含有α连接蛋白C-末端(ACT)肽的局部凝胶的制作方法
【专利摘要】本发明涉及局部凝胶药物产品制剂，该制剂含有组合物，所述组合物包含具有α连接蛋白的羧基末端氨基酸序列的分离多肽(ACT肽)、肽稳定剂、赋形剂、缓冲剂等。本发明公开了用于生产稳定、优质和可倾倒的局部凝胶的制剂和制备步骤。所得到的制剂具有适用于美容和治疗应用的长期稳定性，包括预防瘢痕形成和加速伤口愈合。
【专利说明】含有Ct连接蛋白C-末端（ACT)肽的局部凝胶
[0001] 相关专利申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年3月1日提交的美国临时专利申请No. 61/605528的优先权， 所述申请以引用的方式全文纳入本文。
[0003] 对电子形式提交的文本文件的描述
[0004] 随本文以电子形式提交的文本文件以引用的方式全文纳入本文：计算机可阅读形 式的序列表副本（文件名：FIRS_006_01TO_SeqList_ST25.txt，记录日期：2013年3月1日， 文件大小32千字节）。
【技术领域】
[0005] 本发明涉及用于伤口治疗的的组合物，其包含α连接蛋白多肽和稳定剂。含有α 连接蛋白多肽和羟乙基纤维素的局部制剂是特别稳定的。这些组合物可用于治疗包括急性 外科伤口和慢性溃疡在内的多种伤口。
【背景技术】
[0006] 虽然机械损伤、疾病过程和其他原因损伤的人体组织能够愈合，但复杂的组织结 构和功能，即使能恢复，也很少能完全恢复。取而代之的是，人和其他高等脊椎动物中几乎 所有受过损伤的组织的痊愈主要都是形成瘢痕组织。关于这一点最常见的实例为在皮肤割 伤或擦伤痊愈之后持续存在的变色的和纤维化的瘢痕。还未得到充分认识的是，脑部或脊 椎创伤之后神经胶质瘢痕组织的形成是中枢神经系统损伤后神经功能恢复的主要障碍之 一（SilverandMillerJH, 2004)。目前还没有在损伤后治疗或预防这类瘢痕形成及促进 复杂组织结构和功能再生的方法。
[0007] -旦发现上述治疗方法，还需要提供可使其含有的活性药物成分（API)稳定的制 齐U。虽然现有很多种潜在的稳定剂，但它们在稳定特定API方面并非具有同样良好的作用。
【发明内容】
[0008] 本发明涉及局部凝胶药物产品制剂，所述制剂含有包含分离的α连接蛋白多肽 的组合物。所述局部制剂可进一步包含羟乙基纤维素凝胶，所述羟乙基纤维素凝胶可在 保存期间使所述α连接蛋白多肽稳定。在某些实施方案中，所述α连接蛋白多肽包含 α连接蛋白羧基末端的氨基酸序列（以下称为"ACT"）。本发明的α连接蛋白多肽可 包含α连接蛋白或其保守性变体的最靠近羧基末端的4-30个连续的氨基酸，或由其构 成，其中所述至少一种α连接蛋白多肽在其氨基末端连接至细胞内化转运体（cellular internalizationtransporter)〇
[0009] 本发明的目的是制备稳定、优质、可倾倒的含有ACT的局部凝胶载体的制剂，用于 美容和治疗应用，包括预防受试者的瘢痕形成和加快受试者的伤口愈合。可给予所述药物 产品以用于治疗急性外科伤口以减少瘢痕的形成，或者将所述药物产品长期应用于难愈合 的伤口，所述难愈合的伤口包括但不局限于，下肢静脉性溃瘍（venouslegulcer)、糖尿病 性足溃瘍（diabeticfootulcer)、压迫性溃瘍（pressureulcer)等。所述药物产品这样 的物理化学、生物化学和流变性质，即所述性质使得当将其应用于所有类型伤口时其能够 提供治疗有效量的ACT肽。
[0010] 在本发明的一个方面，从多种稳定剂中选择一种或几种稳定剂并将其与ACT 肽进行配制以稳定所述分离的多肽。优选地，所述稳定剂是无刺激性的、无污染的 (non-staining)且无免疫原性的。所述稳定剂使所述药物产品可在不同温度条件（即， 约5°C、约10°C、约15°C、约20°C、约25°C、约30°C、约35°C或约40°C)和一系列相对湿度 (即，0 %的相对湿度、10 %的相对湿度、20 %的相对湿度、30 %的相对湿度、40 %的相对湿 度、50 %的相对湿度、60 %的相对湿度、70 %的相对湿度、80 %的相对湿度、90 %饿相对湿度 或100%的相对湿度）下长期（即，3个月、6个月、9个月、12个月、18个月或24个月）保 存。
[0011] 在本发明的另一方面中，一种或多种赋形剂选自水溶性致孔剂（porogen)、聚合 物、离子化合物、非离子化合物和溶剂。在另一个实施方案中，赋形剂作为载体、稳定剂和胶 凝剂中的一种或多种。在一个实施方案中，将至少一种赋形剂与ACT-同配制。优选地，所 述赋形剂是无刺激性的、无污染的且无免疫原性的。在一个实施方案中，所述制剂包含至少 一种聚合物。在另一个实施方案中，所述制剂包含纤维素的衍生物。在另一个实施方案中， 所述纤维素的衍生物为羟乙基纤维素。
[0012] 在本发明的另一方面中，所述局部凝胶的最佳pH范围为约pH5至约pH7,并通过 加入一种或多种缓冲剂来维持。优选地，所述缓冲剂是无刺激性的、无污染的且无免疫原性 的。
[0013] 在本发明的另一方面中，至少一种赋形剂为胶凝剂。在一个实施方案中，胶凝剂为 ACT的载体。在一些实施方案中，所述胶凝剂也作为稳定剂。在一些实施方案中，所述胶凝 剂可与以下至少一种结合：一种或多种缓冲剂，及一种或多种额外的赋形剂。在一个实施方 案中，所述胶凝剂为羟乙基纤维素。
[0014] 在一些实施方案中，本发明包括治疗伤口的方法，所述方法包括给予有需要的受 试者包含至少一种α连接蛋白多肽和羟乙基纤维素凝胶的局部制剂。
[0015] 在一个示例性的实施方案中，本发明公开了用于制造所述药物产品的步骤。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 为更完整的理解本发明的特性和优势，参考以下与附图相关的详细描述，其中：
[0017] 图1举例说明制造过程的流程图。
【具体实施方式】
[0018] 在描述本组合物和方法之前，应当理解，本发明不局限于所描述的具体过程、组合 物或方法，因此这些可以变化。本说明书中使用的术语仅用于描述特定形式或实施方案，而 非意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求限定。除非另有定义，本文使用 的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。本文提到 的所有出版物以引用的方式全文纳入。本文所有内容都不应被解释为承认本发明因在先发 明而应被认为晚于这些公开内容。
[0019] 还必须注意的是，除非上下文明确另有说明，用于本文和所附权利要求中时，单数 形式"一""一种"和"所述"包括复数指代对象。因此，例如，提及"元素"是指一种或多种 元素以及本领域技术人员已知的其等价物，等等。
[0020] 术语"局部"是指在施用处或紧贴施用处的下方给予本发明药物产品。本文使用 的"局部施用"指施用到包括角质组织（keratinoustissue)的一种或多种表面上，即"局 部应用"。局部施用或"局部应用"可包括向所述区域直接施用所需作用物（substrate)。 所述局部制剂和/或组合物若为液体，可通过倾注、滴加或喷雾施用；若为软膏剂、洗剂、乳 齐?、凝胶等，可通过摩擦施用；若为粉末，可通过喷撒（dusting)施用；若为液体或气雾剂组 合物，可通过喷雾施用；或通过任何其他适当的方法施用。
[0021] 用于本文时，词组"胶凝剂"指使局部制剂更黏稠或黏度更高的试剂。胶凝剂可为 水基或油基的。胶凝剂也可被称为"增稠剂"。本文使用的"赋形剂"，是作为有效药物成分 (API)的载体的非活性成分。赋形剂也可作为胶凝剂或增稠剂，或稳定剂。
[0022] "受试者"或"哺乳动物"包括人类或非人哺乳动物。非人哺乳动物包括但不限于， 家畜或宠物，例如羊、牛、猪、犬、猫和鼠类哺乳动物。在一个实施方案中，所述受试者或哺乳 动物为人。
[0023] 当"给予"与治疗方法结合使用时是指将治疗剂直接给予靶组织中或其上，或将治 疗剂给予患者，通过这种方法所述治疗剂有利地影响其所靶向的组织。因此，本文使用的术 语"给予"，当与所述药物产品结合使用时，可包括但不局限于，将所述药物产品和ACT肽提 供至所述目标组织中或其上。"给予"组合物可通过注射、局部施用进行，或通过任何与其他 已知技术组合的方法完成。
[0024]除非另有说明，术语"皮肤"指身体的外皮或表层（表层），其由真皮和表皮构成并 位于皮下组织之上。
[0025] 用于本文时，术语"治疗剂（therapeutic) "指用于治疗、对抗、减轻、预防或改善患 者的有害病症或疾病的试剂。部分地，本发明的实施方案涉及治疗瘢痕形成和延迟的伤口 愈合。
[0026] 用于本文时，词组"有效量"或"治疗有效量"指用于实施本发明的有效地达到所 需效果（即治疗急性和慢性伤口）的ACT多肽的无毒但充分的量。本发明方法所考虑的活 性包括医学上的治疗和/或预防处理，适当地，包括，例如疾病或障碍的征象、症状或病因 的降低和/或减轻，或生物系统的任何其他所需变化。当然，依据本发明给予的用于获得治 疗和/或预防效果的化合物的特定剂量可通过病例的具体情况决定，包括例如，所给予的 具体多肽和待治疗的病症。本发明化合物的治疗有效量通常为这样的量，所述量即使得当 所述化合物在生理上可耐受的赋形剂组合物中被给予时，其足以组织中达到有效的细胞内 浓度和局部浓度。
[0027] -般来说，术语"组织"指聚集起来以行使特定功能的相似分化细胞的任意聚集 体。本文使用的"组织"，除非另有说明，是指包括弹性蛋白作为其必要的结构和/或功能的 一部分的组织。
[0028] 本文使用的术语"处理（treat)"指治疗性处理和预防性措施，其中目的是预防、 缓解有害生理病症、障碍或疾病的效应（effect)或减慢（减轻）有害生理病症、障碍或疾 病，或得到有利的或需要的临床结果。出于本发明的目的，有利的或需要的临床结果包括 但不限于缓解症状；减轻病症、障碍或疾病的程度；降低病症、障碍或疾病的症状的严重程 度；降低病症、障碍或疾病的症状的频率；使病症、障碍或疾病的状况稳定（即，不恶化）； 推迟病症、障碍或疾病的发生或减慢病症、障碍或疾病的进展；改善病症、障碍或疾病状态； 及病症、障碍或疾病状态的缓和（部分或全部），可检测或不可检测的，或者增强或改善。治 疗包括引起临床上显著的反应而不引起过度的副作用。在一些实施方案中，治疗可包括在 损伤后预防或降低瘢痕形成并且/或者促进复杂组织结构和功能的再生。
[0029] 用于本文时，术语"肽"、"多肽"或"蛋白质"可以互换使用，是指包括由通过肽键 共价相连的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且不限制构成 蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量。多肽包括任何包含由肽键相互连接的两个或更多个 氨基酸的肽或蛋白质。用于本文时，所述术语指短链和长链，其中短链在本领域中也被称 为例如肽、寡肽和低聚物，长链在本领域中通常被称为蛋白质，其具有许多种类。"多肽"包 括，例如，具有生物学活性的片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变 体、修饰的多肽、衍生物、类似物和融合蛋白等。所述多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其 组合物。非环形的肽具有N-末端和C-末端。N-末端具有氨基，其可以是游离的（即，为 NH2基团）或适当保护的（例如，具有BOC或Fmoc基团）。C-末端具有羧基、其可以是游离 的（即，为COOH基团）或适当保护的（例如，为苯甲酯或甲酯）。由于环形肽的末端是通 过酰胺键共价结合以形成环形结构，因此其不具有游离N-或C-末端。氨基酸可通过其全 名（例如，亮氨酸）、三字母缩写（例如Leu)和单字母缩写（例如L)表示。氨基酸的结构 及其缩写可见于化学文献，例如Stryer，"Biochemistry"，3rdEd.，W.H.FreemanandCo·， NewYork,1988。
[0030] 用于局部凝胶的赋形剂是本领域公知的，实例可见于Handbookof PharmaceuticalExcipients(Rowe,R.C.etaI,APhAPublications；5thed. ,2005)〇 不 例性的赋形剂可包括蜡、多种糖和多种类型的淀粉、聚合物、凝胶、润滑剂、增稠剂、流变改 性剂（rheologymodifier)、润湿剂、丙三醇、有机碱性化合物、纤维素衍生物、明胶、植物油、 聚乙二醇和溶剂。流变改性剂的实例包括卡波姆、羟丙基纤维素、C26_28烷基聚二甲基硅氧 烧、C26_28烧基聚甲基娃氧烧、聚苯基倍半氧烧（polyphenylsisquioxane)、三甲基娃烧氧基 娃酸酯（trimethylsiloxysilicate)、环戊娃氧烧与聚二甲基娃氧烧/乙烯基三甲基娃烧 氧基硅酸酯的交联聚合物、烟雾硅胶（例如，Cab-O-SilM5P)及其混合物。润滑剂的实例包 括丙三醇、戊二醇、吡咯烷酮羧酸钠、羊毛脂、异构糖、硬脂氧基聚二甲基硅氧烷（stearoxy dimethicone)、硬脂基聚二甲基娃氧烧（stearyldimethicone)及其混合物。润滑剂可用于 预防由于在制剂中使用无水溶剂而发生的角质层脱水。有机碱的实例包括2-氨基-2-甲基 丙醇、烟酰胺、甲醇胺、三乙醇胺、三（轻甲基）氨基甲烧（Trisamino)、AMP-95、AmP-Ultra PC2000、三异丙醇胺、二异丙醇胺、NeutrolTE、Ethomeen及其混合物。所述有机碱可使所 述药物的pH呈碱性或中性。
[0031] 其他示例性的赋形剂包括水溶性致孔剂。水溶性致孔剂为可辅助水的吸收和扩散 到凝胶中的添加剂。可以使用任何适当的致孔剂，但在一些实施方案中，所述致孔剂可包括 氯化钠、氯化钾、蔗糖、葡萄糖、乳糖、山梨醇、木糖醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇 或其混合物。
[0032] 聚合物也可在局部凝胶中作为赋形剂。示例性的聚合物包括亲水的聚氨酯、亲 水的聚丙烯酸酯、羧甲基纤维素和丙烯酸的共聚物、N-乙烯基吡咯烷酮、聚（羟基酸）、 聚酐、聚原酸酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯（例如聚乙烯和聚丙烯）、聚亚烷基二醇（例 如聚乙二醇）、聚氧化烯（例如聚氧化乙烯）、聚亚烷基对苯二甲酸酯（例如聚对苯二 甲酸乙二酯）、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物（例如聚氯乙烯）、聚乙烯 吡咯烷酮、聚硅氧烷、聚乙烯基乙酸酯、聚苯乙烯、聚氨酯共聚物、纤维素、纤维素衍生物 (例如，羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲 基纤维素或醋酸纤维素）、藻酸盐、聚丙烯酸、聚丙烯酸衍生物、丙烯酸共聚物、甲基丙烯 酸、甲基丙烯酸衍生物、甲基丙烯酸共聚物、聚丁酸、聚戊酸、聚（丙交酯-Co-己内酯） (poly(lactide-co-caprolactone))、其共聚物及其混合物。
[0033] 在本发明的一些实施方案中，所述聚合物可为超吸收聚合物（SAP)。按照IUPAC 定义，当聚合物可吸收并保留相对于其自身质量来说非常大量的水时，该聚合物被认为是 超强吸收的。SAP可吸收最高达其自身重量500倍的水并可膨胀最高达其最初体积的1000 倍。具体的目的SAP包括聚丙烯酸钠、聚氨酯TecophilicTG-2000及通过使用聚丙烯酰胺 共聚物、乙烯-马来酸酐共聚物、交联羧甲基纤维素、聚乙烯醇共聚物、聚乙烯吡咯烷酮和 交联聚乙烯氧化物制备的聚合物。
[0034] 在本发明的一些实施方案中，可使用相对疏水的聚合物。可使用任何适当的疏水 聚合物。尽管如此，示例性的相对疏水的聚合物包括芳香族聚氨酯、硅橡胶、聚硅氧烷、聚己 酸内酯、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚-L-丙交酯、聚-DL-乙交酯、聚醚醚酮（PEEK)、聚酰 胺、聚酰亚胺和聚乙酸乙烯酯。另外，可使用疏水的凝胶基质和/或流变改性剂。
[0035] 在本发明的一些实施方案中，所述聚合物在药剂中可作用为增稠剂。特别地，所述 凝胶的聚合部分可作为粘弹性物质（visco-elasticsubstance)并可将所述凝胶与分散于 其中的α连接蛋白多肽保持在施用部位。
[0036] 在另一些实施方案中，包含聚合物的凝胶可具有可分散性，使得当施用于皮肤表 面时其可形成薄膜。该薄膜可使所包含的α连接蛋白多肽施用于较大面积，并用于将所述 α连接蛋白多肽保持在皮肤的受影响区域上。
[0037] 其他赋形剂可包括多种离子和非离子化合物以保持所述制剂的稳定性，从而保护 所述制剂成分免于去乳化、沉降、团聚或降解，这些会降低其治疗或美容价值。
[0038] 离子化合物的实例可包括盐例如氯化钠、氯化钾；阳离子、阴离子或两性离子表面 活性剂例如十二烷基硫酸钠（SDS)、全氟辛酸酯（PFOA)、全氟辛烷磺酸酯（PFOS)、十二烷基 硫酸铵（ALS)、十二烷基醚硫酸钠（SLES)、烷基苯磺酸酯、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)、 氯化十六烷基吡啶（CPC)、聚乙氧化牛脂胺（POEA)、氯化苯甲烷铵（BAC)、氯化苄乙氧铵、 十二烧基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱和椰油酰两性甘氨酸（cocoamphoglycine)。
[0039] 可作为赋形剂的非离子化合物的实例包括非离子表面活性剂例如表面活性剂的 普兰尼克（Pluronic)、吐温（Tween)、AMP及苄泽家族；及来自生物来源的表面活性剂，例如 天然或半合成表面活性剂，例如油酸、三油酸山梨坦（sorbitantrioleate)、去水山梨糖醇 单油酸酯（sorbitanmonooleate)、卵磷脂、椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA及椰油酰胺丙基甜 菜碱。表面活性剂（离子型和非离子型）可降低界面的表面能并可帮助所述局部制剂在更 大面积上的扩散。
[0040] 在本发明的一些实施方案中，溶剂赋形剂可作为α连接蛋白多肽和其他赋形剂 的载体。聚合物链可与溶剂相互作用并发生溶胀以形成可赋予所述局部制剂以粘弹性特性 的网络。在所述局部制剂的一些实施方案中，所述溶剂可在使用时蒸发，留下聚合物的残余 薄膜和被包埋的α连接蛋白多肽。
[0041] 可用于亲水性制剂的示例性溶剂赋形剂可包括二甲基异山梨醇酯、丙二醇、丙三 醇、异丙醇、乙醇、苯甲醇、乙二醇、聚乙二醇、乙氧基二甘醇或其混合物。可用于疏水性制剂 的示例性溶剂赋形剂可包括癸酸/辛酸甘油三酯、豆蘧酸异丙酯、矿物油、异十二烷、新戊 酸异癸酯、丁二醇、戊二醇、己二醇、甲氧基聚乙二醇、环戊硅氧烷、环四硅氧烷、聚二甲基硅 氧烧、辛酰基聚甲基娃氧烧（caprylylmethicone)或其混合物。
[0042] 除了所述α连接蛋白多肽和赋形剂之外，所述局部制剂还可包含至少一种另外 的治疗剂，例如杀菌剂、抗痤疮剂、抗炎剂、镇痛剂、麻醉剂、抗组胺剂、防腐剂、免疫抑制剂、 抗出血剂、血管扩张剂、伤口愈合剂、抗生物膜剂及其混合物。
[0043] 杀菌剂的实例包括青霉素和相关药物、碳青霉烯、头孢菌素和相关药物、红霉 素、氨基糖苷、杆菌肽、短杆菌肽、莫匹罗星、氯霉素、甲砜霉素、夫西地酸钠、林可霉素、 克林霉素、大环内酯、新生霉素、多黏菌素、利福霉素、大观霉素、四环素类、万古霉素、替 考拉宁、链阳性菌素，抗叶酸剂包括磺胺、甲氧苄啶及其组合物及乙胺嘧啶，合成的抗菌 药物包括硝基呋喃、孟德立酸乌洛托品（methenaminemandelate)和马尿酸乌洛托品 (methenaminehippurate)，硝基咪唑、喹诺酮、氟喹诺酮、异烟肼、乙胺丁醇、批嗪酰胺、 对氨基水杨酸（PAS)、环丝氨酸、卷曲霉素、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、氨硫脲、紫霉素、扁 枝衣霉素（eveminomycin)、糖肽、甘氨酰四环素（glyclyclycline)、酮内酯、恶唑烧酮 (oxazolidinone);亚胺配南（imipenen)、阿米卡星、奈替米星、磷霉素、庆大霉素、头孢曲 松、齐拉星、利奈唑胺、共杀素、氨曲南、和甲硝唑、依匹普林、山费培南钠、比阿培南、蒽环类 抗生素（Dynemicin)、头孢瑞南、头孢噻利、山费培南西酯（Sanfetrinemcelexetil)、头孢 匹罗、Mersacidin、利福拉齐、Kosan、来那培南、Veneprim、硫培南、利替培南酯（ritipenam acoxyl)、Cyclothialidine、美加球菌素A(micacocidinA)、卡芦莫南、头抱唑兰和头抱他 美。
[0044] 局部抗痤疮剂的实例包括阿达帕林、壬二酸、过氧苯甲酰、克林霉素和克林 霉素磷酸酯、多西环素、红霉素、角质层分离剂（keratolytics)例如水杨酸和视黄酸 (Retin-A")、诺孕酯、有机过氧化物，视黄酸类例如异维甲酸和维甲酸，磺胺醋酰钠和他扎 罗汀（tazarotene)。特定抗痤疮药包括阿达帕林、壬二酸、过氧苯甲酰、克林霉素（例如克 林霉素磷酸酯）、多西环素（例如一水合多西环素）、红霉素、异维甲酸、诺孕酮、磺胺醋酰 钠、他扎罗汀、阿维A酯（etretinate)和阿曲汀（acetretin)。
[0045] 抗组胺剂的实例包括盐酸苯海拉明、水杨酸苯海拉明、苯海拉明、盐酸氯苯那敏、 马来酸氯苯那敏、盐酸氮异丙嗪、盐酸曲吡那敏、盐酸异丙嗪、盐酸甲地嗪等。局部麻醉剂的 实例包括盐酸辛可卡因、辛可卡因、盐酸利多卡因、利多卡因、苯佐卡因、对丁基氨基苯甲酸 2_(二乙基氨基）乙酯盐酸盐（p-buthylaminobenzoicacid2-(die_ethylamino)ethyl esterhydrochloride)、盐酸普鲁卡因、丁卡因、盐酸丁卡因、盐酸氯普鲁卡因、盐酸轻基普 鲁卡因（oxyprocainehydrochloride)、甲哌卡因、盐酸可卡因、盐酸哌罗卡因、达克罗宁和 盐酸达克罗宁。
[0046] 防腐剂的实例包括醇、季铵化合物、硼酸、氯己定和氯己定衍生物、碘、酚、萜、杀细 菌剂、消毒剂包括硫柳汞、苯酚、百里酚、苯扎氯铵、苄索氯铵、氯己定、聚维酮碘、西吡氯铵、 丁香酚和三甲基溴化铵。
[0047]抗炎剂的实例包括非固醇类抗炎剂（NSAID);丙酸衍生物例如布洛芬和萘普生； 乙酸衍生物例如吲哚美辛；烯醇酸衍生物例如美洛昔康、醋氨酚；水杨酸甲酯；水杨酸乙二 醇酯；阿司匹林；甲芬那酸；氟芬那酸；Π引哚美辛；双氯芬酸；阿氯酚酸；双氯芬酸钠；布洛 芬；酮洛芬；萘普生；普拉洛芬；非诺洛芬；舒林酸；芬氯酸；环氯茚酸；氟比洛芬；芬替酸； 丁苯羟酸；吡罗昔康；保泰松；羟基保泰松；氯非宗；喷他佐辛；甲嘧啶唑；盐酸噻拉米特； 固醇类例如丙酸氯倍他索、二丙酸倍他米松（bethamethasonedipropionate)、丙酸卤贝他 索酯（halbetasolproprionate)、双醋二氟拉松、醋酸氟轻松、氯氟舒松、安西奈德、去轻米 松、曲安奈德、糠酸莫米松、丙酸氟替卡松、二丙酸倍他米松、曲安奈德、丙酸氟替卡松、地奈 德、氟轻松、戍酸氢化可的松、泼尼卡酯、曲安奈德、氟轻松、氢化可的松及其它本领域公知 的，氢化泼尼松（predonisolone)、地塞米松、氟轻松、乙酸氢化可的松、乙酸氢化泼尼松、甲 泼尼龙（methylpredonisolone)、乙酸地塞米松、倍他米松、戊酸倍他米松、氟米松、氟米龙、 二丙酸倍氯米松、醋酸氟轻松、局部用皮质类固醇，且可为一种较低效力的皮质类固醇例如 氢化可的松、氢化可的松-21-单酯（例如氢化可的松-21-乙酸酯、氢化可的松-21- 丁酸 酯、氢化可的松-21-丙酸酯、氢化可的松-21-戊酸酯等）、氢化可的松-17, 21-二酯（例如 氢化可的松-17, 21-二乙酸、氢化可的松-17-乙酸酯-21- 丁酸酯、氢化可的松-17, 21-二 丁酸酯等）、阿氯米松、地塞米松、氟米松、泼尼松龙或甲泼尼龙，或可为高效力的皮质类固 醇例如丙酸氯倍他索、苯甲酸倍他米松、二丙酸倍他米松、双醋二氟拉松、醋酸氟轻松、糠酸 莫米松、曲安奈德。
[0048]镇痛剂的实例包括阿芬太尼、苯佐卡因、丁丙诺啡、布托啡诺、氨苯丁酯、辣椒辣 素、可乐定、可待因、地布卡因、脑啡肽、芬太尼、氢可酮、氢吗啡酮、吲哚美辛、利多卡因、左 啡诺、哌替啶、美沙酮、吗啡、尼可吗啡、鸦片、奥布卡因、羟可酮、羟吗啡酮、喷他佐辛、普莫 卡因、丙对卡因、丙氧芬、丙美卡因、舒芬太尼、丁卡因和曲马朵。
[0049]麻醉剂的实例包括醇类例如酚；苯甲酸苄酯；炉甘石；氯二甲酚；达克罗宁；氯胺 酮；薄荷脑；普莫卡因；间苯二酚；三氯生；普鲁卡因药物例如苯佐卡因、布比卡因、氯普鲁 卡因；辛可卡因；可卡因；地昔卡因；二胺卡因；地布卡因；依替卡因；海克卡因；左布比卡 因；利多卡因；甲哌卡因；奥昔卡因；丙胺卡因；普鲁卡因；丙对卡因；丙氧卡因；批咯卡因； 利索卡因；罗多卡因；罗哌卡因；丁卡因；及衍生物，例如药学上可接受的盐和酯包括盐酸 布比卡因、盐酸氯普鲁卡因、环己氨磺酸二胺卡因、盐酸地布卡因、盐酸达克罗宁、盐酸依替 卡因、盐酸左布比卡因、盐酸利多卡因、盐酸甲哌卡因、盐酸普莫卡因、盐酸丙胺卡因、盐酸 布鲁卡因、盐酸丙对卡因、盐酸丙氧卡因、盐酸罗哌卡因及盐酸丁卡因。
[0050] 抗出血剂的实例包括凝血酶、植物甲萘醌、硫酸鱼精蛋白、氨基己酸、氨甲环酸、卡 巴克络、卡巴克络磺酸钠、芦丁（rutin)和橙皮苷。
[0051] 除了生物活性多肽成分，本发明也可含有其他活性剂例如烟酰胺、植三醇 (phytantriol)、法尼醇、红没药醇和水杨酸。预期某些额外的活性成分会与所述生物活性 肽成分协同作用，或提高制剂的贮存期。
[0052] 可与本发明药物产品一起使用的伤口治疗剂的实例包括纤维蛋白溶解酶例如 溶纤维蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、链激酶和链道酶，含有氯化溶菌酶的尸体解剖组织剂 (necrotomytissueagents)，含有硫酸庆大霉素、磺胺啼陡银、杆菌肽和硫酸新霉素的杀 菌剂，含有曲夫明、布拉地新钠、托可维A酸（维A生育醇酯）、前列地尔α环糊精、血活素 (从幼牛的溶血血液中提取）和铝克洛沙的生肉芽剂，含有绵白糖、聚维酮碘和碘的碘制 齐U，及含有苄达酸、二甲基异丙基甘菊环（愈创蓝油烃）和肾上腺素作为有效成分的制剂。
[0053] 除了α连接蛋白多肽、赋形剂和其他治疗剂之外，所述凝胶也可包含可提高所述 局部制剂的感官特性的其他化合物。
[0054] 这类化合物的实例包括香料、染料和色素；螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸二 钠（EDTA)、EGTA、CP94、柠檬酸；防腐剂包括但不限于季铵化合物，例如苯扎氯铵、苄索氯 铵、溴化十六烷基三甲铵（cetrimide)、地喹氯铵和西吡氯铵；汞试剂例如硝酸苯汞、乙酸 苯汞和硫柳汞；醇试剂例如三氯叔丁醇、苯乙醇和苯甲醇；杀细菌酯，例如，对羟基苯甲酸 的酯；及其他杀菌剂例如氯己定、氯甲酚、苯甲酸和多粘菌素。
[0055] 可用在本发明制剂中的α连接蛋白多肽记载于美国专利No. 7786074,所述专利 以引用的方式纳入本文。在一些实施方案中，所述α连接蛋白多肽为全长α连接蛋白蛋 白质例如连接蛋白37、连接蛋白40、连接蛋白43或连接蛋白45。在一些实施方案中，所述 多肽不包含所述全长的连接蛋白蛋白质。
[0056] 用于本发明的制剂中的肽包括α连接蛋白多肽。用于本发明的制剂的α连接蛋 白多肽可包含α连接蛋白或其保守性变体的最靠近羧基末端的4-30个连续氨基酸，或由 其构成。因此，用于所述制剂的多肽可包含所述α连接蛋白的最靠近C末端的4-30个氨基 酸，包括所述α连接蛋白的最靠近C末端的4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个氨基酸。在一些方面，所提供的多肽还包含缺 失所述α连接蛋白的最靠近C末端的4-30个氨基酸中的一个或多个氨基酸，包括缺失所 述α连接蛋白的最靠近C末端的4-30个氨基酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。 例如，在一些方面，用于本发明的制剂的多肽不包含所述α连接蛋白的最靠近C末端的1、 2或3个氨基酸。例如，所述多肽可主要由氨基酸序列SEQIDNO: 92构成，或者主要由氨 基酸序列SEQIDNO:92的长度为至少4、5、6、7、8、9、10个氨基酸的羧基末端片段构成。
[0057] 在某些实施方案中，本发明的α连接蛋白多肽的氨基或羧基末端与细胞内化运 载体（transporter)连接。不同的实施方案包括不与任何细胞内化运载体相连接的α连 接蛋白多肽。与所述α连接蛋白多肽连接的细胞内化运载体可为任何本领域中已知或新 发现的内化序列，或其保守性变体。细胞内化运载体和序列的非限制性实例包括触角足 (Antennapedia)序列、TAT、HIV-Tat、Penetratin、Antp_3A(Antp突变体）、BuforinII、 Transportan、MAP(模式两亲肽）、K-FGF、Ku70、朊病毒、pVEC、P印-1、SynBl、P印-7、HN-1、 BGSC(双-胍盐-亚精胺-胆固醇）和BGTC(双-胍盐-三氨乙基胺-胆固醇）。
[0058] 在本发明的一个实施方案中，所述α连接蛋白多肽的氨基酸序列选自SEQIDNO: 1、2、3、4和5,或其保守性变体。在本发明另一实施方案中，所述α连接蛋白多肽包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列。在本发明的另一实施方案中，所述多肽包含α连接蛋白多肽和细 胞内化运载体。在另一实施方案中，所述α连接蛋白多肽在其氨基末端与所述细胞内化运 载体连接。在另一实施方案中，与细胞内化运载体相连的α连接蛋白多肽的氨基酸序列选 自SEQIDNO:8、9、10、11和12,或其保守性变体。在一个实施方案中，所述多肽由SEQID NO:9的氨基酸序列即RQPKIWFPNRRKPWKKRPRPDDLEI构成，或包含所述序列。
[0059] 当本文提到特定蛋白质时，考虑到了变体、衍生物和片段。蛋白质变体和衍生物对 于本领域技术人员来说很好理解并可包含氨基酸序列修饰。例如，氨基酸序列修饰通常落 在以下三类中的一个或多个的范围内：置换、插入或缺失变体。插入包括氨基和/或羧基 末端融合及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。通常插入为小于氨基或羧基末端融合的 插入，例如，在一个至四个残基的水平。缺失表征为从蛋白质序列去除一个或多个氨基酸残 基。所述变体一般是由编码所述蛋白质的DNA中核苷酸的定点突变制备，从而形成编码所 述变体的DNA，并随后在重组细胞培养物中表达所述DNA。用于在具有已知序列的DNA中的 预定位点处制备置换突变的技术是公知的并包括，例如，M13引物诱变和PCR诱变。氨基酸 置换通常为单个残基，但可一次在多个不同位置发生；插入通常在约1至10个氨基酸残基 的水平。缺失或插入可在相邻的对中进行，即缺失两个残基或插入两个残基。可以将置换、 缺失、插入或其任意组合进行组合以形成最终构建体。所述突变必须不能将序列置于阅读 框之外并优选地不形成可产生二级mRNA结构的互补区域，除非需要在mRNA的二级结构中 产生变化。置换变体为至少一个残基被移除并在其位置插入一个不同残基的那些。这类置 换通常被称为保守性置换。例如，本领域技术人员已知，将一个氨基酸残基用另一个在生物 学和/或化学上相似的氨基酸残基替换是保守性置换。例如，保守性置换可为将一个疏水 残基替换为另一个疏水残基，或将一个极性残基置换为另一个极性残基。本文提供的多肽 包括每个明确公布的序列的保守性置换变体。通常，保守性置换对于所产生的多肽的生物 活性几乎没有或没有影响。在具体实例中，保守性置换为多肽中基本上不影响所述肽的生 物学功能的氨基酸置换。肽可包括一个或多个氨基酸置换，例如2-10个保守性置换、2-5 个保守性置换、4-9个保守性置换，例如2、5或10个保守性置换。可通过使用例如标准程 序（如定点诱变或PCR)来操作编码多肽的核苷酸序列而使所述多肽产生一个或多个保守 性置换。或者，可以使用标准肽合成方法来产生含有一个或多个保守性置换的多肽。丙氨 酸扫描（alaninescan)可用于识别蛋白质中哪个氨基酸可以耐受氨基酸置换。在一个实 例中，当用丙氨酸或其他保守氨基酸（例如以下所列的那些）置换一种或多种天然氨基酸， 该蛋白质的生物活性的降低不超过25%，例如不超过20%，例如不超过10%。关于保守性 置换的其他信息可见于其他位置，Ben-Bassatetal·，（J.Bacterial. 169:751-7,1987)， 0'Reganetal.，（Gene77 :237-51,1989),Sahin-Tothetal.，（ProteinSci. 3 :240-7, 1994)，Hochulietal·，（Bio/Technology6 :1321_5,1988)，及遗传学和分子生物学的标 准教科书中。
[0060] 用于本文时，"分析方法"包括以下用于确定特定制剂中所述ACT肽的种类和含量 的技术：NMR、HPLC、氨基酸组成和分子量确定（AminoAcidCompositionandMolecular WeightDetermination)及比方宠光度（SpecificOpticalRotation)。
[0061] 本发明包括包含至少一种α连接蛋白多肽和羟乙基纤维素凝胶的局部制剂，其 中所述羟乙基纤维素凝胶使所述a连接蛋白多肽稳定。在某些实施方案中，所述羟乙基 纤维素凝胶使a连接蛋白多肽稳定以使得在5°C下保存3个月后至少 83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %, 98%、99%或100%的所述a连接蛋白多肽可通过分析方法检测到。在一些实施方案中，所 述ct连接蛋白多肽以以下浓度存在于所述制剂中：约0.0025% (w/w)，约0.005% (w/w)， 约 0.0075% (w/w)，约 0.010% (w/w)，约 0.015% (w/w)，约 0.020% (w/w)，约 0.025% (w/ w)，约 0· 030 % (w/w)，约 0· 035 % (w/w)，约 0· 040 % (w/w)，约 0· 045 % (w/w)，约 0· 050 % (w/w)，约 0· 080% (w/w)，约 0· 085% (w/w)，约 0· 090% (w/w)，约 0· 095% (w/w)，约 0· 100%^/^)340.1505^^/^)340.2005^^/^)340.2505^^/^)340.5005^^/^)340.7501% (界/'\￥)，约1.00(%(￥/\￥)，约1.50(%(￥/\￥)，约2.00 (%(￥/\￥)，约2.50(%(￥/\￥)，或约5.00(￥/ w)。在一个实施方案中，所述α连接蛋白多肽存在于所述制剂中的浓度介于约0.005% (w/ w)至约 1.00% (w/w)之间。
[0062] 在其他实施方案中，本发明的药物产品为含有0. 0072% (w/w) (20μM)的所述ACT 肽、(λ018 % (w/w) (50μΜ)的所述ACT肽、(λ036 % (w/w) (100μΜ)的所述ACT肽或(λ072 % (w/w)(200yM)的所述ACT肽的澄清无色凝胶。所述ACT肽可溶于半固体剂型中，所述制 剂含有> 〇%水、> 10%水、> 20%水、> 30%水、> 40%水、> 50%水、> 60%水、> 70% 水、>80%水或>90%水以及0.25%胶凝剂（聚合物）、0.55%胶凝剂（聚合物）、0.75% 胶凝剂（聚合物）、1· 00%胶凝剂（聚合物）、1· 25%胶凝剂（聚合物）、1· 50%胶凝剂（聚 合物）、1· 75 %胶凝剂（聚合物）、2. 00 %胶凝剂（聚合物）、2. 25 %胶凝剂（聚合物）或 2. 50%胶凝剂（聚合物）。所述ACT肽可被很好的保存并充分地缓冲至pH6。在所述局部 制剂的一个实施方案中，定性和定量的组成列于表1.
[0063] 表1 :药物产品凝胶定性和定量
【权利要求】
1. 一种局部制剂，其包含至少一种α连接蛋白多肽和羟乙基纤维素凝胶，其中所述羟 乙基纤维素凝胶使所述α连接蛋白多肽稳定。
2. 权利要求1的局部制剂，其中所述羟乙基纤维素凝胶使所述α连接蛋白多肽稳定以 使得在5°C下保存3个月后通过分析方法可检测到至少98%的所述α连接蛋白多肽。
3. 权利要求1的局部制剂，其中所述羟乙基纤维素凝胶使所述α连接蛋白多肽稳定以 使得在5°C下保存3个月后通过分析方法可检测到至少95%的所述α连接蛋白多肽。
4. 权利要求1的局部制剂，其中所述羟乙基纤维素以约1. 25% (w/w)的浓度存在。
5. 权利要求1的局部制剂，其中所述至少一种α连接蛋白多肽以约0.005% (w/w)至 约1.00% (w/w)的浓度存在。
6. 权利要求1的局部制剂，还包含将所述局部制剂的pH保持在约5-约7的缓冲剂。
7. 权利要求6的局部制剂，其中所述缓冲剂为磷酸盐缓冲剂。
8. 权利要求1的局部制剂，其中所述至少一种α连接蛋白多肽包含α连接蛋白蛋白 质或其保守性变体的最靠近羧基末端的4-30个连续氨基酸。
9. 权利要求8的局部制剂，其中所述至少一种α连接蛋白多肽在其氨基末端连接至细 胞内化运载体。
10. 权利要求9的局部制剂，其中所述细胞内化运载体为触角足序列。
11. 权利要求8的局部制剂，其中所述至少一种α连接蛋白多肽包含SEQ ID NO :9的 氨基酸序列。
12. 权利要求8的局部制剂，其中所述α连接蛋白多肽为连接蛋白37、连接蛋白40、连 接蛋白43或连接蛋白45。
13. -种伤口治疗的方法，包括给予有需要的受试者权利要求1的局部制剂。
14. 权利要求13的方法，其中所述伤口为急性外科伤口。
15. 权利要求13的方法，其中所述伤口为慢性的、非感染的、全层皮肤下肢溃疡。
16. -种生产局部制剂的方法，其包括： a) 混合丙二醇、丙三醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯直至所述对羟基苯甲 酸酯完全溶解； b) 单独混合纯水、EDTA、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和D-甘露醇直至获得澄清溶液； c) 将来自a)的溶液加入至来自b)的溶液中，用纯水冲洗所述来自a)的溶液的容器， 将冲洗液加入合并的溶液中，并混合直至所述合并的溶液为目测均相的； d) -边均化混合，一边将羟乙基纤维素加入c)的所述合并的溶液中并混合直至聚合 物完全分散、 e) 单独混合纯水与α连接蛋白多肽直至所述肽完全溶解； f) 将来自e)的溶液加入至d)的溶液中，用纯水冲洗所述来自e)的溶液的容器，将所 述冲洗液加入至所述合并的溶液，并混合直至所述合并的溶液为均相的。
【文档编号】A61K31/74GK104271142SQ201380023492
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2013年3月1日 优先权日:2012年3月1日
【发明者】G·格哈特尼卡 申请人:福斯特斯特林研究公司