一种复合酶法自茶叶渣中提取茶多酚的方法
【专利摘要】本发明涉及一种复合酶法自茶叶渣中提取茶多酚的方法。具体，茶叶渣水溶液以复合酶（果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶）酶解，酶解条件为pH5.0-6.5，温度50-60℃，酶解2-4h，而后煮沸2min，使酶失活；5-10％乙醇溶液浸提1-3h，共3次，合并浸提上清液，进行浓缩，回收溶剂，得浸膏，将浸膏溶于水中，加到大孔吸附树脂pH5.0-8.0中，加液量为柱体积1/3，先用水洗脱除杂，再用50-70%乙醇洗脱，用量为树脂体积的3-4倍，回收茶多酚。本发明与传统提取法比较具有提取速度快，成本低，不用重结晶，省时、省力；提取率高，杂质含量少，易于纯化；提取工艺不使用有毒溶剂，对环境友好等特点；项目适宜大规模工业化生产。
【专利说明】一种复合酶法自茶叶渣中提取茶多酚的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于天然产物或原料加工领域，具体涉及一种复合酶法自茶叶渣中提取茶多酚的方法。
【背景技术】
[0002]茶叶渣是茶叶冲泡后的茶叶渣滓。茶叶在泡水时只能把水溶性强的部分成分浸泡出来，茶多酚(Tea Polyphenols)是茶叶中多酚类物质的总称，包括黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等，未溶出成分主要是水难溶性成分，如黄酮类化合物。茶多酚是抗氧化剂，对人体内自由基具有清除作用，其清除自由基作用比VC、VE强很多倍，此外，茶多酚与抗氧化物还具有协同作用。对茶多酚提取分离的研究越来越引起世人的关注。茶叶渣滓直接丢弃造成巨大浪费，合理利用废弃茶叶渣，变废为宝具有很强的实际应用价值。
[0003]茶多酚的提取方法较多，但存在有以下问题，如水提法提取茶多酚含量很低；溶剂萃取法在提取过程中用到有机溶剂，使得茶多酚中残留有毒性物质，不安全；沉淀法提取茶多酚对于PH值的控制有很高要求，pH过高或过低对茶多酚的提取都不利，且对沉淀剂的选择要求高，有些金属盐离子容易产生残留，使茶多酚的安全性无法保证；超临界二氧化碳萃取法提取茶多酚无污染、无杂质，但是成本高，不适合大规模生产；膜技术的方法提取茶多酚，成本高、产量低。
【发明内容】
[0004]针对现有技术的上述问题，本发明提供一种复合酶法自茶叶渣中提取茶多酚的方法。该方法简单易行、成本低廉、适于大规模生产，提取的茶多酚产品安全、无污染。
[0005]为了实现上述目的，本发明 包括以下技术方案:
[0006]一种复合酶法自茶叶渣中提取茶多酚的方法，该方法的步骤包括:
[0007]a、预处理:先将茶叶渣粉碎，将茶叶渣和水按重量比1:3-7混合，浸泡0.5-1小时；
[0008]b、复合酶解:向上述预处理液中，按茶叶渣重量的0.32%-1.16%加入复合酶，该复合酶为纤维素酶8-30重量份、果胶酶4-20重量份和木聚糖酶0.004-0.008重量份；用HCl调pH为5.0-6.5，温度为50°C _60°C时酶解2-4小时，而后煮沸2_4min，使酶失活；
[0009]C、乙醇浸取:使用5-10体积％乙醇对步骤b酶解后的混合物加热浸提，浸提温度750C -80°C，将提取液离心，取上清液；
[0010]d、分离、提纯:将步骤c获得的上清液减压浓缩，得浸膏，加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏液缓慢滴加到大孔吸附树脂，用50-70体积％乙醇作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
[0011 ] 如上所述的方法，优选地，所述步骤b中纤维素酶为60万U/g、果胶酶为80万U/g和木聚糖酶为4.2万U/g。
[0012]如上所述的方法，优选地，所述步骤c的具体操作为:向步骤b酶解后的混合物中加入无水乙醇，使乙醇终浓度达5-10体积％，加热至75°C _80°C浸提l_2h ;过滤后的茶渣再用5-10体积％的乙醇浸提2次，每次所加5%-10%的乙醇为茶渣干重的5~10倍，浸提温度75°C -80°C，每次浸提l_2h，合并3次提取液，将提取液离心，取上清液。
[0013]如上所述的方法，优选地，所述步骤d中大孔吸附树脂为D-1Ol、AB-8、X-5、LX_60、DM-130中的一种或几种，大孔吸附树脂中pH5.0-8.0。
[0014]如上所述的的方法，优选地，所述步骤b中复合酶中纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶添加量为重量比1500:1000:8。
[0015]如上所述的方法，优选地，所述步骤c中5-10体积％乙醇的浸提条件为，浸提温度80 C，每次浸提2h。
[0016]本发明所述的茶叶渣是茶叶冲泡后的茶叶渣滓。
[0017]本发明的有益效果为:
[0018]1、茶多酚具有明显的抗氧化、降血脂作用，用于制药、食品保健品行业，用途广泛。本专利研究了自茶叶渣中提取茶多酚的工艺制备的新方法。
[0019]2、本发明的提取方法以复合酶法进行酶解处理，成本低、环境友好、产量高、纯度高，适宜工业化生产。
[0020]3、整个提取过程操作简便，避免了有机溶剂带来的毒性成分。
[0021]4、本发明中使用5-10%乙醇提取，提取液澄清，粘度低，产品杂质少，后续处理方便。
[0022]5、本发明使用的大孔吸附树脂可反复使用，成本低。
[0023]6、本发明提取茶叶渣`中的茶多酚，经复合酶处理，用50-70%乙醇洗脱，浸膏重量明显多于水提法，且50-70%乙醇洗脱浸膏中茶多酚的含量可达80%以上。说明通过使用本专利发明的复合酶酶解，5-10%乙醇提取，50-70%的乙醇洗脱就可将大部分的茶多酚富集，纯度大大增加。在复合酶中，木聚糖酶可分解原料细胞壁以及葡聚糖，降低提取的粘度，促进有效成分茶多酚的释放，同时可降低提取液非淀粉多糖含量。本发明复合酶中包括少量木聚糖酶，提取率获得显著提高。
【具体实施方式】
[0024]以下实施例中所用茶树叶洛原料为:双子叶植物属被子植物门(Angiospermae)双子叶植物纲(Dicotyledoneae)山茶科(Theaceae)、山茶属(Camellia)茶 Camelliasinensis (L.)0.Kuntze的嫩叶制成的各类茶叶。称取茶叶,用10倍重量的开水浸泡茶叶30-60分钟，连续浸泡三次，茶叶渣放在恒温干燥箱中干燥6小时至恒重。
[0025]所用纤维素酶为60万U/g、果胶酶为80万U/g、木聚糖酶为4.2万U/g。
[0026]实施例1
[0027](I)取茶 Camellia sinensis (L.) 0.Kuntzes 树叶禮:500g,粉碎。
[0028](2)加入3倍量的蒸馏水，浸泡I小时，加入果胶酶1.0g。
[0029](3) HCl调pH为5.6，温度为50°C酶解2.5h，而后煮沸3min，使酶失活。
[0030](4)加乙醇，使乙醇终浓度达5体积％，加热浸提。茶叶渣再用终浓度为5体积％的乙醇溶液浸提2次。提取条件为:温度77°C，每次lh。合并3次提取液，提取液过滤，离心，取上清液，减压蒸发，提取量为8.332mg/g。[0031](5)上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏缓慢滴加到AB-8大孔吸附树脂，调pH6.0，加样至柱体1/3处，加入3倍柱体积蒸馏水冲洗。
[0032](6)选用4倍柱体积的60%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
[0033]实施例2
[0034](1)取茶叶 Camellia sinensis (L.) 0.Kuntze 禮:500g,粉碎。
[0035](2)加入3倍量的蒸馏水，浸泡I小时，加入果胶酶1.5g。
[0036](3) HCl调pH为5.6，温度为50°C酶解2.5h，而后煮沸3min，使酶失活。
[0037](4)加乙醇，使乙醇终浓度达5体积％，加热浸提。茶叶渣再用终浓度为5体积％的乙醇溶液浸提2次。提取条件为:温度77°C，每次lh。合并3次提取液，提取液过滤，离心，取上清液取上清液，减压蒸发，提取量为7.865mg/g。
[0038](5)上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏缓慢滴加到AB-8大孔吸附树脂，调pH7.2，加样至柱体1/3处，加入3倍柱体积蒸馏水冲洗。
[0039](6)选用4倍柱体积的70%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
[0040]实施例3
[0041](1)取茶叶 Camellia sinensis (L.) 0.Kuntze 禮:500g,粉碎。
[0042](2)加入3倍量的蒸馏水，浸泡I小时，加入果胶酶2.0g。
[0043](3) HCl调pH为5.6，温度为50°C酶解2.5h，而后煮沸3min，使酶失活。
[0044](4)加乙醇，使乙醇终浓度达5体积％，加热浸提。茶叶渣再用终浓度为5体积％的乙醇溶液浸提2次。提取条件为:温度75°C，每次lh。合并3次提取液，提取液过滤，离心，取上清液，减压蒸发，提取量为7.241mg/g。
[0045](5)上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏缓慢滴加到LX-60大孔吸附树脂，调pH7.0，加样至柱体1/3处，加入3倍柱体积蒸馏水冲洗。
[0046](6)选用4倍柱体积的60%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
[0047]实施例4
[0048](I)取茶叶 Camellia sinensis (L.) 0.Kuntze 禮:500g,粉碎。
[0049](2)加入3倍量的蒸馏水，浸泡I小时，加入果胶酶2.5g。
[0050](3) HCl调ρΗ5.6，温度50°C酶解2.5h，而后煮沸3min，使酶失活。
[0051](4)加乙醇，使乙醇终浓度达5体积％，加热浸提。茶叶渣再用终浓度为5体积％的乙醇溶液浸提2次。提取条件为:温度76°C，每次2h。合并3次提取液，提取液过滤，离心，取上清液，减压蒸发，提取量为6.390mg/g。
[0052](5)上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏缓慢滴加到X-5大孔吸附树脂,调pH6.7，加样至柱体1/3处，加入3倍柱体积蒸馏水冲洗。
[0053](6)选用4倍柱体积的50%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
[0054]实施例5
[0055](1)取茶 Camellia sinensis (L.) 0.Kuntzes 树叶禮:500g,粉碎。
[0056](2)加入3倍量的蒸馏水，浸泡I小时，加入纤维素酶1.5g。
[0057](3) HCl调ρΗ5.6，温度57°C酶解2.5h，而后煮沸3min，使酶失活。
[0058](4)加乙醇，使乙醇终浓度达5体积％，加热浸提。茶叶渣再用终浓度为5体积％的乙醇溶液浸提2次。提取条件为:温度74°C，每次2h。合并3次提取液，提取液过滤，离心，取上清液，减压蒸发，提取量为6.777mg/g。
[0059](5)上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏缓慢滴加到D-101大孔吸附树脂，调pH7.8，加样至柱体1/3处，加入3倍柱体积蒸馏水冲洗。
[0060](6)选用4倍柱体积的60%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
[0061]实施例6
[0062](I)取茶叶 Camellia sinensis (L.) 0.Kuntze 禮:500g,粉碎。
[0063](2)加入3倍量的蒸馏水，浸泡I小时,加入纤维素酶2.0g。
[0064](3) HCl调ρΗ5.6，温度55°C酶解2.5h，而后煮沸3min，使酶失活。
[0065](4)加乙醇，使乙醇终浓度达5体积％，加热浸提。茶叶渣再用终浓度为5体积％的乙醇溶液浸提2次。提取条件为:温度78°C，每次2h。合并3次提取液，提取液过滤，离心，取上清液，减压蒸发，提取量为8.406mg/g。
[0066](5)上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏缓慢滴加到X-5大孔吸附树脂,调pH6.5，加样至柱体1/3处，加入3倍柱体积蒸馏水冲洗。[0067](6)选用4倍柱体积的70%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
[0068]实施例7
[0069](I)取茶叶 Camellia sinensis (L.) 0.Kuntze 禮:500g,粉碎。
[0070](2)加入3倍量的蒸馏水，浸泡I小时，加入纤维素酶2.5g。
[0071](3) HCl调pH为5.6，温度为50°C酶解2.5h，而后煮沸3min，使酶失活。
[0072](4)加乙醇，使乙醇终浓度达5体积％，加热浸提。茶叶渣再用终浓度为5体积％的乙醇溶液浸提2次。提取条件为:温度73°C，每次2h。合并3次提取液，提取液过滤，离心，取上清液，减压蒸发，提取量为9.821mg/g。
[0073](5)上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏缓慢滴加到D-101大孔吸附树脂，调pH7.0，加样至柱体1/3处，加入3倍柱体积蒸馏水冲洗。
[0074](6)选用4倍柱体积的50%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
[0075]实施例8
[0076](I)取茶叶 Camellia sinensis (L.) 0.Kuntze 禮:500g,粉碎。
[0077](2)加入4倍量的蒸馏水，浸泡I小时，加入纤维素酶1.0g。
[0078](3) HCl调ρΗ5.6，温度50°C酶解2.5h，，而后煮沸3min，使酶失活。
[0079](4)加乙醇，使乙醇终浓度达5体积％，加热浸提。茶叶渣再用终浓度为5体积％的乙醇溶液浸提2次。提取条件为:温度77°C，每次2h。合并3次提取液，提取液过滤，离心，取上清液，减压蒸发，提取量为9.056mg/g。
[0080](5)上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏缓慢滴加到AB-8大孔吸附树脂，调pH8.0，加样至柱体1/3处，加入3倍柱体积蒸馏水冲洗。
[0081](6)选用4倍柱体积的55%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
[0082]实施例9
[0083](I)取茶叶 Camellia sinensis (L.) 0.Kuntze 禮:500g,粉碎。
[0084](2)加入4倍量的蒸馏水，浸泡I小时，加入纤维素酶3g、果胶酶1.5g、木聚糖酶IOmg0
[0085](3) HCl调ρΗ6.0，温度为55°C酶解2h，而后煮沸2min，使酶失活。[0086](4)加乙醇，使乙醇终浓度达5体积％，加热浸提。茶叶渣再用终浓度为5体积％的乙醇溶液浸提2次。提取条件为:温度80°C，每次2h。合并3次提取液，提取液过滤，离心，取上清液，减压蒸发，提取量为14.210mg/g。
[0087](5)上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏缓慢滴加到X-5大孔吸附树脂,调pH7.0，加样至柱体1/3处，加入3倍柱体积蒸馏水冲洗。
[0088](6)选用4倍柱体积的60%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
[0089]实施例10
[0090](I)取茶叶 Camellia sinensis (L.) 0.Kuntze 禮:500g,粉碎。
[0091](2)加入5倍量的蒸馏水，浸泡I小时，加入纤维素酶2g、果胶酶l.0g、木聚糖酶8mg。
[0092](3) HCl调ρΗ6.0，温度55°C酶解3h，而后煮沸2min，使酶失活。
[0093](4)加乙醇，使乙醇终浓度达5体积％，加热浸提。茶叶渣再用终浓度为5体积％的乙醇溶液浸提2次。提取条件为:温度80°C，每次2h。合并3次提取液，提取液过滤，离心，取上清液，减压蒸发，提取量为11.527mg/g。
[0094]((5)上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏缓慢滴加到LX-60大孔吸附树脂，调pH7.5，加样至柱体1/3处，加入3倍柱体积蒸馏水冲洗。
[0095](6)选用4倍柱体积的70%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
[0096]实施例11
[0097](I)取茶叶 Camellia sinen`sis (L.) 0.Kuntze 禮:500g,粉碎。
[0098](2)加入5倍量的蒸馏水，浸泡I小时，加入纤维素酶1.8g、果胶酶1.2g、木聚糖酶6mg。
[0099](3) HCl调ρΗ6.5，温度60°C，酶解4h，而后煮沸2min，酶失活。
[0100](4)加乙醇，使乙醇终浓度达5体积％，加热浸提。茶叶渣再用终浓度为5体积％的乙醇溶液浸提2次。提取条件为:温度80°C，每次2h。合并3次提取液，提取液过滤，离心，取上清液，减压蒸发，提取量为10.454mg/g。
[0101](5)上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏缓慢滴加到X-5大孔吸附树脂,调pH7.0，加样至柱体1/3处，加入3倍柱体积蒸馏水冲洗。
[0102](6)选用4倍柱体积的65%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
[0103]实施例12
[0104](I)取茶叶 Camellia sinensis (L.) 0.Kuntze 禮:500g,粉碎。
[0105](2)加入4倍量的蒸馏水，浸泡I小时，加入纤维素酶0.8g、果胶酶0.4g、木聚糖酶IOmg0
[0106](3) HCl调pH为5.5，温度为55°C酶解5h，而后煮沸3min，酶失活。
[0107](4)加乙醇，使乙醇终浓度达5体积％，加热浸提。茶叶渣再用终浓度为5体积％的乙醇溶液浸提2次。提取条件为:温度70°C，每次lh。合并3次提取液，提取液过滤，离心，取上清液，减压蒸发，提取量为10.836mg/g。
[0108](5)上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏缓慢滴加到LX-60大孔吸附树脂，调Ph8.0，加样至柱体1/3处，加入3倍柱体积蒸馏水冲洗。
[0109](6)选用4倍柱体积的50%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。[0110]实施例13
[0111](I)取茶叶 Camellia sinensis (L.) 0.Kuntze 禮:500g,粉碎。
[0112](2)加入3倍量的蒸馏水，浸泡I小时，加入纤维素酶2.5g，果胶酶l.0g。
[0113](3) HCl调pH为5.6，温度为50°C酶解2.5h，而后煮沸3min，使酶失活。
[0114](4)加乙醇，使乙醇终浓度达5体积％，加热浸提。茶叶渣再用终浓度为5体积％的乙醇溶液浸提2次。提取条件为:温度73°C，每次2h。合并3次提取液，提取液过滤，离心，取上清液，减压蒸发，提取量为10.06mg/g。
[0115](5)上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏缓慢滴加到D-101大孔吸附树脂，调pH7.0，加样至柱体1/3处，加入3倍柱体积蒸馏水冲洗。
[0116](6)选用4倍柱体积的50%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
[0117]实施例14茶多酚的含量检测
[0118](一)标准品的配制:茶多酚含量测定按GB/T8313—2002《茶:茶多酚的测定》进行。准确称取标准品茶多酚5mg，加蒸馏水定容至25ml，混匀，分别吸取茶多酚标准溶液1.0ml、
2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml于25ml容量瓶中，各加蒸馏水5ml，酒石酸亚铁溶液5ml，最后加入PH7.5的磷酸缓冲液至刻度，摇匀。利用空白的试剂作参照，用紫外分光光度计于539nm处测定吸光度。
[0119](二)样品(洗脱液)测定:准确吸取浸提液(洗脱液)0.2mL，加水至5mL至25mL容量瓶，加酒石酸亚铁5mL，充分混合，加pH7.5磷酸盐缓冲液至刻度，用IOmm比色杯，用紫外-可见分光光度计在波长539n m处，以试剂空白溶液做参比，测定吸光度，计算茶多酚提
取率和含量。
[0120]各实施例茶多酚提取率和各洗脱液的含量
【权利要求】
1.一种复合酶法自茶叶渣中提取茶多酚的方法，其特征在于，该方法的步骤包括: a、预处理:先将茶叶渣粉碎，将茶叶渣和水按重量比1:3-7混合，浸泡0.5-1小时； b、复合酶解:向上述预处理液中，按茶叶渣重量的0.32%-1.16%加入复合酶，该复合酶为纤维素酶8-30重量份、果胶酶4-20重量份和木聚糖酶0.004-0.008重量份；用HCl调pH为5.0-6.5，温度为50°C _60°C时酶解2_4小时，而后煮沸2_4min，使酶失活； C、乙醇浸取:使用5-10体积％乙醇对步骤b酶解后的混合物加热浸提，浸提温度750C -80°C，将提取液离心，取上清液； d、分离、提纯:将步骤c获得的上清液减压浓缩，得浸膏，加水至浸膏完全溶解，将上述浸膏液缓慢滴加到大孔吸附树脂，用50-70体积％乙醇作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b中纤维素酶为60万U/g、果胶酶为80万U/g和木聚糖酶为4.2万U/g。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤c的具体操作为:向步骤b酶解后的混合物中加入无水乙醇，使乙醇终浓度达5-10体积％，加热至75°C _80°C浸提l_2h ;过滤后的茶渣再用5-10体积％的乙醇浸提2次，每次所加5%-10%的乙醇为茶渣干重的5~10倍，浸提温度75°C -80°C，每次浸提l_2h，合并3次提取液，将提取液离心，取上清液。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤d中大孔吸附树脂为D-101、AB-8、X-5、LX-60、DM-130中的一种或几种，大孔吸附树脂中pH5.0-8.0。
5.如权利要求1-4中任一项所述的的方法，其特征在于，所述步骤b中复合酶中纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶添加量为重量比1500:1000:8。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤c中5-10体积％乙醇的浸提条件为，浸提温度80°C，每次浸提2h。
【文档编号】A61P3/06GK103655928SQ201310610964
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月26日 优先权日:2013年11月26日
【发明者】葛喜珍, 林强, 田平芳 申请人:北京联合大学生物化学工程学院