盐酸异丙嗪在制备治疗或预防流感病毒感染药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了盐酸异丙嗪（PromethazineHydrochlorine）在制备预防或治疗流感病毒感染药物中的应用。首先检测了盐酸异丙嗪对MDCK细胞的毒性，结果显示盐酸异丙嗪的最大无毒性浓度为25.0μM。其次，在完全无毒性的浓度范围内测定了盐酸异丙嗪的抗病毒活性，结果显示这种小分子化合物具有显著的抗病毒活性，且抗病毒作用呈剂量依赖效应。最后，检测了盐酸异丙嗪对不同型和亚型的流感病毒的抗病毒活性，结果显示盐酸异丙嗪可以剂量依赖地抑制所有被检测流感病毒株的复制，表明盐酸异丙嗪的抗流感病毒活性具有广谱性。因此，本发明披露了盐酸异丙嗪是一种新型广谱抗流感病毒药物，可以用于制备预防或治疗流感病毒感染的药物。
【专利说明】盐酸异丙嗪在制备治疗或预防流感病毒感染药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及盐酸异丙嗪在制备治疗或预防流感病毒感染药物中的应用，属于医药【技术领域】。
【背景技术】
[0002]流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae),流感病毒属。根据病毒粒子核蛋白(NP)和基质蛋白(M)的抗原特性及基因特性的不同，流感病毒分为A、B、C三型，也称甲、乙、丙三型。A型流感病毒全基因组由8条大小不等的单股负链RNA组成，分别以节段I至节段8命名。病毒基因组全长约13.6吐，编码10种结构蛋白(？82、？81、？4、撤、册、嫩、皿1、M2、PB1-F2和NS2/NEP)和非结构蛋白(NS1)。根据病毒粒子表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同，A型流感病毒可进一步分为17个H(H1-H17)和10个N(Nl-NlO)亚型。人流感病毒主要是H1、H2和H3亚型。而目前危害严重的高致病性禽流感多为H5、H7和H9亚型，其中以H5N1亚型致死率最高。B型流感病毒常引起流感局部流行，不引起世界性流感大爆发，仅在人和海豹中发现。C型流感病毒多以散在形式存在，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流感流行，可感染人类和猪。
[0003]流感病毒的整个生活周期需要在细胞质和细胞核内完成。感染的起始是病毒颗粒表面的刺突HA识别和结合宿主细胞表面含唾液酸的受体。唾液酸与次末端半乳糖的连接键，决定了病毒的宿主特异性，该连接键在禽类中为α (2-3),在人类中为α (2_6)。病毒吸附细胞后，细胞通过网格蛋白受体介导的胞饮作用摄入病毒。在细胞内，网格蛋白分子解离，病毒与内涵体融合形成吞噬体，使得病毒粒子周围的PH值下降至5.0左右。在此pH条件下，病毒HA蛋白的构象发生变化，使位于轻链(HA2) N端的融合肽暴露，从而引起病毒囊膜与细胞膜融合。低PH环境也致使大量H+经由M2离子通道进入病毒粒子内部，导致Ml蛋白与vRNPs的解离。两者的共同结果致使病毒粒子的vRNPs释放到被感染细胞的胞浆。vRNPs随后转到细胞核内进行基因组的复制和转录，复制时病毒首先以自身RNA为模板合成互补RNA (cRNA)，然后以cRNA`为模板再合成vRNA。转录生成的mRNA由核内转移到胞浆，翻译出病毒的结构蛋白和非结构蛋白。一部分合成蛋白如NP需要重新转移到核内与新生成的vRNA组装成vRNP，vRNP出核后与其余的病毒蛋白开始组装成新的病毒粒子，新生成的子代病毒通过神经氨酸酶(NA)水解细胞表面的糖蛋白，释放N-乙酰神经氨酸，促使病毒粒子从出芽位点释放出来。病毒成熟的最后一步是HA在宿主蛋白酶的作用下裂解为HAl和HA2多肽，这样的病毒粒子才具有感染性，从而开始新一轮病毒的复制。
[0004]流感病毒自20世纪初发现以来已在全球范围内造成五次大流行，十年左右会产生一次暴发流行，在全球范围内造成了巨大的损失。流感流行每年可导致25万~50万例死亡，300万~500万重病例，全球约共有5~15%的人被感染。接种疫苗和使用抗病毒药物是应对流感大流行的重要手段，然而由于流感病毒抗原变异能力强，在大流行前基本上不可能大规模生产疫苗。目前，经美国食品和药物管理局(FDA)批准正式上市的抗流感病毒药物有两类:(1)以金刚烷胺和金刚乙胺为代表的M2离子通道阻断剂。此类药只对甲型流感病毒有预防和治疗作用，研究表明此类药物具有神经毒性等毒副作用，而且由于耐药株的普遍存在，所以CDC建议此类药物不再用于预防流感病毒感染。(2)神经氨酸酶抑制剂，此类药的代表是奥斯他韦和扎拉米韦。此类药物对所有已知的人流感病毒及高致病性禽流感病毒均有效。但是近年来关于奥斯他韦的耐药株却不断有报道。因此，研究并开发新型抗流感病毒药物有重要意义。
[0005]盐酸异丙嗪(Promethazinehydrochlorine),又名盐酸普鲁米近(PromethazineHydrochloride)或非那根(Phenergan),化学名为N, N, α -三甲基-10H-吩喔嚷-10-乙胺盐酸盐(N, N-dimethyl-1- (lOH-phenothiazin-lO-yl) propan-2-amine)。临床上作为一种吩噻嗪类抗组胺药，主要用于镇吐、抗晕动以及镇静催眠。其药理作用主要包括:(1)抗组胺作用，与组织释放的组胺竞争Hl受体，能拮抗组胺对胃肠道、气管、支气管或细支气管平滑肌的收缩或挛缩，解除组胺对支气管平滑肌的致痉和充血作用；(2)止吐作用，可能与抑制了延髓的催吐化学感受区有关；(3)抗晕动症:可能通过中枢性抗胆碱能，作用于前庭和呕吐中枢及中脑髓质感受器，主要是阻断前庭核区胆碱能突触迷路冲动的兴奋；(4)镇静催眠作用:可能由于间接降低了脑干网状上行激活系统的应激性。但到目前为止，并未发现任何关于盐酸异丙嗪抗流感病毒的相关报道。盐酸异丙嗪的结构式如下:
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[0006]本发明的目的在于弥补现有技术的不足，是在于提供了一种小分子化合物盐酸异丙嗪在制备治疗或预防流感病毒感染药物中的应用，从而为临床上流感的治疗提供一种安全有效的小分子化合物。盐酸异丙嗪在无毒性范围内能够有效地抑制流感病毒的复制，可进一步开发为治疗或预防流感病毒感染疾病的药物，具有广泛的应用前景。
[0007]为了实现上述的目的，本发明采用的技术方案是:
盐酸异丙嗪在制备治疗或预防流感病毒(甲型或乙型)感染药物中的应用，其步骤
是:
盐酸异丙嗪对MDCK细胞的毒性实验:犬肾细胞(MDCK)按8X IO3个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后，分别用0.8μΜ、1.6μΜ、3.125μΜ、6.25μΜ、12.5.μ Μ、25.0μΜ、50.ΟμΜ和100.ΟμΜ的盐酸异丙嗪进行处理，每组重复两个孔，置于37°C、5% CO2培养箱中培养48小时后，Alamarblue检测细胞的存活率。结果显示，盐酸异丙嗪对MDCK的CC50 (半数致死浓度)为65.2 μ M0
[0008]盐酸异丙嗪抗流感病毒活性的评价:将MDCK细胞按照1.5 X IO4细胞/孔接种于96细胞培养板中，37°C、5% CO2细胞培养箱中培养18-24h待细胞长成单层后，用IOOTCID5q/孔的流感病毒液(A/PuertoRico/8/34 (HlNl))感染细胞，同时加入各梯度浓度的药物至总体积共200 μ I的细胞维持液(DMEM+0.3%BSA+2.5 μ g/L胰酶)中，在细胞培养箱中于37°C培养48h后取各实验孔上清进行神经氨酸酶表达量的检测。结果显示盐酸异丙嗪能够剂量依赖地抑制流感病毒的复制，其EC5tl (半数有效浓度)为4.5 μ M。
[0009]盐酸异丙嗪抗流感病毒作用的广谱性分析:将MDCK细胞按照1.5Χ104细胞/孔接种于96细胞培养板中，37°C、5% CO2细胞培养箱中培养18-24h且长成单层后，用 IOOTCID5q/ 孔的流感病毒液(分别为 A/Human/Hubei/1/2009 (HlNl)，A/human/Hubei/3/2005(H3N2)，A/human/WSN/33/(H1N1, S3 IN)，A/Duck/Hubei/5/2010(H6N6)，A/Duck/Hubei/216/1983(H7N8)， A/Chicken/Jiangsu/1/2005(H9N2)， B/human/Hubei/1/2007)感染细胞，同时加入各梯度浓度的药物至总体积共200 μ I的细胞维持液(DMEM+0.3%BSA+2.5 μ g/L胰酶)中，在细胞培养箱中于37°C培养48h后取各实验孔上清进行神经氨酸酶表达量的检测。结果显示盐酸异丙嗪能够剂量依赖的抑制甲型流感亚型HlNl株、甲型流感病毒亚型H3N2株、甲型流感病毒亚型HlNl金刚烷胺耐药株、甲型流感病毒亚型H6N6株、甲型流感病毒亚型H7N8株、甲型流感病毒亚型H9N2株和乙型流感病毒的复制。
[0010]本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果:
1.盐酸异丙嗪是小分子化合物，其CC5tl (半数致死浓度)为65.2 μ M。盐酸异丙嗪能够剂量依赖的抑制流感病毒复制，其EC5tl (半数有效浓度)为4.5 μ Μ。选择指数(SI)约为14.5。而且盐酸异丙嗪已经在临床上有数十年的应用，安全性良好。这说明盐酸异丙嗪是安全有效的抗流感病毒的药物。
[0011]2.盐酸异丙嗪能够剂量依赖地抑制甲型流感亚型HlNl株、甲型流感病毒亚型Η3Ν2株、甲型流感病毒亚型HlNl金刚烷胺耐药株、甲型流感病毒亚型Η6Ν6株、甲型流感病毒亚型Η7Ν8株、甲型流感病毒亚型Η9Ν2株和乙型流感病毒的复制，具有非常广谱的抗流感病毒活性。
`[0012]3.利用现代常用药物制剂手段，可将盐酸异丙嗪作为活性成分制成片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂或注射剂等任何一种药学上可接受的剂型。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为盐酸异丙嗪化学结构式。
[0014]图2为盐酸异丙嗪细胞毒性检测示意图。
[0015]图3为盐酸异丙嗪处理剂量依赖抑制流感病毒复制水平示意图。
[0016]图4为盐酸异丙嗪抗流感病毒活性广谱性检测示意图:
图 4Α 为甲型流感病毒亚型 HlNl 株(A/Human/Hubei/1/2009 (HlNl))；
图 4B 为甲型流感病毒亚型 H3N2 株(A/human/Hubei/3/2005 (H3N2))；
图4C为甲型流感病毒亚型HlNl金刚烷胺耐药株(A/human/WSN/33/(H1N1，S3 IN))；
图 4D 为甲型流感病毒亚型 H6N6 株(A/Duck/Hubei/5/2010 (H6N6))；
图 4E 为甲型流感病毒亚型 H7N8 株(A/Duck/Hubei/216/1983 (H7N8))；
图 4F 为甲型流感病毒亚型 H9N2 株(A/Chicken/Jiangsu/1/2005 (H9N2))；
图 4G 为乙型流感病毒(B/human/Hubei/1/2007)。具体实施方案
[0017]为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本
【发明内容】
作进一步说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。
[0018]目前，抗流感病毒药物体外筛选模型分为细胞培养模型和病毒酶的无细胞系统筛选模型。酶反应筛选模型具有高通量的特点，但筛选的化合物仍需进行更多的细胞学、组织学和体内毒性、药效实验等以确定其效果。细胞培养模型是最常用的筛选模型，其优点在于:可提供大量遗传性状相同的细胞为研究对象，操作方便，可消除其它外界因素的影响，并可以检测药物的有效浓度和治疗指数，为后期机理研究提供更多基础。本发明采用MDCK细胞培养筛选法检测盐酸异丙嗪对流感病毒感染的影响，基于对上清中代表流感病毒复制水平的神经氨酸酶表达水平的检测，定量分析盐酸异丙嗪的抗流感病毒活性。
[0019]实施例1:盐酸异丙嗪抗流感病毒活性的评价
1.实验材料 1.1细胞、病毒和药物
MDCK细胞购自美国模式菌种保藏中心(ATCC);病毒株:A/PuertoRico/8/34 (HlNl)；药物:盐酸异丙嗪购于Sigma公司。
[0020]1.2实验仪器
多标记微孔板读取仪(Perkin Elmer)。
[0021]2.实验方法与结果
2.1细胞培养:37°C，5% CO2加湿培养箱中培养。使用含有10% FBSU00U/mL的青霉素和链霉素的DMEM培养基。细胞至90%汇合度后传代，传代比例1/3 - 1/4。
[0022]2.2病毒培养:取9~11日龄SPF鸡胚，接种病毒前用验蛋器检查，并在远离胚胎的位置标记，消毒并打孔后按0.2ml/枚接种24血凝效价的病毒液，用指甲油封口，置37°C恒温箱孵育48h (接种24h后死亡的鸡胚一般为操作不当致死，弃之)。取出鸡胚置4°C冷胚12h。75%酒精消毒鸡胚气室，无菌操作剪去气室外壳，毛细吸管吸取鸡胚尿囊液和羊水，3000rpm 4°C离心30min，检测血凝效价，200 μ I/管分装并置_70°C冻存备用。
[0023]2.3盐酸异丙嗪的细胞毒性检测:MDCK细胞按8 X IO3细胞/孔(体积100 μ I)接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用；用细胞维持液(DMEM+2%血清)将药物按照0.8μΜ、1.6μΜ、3.125μΜ、6.25 μ Μ、12.5.μ Μ、25.0 μ Μ、50.0 μ M 和 100.0 μ M 共 8 个梯度浓度配制，每个梯度浓度设2个复孔。培养48h后弃掉培养上清，于每孔中加入100 μ I含有10%Alamarblue试剂的新DMEM培养基，置细胞培养箱中继续培养lh，Ih后用微孔板读取仪分别测量荧光强度和吸光值，计算细胞存活率。
[0024]结果(图2)显示盐酸异丙嗪在50.0 μ M以下的浓度范围内对MDCK细胞完全没有细胞毒性。本实施例中盐酸异丙嗪细胞水平抗病毒实验的给药剂量范围为0.78~50.0 μ Μ，完全处在安全无毒性浓度范围。
[0025]2.4盐酸异丙嗪对流感病毒株A/PuertoRico/8/34 (HlNl)的抗病毒活性评价
2.4.1.实验原理:MUNANA (4-methylumbelliferyl- a -N-acety 1-neuraminate)是流感病毒神经氨酸酶的特异性底物，在神经氨酸酶作用下产生的催化产物在355nm激发光照射下，可以产生460nm荧光，荧光强度的强弱代表了病毒神经氨酸酶表达量的多少，反映了培养细胞上清中的病毒量。
[0026]2.4.2.将MDCK细胞按1.5 X IO4细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，37°C细胞培养箱中培养14~18h后，待细胞长成单层后备用。将孔板中培养基弃去，PBS液洗两遍，加IOOTCId50/孔(100 μ I)病毒液感染细胞，同时加入各梯度浓度的药物(以50.0 μ M为起始浓度，连续2倍梯度稀释7个梯度，每梯度两个复孔)至总体积为200 μ I的细胞维持培养液(DMEM+0.3 %BSA+2.5ug/L胰酶)中，于细胞培养箱中37°C培养48h后取各实验孔上清进行神经氨酸酶表达量的检测。实验设置空白对照组、阳性对照组(利巴韦林)、阴性对照组(病毒感染后无药物处理)和实验药物组。
[0027]2.4.3.黑色 96 孔微量板中加入 40 μ I 缓冲液(32.5mmol/L MES, pH 6.5,4mmol/L CaCl2)配制的底物20umol/L MUNANA，再加入各实验孔培养上清20 μ 1，37°C避光孵育60min，加入反应终止液(0.014μΜ NaOH, 83%乙醇)100 μ I/孔，微孔读板仪上测定荧光值(激发光波长355nm,发射光波长465nm)。
[0028]2.4.4.计算各检测孔中药物对流感病毒复制的抑制率
抑制率(％) =100-(样品孔-空白对照)/ (酶活对照-空白对照)* 100%
结果显示:盐酸异丙嗪明显抑制了流感病毒复制，并且呈剂量依赖关系(见图3)。
[0029]实施例2:盐酸异丙嗪抗流感病毒作用广谱性的评价
本实验检测盐酸异丙嗪对甲型流感亚型HlNl株、甲型流感病毒亚型H3N2株、甲型流感病毒亚型HlNl金刚烷胺耐药株、甲型流感病毒亚型H6N6株、甲型流感病毒亚型H7N8株、甲型流感病毒亚型H9N2株 和乙型流感病毒的抗病毒活性。
[0030]1.实验使用的病毒株包括:A/Human/Hubei/1/2009 (HlNl)，A/human/Hubei/3/2005(H3N2), A/human/WSN/33/(H1N1, S3IN)，A/Duck/Hubei/5/2010 (H6N6)，A/Duck/Hubei/216/1983(H7N8)， A/Chicken/Jiangsu/1/2005(H9N2)， B/human/Hubei/1/2007。
[0031]2.将MDCK细胞按1.5X IO4细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，37°C细胞培养箱中培养14~18h后，待细胞长成单层后备用。将孔板中培养基弃去，PBS液洗两遍，加IOOTCId50/孔(100 μ I)病毒液感染细胞，同时加入各梯度浓度的药物(以25.0 μ M为起始浓度，连续2倍梯度稀释6个梯度，每梯度两个复孔)至总体积为200 μ I维持培养液(DMEM+0.3%BSA+2.5ug/L胰酶)中，于细胞培养箱中37°C培养48h后取各实验孔上清进行神经氨酸酶表达量的检测。
[0032]3.黑色 96 孔微量板中加入 40μ I 缓冲液(32.5mmol/L MES，pH 6.5,4mmol/L CaCl2)配制的底物20umol/L MUNANA，再加入各实验孔培养上清20 μ 1，37°C避光孵育60min，加入反应终止液(0.014 μ M NaOH, 83%乙醇)100 μ I/孔，多功能检测仪上测定荧光值(激发光波长355nm,发射光波长465nm)。
[0033]4.计算各检测孔中药物对流感病毒复制的抑制效率
抑制率(％) =100-(样品孔-空白对照)/ (酶活对照-空白对照)* 100%
结果显示:盐酸异丙嗪呈剂量依赖地抑制了各种流感病毒毒株的复制(见图4)。
【权利要求】
1.盐酸异丙嗪在制备治疗或预防流感病毒感染药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于:所述的流感病毒为甲型流感病毒或乙型流感病毒。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于:所述的药物是盐酸异丙嗪作为药物活性成分，制成任何一种药学上可接受的剂型。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于:所述剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射液、缓释制剂、控释制剂或纳米制`剂等。
【文档编号】A61K31/5415GK103705522SQ201310667779
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】陈绪林, 安利伟 申请人:武汉威立得生物医药有限公司