具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料及制法
【专利摘要】一种具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料，其内部呈并行排列的纵向通道，各通道之间相互交通，通过下述方法得到：透明质酸的水溶液与左旋多聚赖氨酸混匀后加入己二酸二酰肼搅拌，加酸调pH值为4-5，再加入碳二亚胺酸盐搅拌至凝胶，加碱调pH值为中性后将流体注入模具，浸入液氮中冷冻，冷冻干燥成型得到具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料。本发明通过模具结合液氮梯度冷冻法制备的支架材料可有效减轻脊髓损伤后胶质瘢痕形成并引导神经纤维生长。
【专利说明】具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料及制法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料。
[0002]本发明还涉及一种制备上述具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料的方法。
[0003]本发明还涉及上述具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料在脊髓损伤修复方面的应用。
【背景技术】
[0004]应用组织工程技术修复中枢神经系统损伤特别是脊髓损伤具有明显优势。通过在体外构建生物支架材料并植入脊髓损伤区，不仅可以有效地填补、桥接缺损，还能支持细胞长期存活，持续发挥作用，同时还可以通过支架材料携带有益的神经营养因子、细胞因子等，对脊髓损伤进行多靶点治疗，从而大大地提高修复效果。
[0005]透明质酸(hyaluronic acid, HA)因其属于细胞外基质的主要成分,具有高粘弹性，良好的生物相容性、生物可降解性，无毒、无免疫原性等优势而应用广泛。大量研究表明，应用透明质酸水凝胶生物工程材料可有效改善包括脊髓损伤在内的中枢神经系统损伤后局部微环境，从而不同程度地修复损伤。研究表明，将组织工程材料塑造成定向通道结构更有利于脊髓损伤的修复。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料。
`[0007]本发明的又一目的在于提供一种制备上述具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料的方法。
[0008]为实现上述目的，本发明提供的具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料，其内部呈并行排列的纵向通道，各通道之间相互交通，通过下述方法得到:
[0009]透明质酸的水溶液与左旋多聚赖氨酸混匀后加入己二酸二酰肼搅拌，加酸调pH值为4-5，再加入碳二亚胺酸盐搅拌至凝胶，加碱调pH值为中性后将流体注入模具，浸入液氮中冷冻，冷冻干燥成型得到具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料；
[0010]其中，透明质酸:多聚赖氨酸的质量比为4-6:1 ；
[0011]透明质酸:己二酸二酰肼的质量比为6-8:1。
[0012]所述具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料中，具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料的直径为3mm，可自由切割成不同形状；内部的纵向通道其通道孔径为 50 u m。
[0013]所述具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料中，加酸调pH值是用lmol/L的HCl，加碱调pH值是用lmol/L的NaOH溶液。
[0014]所述具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料中，流体注入模具后，模具上下端开放，周围以聚苯乙烯泡沫塑料包封以维持温度梯度，浸入液氮中冷冻30min;A -80°C冰箱预冻2小时后于冷冻真空干燥仪中干燥48小时成型。
[0015]本发明提供的制备上述具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料的方法，其过程是:
[0016]明质酸的水溶液与左旋多聚赖氨酸混匀后加入己二酸二酰肼搅拌，加酸调pH值为4-5，再加入碳二亚胺酸盐搅拌至凝胶，加碱调pH值为中性后将流体注入模具，浸入液氮中冷冻，冷冻干燥成型得到具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料；
[0017]其中，透明质酸:多聚赖氨酸的质量比为4-6:1 ；
[0018]透明质酸:己二酸二酰肼的质量比为6-8:1。
[0019]所述的方法中，加酸调pH值是用lmol/L的HCl，加碱调pH值是用lmol/L的NaOH溶液。
[0020]所述的方法中，流体注入模具后，模具上下端开放，周围以聚苯乙烯泡沫塑料包封以维持温度梯度，浸入液氮中冷冻30min ；A _80°C冰箱预冻2小时后于冷冻真空干燥仪中干燥48小时成型。
[0021]本发明通过模具结合液氮梯度冷冻法制备的具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料，在体外、体内均保持定向通道结构，体内移植后可有效减轻脊髓损伤后胶质瘢痕形成并引导神经纤维生长。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1是本发明制备的普通HA水凝胶支架材料大体形态(A)和扫描电镜图像(B)。
[0023]图2是本发明制备具有定向通道的HA材料的模具。
[0024]图3是本发明制备的具有定向通道的HA水凝胶支架材料大体形态(A)、纵切面扫描电镜图像(B)以及横切面扫描电镜图像(C)。
[0025]图4是本发明制备的具有定向通道的HA水凝胶支架材料浸水24小时后的大体形态(A)和吸水率测定(B)。
[0026]图5是本发明制备的具有定向通道的HA水凝胶支架材料移植于大鼠脊髓胸段背侧半切模型的手术操作图片，其中A是大鼠脊髓T9-10 ;B是脊髓背侧半切模型；(:是材料植入。
[0027]图6是动物存活4周后大体标本及HE染色图片，其中A和Al是模型对照组；B和BI是材料植入组。
[0028]图7是模型组，HA支架植入后4周GFAP表达情况，其中A是模型组；B是支架植入组。
[0029]图8是模型组，HA支架植入后8周NF阳性纤维生长情况，其中A是模型组；B是支架植入组。
【具体实施方式】
[0030]本发明应用模具结合液氮梯度冷冻法制备具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料。本发明的支架材料大体直径3mm，硬度适中，可自由切割成不同形状；材料内部呈并行排列的纵向通道， 通道孔径约50 ym，孔道之间相互交通；浸水后材料发生溶胀，但形状保持圆柱状；将上述材料植入大鼠脊髓胸9-10段(T9-10)背侧半切损伤模型，观察发现此支架材料和组织整合良好，在体内保持纵向通道结构，材料植入组损伤边界胶质瘢痕减轻，神经纤维长入材料内部。
[0031]本发明制备的具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料，在体外、体内均保持定向通道结构，体内移植后可有效减轻脊髓损伤后胶质瘢痕形成并引导神经纤维生长，可应用于脊髓损伤修复治疗，有效改善脊髓损伤预后。
[0032]本发明的制备方法，是先将HA和PLL在EDC介导下用ADH进行交联的方法制备成具有疏松多孔状结构的水凝胶，再通过模具结合液氮梯度冷冻法最终获得可用于脊髓损伤修复的具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料。
[0033]具体地,其主要步骤为:
[0034]I)取透明质酸纳(HA) 0.20g，加去离子水20ml，配成I %的透明质酸溶液，充分搅拌均匀；加入左旋多聚赖氨酸(PLL) 0.04g (HA:PLL=5:1),混匀后加入己二酸二酰肼(八腿)1.48(40!1:拟=7:1)，充分搅拌；逐滴加入111101/1 HCl (约3ml)直至pH值达到4~5 ;再加入碳二亚胺酸盐(EDC)0.4g，充分搅拌10min~20min，溶液渐变为凝胶；用lmol/LNaOH调pH值为7。
[0035]2)将上述制备的流体注入公知的模具后，使模具上下端开放，周围以聚苯乙烯泡沫塑料包封以维持温度梯度，浸入液氮中冷冻30min ；λ _80°C冰箱预冻2小时后于冷冻真空干燥仪中干燥48小时成型。
[0036]以下结合附图和具体实施例对本发明作详细说明。
[0037]实施例1
[0038]普通透明质酸水凝胶材料制备
[0039]根据相关文献，取透明质酸纳(HA) 0.20g，加去离子水20ml，配成I %的透明质酸溶液，充分搅拌均匀；加入左旋多聚赖氨酸(PLL) 0.04g (HA:PLL=5:1)，混匀后加入己二酸二酰肼(ADH)1.4g(ADH:HA=7:l)，充分搅拌；逐滴加入lmol/L HCl (约3ml)直至pH值达到4~5 ;再加入碳二亚胺酸盐(EDC)0.4g，充分搅拌IOmin~20min，溶液渐变为凝胶；用lmol/L NaOH 调 pH 值为 7。
[0040]普通透明质酸水凝胶内部呈疏松多孔状结构，孔径50-100 μ m,相互连通，图1A显示了实施例1制备的普通HA水凝胶支架材料大体形态，图1B是实施例1制备的普通HA水凝胶支架材料的扫描电镜图像。
[0041]实施例2
[0042]应用模具结合液氮梯度冷冻法制备具体定向通道的HA水凝胶生物支架材料
[0043]将实施例1制备的水凝胶流体注入如图2所示的模具后，使模具上下端开放，周围以聚苯乙烯泡沫塑料包封以维持温度梯度，浸入液氮中冷冻30min ；Λ _80°C冰箱预冻2小时后于冷冻真空干燥仪中干燥48小时成型。
[0044]通过上述方法制备的具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料大体直径3mm，硬度适中，可自由切割成不同形状；材料内部呈并行排列的纵向通道，通道孔径约50 μ m,孔道之间相互交通。图3A显示了实施例2制备的具有定向通道的HA水凝胶支架材料大体形态；图3B显示了实施例2制备的具有定向通道的HA水凝胶支架材料的纵切面扫描电镜图像以及图3C显示了横切面扫描电镜图像。
[0045]浸水后HA水凝胶支架材料发生溶胀，但形状保持圆柱状，与普通材料相比，其吸水率进一步增大，表明其具有更大的孔隙率。图4A是实施例2的具有定向通道的HA水凝胶支架材料浸水24小时后的大体形态，图4B是其吸水率测定结果。
[0046]实施例3
[0047]制备的定向通道HA生物支架材料与脊髓组织相容性及体内形态
[0048]将实施例2中制备的材料植入大鼠T9-10脊髓背侧半切模型，单纯模型作为对照。图5所示是将实施例2的HA水凝胶支架材料移植于大鼠脊髓胸段背侧半切模型的手术操作图片，其中A是大鼠脊髓T9-10 ；B是脊髓背侧半切模型；C是材料植入后。
[0049]动物存活4周后大体观察发现材料与组织整合良好，HE染色材料在体内仍保持纵向通道结构，而模型组脊髓组织呈现较大缺损区。其结果如图6所示，其中A和Al是模型对照组；B和BI是材料植入组。
[0050]实施例4
[0051]材料植入减轻脊髓损伤边界胶质瘢痕形成
[0052]取实施例3中动物脊髓组织做冰冻切片并进行GFAP免疫荧光染色，可见材料植入组GFAP荧光强度较模型组显著降低，表明材料植入可有效减轻胶质瘢痕。图7所示是HA支架植入后4周GFAP表达情况，其中A是模型组；B是支架植入组。
[0053]实施例5
[0054]材料促进脊髓损伤后神经纤维再生
`[0055]将实施例2中制备所得支架材料植入大鼠T9-10脊髓背侧半切模型，单纯模型作为对照，动物存活8周后取脊髓组织做冰冻切片并进行NF免疫荧光染色，可见材料植入组NF阳性神经纤维长入材料内部，而模型组缺损区内则无NF阳性纤维，表明材料植入可促进神经纤维再生进入材料内部。图8所示是HA支架植入后8周NF阳性纤维生长情况，其中A是模型组；B是支架植入组。
【权利要求】
1.一种具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料，其内部呈并行排列的纵向通道，各通道之间相互交通，通过下述方法得到: 透明质酸的水溶液与左旋多聚赖氨酸混匀后加入己二酸二酰肼搅拌，加酸调PH值为4-5，再加入碳二亚胺酸盐搅拌至凝胶，加碱调pH值为中性后将流体注入模具，浸入液氮中冷冻，冷冻干燥成型得到具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料； 其中，透明质酸:多聚赖氨酸的质量比为4-6:1 ; 透明质酸:己二酸二酰肼的质量比为6-8:1。
2.根据权利要求1所述具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料，其中，具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料的直径为3_，可自由切割成不同形状；内部的纵向通道其通道孔径为50iim。
3.根据权利要求1所述具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料，其中，加酸调pH值是用lmol/L的HCl，加碱调pH值是用lmol/L的NaOH溶液。
4.根据权利要求1所述具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料，其中，流体注入模具后，模具上下端开放，周围以聚苯乙烯泡沫塑料包封以维持温度梯度，浸入液氮中冷冻30min ；A _80°C冰箱预冻2小时后于冷冻真空干燥仪中干燥48小时成型。
5.制备权利要求1所述具有定向通道 的透明质酸水凝胶生物支架材料的方法，其过程是: 明质酸的水溶液与左旋多聚赖氨酸混匀后加入己二酸二酰肼搅拌，加酸调PH值为4-5，再加入碳二亚胺酸盐搅拌至凝胶，加碱调pH值为中性后将流体注入模具，浸入液氮中冷冻，冷冻干燥成型得到具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料； 其中，透明质酸:多聚赖氨酸的质量比为4-6:1 ; 透明质酸:己二酸二酰肼的质量比为6-8:1。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，加酸调pH值是用lmol/L的HCl，加碱调pH值是用lmol/L的NaOH溶液。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，流体注入模具后，模具上下端开放，周围以聚苯乙烯泡沫塑料包封以维持温度梯度，浸入液氮中冷冻30min ；A _80°C冰箱预冻2小时后于冷冻真空干燥仪中干燥48小时成型。
8.权利要求1所述具有定向通道的透明质酸水凝胶生物支架材料在脊髓损伤修复方面的应用。
【文档编号】A61L27/18GK103638553SQ201310616025
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月27日 优先权日:2013年11月27日
【发明者】文玉军, 徐群渊, 王颖, 巨荣凯, 魏岳腾 申请人:首都医科大学