子⑶80和⑶54的cDNA转染原始果蝇细胞株S2而得到的稳定表达HLA-A2、⑶80和⑶54分子的细胞株。
[0010]通过红细胞制备所述的人工抗原提呈细胞，将可溶性的MHC I类分子和微球蛋白包被在其表面，使其具有抗原递呈的功能。 [0011]所述的抗原肽是与MHC I类分子具有高亲和结合的多肽分子。
[0012]所述的抗原肽为MAGE-1、MAGE-3、NY-ESO-l、SSX-2、WT-1 和 hTERT。
[0013]上述⑶8毒性T淋巴细胞(CTL)可用于制造肺癌治疗药物。
[0014]本发明同现有技术相比，用人工抗原提呈细胞(artificial antigen presentingcell, aAPC) 668株负载抗原肽后在体外高效活化用磁珠法分选HLA-A2阳性肿瘤患者外周血而来的CD8T细胞，CD8T细胞经激活，分化成具为具有杀伤肿瘤细胞的CD8毒性细胞(CTL)，诱导的CTL分泌IFN- Y，且体外对人肿瘤細胞株和体内对自体肿瘤细胞具有明显的杀伤作用，CTL回输给病人后可用来治愈肿瘤患者或延长患者的生命。
[【专利附图】
【附图说明】]
[0015]图1为多肽与MHCI结合的亲和性示意图；
[0016]图2为多肽与MHCI结合的亲和性示意图；
[0017]图3为⑶8T细胞增长曲线示意图；
[0018]图4为CTL活性测试示意图；
[0019]图5为CTL活性测试示意图；
[0020]图6为CTL分泌IFN- Y示意图；
[0021]图7为⑶62L，CCR7等分子在静止的⑶8T细胞和CTL上的表达示意图。
[【具体实施方式】]
[0022]为了使本发明更加清楚，结合附图和实施例对本发明做进一步说明，应当理解，本实施例并不用于限定本发明的保护范围。
[0023]I)多肽的制备和分析:运用生物信息学的方法，分析肺癌特异性抗原分子内的抗原肽片段，设计能与MHC I类分子结合的肽段，并在体外合成这些肽段，保证纯度在95%以上。研究肽段与MHC I类分子的结合稳定性。
[0024]2)人造抗原提呈细胞:
[0025](I)昆虫细胞人造抗原递呈细胞(aAPC)的制备:构建表达各种相关蛋白的载体。以果蝇S2细胞为基础，共转染表达HLA-A2、β-微球蛋白、⑶80、细胞间黏附分子-1(ICAM-1,⑶54);流式细胞术(FACS)分析各种分子的表达情况，保证相关分子的表达在80%以上。
[0026](2)红细胞人造抗原递呈细胞(aAPC)的制备:通过果蝇细胞表达可溶性HLA-A2分子和β2-微球蛋白，并包被于红细胞表面。通过流式细胞术分析，包被相关分子的红细胞占总数的80%以上。
[0027]3)分离⑶8+Τ细胞及纯度分析:使用Ficoll或类似试剂进行分离PBMC，用磁珠法免疫纯化分离CD8+细胞。通过流式细胞术，分析CD8+T细胞的纯度。
[0028]4) CTL的产生:利用人工抗原递呈细胞和合成的抗原肽与⑶8Τ细胞在体外共培养，在多肽存在的条件下用同一个捐赠者的PBMC中的非CD8粘附细胞(第一天已冻存)重覆刺激⑶8细胞，细胞扩增后产生⑶8Τ毒性T淋巴细胞(CTL)。
[0029]5)特异的CTL活性:通过51Cr释放试验，测定CTL对靶细胞的杀伤作用；
[0030]6)高质量CTL的确定:通过对CTL表型的追踪测定，可以确定高质量的CTL的表型分子表达水平。
[0031]7) CTL体内活性试验:使用肺癌小鼠模型分析检测CTL活性。
[0032]抗原肽的设计:根据文献报道的有关肺癌特异表达的抗原分子，计算机程序按照MHC I与多肽结合的立体结构预测与MHCI高亲和结合的多肽分子(SYFPEITHI epitopeprediction)。表一所列出的7个多肽来自于7个肿瘤抗原上与MHC I亲和性最高的可能的抗原肽，这些肿瘤抗原分别是MAGE-1，MAGE-3, NY-ESO-1, SSX-2, WT-1和hTERT。在程序中
输入抗原氨基酸顺序，计算机将显示出一系列亲和性不同的与MHC I结合的多肽。
[0033]
抗原抗原肽顺序
MAGE-1KVLEYVIKV (948)
MAGE-3FLWGPRALV (909)`[0034]
NY-ESO-lSLLM WITQV (906)
SSX-2KASEKIFYV (922)
WT-1RMFPNAPYL (974)
hTERTYLFFYRKSV(933)
[0035]MAGE=melanoma antigen gene
[0036]SSX=synovial sarcoma, X breakpoint2
[0037]WT=Wi lm，s Tumor
[0038]NY-ESO=cancer-testis antigen
[0039]hTERT=human telomerase reverse transcriptase
[0040]抗原肽的稳定MHC I的确定:对于肽结合在主要组织相容性复合体(MHC/HLA-A2)分子的研究分析基于肽对果蝇人工抗原提呈细胞(aAPCs，668)上I类MHC的稳定能力。在96孔V型板上1: 10稀释多肽，使最终肽浓度分别为200uM, 20uM, 2uM, 200nM, 20nM, 2nM,每孔多肽溶液为100 μ 1，同时设置无肽孔为阴性对照。将100 μ I的经ImM CuS04诱导的果蝇668细胞(细胞浓度调至I X IO6个/ml)置于V底96孔板中，于26°C，5%C02条件下培养，18h后移至37°C，5%C02的细胞培养箱中继续培养2h。随后将细胞用FACS缓冲液(PBS, 2.5%FCS, 0.01%NaN3)洗涤一次，悬浮细胞在50 μ I的FACS缓冲液中，接着每孔加入I μ I FITC 标记的鼠抗人 HLA-A2 抗体(BD Pharmingen, Cat.N0.551285)和 I μ I PI 染色，4°C培养30min，染色后将洗涤后的细胞重新悬浮于200 μ I FACS缓冲液并将细胞转移至96个微型管中。样本用FACScan流式细胞仪测定，CellQuest软件分析，如图1、图2所示。
[0041]⑶8Τ细胞增长曲线:从HLA-A2阳性捐献者中用血分仪得到的白细胞经Ficoll分离得到PBMC，经抗⑶8抗体连接的磁珠进一步纯化出的⑶8+Τ细胞，再和已负载多肽的果蝇APC668 于 37°C，5%C02 培养 5 天。在第五天加入人 IL-2 (20U/ml, R&D)和 IL-7 (30U/ml, R&D体)，并于第7天和第15天，在多肽存在的条件下用同一个捐赠者的PBMC中的非CD8粘附细胞重复刺激⑶8+T细胞两次，细胞浓度用细胞培养液调节至2 X 106/ml。在第7，10，12，14，17，20，22天用Typan Blue细胞计数而获得细胞增长曲线，如图3所示。
[0042]CTL活性测定:
[0043]释放51Cr方法:CTL (效应物)活性用标准的铬(51Cr)释放试验来衡量，负载单一月太的 T2 细胞(祀目标)作为祀细胞(Brunner et al., Immunology.1968February; 14 (2): 181-96)。利用1:5的CTL (效应物)系列稀释倍数产生的剂量应答，得到最高效应物(E)和靶目标(T)比率为50:1。在试验之前，靶细胞(3 X 106cells/100 μ I Τ2细胞放置在含有4%FCS的IXPBS中)用100 μ I51Cr (Perkin Elmer)标记并于37°C培养lh。结束后标记的靶细胞用含有2.5%马血清(Invitrogen)的I X Hank’s平衡盐溶液(Invitrogen)洗4次，于40C 1200-1500rpm离心8min，重新悬浮在15ml新鲜MLR培养基(含10%FCS，1%谷氨酰胺，1%青霉素-链霉素，1%HEPES和1%MEM非必须氨基酸的RPM1-1640溶液)中。标记的T2细胞最终浓度定为0.2X IO6个/ml。试验前，标记的T2细胞用IOuM单一肽于室温下负载30min ；100 μ I CTL (初浓度为5 X IO6个/ml)用MLR培养基在圆底96孔板中连读稀释1:5，每个效应细胞浓度设I个重复。在每个孔中含有不同稀释倍数的CTLlOOy 1，加入50 μ I Κ562细胞(4 X IO6 个 /ml) ( ATCC? Number:CCL-243?)和 50 μ I 负载肽的 51Cr 标记的 Τ2 靶细胞(0.2X IO6个/ml),于37°C，5%C0培养4h,900rpm离心5min,每孔取100 μ I上清液至51Cr计数管中计数(如图4、图5所示)。
[0044]IFN- Y的测定:在96孔板中，负载多肽的100 μ I靶细胞Τ2或肿瘤细胞(106cells/1000y 1，多肽浓度:5μ g/ml)与 100 μ I 效应细胞 CTLs (106cells/1000 μ 1)1:I在37°C，5%C02培养8h，1200rpm离心5min,每孔取100 μ I上清液用于ELISA测定T细胞受抗原刺激产生并释放IFN-Y的量(IFN-Y测定试剂盒)。释放IFN-Y的量与T细胞的活性成正比，如图6所示。
[0045]细胞表型:细胞的表型反应了细胞的状态，与细胞的活性及在体内的存活有关。⑶28，⑶27，⑶62L以及CCR7的表达常被用来推测CTL细胞形态和表型以及记忆状态。I X IO6的CTL用缓冲液(PBS/2%FCS/0.02%NaN3)洗涤，悬浮在100 μ I同一缓冲液中，加抗CD8-PerCP-Cy5-5 抗体，并分别加入抗 CD28-FITC，CD27-FITC，CD62L-FITC 和 CCR7-FITC 抗体，4C，30min.，缓冲液洗涤后，悬浮细胞在0.5毫升的缓冲液中，用流式细胞仪分析CTL上CD28, CD27, CD62L和CCR7的表达，如图7所示。
【权利要求】
1.一种用于治疗肺癌的CD8毒性T淋巴细胞的制备方法，其特征在于用人工抗原提呈细胞负载抗原肽后在体外高效活化用磁珠法分选HLA-A2阳性肿瘤患者外周血而来的CD8T细胞，CD8T细胞经激活，分化成具为具有杀伤肿瘤细胞的CD8毒性T淋巴细胞。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于通过果蝇细胞制备所述的人工抗原提呈细胞，通过在果蝇细胞表面共表达MHC I和T细胞共刺激分子，使果蝇细胞具有抗原递呈的功能。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的人工抗原提呈细胞是由编码HLA-A2和两个共刺激分子CD80和CD54的cDNA转染原始果蝇细胞株S2而得到的稳定表达HLA-A2、CD80和CD54分子的细胞株。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于通过红细胞制备所述的人工抗原提呈细胞，将可溶性的MHC I类分子和微球蛋白包被在其表面，使其具有抗原递呈的功能。
5.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于所述的抗原肽是与MHCI类分子具有高亲和结合的多肽分子。
6.如权利要求5所述的其特征在于所述的抗原肽为MAGE-1、MAGE-3、NY-ESO-1、SSX-2、WT-1 和 hTERT。
7.一种通过权利要求1至6中任一所述制备方法制得的⑶8毒性T淋巴细胞。
8.—种权利要求7所述CD8毒性T淋巴细胞在肺癌治疗药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK103667189SQ201310439121
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年9月24日 优先权日:2013年9月24日
【发明者】施炜星, 杨春霞, 房永生 申请人:上海宇研生物技术有限公司