一种靶向治疗肝癌的复合磁性纳米粒及制备方法
【专利摘要】本发明是一种靶向治疗肝癌的复合磁性纳米粒及制备方法，该方法是分别制备重组真核表达质粒p[HRE]AFP-p53和聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁纳米磁粒，再将聚乙烯亚胺修饰的纳米磁粒与质粒p[HRE]AFP-p53按照质量比为2：1至16：1混匀，孵育30分钟，即获得p[HRE]AFP-p53/聚乙烯亚胺四氧化三铁磁性纳米粒复合物。本发明制得的复合物用于肝癌靶向基因治疗与磁流体热疗的联合，在体内外治疗试验中，均获得了具有肝癌特异性的治疗效果。
【专利说明】一种靶向治疗肝癌的复合磁性纳米粒及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，具体涉及一种靶向治疗肝癌的复合磁性纳米粒及其制备方法。
【背景技术】
[0002]肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是常见的恶性肿瘤,每年全世界发病率为5.5-14.9/10万人，有60-100万人死于肝细胞癌，我国是肝细胞癌发病率最闻的国家，每年发病率超过30.3/10万人。肝细胞癌侵袭性强、发病隐匿，大部分患者(80%)不能手术切除，仅能依赖化疗、放疗等治疗方法，而肝细胞癌对很多传统的化疗药物都有耐药性，且肝脏放射耐受量低，治疗效果有限。因此人们逐渐把更多的目光投向肿瘤的第四种治疗模式:生物治疗。生物治疗包括免疫治疗和基因治疗，其中基因疗法被认为有希望能从根源上治愈肿瘤，在肿瘤治疗方面显示出良好的前景。
[0003]常用的治疗基因包括抑癌基因、自杀基因和反义基因。抑癌基因是与肿瘤相关性最强的基因，超过50%的人类恶性肿瘤和60%的肝细胞癌中都存在的突变，选用野生型作为治疗基因，能调节细胞周期，修复DNA，诱导细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成，控制肿瘤转移，还有研究显不基因治疗可以提闻肿瘤组织对热疗、化疗和放疗的敏感性。但是目前基因治疗还不能在临床广泛开展，限制其应用的瓶颈在于其安全性问题，尤其是基因表达不可控制性所引起的正常细胞损伤，通过对基因的表达进行调控，提高基因治疗的靶向性，能最小程度的减少其治疗的毒性和副作用。
[0004]利用肿瘤细胞的特异性启动子，在转录水平实现基因表达的调控，可使治疗基因仅在靶细胞内表达，从而保护基因治疗中正常的组织和细胞不受损伤。使用AFP(alpha-fetoprotein)基因启动子能祀向AFP阳性的肝细胞癌,但J/7/7启动子较弱，介导的治疗体系很难达到理想的治疗效果，且在AFP阴性以及低AFP表达的HCC细胞中仅能介导痕量的基因表达。经研究发现，启动子的表达活性在大程度上依赖于其上游增强子的作用，若将来源于血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)基因的乏氧反应序列(及responsive作为增强子与启动子5’端融合，于乏氧诱导的条件下，在高AFP和低AFP产生的HCC细胞内都能高效的表达。由于肿瘤组织生长速度远远快于新生血管的速度，瘤体内缺乏血供，人类实体肿瘤包括肝癌中都不同程度的存在乏氧环境，而对于正常细胞，如代表肝脏恢复和储备能力的肝干细胞以及肝脏的基质细胞，即使有微弱的AFP表达，由于不存在乏氧环境，他7?及启动子介导的治疗体系对它们没有细胞毒性，可以在很大程度上保留肝脏的修复和储备能力。
[0005]目前将治疗基因导入体内的运载体包括两类:病毒载体和非病毒载体。病毒载体转运效率高，但是存在不够安全(如产生免疫原性、可能致宿主基因突变等)，携带基因量有限，载体功能单一等不足之处。
【发明内容】
[0006]技术问题:本发明提供了一种得到用于肝癌的体内外治疗，具有肝癌特异性的治疗效果的靶向治疗肝癌的复合磁性纳米粒的制备方法。
[0007]技术方案:本发明的靶向治疗肝癌的复合磁性纳米粒的制备方法，包括下述步骤:
(1)质粒p[HRE]AFP-p53的制备:将甲胎蛋白启动子序列插入质粒P⑶NA3.1的Mlu1-HindIII质粒限制性内切酶位点，得到质粒p⑶NA3.1-AFP ;将5个连续的乏氧反应序列元件插入质粒pCDNA3.1-AFP的质粒限制性内切酶MluI位点，得到质粒pCDNA3.1-HRE-AFP ;将野生型p53片段亚克隆至质粒pCDNA3.1-HRE-AFP的质粒限制性内切酶 EcoR 1-Xho I 位点，得到质粒 p[HRE]AFP-p53 ;
(2)制备复合磁性纳米粒:将质粒p[HRE]AFP-p53和聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒分别用无血清培养基稀释，然后将两者按照磁性纳米粒与P[HRE]AFP-p53质量比为2:1至16:1混和均匀，孵育后即获得靶向治疗肝癌的复合磁性纳米粒。 [0008]本发明方法的一个优选方案的步骤(2)中，磁性纳米粒与p[HRE]AFP_p53质量比为 8:1。
[0009]本发明的靶向治疗肝癌的复合磁性纳米粒，是按照上述方法制备得到。
[0010]有益效果:本发明与现有技术相比，具有以下优点:
试验证实，在本发明中，受到甲胎蛋白启动子介导和乏氧反应序列增强的P53蛋白仅仅局限在肝癌细胞内表达，所以对人体正常细胞和组织不会产生毒副作用，与其它的基因治疗方案相比，本发明的安全性和可控性极大提高。与其它靶向治疗方案相比，本发明不仅可以靶向原发肝细胞癌的病灶，对于原发性肝癌的转移灶也有靶向治疗作用。在本发明中，使用的基因载体是磁性四氧化三铁纳米粒，相比较于常用的病毒载体，纳米载体具有很有优势:其一，安全性高，可反复注射而不产生抗原性，不会导致细胞的转化。第二，携带基因数量多，对非增殖期的细胞也能有效转染，能与其他功能性材料相复合。第三。研究表明磁性纳米颗粒制备简单，生物相容性好，转染效率高，易于表面修饰，能在交变磁场中可控升温，可用于肿瘤的磁流体热疗。并且，随着纳米生物技术的发展，纳米粒子作为探针和造影剂被用于肿瘤的分子成像，可以在很大程度上提高肿瘤显像的灵敏度，对肿瘤的早期诊断具有重大的意义。因此，同时具备成像和基因转运功能的纳米粒子将能实现肿瘤的诊断和治疗相结合。此外，本发明可以在一个系统内实现靶向基因治疗与肿瘤磁流体热疗的结合。体内外试验数据显示，相对于单一治疗，肿瘤的磁流体热疗联合靶向基因治疗具有最大的肿瘤抑制率，取得的治疗效果要远远优于单一疗法。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1是肝癌靶向复合磁性纳米颗粒介导肝细胞癌选择性的细胞毒效应示意图； 图中，HepG2 (产甲胎蛋白)和SMMC7721 (不产甲胎蛋白)是肝癌细胞系。Lovo (肠
癌细胞)和L929 (成纤维细胞)是非肝癌细胞系。所有的细胞系的细胞经复合磁性纳米粒转染后72小时后，计算细胞相对增值率(RPR %)。
[0012]图2是体内抑瘤试验的分组效果图；
图中，每个治疗组的瘤块质量以mean 土 SD (n=5)的形式表示，*治疗组相对阴性对照组 p〈0.001。[0013]图3是体内移植瘤经热疗联合基因治疗后细胞的超微结构TEM图；
图中可见细胞中染色质聚集,边聚,典型的凋亡小体形成。
【具体实施方式】
[0014]下面通过实施例对本发明做进一步具体说明。
[0015]本发明用于肝细胞癌的靶向基因治疗与热疗的联合治疗，在具体实施例中，不论是体外细胞试验还是体内肿瘤抑制试验的数据，都证明了该靶向肝癌的磁性纳米粒具有对肝癌组织和细胞的特异性抑制作用，同时结合磁流体热疗，具有协同治疗效果，肿瘤抑制率优于单一治疗方法。
[0016]实施例1:
1.复合磁性纳米粒的制备
(I)质粒p[HRE]AFP-p53的制备:p[HRE]AFP_p53为一种重组真核表达质粒的命名，其中HRE是指代乏氧反应序列元件，在质粒表达中起到增强子的作用，AFP是指代甲胎蛋白启动子，作用是介导下游的抑癌基因P53 (—种基因的名称)仅能在肝癌细胞内表达。甲胎蛋白启动子序列通过碱基合成法制备，合成的序列两端分别含有质粒限制性内切酶MluI (MluI是内切酶的名称，以下相同)和HindIII位点，分别将真核表达质粒p⑶NA3.1(PCDNA3.1是一个常用的基因克隆质粒的名称，最早由西方生物公司合成并应用，目前尚没有对应的中文名称)和甲胎蛋白启动子片段用内切酶Mlu1-HindIII双酶切后，纯化的片段用质粒连接酶连接，既将甲胎蛋白启动子序列插入质粒P⑶NA3.1的Mlu1-HindIII质粒限制性内切酶位点，替换原有的启动子，得到质粒pCDNA3.1-AFP ;含有5个连续的乏氧反应序列元件也采用碱基合成法合成，两端均有质粒限制性内切酶MluI的酶切位点，将其和质粒P⑶NA3.1-AFP均用MluI酶切后，纯化片段用质粒连接酶连接，即将5个连续的乏氧反应序列元件插入质粒pCDNA3.1-AFP的质粒限制性内切酶MluI位点，得到质粒pCDNA3.1-HRE-AFP ;将野生型p53片段亚克隆至质粒pCDNA3.1-HRE-AFP的质粒限制性内切酶EcoR 1-Xho I位点，得到质粒p[HRE]AFP-p53，经酶切鉴定及测序分析，合成质粒序列正确。
[0017](2)聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁纳米磁粒的制备:用化学共沉淀法制备四氧化三铁磁性纳米颗粒:在氮气保护下，于250毫升容积的三口烧瓶中将氯化亚铁(1.0摩尔每升)和氯化铁(1.0摩尔每升)以摩尔比5:3的比例溶于150毫升纯水，300转/分边搅拌边加入氨水调整溶液PH值至9.5±0.1，50°C反应30分钟后得到磁性四氧化三铁纳米粒，磁分离，水洗至PH为7.0，真空冷冻干燥。0.5克磁性纳米颗粒溶于50ml纯水中，超声分散60分钟后，逐滴滴入2ml体积比为20%的聚乙烯亚胺水溶液，得到聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁纳米磁粒。
[0018](3)制备复合磁性纳米粒:将质粒p[HRE]AFP_p53和聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒分别用无血清培养基稀释，然后将两者按照磁性纳米粒与P[HRE]AFP-p53质量比为8:1混和均匀，孵育后即获得靶向治疗肝癌的复合磁性纳米粒。
[0019]2.纳米材料的表征:
磁性纳米材料用透射电镜(SEM，HITACH1-600)和扫描电镜(SEM，JE0LJSM-6360LV)观察形貌、粒径、分散性； 扫描电镜能谱仪(SEM-EDS，GENESIS2000XMS60)对材料成分进行分析；用傅立叶红外光谱分析仪(FTIR，Nicolet 560)分析表面官能团的变化；用X射线衍射仪(ARL-X’ TRA)分析样品的晶体结构；结果显示磁性纳米粒构建成功。
[0020]3.纳米粒子DNA结合能力的检测:将纳米粒子与质粒DNA按O:1，3:1，5:1，10:1的质量比混合，终体积50 μ 1，质粒浓度恒定在0.01 Ug/μ I,室温静置结合30分钟后，用琼脂糖凝胶电泳检测结合情况，以未加材料的等浓度质粒作为对照，若材料与质粒充分结合将能阻止质粒电泳，即电泳抑制试验阳性。结果显示，在纳米粒子与质粒DNA质量比高于2:1之后,质粒电泳均被抑制,表明以高于纳米粒子和质粒质量比2:1的比例混合时，质粒均能被纳米粒子完全结合。 [0021]4.体外热动力学试验:将测试材料用生理盐水配置成浓度为1.0mg/mL的磁流体溶液，各取5ml加入直径25mm的平底试管中，置于230kHZ，30A的SPG-06A高频磁感应加热设备平板线圈上加热lh，起始室温25°C，试管底距线圈中心0.5cm，每5分钟用TM902C数字测温器测温一次，绘制磁流体的升温曲线图。实验结果显示，前30分钟，温度上升速度很快，30分钟时达到42摄氏度，然后在接下来的30分钟内，温度仅有缓慢上升，稳定在44摄氏度左右，显示出磁性纳米粒子在交变磁场中升温的可控性，用于体内肿瘤热疗时，可以达到有效温度，且不会过度加温伤害正常组织。
[0022]5.体外靶向肝癌的治疗试验:
选用肝癌细胞系H印G2 (产甲胎蛋白)和SMMC7721 (不产甲胎蛋白)。非肝癌细胞系Lovo (肠癌细胞)和L929 (成纤维细胞)进行试验。所有的细胞系的细胞经复合磁性纳米粒转染后72小时后，计算细胞相对增值率(RPR %)。试验结果显示，该复合磁性纳米粒仅对肝癌细胞H印G2和SMMC7721的增殖有抑制作用，且该抑制作用可以被乏氧培养诱导增强，而对非肝癌细胞没有显示出明显的抑制作用。该试验显示出复合磁性纳米粒对肝癌的治疗效果是具有靶向性的。
[0023]6.体外联合治疗试验:
将H印G2细胞分为阴性对照组，单独热疗组，单独基因治疗组，热疗联合基因治疗组，阴性对照组的细胞不采用任何操作，各处理组细胞MTT吸光度和对照组的比值为增值率，并用流式细胞检测凋亡细胞率，与空白对照组相比较。体外靶向试验结果显示，热疗联合基因治疗组细胞增殖抑制率为76.11%，单独热疗组为35.22%，单独基因治疗组为50.18%。联合治疗组在体外试验中显示出良好的协同效应。
[0024]7.荷瘤模型动物的建立:
取培养的HepG2细胞，经计数后调整浓度为6.0X IO6细胞/ml，裸鼠称重后，皮下注射细胞培养液0.2ml，所有裸鼠在SPF条件下的层流架中饲养。试验后观察动物存活量和生理状态。
[0025]8.体内基因治疗联合热疗:
荷瘤动物手术两周后按体外试验分组，分为阴性对照组，单独热疗组，单独基因治疗组，热疗联合基因治疗组，每组5只裸鼠，治疗后6周，各组动物活杀，剥离瘤体称重，取平均值。结果显示，联合治疗组对肿瘤生长抑制率为85.18%，单独基因治疗组抑制率为42.85%，单独热疗组抑制率为46.93%。体内试验的结果与体外试验结果相符合。
实施例2:
基本步骤和流程同实施例1，不同之处在于，制备复合磁性纳米粒时:将质粒p[HRE]AFP-p53和聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒分别用无血清培养基稀释，然后将两者按照磁性纳米粒与P[HRE]AFP-p53质量比为2:1混和均匀，孵育后即获得靶向治疗肝癌的复合磁性纳米粒。
[0026]其余实施部分与实施例1相同。
[0027]实施例3:
基本步骤和流程同实施例1，不同之处在于，制备复合磁性纳米粒时:将质粒p[HRE]AFP-p53和聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒分别用无血清培养基稀释，然后将两者按照磁性纳米粒与P[HRE]AFP-p53质量比为16:1混和均匀，孵育后即获得靶向治疗肝癌的复合磁性纳米粒。
[0028]其余实施部分与实施例1相同。
【权利要求】
1.一种靶向治疗肝癌的复合磁性纳米粒的制备方法，其特征在于，该方法包括下述步骤: (1)质粒p[HRE]AFP-p53的制备:将甲胎蛋白启动子序列插入质粒P⑶NA3.1的Mlu1-HindIII质粒限制性内切酶位点，得到质粒p⑶NA3.1-AFP ;将5个连续的乏氧反应序列元件插入质粒pCDNA3.1-AFP的质粒限制性内切酶MluI位点，得到质粒pCDNA3.1-HRE-AFP ;将野生型p53片段亚克隆至质粒pCDNA3.1-HRE-AFP的质粒限制性内切酶 EcoR 1-Xho I 位点，得到质粒 p[HRE]AFP-p53 ; (2)制备复合磁性纳米粒:将质粒p[HRE]AFP-p53和聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒分别用无血清培养基稀释，然后将两者按照磁性纳米粒与P[HRE]AFP-p53质量比为2:1至16:1混和均匀，孵育后即获得靶向治疗肝癌的复合磁性纳米粒。
2.根据权利要求1所述的靶向治疗肝癌的复合磁性纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，磁性纳米粒与p[HRE]AFP-p53质量比为8:1。
3.—种靶向治疗肝癌的复合磁性纳米粒，其特征在于，该方法复合磁性纳米粒是按照权利要求1或2所述方法制备得到。
【文档编号】A61K48/00GK103611168SQ201310626550
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年12月2日 优先权日:2013年12月2日
【发明者】张东生, 袁晨燕, 张皓 申请人:东南大学