与艰难梭菌细胞毒素b相互作用的蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种与艰难梭菌细胞毒素B相互作用的蛋白，其为硫酸软骨素蛋白多糖CSPG4，或由CSPG4蛋白N端640个氨基酸组成的多肽。本发明首次发现CSPG4具有艰难梭菌细胞毒素B细胞受体的功能，抑制CSPG4的表达或功能可显著降低艰难梭菌细胞毒素B的毒性，为治疗艰难梭菌感染提供了新思路。
【专利说明】与艰难梭菌细胞毒素B相互作用的蛋白
【技术领域】
[0001]本发明涉及蛋白质工程领域，具体地说，涉及一种与艰难梭菌细胞毒素B相互作用的蛋白。
【背景技术】
[0002]艰难梭 菌(Clostridium difficile)是一种厌氧的革兰氏阳性菌,最早发现于1935年，直到1978年发现该菌与临床长期使用某些抗生素(氨苄青霉素、头孢霉素、红霉素、氯林可霉素等)引起的伪膜性肠炎有关，从而逐渐受到重视。目前，科学界已经公认艰难梭菌感染是临床上抗生素相关性腹?写(antibiotic-associated diarrhoea, AAD)以及假膜性肠炎(pseudomenbranous colitis, PMC)的主要病因。在2013年美国疾病预防与控制中心发布的文件中(ANTIBIOTIC RESISTANCE THREATS in the United States, 2013)指出，仅在美国一地，每年有超过25万人被艰难梭菌感染，其中14000人因此死亡。每年因治疗艰难梭菌感染所需花费超过10亿美元。
[0003]艰难梭菌通过分泌两种外毒素，肠毒素A和细胞毒素B来实现其致病性。其中，毒素B被认为是艰难梭菌感染过程中所必须的外毒素(Lyras, 2009)。毒素B通过受体介导的内吞机制进入细胞(Florin，1983)，进一步通过糖基转移酶活性使细胞内的GTPase失去活性，从而使肠细胞失去细胞骨架，细胞形态发生变化，肠细胞功能出现异常，引发强烈的腹泻。
[0004]由于艰难梭菌具有很强的耐药性，目前尚无一种非常有效的方法治疗艰难梭菌感染(Rupnik，2009)。目前，对于艰难梭菌感染的细胞机制所知甚少，特别是毒素蛋白入胞机制，所应用的宿主受体蛋白尚不清楚。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种与艰难梭菌细胞毒素B相互作用的蛋白。
[0006]为了实现本发明目的，本发明的一种与艰难梭菌细胞毒素B相互作用的蛋白，其为硫酸软骨素蛋白多糖CSPG4，其氨基酸序列如SEQID N0.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0007]本发明的另一种与艰难梭菌细胞毒素B相互作用的多肽CSPG4N1-640，其由CSPG4蛋白N端640个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0008]本发明还提供一种抗艰难梭菌感染的药物，其有效成分为CSPG4或CSPG4N1-640。
[0009]本发明还提供一种用于诊断艰难梭菌感染的试剂，所述试剂中含有CSPG4或CSPG4N1-640。
[0010]本发明还提供一种用于诊断艰难梭菌感染的试剂盒，所述试剂盒中包括上述试剂。
[0011]本发明还提供CSPG4蛋白在制备抗艰难梭菌感染药物及诊断试剂中的应用。[0012]本发明还提供多肽CSPG4N1-640在制备抗艰难梭菌感染药物及诊断试剂中的应用。
[0013]本发明还提供CSPG4基因打靶载体，其构建方法包括以下步骤:
[0014]1)基于TALEN基因敲除技术，采用ULtiMATE方法(Yang, 2013)组装针对CSPG4编码序列 5’ -TCCAGCCCCCGGCCT-3’ 以及 5’ -CTGGCCAACATAGTC-3’ 的 DNA 识别区段，并最终克隆至PGL3-TALEN载体中；
[0015]2)基于CRISPR系统的基因敲除载体，以CSPG4编码序列5’ -TTGGCCAGACTTGCATCCG-3’为靶序列，通过酶切，将U6启动子、靶序列和gRNA5’ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT-3’依次连接，并克隆至pGL3-basic载体中，即得CSPG4基因打靶载体。
[0016]本发明还提供含有上述打靶载体的宿主细胞，其为人或哺乳动物细胞。
[0017]本发明首次发现CSPG4是艰难梭菌细胞毒素B的细胞受体。对CSPG4表达抑制可以显著降低毒素B对细胞的毒性。考虑到毒素B在艰难梭菌感染中的不可或缺的作用，CSPG4将是治疗艰难梭菌感染的重要靶点。
[0018]CSPG4基因(GenBank:NM_001897)最初作为黑色素瘤的标志物被发现，截至目前，已发现CSPG4在正常组织的发育和功能上也发挥一定的作用。本发明首次发现CSPG4在艰难梭菌细胞毒素B在毒性作用中起到关键作用。抑制CSPG4表达能显著降低艰难梭菌细胞
毒素B的毒性。
[0019]本发明通过构建全基因组shRNA文库结合高通量测序技术，经细胞毒素B筛选后，首次发现CSPG4在艰难梭菌细胞毒素B发挥毒性过程中起关键作用。通过TALEN以及CRISPR等基因敲除技术，在HeLa和HT29细胞中完全抑制CSPG4基因的表达，由此明显抑制了 TcdB的毒性。同时，克隆并表达了 CSPG4基因的N端肽段CSPG4N1-640，并证明该肽段能竞争性抑制毒素B的细胞毒性。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为本发明实施例1中用70pg/mL TcdB处理8小时后，shRNA文库细胞中仍含有保持明显形态，即对TcdB不敏感的细胞。
[0021]图2为本发明实施例1中利用深度测序揭示出针对CSPG4的shRNA在抑制TcdB毒性上具有明显作用。
[0022]图3为本发明实施例2中野生型HeLa、CSPG4基因敲除型HeLa (CSPG4+)以及CSPG4过表达型HeLa (CSPG4+/CSPG4)在TcdB处理下，细胞形态变化情况；其中，a.野生型 HeLa、CSPG4 基因敲除型 HeLa (CSPG4+)以及 CSPG4 过表达型 HeLa (CSPG4-/-/CSPG4)在0.1ng/mL TcdB处理八小时后的形态变化情况；b.野生型HeLa、CSPG4基因敲除型HeLa(CSPG4+)以及CSPG4过表达型HeLa (CSPG4+/CSPG4)在不同浓度TcdB处理时形态变化情况。
[0023]图4为本发明实施例2中野生型HeLa、CSPG4基因敲除型HeLa (CSPG4+)以及CSPG4过表达型HeLa (CSPG4+/CSPG4)在高浓度TcdB处理下，细胞死亡情况。
[0024]图5为本发明实施例3中通过Western Blot确定CSPG4表达量与细胞膜内TcdB量的关系；其中，a.野生型HeLa、CSPG4基因敲除型HeLa (CSPG4+)以及CSPG4过表达型HeLa (CSPG4+/CSPG4) CSPG4表达量与细胞表面结合TcdB的量；b.野生型HeLa、CSPG4基因敲除型HeLa (CSPG4+)以及CSPG4过表达型HeLa (CSPG4+/CSPG4)细胞中CSPG4表达量与细胞膜结构上TcdB的结合量。
[0025]图6为本发明实施例4中SDS-PAGE电泳后，利用考马斯亮蓝染色鉴定CSPG4N1-640的表达纯化情况。
[0026]图7为本发明实施例4中Pull-down检测证明TcdB与CSPG4N1-640存在直接的相互作用。ANTXRIN-Fc为阴性对照。
[0027]图8 为本发明实施例 5 中使用 ImageXpress Micro XL Widefield High ContentScreening System观察CSPG4N1-640能够竞争性抑制TcdB的毒性。
【具体实施方式】 [0028]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0029]实施例1全基因组shRNA文库筛选
[0030]shRNA 文库购自 Open-biosystem,共 65000 条 shRNA,针对人类的 20000 个基因。通过慢病毒系统将该文库构建于HeLa细胞中。使用含70pg/mL TcdB的培养基培养2X IO6个HeLa细胞，8小时后，使用移液器除去被TcdB侵染的细胞，并更换为正常的培养基培养3天。重复操作6次后，收集对TcdB具有抗性的HeLa细胞(图1)，利用引物(5，-ACGTCGAGGTGCCCGAAGGA-3’ 和 5’ -TACATCTGTGGCTTCACTA-3’ )进行 PCR 扩增，进一步通过深度测序确定针对CSPG4的shRNA能够抑制TcdB的毒性(图2)。
[0031]实施例2CSPG4基因敲除
[0032]针对CSPG4 基因的 TALENs 序列如下:5’-TCCAGCCCCCGGCCT-3’ (TALENl),5’ -CTGGCCAACATAGTC-3’ (TALENe)。针对CSPG4基因的CRISPR系统中所使用的靶序列为:5’ -TTGGCCAGACTTGCATCCG-3’，gRNA 序列为:5’ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT-3’ 。
[0033]将TALENs或CRISPR系统质粒转染进细胞后，选取单克隆，并通过Western Blot确定CSPG4基因敲除的细胞。获得CSPG4基因敲除细胞系后，对比野生型HeLa细胞，以及CSPG4过表达型Hela细胞，使用TcdB处理，并通过细胞形状(图3)及细胞死亡(图4)等表型来评价TcdB的毒性。
[0034]实施例3CSPG4表达量直接影响TcdB与细胞表面的结合
[0035]将上述CSPG4基因敲除的HeLa细胞和通过慢病毒侵染获得的CSPG4过表达HeLa细胞同步培养后，用含?ο μ g/mL TcdB的培养基在4°C培养一小时。进一步使用PBS清洗5遍，洗去未与细胞表面结合的TcdB。裂解细胞后，通过Western Blot确定CSPG4表达量与细胞表面结合TcdB量的关系。同时，用含10 μ g/mL TcdB的培养基在37°C培养半小时后，使用 FractionPREP? Cell Fraction Kit 分离细胞膜结构，通过 Western Blot 确定 CSPG4表达量与细胞膜内TcdB量的关系(图5)。
[0036]实施例4CSPG4蛋白N端肽段直接与TcdB相互作用
[0037]编码CSPG4N端前640氨基酸多肽的DNA序列克隆自CSPG4cDNA，装载于pIRES2-Fc-eGFP载体上，转染细胞后能够产生分泌型CSPG4Nl-640Fc_tag融合蛋白以及绿色荧光蛋白。该质粒转染至CHO细胞后，利用流式细胞仪分离出表达绿色荧光蛋白的细胞，这些细胞继续培养后，收集培养基，利用HitrapPiOteinG柱子(GE)分离纯化的的得到CSPG4N1-640 多肽(图 6)。[0038]将上述得到的CSPG4N1-640与TcdB在PBS中4 °C孵育过夜，然后分别使用ProteinA 或 N1-NTA Superflow (QiaGen, 30450)吸附 CSPG4N1-640 或 TcdB，用 PBS 洗三次后，通过Western Blot分析两者之间的相互作用(图7)。
[0039]实施例5CSPG4蛋白N端肽段竞争性抑制TcdB的细胞毒性
[0040]将纯化好的CSPG4Nl-640(10u g/mL)与 TcdB( 100pg/mL)在 4°C共同孵育 I 个小时后加入到 HeLa 细胞中。使用 ImageXpress Micro XL Widefield High Content ScreeningSystem通过观测细胞形态变化来评价TcdB的毒性(图8)。
[0041]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0042]参考文献
[0043]Yang, J.，Yuan, P.，Wen, D.，Shengj Y.，Zhuj S.，Yuj Y.，Gaoj X.，and Weij W.(2013).ULtiMATE system for rapid assembly of customized TAL effectors.PLoS0ne8，e75649.[0044]Lyras, D.，0，Connor, J.R.，Howarthj P.M.，Sambolj S.P.，Carter, G.P.，Phumoonna，T.，Poonj R.，Adams, V.，Vedantamj G.，Johnson, S.，et al.(2009).Toxin B is essentialfor virulence of Clostridium difficile.Nature458, 1176-1179.[0045]Florin,1., and Thelestamj M.(1983).1nternalization of Clostridiumdifficile cytotoxin into cultured human lung fibroblasts.Biochim BiophysActa763，383-392.[0046]Rupnik，M.，Wilcox，M.H.，&Gerding, D.N.(2009).Clostridium difficileinfection:new developments in epidemiology and pathogenesis.Nature ReviewsMicrobiology, 7(7)，526-536.
【权利要求】
1.与艰难梭菌细胞毒素B相互作用的蛋白，其特征在于，其为硫酸软骨素蛋白多糖CSPG4，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.与艰难梭菌细胞毒素B相互作用的多肽，其特征在于，其由CSPG4蛋白N端640个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
3.一种抗艰难梭菌感染的药物，其特征在于，其有效成分为权利要求1所述蛋白或权利要求2所述多肽。
4.一种用于诊断艰难梭菌感染的试剂，其特征在于，所述试剂中含有权利要求1所述蛋白或权利要求2所述多肽。
5.一种用于诊断艰难梭菌感染的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求4所述试剂。
6.CSPG4蛋白在制备抗艰难梭菌感染药物及诊断试剂中的应用。
7.权利要求2所述多肽在制备抗艰难梭菌感染药物及诊断试剂中的应用。
8.CSPG4基因打靶载体，其构建方法包括以下步骤: 1)基于TALEN基因敲除技术，采用ULtiMATE方法组装针对CSPG4编码序列5’ -TCCAGCCCCCGGCCT-3’ 以及 5’ -CTGGCCAACATAGTC-3’ 的 DNA 识别区段，并最终克隆至PGL3-TALEN 载体中； 2)基于CRISPR系统的基因敲除载体，以CSPG4编码序列5’-TTGGCCAGACTTGCATCCG-3’为靶序列，通过酶切，将U6启动子、靶序列和gRNA5’ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAG`TGGCACCGAGTCGGTGCTTITITT-3’ 依次连接，并克隆至pGL3-basic载体中，即得CSPG4基因打靶载体。
9.含有权利要求8所述打靶载体的宿主细胞。
10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，其为人或哺乳动物细胞。
【文档编号】A61P31/04GK103665141SQ201310752493
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】魏文胜, 袁鹏飞 申请人:北京大学